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学校代码：１０２８５学号：２０１８７７３２０４０ＳＯＯＣＨＯ同等学力人员硕士学位论文结核分枝杆菌感染对ＨＩＶ患者病毒储存库的影响ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｖｉｒａｌｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓｉｎＨＩＶａｔｉｅｎｔｓｐ研究生姓名邹磊指导教师姓名赵卫峰卢洪洲专业名称内科学（感染病学）研究方向艾滋病所在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期２０１８年５月 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研宄成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研宄作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名ｚ一“：外恭曰期： ？＇＇＇■％苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸一质论文的内容相致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研宄所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在年月解密后适用本规定。非涉密论文口论文作者签名：邹氙日期：．导师签名：：日期 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响中文摘要结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响中文摘要目的：研究HIV患者中结核分枝杆菌感染对病毒储存库的影响。方法：回顾性分析上海市公共卫生中心近2年收治的非机会性感染的HIV患者35例以及HIV患者中结核分枝杆菌感染者30例，剔除失访及疗效不佳者，最终入组非机会性感染的HIV患者25例以及HIV患者中结核分枝杆菌感染者20例；留取基线、抗病毒治疗1年后全血标本，-80℃保存；统计入组患者基线状况包括性别，年龄，基线CD4，抗病毒方案，抗结核方案，抗病毒时机，CD8，病毒载量等相关指标，其中抗病毒方案选用“替诺福韦酯+拉米夫定+依非韦仑/奈韦拉平”一线方案，抗结核方案选用“异烟肼+利福平/利福布汀+乙胺丁醇+吡嗪酰胺”方案，抗病毒时机在抗结核方案开始后至少2周，抗病毒治疗1年；病毒储存库测定采用PCR-荧光探针法定量检测全血基因组中人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA；通过非参数Mann-whitneyU检验比较非机会性感染HIV组与HIV合并结核分枝杆菌组基线病毒储存库大小；比较抗病毒治疗1年前后非机会性感染HIV组以及HIV合并结核分枝感染组中病毒潜伏库各自大小动态变化；比较抗病毒治疗1年后结核分枝杆菌感染对HIV潜伏库的影响。结果：1）非机会性感染HIV组与HIV合并结核分枝感染组基线CD4、CD8均存在差异，非机会性感染HIV组CD4平均值为260.90±149.44cells/ul，HIV合并结核分枝感染组CD4平均值为61.85±65.05cells/ul，CD4P值0.000，有统计学意义。非机会性感染HIV组CD8平均值为772.80±427.17cells/ul，HIV合并结核分枝感染组CD8平均值为425.30±269.13cells/ul，CD8P值为0.001，有统计学意义。2）非机会性感染HIV组病毒储存库基线与HIV合并结核分枝杆菌感染组基线比较，非机会性感染HIV组基线HIV-1DNA平均值为2.594±0.5176logcopies/106cells，HIV合并结核分枝杆菌感染组基线HIV-1DNA平均值为3.410±0.4344logcopies/106cells，P值<0.0001，有显著统计学差异。III 中文摘要结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响3)非机会性感染HIV组病毒储存库基线与抗病毒治疗1年后病毒储存库比较，基线HIV-1DNA平均值为2.594±0.5176logcopies/106cells，抗病毒治疗1年后HIV-1DNA平均值为1.956±0.5951logcopies/106cells，P值<0.0001，有显著统计学差异。4）HIV合并结核分枝感染组基线病毒储存库基线与抗病毒治疗1年后病毒储存库比较，基线HIV-1DNA平均值为3.410±0.4344logcopies/106cells，抗病毒治疗1年后HIV-1DNA平均值为2.974±0.4847logcopies/106cells，P值0.0161，有统计学差异。5）HIV合并结核分枝感染组经抗病毒治疗1年后病毒储存库与基线病毒储存库下降百分比平均值为-10%~20%,，与非机会性感染HIV组抗病毒治疗1年后病毒储存库与基线病毒储存库下降百分比-20%~20%，两组相比较，P值为0.0150，有显著统计学差异。结论：HIV合并结核分枝感染组较非机会性感染HIV组病毒储存库基线大；结核分枝杆菌感染与HIV患者病毒储存库的清除之间存在相关性，HIV患者中结核分枝杆菌感染延缓了病毒储存库的下降，影响了抗病毒治疗疗效以及HIV的功能性治愈。【关键词】：结核分枝杆菌感染，HIV-1，病毒储存库，抗病毒治疗作者：邹磊指导老师：赵卫峰卢洪洲IV 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响AbstractEffectsofMycobacteriumtuberculosisinfectiononviralreservoirsinHIVpatientsAbstractObjective:TostudytheeffectsofmycobacteriumtuberculosisinfectiononviralreservoirsinHIVpatients.Methods:Thirty-fivenon-opportunisticand30opportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectioninHIVpositivepatientswereretrospectivelystudiedinShanghaiPublicHealthCenterinthepast2years.Eventually25non-opportunisticand20opportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatientswererecruited,Excludinglostcases.Whole-bloodsamplesatbaselineandafter1yearofanti-virustreatmentwerestoredat-80°C.Statisticalanalysiswasperformedonthebaselineconditionsofpatientsenrolledinthestudy,includinggender,age,CD4,CD8,antiviralprogram,antiviralopportunity,HIVviralload