菊芋来源菊糖对正常大鼠和糖尿病大鼠糖代谢影响研究

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分类号学号151135ＵＤＣ密级公开军事科学院硕士学位论文菊芋来源菊糖对正常大鼠和糖尿病大鼠糖代谢影响研究EffectofInulinonGlucoseMetabolisminNormalRatsandDiabeticRats作者姓名郭臻学科专业药理学指导教师窦桂芳研究员答辩主席史爱欣教授学位授予单位军事科学院论文提交日期2018年6月1日 ＩＩ原銀性声魃本人声明所呈交的学生掩夫足本人在尋り〒指早下邊行的研究工作新取得的研究成果。尽我所夫口,除了文中特ガ1か以林注和致堀的地方外,港文中不包含其他人已笙友表禾口撰写量的研究成果,也不包合力荻得軍事科学院或其他教育机柏的学位或江牟而使用址的材料。有我一同工作的同恙対本研究所倣的任何貢献均己在沿文中作了明晩的説明井表示拗意。学位介文題目:菊芋来源菊施対正常大限和糖丞重大鼠糖代切1影泊研究_学位沿文作者答銘:罐幹脅秦日期:)ο19年ゝ賓2oヨ学位稔文版紋使用授杖事本人完全了解写事科学院有夫保留、使用学位介夫的規定=三ヽ:子1三写■_学院可以保留井向国家有美部日或机杓ミ交沿文的隻じ口件孝口屯子文til二「士二被査岡和借岡;可以杵学位港文的全部或部分内容編入有夫数据庫逹行i言可以釆用影F口、縮或掏描等夏告1手段保存、,E名学生港文。`「(保密学位沿文在解密后造用本授杖牟)学位奇文題目:菊芋来源菊糖対正常大気利精尿病大氣糖代球影噛研究学位盗文作者答名:う}珍本曰期:2oS年ゝ月らο日作者指早教り雨答名:__1ゴ――――曰期:、■月3θロ″罷≠|―"`年 军事科学院硕士学位论文目录原创性声明................................................................................................ii学位论文版权使用授权书.........................................................................................ii摘要...................................................................................................................IXAbstract..................................................................................................................XI前言....................................................................................................................1第一章菊芋中菊糖质量控制研究..........................................................................3一、菊糖中重金属元素含量检测.............................................................................31实验目的..............................................................................................................32实验材料..............................................................................................................32.1药品与试剂...............................................................................................32.2仪器...........................................................................................................33实验方法..............................................................................................................33.1实验原理...................................................................................................43.2硝酸溶液的配制.......................................................................................43.3五种元素混合标准曲线的制备...............................................................43.4样品前处理...............................................................................................43.5仪器参数...................................................................................................43.6数据处理与分析.......................................................................................54实验结果..............................................................................................................54.1五种重金属元素标准曲线.......................................................................54.2菊糖中五种重金属元素含量测定结果...................................................65讨论......................................................................................................................66结论......................................................................................................................7二、菊芋菊糖中非法添加降糖药物检测..................................................................81实验目的..............................................................................................................82实验材料..............................................................................................................82.1药品与试剂...............................................................................................82.2仪器...........................................................................................................83实验方法..............................................................................................................8第I页 军事科学院硕士学位论文3.1实验原理...................................................................................................93.2样品前处理...............................................................................................93.3色谱条件...................................................................................................93.4质谱条件...................................................................................................93.5数据处理和分析.....................................................................................104实验结果............................................................................................................105讨论....................................................................................................................126结论....................................................................................................................12三、菊芋菊糖含量检测.........................................