,andanti-tuberculosisprogram.Tripletherapywithtenofovirdisoproxilfumarate,lamivudineandefavirenz/nevirapinewasfirst-lineantiviraltherapies.Theanti-tuberculosistreatmentregimencontainedisoniazid,rifampicin/rifabutin,ethambutolandpyrazinamid.Atleast2weeksaftertheinitiationofanti-tuberculosistreatment,antiviraltreatmentwouldbestarted,andantiviraltreatmentfor1year.QuantitativedetectionofHIVDNA(genotype-1)inthewholebloodbyfluorescentprobereal-timePCR.ComparedthesizeofHIV-1reservoirsinnon-opportunisticandopportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatientsatbaselineandafteroneyearofantiviraltherapy.AnalyzedtheeffectofmycobacteriumtuberculosisinfectionontheHIVvirusreservoirs.Results:1)ThebaselineCD4andCD8werestatisticallydifferentbetweenthetwogroups.TheCD4ofnon-opportunisticandopportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatientswere260.90±149.44cells/ul,and61.85±65.05cells/ulrespectively(P=0.000).TheCD8ofnon-opportunisticandopportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatientswere772.80±427.17cells/ul,and425.30±269.13cells/ulrespectively(P=0.001).2)TheHIV-1DNAofnon-opportunisticandopportunisticmycobacteriumV Abstract结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响tuberculosisinfectionpatientswere2.594±0.5176logcopies/106cells,and3.410±0.4344logcopies/106cellsatbaseline,respectively(P＜0.001).3)ThebaselineHIV-1DNAofnon-opportunisticinfectionpatientswere2.594±0.5176logcopies/106cells,and1.956±0.5951logcopies/106cells,afteroneyearofantiviraltherapy,respectively,(P<0.0001).4)ThebaselineHIV-1DNAofopportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatientswere3.410±0.4344logcopies/106cells,and2.974±0.4847logcopies/106cellsafteroneyearofantiviraltherapy,respectively(p=0.0161).5)Comparedtothebaseline，oneyearafterantiviraltreatment,thevirusreservoirdecreasedby10%~20%and-20%~20%inthenon-opportunisticandopportunisticmycobacteriumtuberculosisinfectionpatients,respectively(P=0.0150).Conclusion:Atbaseline,mycobacteriumtuberculosisinfectionleadstoanincreaseinHIVvirusreservoirs.ThereisacorrelationbetweenMycobacteriumtuberculosisinfectionandtheclearanceofviralreservoirsinHIVpatients.MycobacteriumtuberculosisinfectiondelaysthedeclineofviralreservoirsinHIVpatients.MycobacteriumtuberculosisinfectioninHIVpatientsaffectstheefficacyofantiviraltherapyandfunctionalhealingofHIV.【Keywords】：Mycobacteriumtuberculosisinfection，HIV-1，Viralreservoirs，AntiviraltreatmentWrittenby：ZouLeiSupervisedby：ProfessorZhaoWeifengProfessorLuHongzhouVI 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响目录引言···········································································································································1材料与方法··································································································································31.材料来源·························································································································32.方法·································································································································43.观察指标·························································································································74.数据统计·························································································································7结果···········································································································································8讨论·········································································································································11结论·········································································································································13参考文献····································································································································14综述·········································································································································16参考文献··························································································································18攻读学位期间公开发表的论文······························································································22中英文对照缩略词表···············································································································23致谢·········································································································································24 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响引言引言联合国艾滋病规划署发布，截至2016年全球约有3670万艾滋病感染者，2016年约有230万新发感染和160万艾滋病患者死亡，约1500万感染者服用抗逆转录病毒药物治疗[1]。艾滋病（AcquiredImuuneDeficiencySyndrome，AIDS）即获得性免疫缺陷综合症，是人类免疫缺陷病毒（HumanImuunodeficiencyVirus,HIV）所导致的慢性传染病。目前全球流行的主要是HIV-1，是一种属于感染人类免疫系统细胞的逆转录病毒科慢病毒属，主要侵犯和破坏人类辅助性T淋巴细胞，导致机体细胞免疫功能缺陷。艾滋病作为危害全人类生命健康的重大传染疾病，引起全世界范围内的高度重视。近年来，新型抗逆转录病毒治疗的迅速发展增加了对药物治疗方案的依从性，很好的控制了艾滋病病毒血症[2]，但由于HIV-1病毒储存库的存在，艾滋病病毒在人体仍持续存在，一旦中止HAART治疗，迅速会出现病毒学反弹[3-5]。HIV-1病毒储存库主要存在于静息CD4+T淋巴细胞中，亦可在于单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等[6-7],并主要以整合DNA形式持续存在[8]。潜伏感染的细胞并不被免疫系统或抗病毒治疗靶向，因此存在于静息记忆CD4+T细胞中的HIV-1病毒储存库被认为是HIV-1根除的主要障碍。HIV病毒储存库的清除影响了HIV的功能性治愈。当前定量检测病毒潜伏库的大小，对于抗病毒治疗疗效和功能性治愈的判定有着重要的指导意义。此外，结核病作为全世界十大死因之一，其危害性仅次于HIV/AIDS,截止2016年，全世界有1040万人患有结核病，170万人因该病死亡（包括40万合并艾滋病毒感染者）[9]。结核病是艾滋病毒携带者的头号杀手，是HIV感染者最常见的机会感染之一,是HIV感染者疾病进展的重要影响因素,也是艾滋病患者(包括已接受抗病毒治疗的患者)死亡的重要原因。2016年，艾滋病毒引起的死亡中40%由结核病导致。与未感染的个体相比，感染HIV-1的个体患结核病的可能性要高20〜30倍[10]。结核分枝杆菌感染（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）是引起人类结核病的主要病原体，人类普遍对HIV、Mtb易感，可以先后或同时感染，造成HIV与Mtb共感染。有研究表明HIV-1/Mtb共感染患者表现出HIV-1疾病加速进展和总体生存期缩短[11]。同时HIV感染可增加活动性结核的发病机率。活动性结核感染的风险从一生中约10％增加到共感染HIV-1的患者每年约10％[12]。HIV/Mtb共感染已成为全球及其紧1 引言结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响迫的社会公共卫生问题。HIV-1合并感染是进展为活动性结核病的唯一最大的危险因素，以及结核分枝杆菌合并感染加剧了病毒复制，可能促进HIV-1疾病进展。这种加速的疾病进展表明这两种病原体之间的相互作用。为了治愈HIV-1，当前正在开展包括基因治疗、骨髓移植、药物治疗以及免疫治疗等一些积极治疗方案。需要对HIV-1病毒储存库进行准确而敏感的衡量来测量这些研究的结果。然而目前对于HIV病毒储存库的定量检测尚无统一的标准[13-15]。目前常用的检测方法有病毒生长法和PCR方法。本文将使用实时荧光定量PCR来检测外周血中的HIV-1DNA来判定病毒储存库的大小。伴随着HIV感染者自身抵抗能力的下降，HIV患者成为结核分枝杆菌的易感人群，HIV合并结核分枝杆菌感染加剧了疾病病情进展，我们在评估抗病毒治疗过程中HIV病毒潜伏库动态变化的同时提出猜想，是否结核分枝杆菌影响了病毒储存库的变化，从而影响了抗病毒疗效以及HIV的功能性治愈。2 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响材料与方法材料与方法1.材料来源本文选取上海市公共卫生临床中心2015年2月-2017年3月收治的HIV患者，其中非机会性感染的HIV患者35例以及HIV患者中结核分枝杆菌感染者30例，剔除失访及疗效不佳者，最终入组非机会性感染的HIV患者25例以及HIV患者中结核分枝杆菌感染者20例；留取基线、抗病毒治疗后全血标本，-80℃保存；统计入组患者基线状况包括性别，年龄，基线CD4，抗病毒方案，抗结核方案，抗病毒时机，CD8，病毒载量等相关指标，其中抗病毒方案选用“替诺福韦酯+拉米夫定+依非韦仑/奈韦拉平”一线方案，抗结核方案选用“异烟肼+利福平/利福布汀+乙胺丁醇+吡嗪酰胺”方案，抗病毒时机在抗结核方案开始后至少2周，抗病毒治疗1年。