................................................131实验目的............................................................................................................132实验材料............................................................................................................132.1药品与试剂.............................................................................................132.2仪器.........................................................................................................133实验方法............................................................................................................133.1实验原理.................................................................................................133.2溶液的配制.............................................................................................143.3苯酚-硫酸法测定波长的选择................................................................143.3总糖含量测定.........................................................................................143.4还原糖含量测定.....................................................................................153.5数据处理和分析.....................................................................................154实验结果............................................................................................................154.1总糖波长选择.........................................................................................154.2苯酚-硫酸法总糖标准曲线绘制............................................................164.3DNS法还原糖标准曲线绘制.................................................................164.4菊糖中总糖和还原糖含量测定.............................................................174.5菊糖含量测定.........................................................................................175讨论....................................................................................................................176结论....................................................................................................................18四、菊芋菊糖分子量测定......................................................................................191实验目的............................................................................................................192实验材料............................................................................................................192.1药品与试剂.............................................................................................192.2仪器.........................................................................................................193实验方法............................................................................................................19第II页 军事科学院硕士学位论文3.1实验原理.................................................................................................193.2仪器条件.................................................................................................193.3标准曲线绘制.........................................................................................203.4菊糖样品分子量测定.............................................................................204实验结果............................................................................................................204.1右旋糖酐标准曲线绘制.........................................................................204.1三种不同来源菊糖样品分子量测定.....................................................215讨论....................................................................................................................226结论....................................................................................................................23第二章菊芋菊糖对正常大鼠糖代谢影响的研究..................................................24一、正常大鼠灌胃菊糖后血糖等指标变化.............................................................241实验目的............................................................................................................242实验材料............................................................................................................242.1药品与试剂.............................................................................................242.2仪器.........................................................................................................242.3实验动物.................................................................................................243实验方法............................................................................................................253.1实验原理.................................................................................................253.2实验分组.................................................................................................253.3体重及空腹血糖监测.............................................................................253.4摄食量监测.............................................