入选患者符合以下标准：①均经HIV抗体蛋白印迹检测（WB）诊断阳性的HIV/AIDS确诊病例；②非机会性感染HIV组接受HAART治疗、合并Mtb组接受抗结核以及HAART治疗1年，所有患者经治疗后HIV-RNA检测低于20copy/ml；③HIV合并Mtb组诊断标准符合HIV合并结核分枝杆菌感染诊治专家共识[16]。排除标准：①非机会性感染HIV组排除其他合并感染；②HIV合并Mtb组排除合并除结核分枝杆菌以外的机会性感染；③入组标本经治疗后排除HIV-RNA检测高于20copy/ml。1.1实验材料名称公司PBS溶液（10×）PAA乙醇国药集团化学试剂有限公司细胞计数板Bio-RAD各种规格Tip头（10/200/1000ul）QSP(QualityScientificPlastics)冻存管ThermoSCIENTIFIC15ml离心管LabServ50ml离心管LabServ1.5mlEP管LabServ5mLEDTA抗凝采血管BD移液枪国药集团化学试剂有限公司3 材料与方法结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响1.2实验设备仪器公司型号离心机Hettich公司Rotina46高温灭菌锅日本TOMY公司SS-325二级生物安全柜海尔公司HAIERHR40-IIA2恒温水浴锅上海精宏实验仪器公司XMTD-82224℃冰箱海尔公司BCD-268WBCS-80℃冰箱海尔公司DW-86W626液氮罐STATEBOURNEBiorack6000振荡器常州菲普实验仪器厂SK-1移液器德国Eppendorf公司EppendorfResearch流式细胞仪BD公司LSRII细胞计数仪Bio-RADTC20显微镜Leitz公司Dialux20PCR检测仪美国ABI7500型实时荧光2.方法A.全血采集：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5~10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，存入-80℃冰箱保存；B.全血HIV-1DNA提取：采取QIAampDNABloodMiniKit试剂盒进行检测1）将20μlQIAGEN蛋白酶（或蛋白酶K）吸入1.5ml微量离心管的底部。2）向其中微量离心管中加入200μl全血样品。3）再向样品中加入200μlBufferAL，通过涡旋仪混合15秒。4）在56℃孵育10分钟。5）将1.5ml微量离心管简单地离心，以从盖子的内部除去液滴。6）向样品中加入200μl乙醇（96-100％），并通过脉冲涡旋仪再次混合15秒。混合后，短暂离心1.5ml微量离心管，以从盖子的内部除去液滴。7）小心地将步骤6的混合物施加到QIAampMini旋转柱（在2ml收集管中），4 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响材料与方法关闭盖子，并以6000xg（8000rpm）离心1分钟。将QIAampMini旋转柱放入干净的2ml收集管（提供）中，并丢弃含有滤液的试管。8）小心打开QIAampMini旋转柱，加入500μlBufferAW1，不要弄湿边缘。关闭盖子并以6000xg（8000rpm）离心1分钟。将QIAampMini旋转柱放置在干净的2ml收集管（提供）中，并丢弃含有滤液的收集管。9）小心打开QIAampMini旋转柱，加入500μlBufferAW2，关闭盖子并以全速（20,000xg;14,000rpm）离心3分钟。10）将QIAampMini旋转柱放入新的2ml收集管（未提供）中，并丢弃含有滤液的旧的收集管。以全速离心1分钟。此步骤有助于消除可能的携带BufferAW2的机会。11）将QIAampMini旋转柱放入干净的1.5ml微量离心管（未提供）中，弃去含有滤液的收集管。小心打开QIAampMini旋转柱，加入200μlBufferAE或蒸馏水。在室温（15-25°C）下孵育1min，然后离心6000×g（8000rpm）1分钟。C.采用PCR-荧光探针法检测HIV-1病毒储存库大小（全血HIV-1DNA检测）：运用广州海力特生物科技有限公司生产的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）DNA定量检测试剂盒进行检测。（1）检测原理：用HIV特异性引物和HIV特异性探针（Taqman探针），配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法定量检测HIV-1DNA。本试剂盒设置了内标和细胞定量体系融合，用于控制假阴性及定量样本中所含细胞或人类基因组数量。本试剂盒设置了dUTP/UDG反应体系，PCR扩增时37℃预处理，利用UDG酶将可能存在的PCR产物污染充分降解，排除假阳性结果。（2）主要组成部分：HIVDNAPCR反应液酶系、HIVDNA定量参考品1、HIVDNA弱阳性质控品、HIVDNA强阳性质控品、HIVDNA阴性质控品、参考品稀释液。（3）适用仪器：ABI7500荧光PCR检测仪。（4）检验方法：Ⅰ.HIVDNA提取：使用QIAampDNABloodMiniKit，提取HIVDNA弱阳性质控品、HIVDNA强阳性质控品、HIVDNA阴性质控品及临床标本基因组DNA。5 材料与方法结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响Ⅱ.PCR扩增：1）试剂准备：取出HIVDNAPCR反应液、酶系，室温溶解后，瞬时离心；按比例（HIVDNAPCR反应液44.2μL/测试+酶系0.8μL/测试）取相应的PCR反应液、酶系，充分均匀后按45μL/管分装至0.2mLPCR管或PCR反应板，备用。2）HIVDNA定量参考品稀释：将HIVDNA定量参考品1用参考品稀释液10倍梯度稀释（推荐：1μL定量参考品+9μL参考品稀释液），分别标记为HIVDNA定量参考品2-4。3）加样：向准备好试剂的0.2mLPCR管或PCR反应板中分别加入5μL的样品（待测标本、HIVDNA定量参考品1-4、HIVDNA强阳性参考品、HIVDNA弱阳性参考品及HIVDNA阴性质控品）。盖好薄壁盖或PCR反应板膜，1000rpm离心2min，立即进行PCR扩增反应。4）反应管置于荧光定量PCR仪上，设置循环参数：Stage1：37°C×5min；95°C×10min；Stage2：95°C×15s，65°C×15s，72°C×20s，循环5次；Stage3：95°C×15s，62°C×15s，72°C×20s，循环10次；Stage4：95°C×15s，52°C×15s，72°C×32s(荧光采集)，循环40次荧光通道检测选择：HIVDNA检测选择FAM通道，细胞定量检测选择VIC通道。Ⅲ.结果分析反应结束后自动保存结果，对HIVDNA的曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold的Value值，点击Analyze进行分析，使StdCurve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0-0.98。然后到Plate窗口下记录定量结果。细胞中HIVDNA含量结果计算：同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIVDNA定量值（单位：copies/μL）除以细胞定量结果（单位：cells/μL），再乘以106得出标本中每106个细胞中HIVDNA含量（单位：copies/106cells）。Ⅳ.质量控制：1）HIVDNA阴性质控品：HIVDNA扩增曲线无CT值显示；2）HIVDNA弱阳性参考品：检测值介于50-5000copies/106cells；3）HIVDNA强阳性参考品：检测值介于104-105copies/106cells；（4）HIVDNA定量参考品（FAM通道和VIC通道）的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98≤｜r｜≤1。（5）阳性判断值或者参考区间：定量范围是100-106copies/106cells。6 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响材料与方法3.观察指标采用基因组提取，双重定量PCR检测，比较非机会性感染HIV组与HIV合并结核分枝杆菌组基线病毒储存库大小变化；比较抗病毒治疗1年前后非机会性感染HIV组以及HIV合并结核分枝感染组中病毒潜伏库各自大小动态变化；比较抗病毒治疗1年后结核分枝杆菌感染对HIV潜伏库的影响。4.数据统计所有数据的统计分析GraphpadPrism5统计软件，其中计量资料的统计学描述使用XS，计量资料不同组间的差异性比较使用非参数检验，当P<0.05时表示差异具有统计学意义。7 结果结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响结果本研究回顾性分析25例非机会性感染HIV组（A组）与20例HIV合并MTB组（B组）抗病毒治疗后病毒储存库较基线变化。1.基本情况与基线水平非机会性感染HIV组男性23例，女性2例；平均年龄37.80±10.80岁；HIV合并MTB组男性19例，女性1例，平均年龄41.05±11.83岁。A组与B组年龄无统计学差异（P>0.05）。A组、B组基线CD4平均值分别为：260.90±149.44、61.85±65.05(cells/ul)，两组有统计学差异，P<0.05；A组、B组基线CD8平均值分别为：772.80±427.17、425.30±269.13(cells/ul)，两组有统计学差异，P<0.05。（表1）表1：患者基本情况及临床相关指标非机会性感染HIV组HIV合并MTB组基线P值（A组）XS（B组）XS年龄(岁)37.80±10.8041.05±11.830.272CD4(cells/ul)260.90±149.4461.85±65.050.000CD8(cells/ul)772.80±427.17425.30±269.130.0012.HIV-1DNA测定：非机会性感染HIV组基线HIV-1DNA平均值为2.594±0.5176logcopies/106cells，抗病毒治疗1年后HIV-1DNA平均值为1.956±0.5951logcopies/106cells；HIV合并结核分枝杆菌感染组基线HIV-1DNA平均值为3.410±0.4344logcopies/106cells，抗病毒治疗1年后HIV-1DNA平均值为2.974±0.4847logcopies/106cells。（表2）表2：A组、B组治疗前后HIV-1DNA大小测定基线HIV-1DNA治疗后HIV-1DNA组别XS(logcopies/106cells)XS(logcopies/106cells)非机会性感染HIV组（A2.594±0.51761.956±0.5951组）HIV合并MTB组3.410±0.43442.974±0.4847（B组）8 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响结果3.HIV-DNA定量检测标准曲线PCR仪运行分析过程图1.标准曲线4.病毒储存库动态变化经GraphpadPrism5统计分析，本研究结果提示：1）两组病毒储存库基线：非机会性感染HIV组与HIV合并MTB组HIV-1DNA基线存在统计学差异，P值<0.0001（图2A）；2）经抗病毒治疗后，非机会性感染HIV组HIV-1DNA较治疗前明显下降，差别具有统计学意义，P值<0.0001（图2B）；3）经抗病毒联合抗MTB治疗后，HIV感染合并MTB组HIV-1DNA较治疗前下降，差别具有统计学意义，P值<0.05（图2C）。4）非机会性感染HIV组治疗后HIV-1DNA较基线变化范围为-20%~20%，HIV合并MTB组HIV-1DNA较基线变化范围为-10%~20%，两者下降幅度差别有统计学意义，P<0.05（图2D）。9 结果结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响图2：两组抗病毒治疗前后病毒储存库动态变化图2：A：两组病毒储存库基线；B：非机会性感染HIV组；C：HIV合并结核分枝杆菌；D：两组病毒储存库下降幅度比较10 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响讨论讨论HIV目前治疗的希望是实现功能性治愈，是指HIV感染者经抗病毒治疗后病情稳定，即使中断抗病毒治疗，不会出现HIV-RNA反弹，且机体免疫功能长期维持正常。由于HIV-1病毒储存库的存在，尚无法根除HIV，尽管许多研究试图实现功能性治愈，HIV储存库的存在是实现这一目标的主要障碍[17]。病毒储存库通常是指病毒潜伏在被感染的细胞中暂不复制，通过整合HIV-1DNA形式主要存在于静止记忆CD4+T细胞中，逃避宿主的免疫攻击，抗病毒治疗起不到根除作用。但当静息细胞再次遇到相关抗原和受细胞因子等刺激而活化时，可再次表达复制。WangND[18]等通过包括病毒血症、免疫系统和治疗策略的综合机制确定经治疗或未治疗的患者中HIV-1病毒储存库组成和发展，提出HIV-1病毒储存库大小及组成对临床治疗及疾病发展有着重要意义。HIV-1/Mtb共感染一方面HIV-1感染改变了结核分枝杆菌感染的进程，并大大增加了活动性结核病的风险，另一方面结核病同时也加剧了病毒复制，可能促进HIV-1疾病进展。研究发现在晚期艾滋病人中，结核分枝杆菌经常引起播散性肺外疾病和分枝杆菌血症[19-20]。活动性结核与血液和脑脊液中HIV-1病毒载量较高以及病毒准种的遗传异质性增加有关[21]。这些效应可能是由HIV-1在共同感染位点上复制增加所驱动[22-23]。另外，结核分枝杆菌合并感染可能有助于与HIV-1疾病进展有关的更高水平的系统免疫激活[24-25]。目前关于Mtb对潜伏HIV-1储存库影响的机制尚未被研究，Mtb与潜伏HIV-1感染细胞之间的相互作用仍然大部分不明确，有研究表明慢性Mtb感染可以驱动中央记忆型T细胞（CentralMemoryTcell,TCM）细胞的潜伏期逆转，这可能导致更高的病毒载量，增加的T细胞损失，从而导致T细胞耗竭，导致HIV患者高病毒血症水平[26]。EricaC.Larson等提出结核分枝杆菌可以驱动潜伏感染的T细胞中的HIV-1活化的可能[27]。对于HIV病毒储存库的定量检测目前主要有病毒生长法和PCR方法，病毒生长法也称极限生长法，优点在于能定量检测携带有复制潜伏病毒细胞最小数目，但不能区分细胞整合的原病毒和新近感染细胞未整合的HIV-1DNA。本文使用的PCR-荧光探针法来检测DNA，荧光定量PCR特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光11 讨论结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，由于增加了探针的识别步骤，因此检测特异性更高。