................................................253.5数据处理和分析.....................................................................................254实验结果............................................................................................................264.1不同剂量菊糖对大鼠体重的影响.........................................................264.2不同剂量菊糖对大鼠空腹血糖的影响.................................................274.3不同剂量菊糖对大鼠摄食量的影响.....................................................275讨论....................................................................................................................286结论....................................................................................................................29二、单次和长期给菊糖对正常大鼠糖耐量的影响..................................................301实验目的............................................................................................................302实验材料............................................................................................................302.1药品与试剂.............................................................................................302.2仪器.........................................................................................................30第III页 军事科学院硕士学位论文2.3实验动物.................................................................................................303实验方法............................................................................................................303.1实验原理.................................................................................................303.2实验分组.................................................................................................313.3单次给药口服糖耐量实验.....................................................................313.4长期给药口服糖耐量实验.....................................................................313.5胰岛素反应.............................................................................................313.6数据处理和分析.....................................................................................314实验结果............................................................................................................324.1单次给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响.................................................324.2长期给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响.................................................335讨论....................................................................................................................346结论....................................................................................................................35第三章菊芋菊糖对糖尿病模型大鼠的降糖作用研究...........................................361实验目的............................................................................................................362实验材料............................................................................................................362.1药品与试剂.............................................................................................362.2仪器.........................................................................................................362.3实验动物.................................................................................................363实验方法............................................................................................................373.1实验原理.................................................................................................373.2试剂的配制...........................................................................................373.3糖尿病大鼠模型建立...........................................................................373.4实验分组.................................................................................................383.5血糖监测.................................................................................................383.6体重监测.................................................................................................383.7胰岛素测定.............................................................................................383.8统计学分析.............................................................................................384实验结果............................................................................................................384.1糖尿病大鼠模型建立.............................................................................384.2菊糖对糖尿病大鼠空腹血糖的影响.....................................................394.3菊糖对糖尿病大鼠体重的影响.............................................................414.4菊糖对糖尿病大鼠胰岛素分泌的影响.................................................425讨论....................................................................................................................42第IV页 