目前国内外文献对于结核分枝感染对于HIV病毒储存库影响的研究甚少，我们的研究表明了非机会性感染HIV组经抗病毒治疗后病毒储存库呈明显下降趋势，艾滋病合并结核分枝杆菌组入组时血CD4、CD8减少，可能与结核患者加剧HIV进展，导致CD4、CD8下降过多有关，经抗病毒治疗后，病毒储存库亦呈下降趋势。但总体上经治疗后艾滋病合并结核分枝杆菌组病毒储存库下降趋势较非机会性感染HIV组下降较慢，我们从中得出结核分枝杆菌感染延缓了病毒储存库的下降，结核分枝杆菌感染与HIV患者病毒储存库的清除之间存在相关性。艾滋病合并结核分枝杆菌感染对病毒储存库具有一定的影响，影响了残余病毒血症的生产能力，加剧了疾病进展，影响了抗病毒治疗疗效以及HIV的功能性治愈。由于本次研究工作的样本量较少，而且患者随访时间有限，因此各研究程序、研究结果均存在着各种缺陷与不足，需要进一步的工作来充分描述分枝杆菌可能影响HIV-1潜伏期逆转的机制和途径。12 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响结论结论1.非机会性感染HIV组与HIV合并MTB组基线CD4、CD8存在差异，可能与结核患者加剧HIV进展，导致CD4、CD8下降过多有关。2.非机会性感染HIV组与HIV合MTB组病毒储存库基线存在差异；3.抗病毒治疗后非机会性感染HIV组与HIV合并结核分枝感染组病毒储存均下降；4.抗病毒治疗后非机会性感染HIV组病毒储存库相比较艾滋病合并MTB组病毒储存库下降趋势较快，提示了HIV患者中结核分枝杆菌感染减缓了病毒储存库的下降，影响了抗病毒治疗的疗效以及HIV的功能性治愈，加剧了疾病进展。13 参考文献结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响参考文献[1]HO.WHOFactSheet211;GlobalHIVSituation.Geneva:WHO(2016).SwartzJE,VandekerckhoveL,AmmerlaanH,deVriesAC,[2]BegovacJ,BiermanWF,etal.Efficacyoftenofovirandefavirenzincombinationwithlamivudineoremtricitabineinantiretroviral‑naivepatientsinEurope.JAntim.[3]EiseleE，SilicianoRF.RedefiningtheviralreservoirsthatpreventHIV-1eradication[J].Immunity，2012，37（3）:377-388.[4]TyagiM，BukrinskyM.Humanimmunodeficiencyvirus（HIV）latency:themajorhurdleinHIVeradication[J].MolMed，2012，18:1096-1108.[5]ChunTW，JustementJS，MurrayD，etal.ReboundofplasmaviremiafollowingcessationofantiretroviraltherapydespiteprofoundlylowlevelsofHIVreservoir:implicationsforeradication[J].AIDS，2010，24（18）:2803-2808.[6]EiseleE，SilicianoRF.RedefiningtheviralreservoirsthatpreventHIV-1eradication[J].Immunity，2012，37（3）:377-388.[7]KumarA，AbbasW，HerbeinG.HIV-1latencyinmonocytes/macrophages[J].Viruses，2014，6（4）:1837-1860.[8]CasabiancaA,OrlandiC,CanovariB,ScottiM,AcetosoM,ValentiniM,etal.ArealtimePCRplatformforthesimultaneousquantificationoftotalandextrachromosomalHIVDNAformsinbloodofHIV‑1infectedpatients.PLoSOne2014;9:e111919.[9]WHO2017:Globaltuberculosisreport2017.[10]LawnSD,ZumlaAI.Tuberculosis.Lancet.2011;378(9785):57–72.[11]WhalenC,HorsburghCR,HomD,etal.J.Acceleratedcourseofhumanimmunodeficiencyvirusinfectionaftertuberculosis.AmJRespirCritCareMed.1995;151(1):129-35.Epub1995/01/01.[12]KwanCK,ErnstJD.HIVandtuberculosis:adeadlyhumansyndemic.ClinMicrobiolRev.2011;24(2):351-76.[13]EbinaH,MisawaN,KanemuraY,KoyanagiY.HarnessingtheCRISPR/Cas9systemtodisruptlatentHIV-1provirus.SciRep.2013;3:2510.[14]ArchinNM,LibertyAL,KashubaAD,etal.AdministrationofvorinostatdisruptsHIV-1latencyinpatientsonantiretroviraltherapy.Nature.2012;487(7408):482–5.14 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响参考文献[15]ElliottJH,WightmanF,SolomonA,etal.ActivationofHIVtranscriptionwithshort-coursevorinostatinHIV-infectedpatientsonsuppressiveantiretroviraltherapy.PLoSPathog.2014;10(10):e1004473.[16]李太生，卢洪洲，HIV合并结核分枝杆菌感染诊治专家共识[J].高等理科教育，2017，10（2）:81-90.[17]KimataJT,RiceAP,WangJ.ChallengesandstrategiesfortheeradicationoftheHIVreservoir.CurrOpinImmunol2016;42:65‑70.[18]WangND，LiTS.FactorsAssociatedwiththeSizeofHIV-DNAReservoir.Chin.Med.J2017;130:224-30.[19]Naing,C.,Mak,J.W.,Maung,M.,Wong,S.F.&Kassim,A.I.B.M.Meta-analysis:theassociationbetweenHIVinfectionandextrapulmonarytuberculosis.Lung191,27–34(2013).[20]Gilks,C.F.etal.ExtrapulmonaryanddisseminatedtuberculosisinHIV-1-seropositivepatientspresentingtotheacutemedicalservicesinNairobi.AIDS4,981–985(1990).[21]Collins,K.R.etal.Humanimmunodeficiencyvirustype1(HIV-1)quasispeciesatthesitesofMycobacteriumtuberculosisinfectioncontributetosystemicHIV-1heterogeneity.J.Virol.76,1697–1706(2002).[22]Lawn,S.D.etal.Anatomicallycompartmentalizedhumanimmuno-deficiencyvirusreplicationinHLA-DR+cellsandCD14+macrophagesatthesiteofpleuraltuberculosiscoinfection.J.Infect.Dis.184,1127–1133(2001).[23]Nakata,K.etal.Mycobacteriumtuberculosisenhanceshumanimmuno-deficiencyvirus-1replicationinthelung.Am.J.Respir.Crit.CareMed.155,996–1003(1997).[24]Toossi,Z.etal.SystemicimmuneactivationandmicrobialtranslocationindualHIV/tuberculosis-infectedsubjects.J.Infect.Dis.207,1841–1849(2013).[25]Whalen,C.etal.Acceleratedcourseofhumanimmunodeficiencyvirusinfectionaftertuberculosis.Am.J.Respir.Crit.CareMed.151,129–135(1995).[26]NovisCL,ArchinNM,BuzonMJ,VerdinE,RoundJL,LichterfeldM,etal.ReactivationoflatentHIV-1incentralmemoryCD4(+)TcellsthroughTLR-1/2stimulation.Retrovirology.2013;10:119.[27]LarsonEC,NovisCL,MartinsLJ,MacedoAB,KimballKE,BosqueA,etal.(2017)MycobacteriumtuberculosisreactivateslatentHIV-1inTcellsinvitro.PLoSONE12(9):e018516215 综述结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响综述根除HIV-1病毒储存库的研究进展摘要：HIV-1患者接受联合抗反转录病毒疗法可有效降低HIV病毒血症，延长患者生存期及降低病死率，但由于潜伏在静息记忆CD4+T细胞中的HIV-1病毒储存库无法被根除，故目前认为HIV-1病毒储存库的存在是HIV-1功能性治愈的主要障碍。需要新的策略来根除HIV-1病毒储存库。近年来一些研究提出“shockandkill”策略来逆转艾滋病毒潜伏期和启动病毒翻译活动，目的是进行抗反转录病毒治疗和引发的免疫应答，根除有生产力的感染细胞的同时防止重新感染。本文将介绍关于艾滋病治疗的观点和正在采取的根除病毒储存库的新方法。关键词：HIV-1，联合抗反转录病毒，病毒储存库，CD4+T细胞联合国艾滋病规划署发布，截至2016年全球约有3670万艾滋病感染者，2016年约有230万新发感染和160万艾滋病患者死亡[1]。联合抗反转录病毒疗法（cART）不能根除HIV-1病毒储存库，患者需要终生治疗，一旦患者停止治疗，HIV-1病毒会反弹致病情复发。HIV-1病毒一经感染，携带有转录失活的整合前病毒DNA的潜伏感染细胞的一个亚群便迅速建立[2，3]。这些细胞是在抗病毒治疗下HIV-1持续存在的主要来源。因此，成为艾滋病治愈的主要障碍[4-6]。长期抗病毒治疗带来的高额费用以及可能出现的耐药株，加上缺乏一种有效的预防性疫苗，迫切需要一种新的策略来控制HIV-1感染。一、HIV-1病毒储存库建立当HIV-1感染完全或部分激活的CD4+T细胞，其后恢复到静息记忆状态，作为正常生理过程的一部分，遇到同源抗原后，HIV-1病毒储存库可能建立[7，8]。HIV-1病毒储存库主要存在于静息CD4+T淋巴细胞中，亦可在于巨噬细胞、中枢神经系统等[9，10]。同时主要以整合DNA形式持续存在。研究表明潜伏感染的细胞衰减十分缓慢，半衰期为44个月，若通过抗病毒治疗，大约需要60年以上[11]。HIV-1病毒储存库在急性感染期即已形成，早期抗病毒治疗并不能阻止其形成[12]。联合抗反转录病毒疗法是一种终生的治疗方案，中断易致病毒快速复发。然而，有研究表明，早期抗病毒治疗可以减少病毒储存库的大小，并可能促进“功能治愈”，其中病毒血症是由未知的免16 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响综述疫过程所控制[13]。静息记忆CD4+T细胞对病毒基因的表达很大程度上是不允许的，病毒基因组作为一种整合的病毒不会被活跃转录[14]。鉴于此，潜伏感染的细胞不被免疫系统或抗病毒治疗靶向。存在于静息记忆CD4+T细胞中的HIV-1病毒储存库被认为是HIV-1根除的主要障碍。二、HIV-1病毒储存库的清除近年来关于HIV-1病毒储存库清除策略主要包括：IFN联合HAART治疗，活化静息的HIV感染细胞，如通过组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDAC抑制剂）、BET家族抑制剂、PKC/NF-κB通路调节剂PKC/NF-κB通路调节剂等“ShockandKill”疗法;通过广谱中和抗体、免疫毒素或其他免疫疗法杀灭HIV潜伏感染细胞；编辑基因诱导细胞产生HIV抗性，如通过编辑疗法消除CC趋化因子受体5（CCR5）辅助受体[15]。其中最有希望的策略涉及“shockandkill”的方法，利用药物诱导“shock”和具有传染性的艾滋病病毒在储存库的转录活动，从而使其能够通过免疫或治疗机制进行检测和消除。研究表明，大部分艾滋病毒整合在主动转录的宿主基因的内含子之内，并且发现了HIV-1病毒储存库主要存在于静息CD4+T细胞内。HIV治疗的中心是逆转拥有复制能力的前病毒的静息CD4+T细胞的潜伏期[16]，但与此同时，“清除”治疗策略的一个主要挑战是减少病毒而不引起全部T细胞活化[[17]。诱发HIV病毒血症或至少病毒蛋白的细胞表面表达和病毒抗原呈递的能力，是免疫介导杀死潜伏感染的细胞的基本要求，从而确定潜伏性反转剂（LRAs）在根除策略中成为关键目标[18]。这些药物包括组蛋白甲基转移酶抑制剂和组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACi）[19]。HDACi在体外具有促进整合前病毒启动子的组蛋白乙酰化能力[20]。有证据表明某些HDACis可能通过抑制细胞因子释放来抑制免疫应答，延迟杀死活化的感染CD4+T细胞，细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能受损和NK细胞凋亡[21]。此外，某些HDACis对B细胞具有免疫调节作用并抑制原发生发中心反应[22]。考虑到HDACi是非特异性T细胞活化剂，这理论上可以导致感染细胞的繁殖。