军事科学院硕士学位论文6结论....................................................................................................................43第四章结论与展望.............................................................................................45参考文献...............................................................................................................46作者在学期间取得的学术成果...............................................................................50主要简历...............................................................................................................64致谢..................................................................................................................65第V页 军事科学院硕士学位论文表目录表1-1ICP-MS工作参数................................................................................................5表1-2三种不同来源菊糖中重金属元素含量测定结果..............................................6表1-3流动相梯度洗脱程序..........................................................................................9表1-414种化学药物监测离子对及质谱参数............................................................10表1-5三种菊糖中总糖含量........................................................................................17表1-6三种菊糖中还原糖含量....................................................................................17表1-7标准品分子量及出峰时间................................................................................20表2-1菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对体重的影响........................................26表2-2菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对空腹血糖的影响................................27表3-1基础、给菊糖前以及给菊糖后大鼠血糖值(X±SD，n=14).........................40表3-2给菊糖前及给菊糖后大鼠体重值变化(X±SD，n=14).................................42表3-3给菊糖后大鼠胰岛素水平................................................................................42第VI页 军事科学院硕士学位论文图目录图1菊糖的分子结构.....................................................................................................2图1-15种重金属元素标准曲线....................................................................................6图1-214种化学药物出峰图........................................................................................12图1-3D-果糖标准品紫外全扫描图.............................................................................15图1-4苯酚-硫酸法绘制D-果糖标准曲线.................................................................16图1-5DNS法绘制D-果糖标准曲线...........................................................................17图1-6分子量标准曲线................................................................................................21图1-7三种菊糖分子量出峰时间................................................................................22图2-1菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后体重增长值的变化................................27图2-2菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对摄食量的影响....................................28图2-3单次给菊糖对正常大鼠口服糖耐量的影响....................................................32图2-4单次给菊糖对胰岛素反应的影响....................................................................33图2-5长期给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响............................................................34图2-6长期给菊糖对胰岛素反应的影响....................................................................34图3-1不同剂量链尿佐菌素造模后大鼠血糖水平....................................................39图3-2各组大鼠基础血糖值水平................................................................................40图3-3各组给菊糖前血糖值水平................................................................................41图3-4各组给菊糖4周后血糖值水平........................................................................41第VII页 军事科学院硕士学位论文缩略语表缩写英文全称中文全称DMDiabetesmellitus糖尿病DNSDinitrosalicylicAcid二硝基水杨酸法DPDegreeofpolymerization聚合度GCGaschromatography气相色谱法HbA1cGlycatedhemoglobin糖化血红蛋白HPGFCHighperformancegelfiltration高效凝胶过滤色谱chromatographyHPLCHighperformanceliquid高效液相色谱法chromatographyHPLC-MS/MSHighperformanceliquid高效液相色谱-串Chromatography-tandemmass联质谱spectrometryICP-MSInductivelycoupledplasmamass电感耦合等离子体spectrometry质谱RTRetentiontime保留时间STZStreptozocin链尿佐菌素第VIII页 军事科学院硕士学位论文摘要糖尿病是由遗传和环境因素共同引起的一组以糖代谢紊乱为主要表现的临床综合征，病因复杂，至今人类尚未彻底了解糖尿病的发生过程。目前糖尿病治疗方式虽然在不断增加，但都还存在一定局限性，糖尿病患者的生活质量和寿命仍面临严重威胁。而近几年，微生态分子技术的发展使得人们对肠道菌群研究更为深入，提出肠道微生物将作为糖尿病治疗的新靶点。肠道菌群平衡状态与人体健康密切相关，肠道菌群结构功能紊乱不仅会产生多种胃肠道疾病如腹泻、便秘、肠炎等，还易诱发肥胖、脑心血管病、糖尿病等慢性代谢性和免疫系统疾病。因此，从维持肠道菌群平衡，增加肠道内有益菌数量，减少有害菌角度出发，饮食干预和益生元、益生菌治疗方法等成为糖尿病治疗的新策略。菊糖作为天然可溶性膳食纤维，其结构特点决定了它通过人体口腔及小肠过程中基本不被分解和吸收，因此可作为糖尿病病人的理想食品。菊糖被称为果聚糖化合物，存在于水果和蔬菜中，最常见的来源是小麦、洋葱、香蕉、芦笋、菊苣、大蒜和韭菜等，目前工业上生产菊糖则主要来源于菊苣和菊芋这两种菊科植物。菊糖在欧盟国家已被认定为天然来源食品成分，具备多种功效。其中作为益生元的活性已被广泛证实--可增加人体肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌数量；还可作为食品添加剂改善食品性质和口感；此外，文献研究表明菊糖能够对人体起到降糖降脂、预防癌症、调节肠道菌群平衡、促进矿物质和维生素吸收、缓解便秘等作用。目前，虽有文献研究菊糖降糖作用的生物活性，但对于菊糖降糖作用尚无一致相关性报道。因次，本文拟以菊糖为研究对象，从安全性和有效性两个方面探讨菊糖作用，阐明菊糖的安全性和对糖尿病血糖调节作用机制，为糖尿病治疗提供一定理论依据和研究思路。1.