新的和改进的LRAs对于病毒储存库的根除和治疗是必要的。传播艾滋病毒感染导致招募并激活CD4和CD8T细胞，认为抗病毒T细胞应答尽管能够发挥一定程度的病毒血症控制，但同时也促进了HIV感染。因此，在急性感染时，排除任何可能激活免疫反应的混杂性传播疾病，可以使抗HIVCD4T细胞反应合理化，将比T细胞受体（TCR）富集更多具有其他抗原特异性，从而成为延迟17 综述结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响建立的候选目标。研究表明，艾滋病病毒感染者血液中的大部分潜伏感染细胞似乎表达了对HIV肽特异性的TCRs,但不能控制抗原。此外，非特异性TCR激活剂如CD3/CD28将导致HIV感染的CD4T细胞重新生产RNA病毒[23,24]。总而言之，这些涉及T细胞活化途径这对于实现延迟反转非常重要。此外，抗原呈递细胞（APCs）如树突状细胞（DCs）显示诱导接触依赖性潜伏期反转[25，26]。Joshua[27]等对HIV急性感染期间接受治疗的志愿者的外周血单个核细胞（PBMCs）进行了延迟反转研究,构建了一个多价病毒样颗粒（VLP）从被感染的个体中分离出HIV-RNA并用作延迟反转激活矢量（ACT-VEC）。ACT-VEC当用于脉冲DCs与HIV感染共培养CD4+T细胞，将导致HIVRNA的显著转录。未来对ACT-VEC的潜在递送和辅助策略的研究，将使我们能够了解ACT-VEC是否可以作为免疫启动策略来促进治疗的“kill”成分[28]。三、结语无论是经治或是未治疗的HIV-1患者病毒储存库的大小和组成是通过包含病毒特征的综合机制，免疫系统和治疗策略来确定。在长期病毒抑制期间，缺乏强调的特异性CD4+T细胞反应来清除循环血液细胞和组织中的残留储存库，意味着HIV-1病毒储存库仍然是一颗定时炸弹[29,30]。残留病毒血症的随机激活储存库充当了导火线，不断刺激着免疫系统来维持激活的微环境，因为一旦抗病毒治疗停止，病毒感染反弹[31,32]。一个优化的策略应该是通过抗反转录病毒药物，特异性免疫和潜伏激活剂的联合。虽然ACT-VEC作为临床相关药理学的发展有明确的方法，它代表了“shockandkill”治疗的一个有前途的候选。这需要投入巨大的努力和资本来投入到预防性疫苗的创造中。因此，HIV功能治愈的前景曾经被认为不可能，现在认为是可行的。参考文献[1]WHO.WHOFactSheet211;GlobalHIVSituation.Geneva:WHO(2016).[2]EiseleE,SilicianoRF.RedefiningtheviralreservoirsthatpreventHIV-1eradication.Immunity(2012)37(3):377–88.[3]Barré-SinoussiF,RossAL,DelfraissyJ-F.Past,presentandfuture:30yearsofHIVresearch.NatRevMicrobiol(2013)11(12):877–83.[4]DeeksSG,AutranB,BerkhoutB,etal.TowardsanHIVcure:aglobalscientificstrategy.NatRevImmunol(2012)12(8):607–14.[5]LewinSR,DeeksSG,Barré-SinoussiF.TowardsacureforHIV-arewemaking18 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结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响综述[31]BaileyJR,SedaghatAR,KiefferT,etal.Residualhumanimmunodeficiencyvirustype1viremiainsomepatientsonantiretroviraltherapyisdominatedbyasmallnumberofinvariantclonesrarelyfoundincirculatingCD4+Tcells.JVirol2006;80:6441‑57.[32]PaceMJ,GrafEH,AgostoLM,MexasAM,MaleF,BradyT,etal.DirectlyinfectedrestingCD4+TcellscanproduceHIVGagwithoutspreadinginfectioninamodelofHIVlatency.PLoSPathog2012;8:e1002818.21 攻读学位期间公开发表的论文结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响攻读学位期间公开发表的论文1.邹磊洛赛克、奥曲肽和立止血联合治疗肝硬化并上消化道大出血42例[J].中国现代药物应用,2016，10(15):127-128.2.邹磊注射用核糖核酸联合恩替卡韦治疗乙肝肝硬化60例[J].中国实用医药，2016,11（27）：202-203.22 结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响中英文对照缩略词表中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称HIV-1Humanimmunodeficiencyvirrus艾滋病毒1型MycobacteriumtuberculosisMTB结核分枝杆菌Highlyactiveanti-retroviraltherapyHAART高效抗逆转录病毒疗法PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应Combinedanti-retroviraltherapycART联合抗反转录病毒疗法TCRTcellreceptorT细胞受体APCAntigenpresentingcell抗原递呈细胞PBMCPeripheralbloodmononuclearcells外周血单个核细胞INFinterferon干扰素WBWesternblot免疫印迹LRAsLatentreverseagent潜伏性反转剂23 致谢结核分枝杆菌感染对HIV患者病毒储存库的影响致谢白驹过隙，岁月如梭，充实而又短暂的研究生生涯很快就结束了。在这三年的学习中，感谢各位老师对我的指导与帮助，我的内心充满了感激，即使毕业的脚步已经临近，但三年来经历的每一份关怀，每一份收获我都会铭记于心，这将激励我不断进步，不断成长，不断前行。首先我要特别感谢的是我的指导老师赵卫峰教授,感谢赵老师严谨的科研作风，对我的指导与帮助，对我论文选题、实验设计、实验方案以及撰稿阶段都给予了很好的建议与指导、并进行了修改、完善，使得我的毕业论文成稿。其次我要感谢上海公共卫生中心的卢洪洲老师、陈军老师、齐唐凯老师、荀静娜老师等，感谢他们为我提供了实验场所、实验设备、以及实验过程中对我的指导。感谢苏大许华宇等同学的热情帮助，指点了我对论文格式规范化调整，论文写作注意事项、以及苏大论文答辩程序，在他们的关心与支持下，使得我顺利提交毕业论文、完成硕士阶段的学习。我还要感谢我的家人，他们一直在背后无条件地支持我，为我付出，解决我的后顾之忧，让我可以全身心投入到科研工作中。最后，我要衷心感谢各位评审专家不辞辛劳参加我的论文答辩，对我的论文进行评阅，他们的点评让我获益良多，为我今后的学习指明了方向。24 苏州大学同等学力人员硕士学位论文（学术学位）苏州大学研究生院统一印制