菊糖质量控制研究为全面监测菊糖质量，本章实验建立了一系列快速、高效的检测方法对三种不同来源菊糖的质量进行考察。采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对菊糖中铜、砷、镉、汞、铅五种重金属元素含量进行测定，三种不同来源菊糖中重金属元素含量均不超过国家标准；建立液质联用技术（HPLC-MS/MS）同时检测菊糖中那格列奈、二甲双胍等14种非法添加降糖药物，结果显示，三种不同来源菊糖中均无明显响应的离子峰，未检测出14种常用降糖药物；利用紫外分光光度法测定菊糖含量，测得菊糖-1中菊糖含量占比69.52%，菊糖-2中菊糖含量占比95.80%，菊糖-3中菊糖含量占比89.32%；建立高效凝胶过滤色谱（HPGFC）方法对菊糖进行分子量测定，结果显示菊糖-1分子量为2890；菊糖-2为3657；菊糖-3第IX页 军事科学院硕士学位论文为5288，均为低聚果糖。2.菊糖对正常大鼠糖代谢影响从菊糖安全性角度出发，观察菊糖对正常大鼠血糖、摄食量以及糖耐量的影响，探讨其使用的安全性。所采用的方法是将32只成年雄性Wistar大鼠随机分为-1-1-1正常对照组、菊糖低剂量组（0.5gkg）、中剂量组（1gkg）和高剂量组（2gkg）。每组分别灌胃相应空白溶剂和菊糖溶液，每天1次，连续灌胃4周。通过对大鼠血糖等指标的测定，评价不同剂量菊糖对正常大鼠血糖的影响。结果显示，与正常对照组相比，菊糖三个剂量组对大鼠血糖均无显著影响（p>0.05）,菊糖中、高剂量组可显著减缓大鼠体重的增长，降低摄食量（p<0.05）。口服糖耐量实验中，菊糖对正常大鼠的血糖变化也无显著影响（p>0.05），但长期给菊糖可提高胰岛素敏感性（p<0.05）。因此，菊糖对正常大鼠血糖值均无显著影响，但是可能会作为食物替代品，起到减少大鼠摄食量，减缓体重增长的作用。3.菊糖对糖尿病模型大鼠降糖效果研究从菊糖降糖作用角度出发，观察菊糖对糖尿病模型大鼠降糖效果，探讨菊糖-1对糖尿病的治疗作用和机制。首先尾静脉大剂量注射链尿佐菌素50mgkg，建立-1糖尿病大鼠模型，将Wistar大鼠随机分为正常对照组、菊糖给药组（1gkg）、-1-1阳性对照组（200mgkg）和模型对照组（2gkg），每组分别灌胃相应药物和空白溶剂，每天1次，连续灌胃4周。通过对大鼠空腹血糖、体重、胰岛素等测定，评价菊糖对糖尿病大鼠治疗效果；结果显示，给药后，模型组空腹血糖值基本稳定在较高水平，菊糖组和阳性组于给药4周时显著低于模型组（p<0.05）；造模后，糖尿病模型大鼠均出现模型组体重持续减轻，阳性组略有降低，菊糖组基本保持稳定。由此，我们得出，菊糖可降低糖尿病大鼠空腹血糖值，且菊糖效果与二甲双胍相当，也可改善糖尿病大鼠体重减轻症状，提高糖尿病大鼠的生活质量。综上分析，菊糖对于糖尿病的改善具有积极作用。关键词：菊糖；糖尿病；安全性；糖代谢；肠道菌群第X页 军事科学院硕士学位论文AbstractDiabetesmellitusisagroupofclinicalsyndromeswithacombinationofgeneticandenvironmentalfactors,whichcharacterizedbyglucosemetabolismdisorders.Thecauseofthediseaseiscomplex.Humanshavenotyetfullyunderstoodthecourseofdiabetes.Althoughthecurrenttreatmentofdiabetesisincreasing,itstillhascertainlimitations.Thequalityoflifeandlifeexpectancyofdiabeticpatientsstillfaceseriousthreats.Inrecentyears,thedevelopmentofmicro-ecologicaltechnologyhasmadepeoplemorein-depthresearchongutmicrobiota,suggestingthatgutmicrobiotawillbeanewtargetforthetreatmentofdiabetes.Thebalancestateoftheintestinalmicrofloraiscloselyrelatedtohumanhealth.Thedisorderofintestinalflorastructurenotonlyproducesavarietyofgastrointestinaldiseasessuchasdiarrhea,constipation,andenteritis,butalsoinduceschronicmetabolismandimmunesystemdiseasessuchasobesity,cerebralcardiovasculardisease,anddiabetes.Therefore,fromtheperspectiveofmaintainingintestinalflorabalance,increasingthenumberofbeneficialbacteriaintheintestine,reducingharmfulbacteria,dietaryinterventionandprebiotics,probiotictreatmentmethodsbecomenewstrategiesforthetreatmentofdiabetes.Fordiabetics,itisimportanttoeffectivelycontroltheintakeofsugar.Inulinasanaturalsolubledietaryfiber,itsstructuralcharacteristicsdeterminethatitisnotsubstantiallydecomposedandabsorbedthroughtheoralcavityandsmallintestineofthehumanbody,andthuscanbeusedasanidealfoodfordiabetics.Inulinisknownasfructancompoundsanditfoundinfruitsandvegetable.Themostcommonsourcearewheat,onions,bananas,asparagus,chicory,garlic,andleeks.Currently,therawmaterialresourceofinulinproducedbyindustryismainlyfromchicoryandJerusalemartichoke.Theinulin,withvarietyofeffects,hasbeenidentifiedasagoodingredientfromnaturalsourceinEU.Theactivityofinulinasaprebiotichasbeenwidelyconfirmed–itcanincreasethenumberofprobioticssuchasbifidbacteriaandlactobacillusintheintestine.Itcanalsobeusedasafoodadditivetoimprovefoodpropertiesandtaste.Moreover,studieshasconfirmedthatinulincanactasahypoglycemicandlipidloweringagentforthehumanbody,preventingcancer,regulatingintestinalflorabalance,promotingabsorptionofmineralsandvitamins,andrelievingconstipation.Atpresent,althoughtheliteraturehasstudiedthebiologicalactivityofinulininthehypoglycemiceffect,thereisnoconsistentcorrelationreportonthemechanismofinulinhypoglycemiceffect.Becauseofthis,thisdissertationintendstostudyinulinasaresearchobjectfromtwoaspectsofsafetyandefficacy,andintroducethe“physiologicalorgan”oftheintestinalmicrobeintothestudyofdiabetesinordertoclarifytheinulinSafetyandmechanismofregulatingdiabetesandblood第XI页 军事科学院硕士学位论文glucoseandintestinalfloraprovidecertaintheoreticalreferencesandresearchideasforthetreatmentofdiabetes.1.Studyonqualificationcontrolofinulin.Inordertocomprehensivelymonitorthequalityofinulin,aseriesoffastandefficienttestingmethodshavebeenestablishedinthischaptertoexaminethequalityofthreedifferentsourcesofinulin.Inductivelycoupledplasmamassspectrometry(ICP-MS)wasusedtoevaluatethecontentsofheavymetalsincopper,arsenic,cadmium,mercury,andleadininulin.Thecontentofheavymetalsininulinfromthreedifferentsourcesdidnotexceedthenationalstandard.Simultaneouslydetected14kindsofillegallyaddedhypoglycemicagentssuchasnateglinideandmetforminininulinbyhighperformanceliquidchromatography(HPLC-MS/MS).Theresultsshowedthattherewerenoobviousresponseionpeaksinthreedifferentsourcesofinulin.14kindsofcommonlyusedhypoglycemicdrugswerenotdetected;thecontentofinulin-1wasdeterminedbyultravioletspectrophotometry,theinulincontentininulinwas69.52%,theinulinininulin-2was95.80%,inulin-3inulincontentaccountedfor89.32%;theestablishmentofhighperformancegelfiltrationchromatography(HPGFC)methodforthedeterminationofinulinmolecularweight,theresultsshowedthatthemolecularweightofinulin-1is2890;inulin-2is3657;inulin-3is5288,allFructooligosaccharides.2.EffectofInulinonGlucoseMetabolisminRatsFromtheperspectiveofthesafetyofinulin,theeffectsofinulinonbloodglucose,foodintake,andglucosetoleranceofnormalratswereobservedandthesafetyofusewasdiscussed.Themethodusedwastorandomlydivide32adultmaleWistarratsintothenormalcontrolgroup,thelow-doseinulingroup(0.5gkg-1),themiddle-dosegroup(1gkg-1)andthehigh-dosegroup(2gkg-1).Eachgroupwasintragastricallyinstilledwiththecorrespondingblanksolventandinulinsolutiononcedailyfor4weeks.Throughthedeterminationofbloodglucoseandotherindicatorsinrats,evaluatetheeffectofdifferentdosesofinulinonbloodglucoseinnormalrats.Theresultsshowedthatcomparedwiththenormalcontrolgroup,thethreeinulindosegroupshadnosignificanteffectonbloodglucoseinrats(p>0.05),andthemediumandhighdosesofinulincouldsignificantlyreducetheweightgainofratsandreducefoodintake(p<0.05).Intheoralglucosetolerancetest,inulinalsohadnosignificanteffectonbloodglucosechangesinnormalrats(p>0.05),butlong-terminulincouldincreaseinsulinsensitivity(p<0.05).Therefore,inulinhasnosignificanteffectonbloodglucoselevelsinnormalrats,butitmayserveasafoodsubstitutetoreducethefoodintakeandslowweightgaininrats.3.StudyontheeffectofinulinhypoglycemicactivityindiabeticratsanditsregulationmechanismonintestinalfloraFromtheperspectiveofinulinhypoglycemiceffect,thehypoglycemiceffectof第XII页 军事科学院硕士学位论文inulinondiabeticratswasobservedandthetherapeuticeffectandmechanismofinulin-1ondiabeteswerediscussed.First,alarge-doseofStreptozotocin(STZ)50mgkg(i.v.)wasperformedtoestablishadiabeticratmodel.Wistarratswererandomlydividedinto-1normalcontrolgroup,inulin-administeredgroup(1gkg),andpositivecontrolgroup.-1-1(200mgkg)andmodelcontrolgroup(2gkg),eachgroupwasintragastricallyadministratedwiththecorrespondingdrugandblanksolventonceadayfor4weeks.Throughthedeterminationoffastingbloodglucose,bodyweightandinsulininrats,thetherapeuticeffectofinulinondiabeticratswasevaluated;fecalsampleswerecollected;theinteractionbetweeninulinandintestinalmicroflorawasstudiedbymetgenomicsandmicrobialmolecularecologymethods.Inordertotarget,thedifferencesbetweenthediseasestateoftheratsandtheintestinalmicrofloraintheinvivoafterinterventionofinulinwereinvestigated.Theresultsshowedthatafteradministration,thefastingbloodglucoselevelofthemodelgroupwasbasicallystableatarelativelyhighlevel,theinulingroupandthemetformingroupweresignificantlylowerthanthemodelgroupat4weeks(p<0.05);afterthemodelwasestablished,thediabeticmodelratsAlltheweightlossofthemodelgroupcontinuedtodecrease,themetformingroupslightlydecreased,andtheinulingroupremainedbasicallystable.Thus,wehaveconcludedthatinulincanreducefastingbloodglucoselevelsindiabeticrats,andtheinulineffectiscomparabletothatofmetformin,anditcanalsoimproveweightlosssymptomsindiabeticratsandimprovethequalityoflifeofdiabeticrats.Insummary,inulinhasapositiveeffectontheimprovementofdiabetes.Keywords:Inulin;Diabetesmellitus;Safety;Glucosemetabolism;Intestinalflora第XIII页 军事科学院硕士学位论文前言糖尿病是严重威胁人类生命健康的危险因素之一，病因复杂，人类尚未彻底了解到糖尿病的发生发展过程。国际糖尿病联合会数据显示，全世界约有3.8亿人[1]甚至更多的人患有糖尿病，到2035年预计这一数字将增加到5.92亿。根据最新[2]的全球疾病负担研究，在世界疾病致残中糖尿病排第7位，并发症多且患者生活[3]质量显著下降，寿命减短，给全球公共卫生和卫生服务带来了巨大挑战。糖尿病表观发病原因是由于胰岛素分泌不足或胰岛β细胞功能缺失，临床表[4]现为以高血糖为主要特征的一系列新陈代谢紊乱症状。临床上常见的糖尿病主要分为两种：Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅰ型糖尿病主要是由于胰岛β细胞被彻底[5-6]破坏，细胞功能缺失，导致胰岛素分泌绝对不足，在组织病理学上以胰岛β细胞凋亡为主要特征；Ⅱ型糖尿病主要表现为胰岛β细胞代偿能力下降，外周组织[7]出现胰岛素抵抗、导致胰岛素分泌相对不足，胰岛功能衰竭。目前糖尿病临床治疗总策略以西药为主，降糖药物包括磺酰脲类、双胍类、格列奈类等促胰岛素分泌剂和胰岛素增敏剂等，或者最直接也是现代医学最常用的方法给患者补充胰岛素。尽管糖尿病的治疗方式有很多，降糖药物种类也在不断增加，但总归治“标”不治“本”，仍有约50%的糖尿病人HbA1c仍不达标或没有长期达标，而且随着糖尿病后期严重程度增加、并发症发生，上述治疗方式往往[8]受到限制。而近几年，随着微生物生态技术和宏基因组学飞速发展，科学家对肠道菌群的研究日益深入，将肠道微生物作为突破口，已被认为是治疗代谢性疾病的关键，因此提出了糖尿病治疗新策略，即从宿主与肠道微生物入手，对糖尿病[9]患者进行饮食（益生元）干预和益生菌治疗等实现糖尿病的个体化治疗。植物多糖作为改善肠道的益生元被广泛应用，它是指由很多相同或不同的单[14]糖以α-或β-糖苷键组成的聚合物,主要包括菊糖、果胶质，纤维素和淀粉等。其结构的特殊性决定了它们进入机体后，基本不被机体吸收和分解，而在肠道中被微生物发酵。由于植物多糖多重的生理保健功效和来源的安全性而日益受到关注，从免疫功能的壁垒到血糖、血脂的调节，从抑制病毒到抗肿瘤的恶化，都体现着植物多糖将为疾病治疗提供崭新的思路。菊糖是一种典型的植物多糖，存在于水果和蔬菜中，最常见的来源是小麦、洋葱、香蕉、芦笋、菊苣、大蒜和韭菜等，目前工业上生产菊糖则主要来源于菊苣和菊芋这两种菊科植物。在食品、保健品等领域的应用价值日益突出。菊糖是一种天然可溶性膳食纤维，由D-呋喃果糖以β-2，1糖苷键连接而成，末端常连有一个葡萄糖残基，聚合度在2-60之间，[15]其结构简式可表示为GFn（G代表末端葡萄糖，F代表果糖，n代表果糖分子数），结构如图1。现代研究表明，菊粉果聚糖不仅具有类似脂肪的口感和独特的凝胶特第1页 军事科学院硕士学位论文[16][17][18]性，还有降糖降脂、预防癌症、调节肠道菌群平衡、促进矿物质和维生素[19]吸收等多种生理功能，在欧盟国家已被认定为天然食品成分。CH2OHOOHOHOCH2OHOHOnOHOCH2OHOHOCH2OHOH图1菊糖分子结构[20][21]菊糖对于糖尿病患者而言，可有效控制其糖分摄入。Kim等采用由葡萄糖和菊糖组成的等渗电解质溶液对大鼠进行灌肠实验，证明了菊糖能显著抑制空[22]肠对葡萄糖的吸收，史雪洁等将阿胶、菊糖、富硒卡拉胶等作为原料，制备富硒阿胶-菊糖咀嚼片，结果显示，富含菊糖的此咀嚼片能够明显降低小鼠空腹血糖水平，且降糖作用与二甲双胍相当。目前，虽有文献研究菊糖降糖作用的生物活性，但对于菊糖降糖机制尚无一致相关性报道。因此，本实验拟以菊芋来源菊糖为研究对象，从应用安全性和降糖有效性两方面入手，探讨菊糖对糖尿病降糖作用机制，全面考察菊糖作用。1、菊糖安全性方面，首先对三种不同来源的菊芋菊糖进行质量考察与筛选：采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）评价菊糖中重金属元素含量；建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时检测菊糖中那格列奈、二甲双胍等14中非法添加化学药物；利用紫外分光光度法测定菊糖含量；建立高效凝胶过滤色谱（HPGFC）方法测定菊糖分子量。其次，通过进行血糖、体重的检测及口服糖耐量实验评价菊糖对正常大鼠糖代谢的影响。2、菊糖降低血糖作用方面：将肠道微生物这一“生理器官”引入治疗糖尿病的研究中来，通过链尿佐菌素破坏胰岛β细胞建立糖尿病大鼠模型，监测血糖、体重、摄食量及胰岛素等糖代谢指标，评价菊糖降糖效果，为菊糖治疗糖尿病提供理论基础。第2页 军事科学院硕士学位论文第一章菊芋中菊糖质量控制研究一、菊糖中重金属元素含量检测1实验目的随着全社会健康和食品安全意识的提升，食品、保健品中重金属残留问题逐[23]渐得到大家的关注。纯天然菊糖中原本是不含重金属元素的，但可能在提取制备、保存中会受到不同程度的重金属污染，当食用含重金属元素的菊糖后，重金属元素在人体蓄积而过量时，会明显损害机体正常新陈代谢和生理功能的发挥，[24]从而导致各种疾病的发生。本节实验的主要目的是采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对不同产地的菊糖进行铜，砷，镉，汞，铅五种重金属元素残留量的检测，保证菊糖质量，筛选重金属元素含量符合国家标准的菊糖用于下一步研究。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖-1：徐州汇美食品有限公司，规格：250g包，批号：20160530；-1菊糖-2：武汉英纽林生物科技有限公司，规格：10g包，批号：20161017；菊糖-3：阿尔法，规格：50g，批号：I1522037；-110μg·mL的As、Cd、Pb、Cu元素混合物标准溶液；-110μg·mL的Hg元素标准溶液；-110μg·mL的Ce、Co、Li、Tl、Y元素的质谱调谐液；美国Agilent公司；HNO3(优纯级)：韩国德山药品工业。2.2仪器Agilent7700xICP-MS：美国Agilent公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；ME235S电子分析天平：德国Sartorius公司；低温离心机3K-15：美国Sigma公司。3实验方法第3页 军事科学院硕士学位论文3.1实验原理过去对于重金属的测定，多采用原子吸收分光光度法，此方法存在基体干扰严重，无法同时分析多种元素的缺点，近年来ICP-MS技术被广泛应用于分析领域[25]，具有灵敏度高、精确度高的特点，可同时快速检测多种元素及其同位素。电感耦合等离子体质谱（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS），是将电感耦合等离子体作为高温离子源，参与样品蒸发、解离、原子化及电离等过程，四级杆快速扫描，分离后的离子由高速双通道模式检测器进行检测，通过高速顺序扫描分离待测所有元素。本实验利用此技术，采用湿法消解样品，对三种不同产地菊糖中重金属元素含量进行检测，考察菊糖中重金属元素含量是否符合国家标准。3.2硝酸溶液的配制取浓硝酸适量，用一定量纯水稀释成浓度为5%和2%的硝酸溶液，其中5%硝酸作为仪器清洗液，2%的硝酸溶液用于标准曲线的配制。3.3五种元素混合标准曲线的制备分别取各元素储备液各500μL，加入2%硝酸溶液定容至5mL，作为混合元素标准曲线制备的初始浓度溶液。取上述新鲜配制的混合元素标准曲线制备初始浓度溶液适量，加入2%硝酸稀释成系列浓度梯度的标准曲线溶液，命名为STD-1、STD-2、STD-3、……、STD-20。-1Hg元素标准曲线浓度：0.1、0.2、0.5、1、2ngmL；-1Cu、As、Cd、Pb元素标准曲线浓度为：0.1、0.5、2、10、50和200ngmL。3.4样品前处理精密称定三种菊糖0.1g，加入1mL浓硝酸，放入100℃水浴中消解4h，待溶液透明时，进行散气40min，然后用超纯水定容至10mL，混匀待测。3.5仪器参数第4页 军事科学院硕士学位论文表1-1ICP-MS工作参数名称工作条件射频功率1550W雾化器同心雾化MicroMist采样深度8mm载气流速0.70L/min补偿气流速0.40L/minHe气流速3.3mL/min等离子气流15L/min采集模式Nogas/He模式重复采集次数3次3.6数据处理与分析根据重金属元素标准曲线，将菊糖中重金属元素测定值进行计算，得菊糖中重金属元素含量，与国家标准进行比较。数据由Microsoftexcel2013进行整理。4实验结果4.1五种重金属元素标准曲线第5页 军事科学院硕士学位论文图1-15种重金属元素标准曲线4.2菊糖中五种重金属元素含量测定结果本实验所采取方法可行，应用本法对三种不同来源菊糖中五种重金属元素含量进行了检测，结果如表1-2所示：表1-2三种不同来源菊糖中重金属元素含量测定结果重金属含量Cu[He]As[He]Cd[He]Hg[He]Pb[He]-1(μgg）菊糖-16.430.245600.029540.001680.48342菊糖-20.004560.000000.000130.004700.00066菊糖-30.043220.000000.000410.004940.006555讨论本实验采用的ICP-MS法可同时测定待测所有元素，快速简便，克服了之前原子吸收等分析技术耗时较长、需要对所测元素逐一分析的缺点，大大提高了测定效率，而且此方法抗基质干扰能力强，灵敏度、精确度高，已被推荐用于食品、保健品中重金属元素的定量分析。[26]相关文献表明，使用高剂量天然纯菊糖无明显毒副反应，它可作为食品添加剂用于食品、保健品的生产、加工与使用中，但若其中含有的重金属元素含量超过一定标准，进入人体后在体内蓄积，由于重金属元素半衰期长且不易分解，则会呈现毒性反应，引发人体多种疾病。因此，检测菊糖中重金属元素含量是否超标是保证菊糖安全使用的基础。参照现行《中国药典》（2015版)、《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》、GB－14882－94《食品中放射性物质限制浓度标准》[27]-1-1-1限量指标:Pb≤5.0mgkg，Cd≤0.3mgkg，Hg≤0.2mgkg，As≤2.0-1-1mgkg，Cu≤20.0mgkg，对不同来源的三种菊糖进行重金属元素含量的检测，以保证菊糖质量与安全应用。第6页 军事科学院硕士学位论文6结论本节实验通过ICP-MS法对三种不同来源菊糖中重金属元素含量进行检测。实验结果显示，三种不同来源菊糖中重金属元素含量均不超过国家标准，符合筛选要求，但菊糖之间重金属含量存在较大差异，这可能与菊糖种植环境、提取方法、储存方式等因素有关。第7页 军事科学院硕士学位论文二、菊芋菊糖中非法添加降糖药物检测1实验目的当天然产物或食品被研究表明具备一定功效时，许多不法商贩为获得更大的经济利益，在天然产物或食品中添加相关化学药物以凸显这些功效。由于所添加化学药物数量、种类、剂量的不确定性以及药物之间可能会存在的相互作用，都潜在地影响了天然产物或食品的安全性，长期以往会损害服用者的身心健康。[28-30]目前，部分文献报道菊糖对糖尿病患者血糖的改善具有一定作用，因此，本实验目的就是为了控制菊糖质量，建立了高效液相色谱-串联质谱（Highperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry,HPLC-MS/MS）法，可快速、准确地同时检测14种常见降糖化学药物，为菊糖筛查非法降糖药物添加提供实验依据。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖-1：徐州汇美食品有限公司，规格：250g包，批号：20160530；-1菊糖-2：武汉英纽林生物科技有限公司，规格：10g包，批号：20161017；菊糖-3：阿尔法，规格：50g，批号：I1522037；甲醇、甲酸（色谱纯）：美国Fisher公司。2.2仪器AgilentLC-1100高效液相色谱分析仪：美国安捷伦公司；NANOSPACE高效液相色谱分析仪：日本资生堂公司；API4000质谱及Analyst工作站：美国应用生物系统公司；3K18低温高速离心机：美国SIGMA公司；多管涡旋混合器TARGINTECH；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；ME235S电子分析天平：德国Sartorius公司。3实验方法第8页 军事科学院硕士学位论文3.1实验原理液质联用技术，即将液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，将色谱对复杂样品的高分离能力，与质谱高选择性、高灵敏度、高精密度及能够提供物质相对分子质量与结构信息的优点结合起来，定性与定量相结合，可同时检测14种[31-32]非法降糖药物的添加。本实验利用实验室已经建立的稳定HPLC-MS/MS法检测非法降糖药物添加，经过总结及改善相关条件，可一次性较为全面地检测菊糖中是否有降糖药物的非法添加。3.2样品前处理-1三种不同来源的菊糖样品分别配制成浓度为1mgmL甲醇溶液。超声提取30min，静置2h，混匀。离心后吸取上清液，稀释10倍待用。3.3色谱条件色谱柱：CAPCELLPAKC18MGIII（2.0mm×100mm,5μm）；柱温：室温，20-25℃；流速200μL/min；进样量1μL；分析时间8min；洗针溶液：水；流动相：A相：水（0.1%甲酸），B相：乙腈（0.1%甲酸），梯度洗脱，梯度程序表如下：表1-3流动相梯度洗脱程序时间/(min)A(%)B(%)1901029010410906109069010890103.4质谱条件电喷雾离子源（ESI）；雾化温度300℃；喷雾电压（IS）5500V；碰撞气（CAD）8psi；气帘气（CUR）20psi；雾化气（GS1）55psi；辅助气（GS2）55psi；去簇电压（DP）62V；碰撞裂解气高纯氮气。各化学药物监测离子对及质谱参数如下[31-32]表所示。第9页 军事科学院硕士学位论文表1-414种化学药物监测离子对及质谱参数化合物母离子m/z碎片离子m/z碰撞能量/Ev那格列奈318.3616618盐酸吡格列酮357.21134.123格列喹酮529.33390.114格列齐特324.2127.117格列吡嗪446.27321.110格列苯脲49516918瑞格列奈453.39230.226盐酸苯乙双胍206.18105.127盐酸罗格列酮358.21135.122格列美脲513.35374.220二甲双胍130.1111320西地那非47558.128他达拉非39026812甲苯磺丁脲271.1172.0/155.020/203.5数据处理和分析将甲醇溶液作为空白对照，三种菊糖甲醇溶液进样后，出峰情况与空白甲醇相比，观察14种降糖药物响应值。4实验结果应用本法对三种不同来源菊糖中格列本脲、那格列奈、盐酸吡格列酮、格列喹酮、格列齐特、格列吡嗪、瑞格列奈、盐酸苯乙双胍、盐酸罗格列酮、格列美脲、二甲双胍、他达拉非、甲苯磺丁脲、西地那非进行筛查，结果如图1-2，与空白甲醇相比，三种菊糖均无明显响应的离子峰。第10页 军事科学院硕士学位论文ABC第11页 军事科学院硕士学位论文D图1-214种化学药物出峰图（A:空白甲醇B:菊糖-1C:菊糖-2D:菊糖-3）5讨论高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法将质谱与液相优势互补，与过去[33][34][35]报道过的高效液相色谱法，薄层色谱法，色谱联用法相比，具备灵敏度高、所需样品量少，定性准确、分析速度快的优点，而且可在一个液相色谱系统内进行，操作方便，近年来在分析领域应用广泛。目前常的降糖药物添加有：噻唑烷二酮类、双胍类、磺酰脲类等。本实验采用实验室之前建立的实验方法，对14种常见降糖药物进行同时筛查，方法可行稳定，三种菊糖均未发现药物添加。6结论实验结果显示，三种不同来源菊糖均无降糖药物添加。本实验参考有关文献，总结实验条件并进行改善，可一次性较为全面地检测中成药或保健食品中14种非法添加降糖药物，并且将分析时间缩短。该方法简便准确，可作为降糖药物添加的快速筛查方法。第12页 军事科学院硕士学位论文三、菊芋菊糖含量检测1实验目的菊糖果聚糖是水溶性膳食纤维，作为益生元和功能性配料被广泛应用，对于[36]粗菊糖而言，其降糖作用的发挥与菊糖含量密切相关。因此，本实验的目的就是通过紫外分光光度计法测定三种菊糖含量，筛选出纯度更高、降糖效果更好的菊糖。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖-1：徐州汇美食品有限公司，规格：250g包，批号：20160530；-1菊糖-2：武汉英纽林生物科技有限公司，规格：10g包，批号：20161017；菊糖-3：阿尔法，规格：50g，批号：I1522037；葡萄糖、D-果糖、浓硫酸、苯酚、3.5-二硝基水杨酸（分析纯）:国药集团化学试剂有限公司2.2仪器电子天平FA1104：上海天平仪器厂；酶标板振荡器MM-1：海门市其林贝尔仪器厂；酶标仪Elx800，BIO-TEK；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；KQ-3000DE型数控超声波清洗器；XMTD-6000数显恒温水浴锅等。3实验方法3.1实验原理菊糖是由β-2,1糖苷键连接而成的果聚糖。根据对菊糖结构分析，其聚合度范围在2-60，多为低聚果糖，分子中不存在游离的还原性羟基和酮基，而粗菊糖中常含有葡萄糖、果糖等还原性单糖。因此，利用紫外分光光度计法分别测定菊糖中总糖含量和还原糖含量，菊糖含量=总糖含量-还原糖含量，总糖含量用苯酚-硫第13页 军事科学院硕士学位论文酸法测定，还原糖含量用二硝基水杨酸法（DNS）测定。3.2溶液的配制3.2.1DNS试剂称取3.15gDNS，加500mL去离子水搅拌溶解，水浴至45℃，然后逐步加入100mL氢氧化钠，同时不断地搅拌，直至完全溶解，再依次加入酒石酸钾钠91.0g，苯酚2.5g和亚硫酸钠2.5g，搅拌至溶解，待冷却至室温，纯水定容至1000mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，需避光保存。稳定一周后可使用。3.2.25%苯酚溶液将苯酚试剂瓶放于40-50℃水浴中，待苯酚融化有液体生成时，称取苯酚约5g，然后加入去离子水95mL，混匀待用，需现配现用。3.2.3D-果糖标准溶液精密称取于55℃干燥至恒重的D-果糖标准品100mg，用少量去离子水溶解后，定量转移至100mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀，将母液稀释2倍和10-1-1倍，即得浓度为0.5mgmL、0.lmgmL的果糖对照品溶液，备用。3.2.4菊糖样品溶液-1-1称取一定量菊糖，配制成浓度为0.2mgmL、5mgmL的菊糖水溶液。3.3苯酚-硫酸法测定波长的选择移液管移取1mLD-果糖标准品溶液，放于试管中，滴加蒸馏水至2mL，然后加入1mL5%苯酚溶液，混匀，再加入5mL浓硫酸，震荡摇匀，25℃下静置10min，然后沸水浴中加热10min，待冷却至室温进行测定。将上述溶液置于400-600nm范围内，每隔10nm的波长测定吸光值，由此来确定其最大吸收波长。3.3总糖含量测定-1量取0.lmgmL的D-果糖标准品溶液6个剂量分置于10mL试管中，滴加蒸馏水至2mL，然后加入1mL5%苯酚溶液，混匀，再加入5mL浓硫酸，震荡摇匀，25℃下静置10min后，沸水浴加热10min，待冷却至室温进行测定，以空白调零，在490nm处测定各个吸光度值。第14页 军事科学院硕士学位论文-1同样，按上述方法测三种不同来源菊糖含量，菊糖浓度为0.2mgmL，重复3次，取平均值，根据总糖标准曲线计算即得样品中总糖含量。3.4还原糖含量测定分别量取D-果糖标准品溶液6个剂量分置于25mL试管中，滴加蒸馏水至2mL，然后于6个试管中各加入1.5mLDNS试剂，震荡摇匀，沸水浴加热10min，以流动水冷却至室温，最后用蒸馏水定容至25mL，摇匀待测。以空白调零，在540nm处测定各个吸光度值。-1同样，按上述方法测三种不同来源菊糖含量，菊糖浓度为5mgmL，重复3次，取平均值，根据还原糖标准曲线计算即得样品中还原糖含量。3.5数据处理和分析所有数据采用X±SD形式表示，由GraphPadPrism5、Microsoftexcel2013、Origin7.5软件进行数据分析和绘图。4实验结果4.1总糖波长选择D-果糖溶液在400-600nm处吸光度值如图3所示：图1-3D-果糖标准品紫外全扫描图D-果糖溶液经苯酚-硫酸法显色后，结果显示在490nm处有最大吸收，因此将490nm作为测定总糖含量的最大吸收波长。第15页 军事科学院硕士学位论文4.2苯酚-硫酸法总糖标准曲线绘制2总糖标准曲线方程y=0.1284+9.44554x,R=0.9977Y=0.1284+9.44554X1.4R=0.998871.21.00.80.6吸光度值0.40.20.00.000.020.040.060.080.100.12浓度（mg/ml）图1-4苯酚-硫酸法绘制D-果糖标准曲线4.3DNS法还原糖标准曲线绘制Y=2.80679-0.01666XR=0.996421.81.61.41.21.00.8吸光度值0.60.40.20.00.00.10.20.30.40.50.6浓度（mg/ml）图1-5DNS法绘制D-果糖标准曲线第16页 军事科学院硕士学位论文2还原糖标准曲线方程y=2.80679x-0.01666,R=0.99294.4菊糖中总糖和还原糖含量测定根据紫外分光光度计法测得菊糖中总糖含量如下表：表1-5三种菊糖中总糖含量-1种类OD值计算浓度(mgmL)菊糖-10.831±0.00360.074±0.0004菊糖-21.070±0.02390.100±0.0025菊糖-31.007±0.02050.093±0.0022根据紫外分光光度法测得的菊糖中还原糖含量如图1-6：表1-6三种菊糖中还原糖含量-1种类OD值计算浓度(mgmL)菊糖-10.297±0.01140.112±0.0040菊糖-20.278±0.00920.105±0.0033菊糖-30.241±0.00650.092±0.00234.5菊糖含量测定[37]菊糖含量=总糖含量-还原糖含量，经计算得，每克菊糖-1中菊糖含量为0.6952g，占总质量的69.52%；每克菊糖-2中菊糖含量为0.9580g，占总质量的95.80%；每克菊糖-3中菊糖含量为0.8932g，占总质量的89.32%。5讨论糖类物质分析检测一直是分析领域中的难点。文献中报道的多糖含量测定方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、高效阴离子交换色谱法-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）等，但是存在标准品不易获得，前期处理繁杂的缺点。本实验通过分析菊糖结构特征，采用紫外分光光度计法对菊糖含量进行测定，先用苯酚-硫酸法测定菊糖中总糖含量，再用DNS法测定其还原糖含量，两者之差即为菊糖含量。此法简单便捷易操作，可用于多糖初步定量。在总糖、还原糖含量测定过程中，菊糖浓度值对测定结果影响较大。要使菊糖测定值落在标准曲线范围内且具有意义，本实验事先选择了6个浓度，分别用-1于总糖、还原糖的检测，最终确定测定总糖含量时选择菊糖浓度0.2mgmL，测-1定还原糖含量时选择5mgmL。绘制总糖和还原糖标准曲线后，根据紫外分光光第17页 军事科学院硕士学位论文度法测定菊糖样品吸光度值，计算得到的浓度根据总糖和还原糖所在体系进行换算，最终表示为每克菊糖中的含量值。整个实验过程中，不论是苯酚-硫酸显色还是DNS法显色，样品浓度、温度、时间等对于结果均有较大影响，因此，在实验过程中应该严控实验条件。6结论根据紫外分光光度计法，以D-果糖作为标准品，采用苯酚-硫酸法测定菊糖中总糖含量，二硝基水杨酸法测定其还原糖含量,然后用总糖含量减去还原糖含量即得菊糖水溶液中菊糖含量。标准曲线表明，D-果糖含量在测定范围内呈良好线性。采用苯酚-硫酸法测定总糖吸收最大波长为490nm，菊糖-1中菊糖含量占比69.52%，菊糖-2中菊糖含量占比95.80%，菊糖-3中菊糖含量占比89.32%。该方法显色稳定、重现性好。第18页 军事科学院硕士学位论文四、菊芋菊糖分子量测定1实验目的相关研究表明，特定的菊糖类型可通过调节肠道免疫，屏障功能和微生物稳[38]态来控制糖尿病的发展。本实验主要目的就是采用高效凝胶过滤色谱法对三种不同来源菊糖分子量进行测定，筛选具有一定聚合度，能发挥更好降糖效果的菊糖。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖-1：徐州汇美食品有限公司，规格：250g包，批号：20160530；-1菊糖-2：武汉英纽林生物科技有限公司，规格：10g包，批号：20161017；菊糖-3：阿尔法，规格：50g，批号：I1522037；右旋糖酐标准品：美国sigma公司；-10.15molL乙酸铵缓冲液2.2仪器岛津20A高效液相色谱仪，配置为高压双泵（LC-20AT）、自动进样器（SIL-20A）、柱温箱（CTO-20A）和示差折光检测器（RID-10A）。3实验方法3.1实验原理高效凝胶过滤色谱法，当待测样品溶液缓慢流经凝胶色谱柱时，不同分子在柱内同时进行不同运动，大致分为两种：垂直向下的移动和无定向扩散运动，从而使样品中大分子先流出色谱柱，中等分子随后流出，分子最小的最后流出，即[39]分子筛效应。本实验就是利用此方法，对三种不同来源菊糖进行分子量的检测。3.2仪器条件[40-41]本实验总结的适用于菊糖分子量测定的HPGFC方法：流动相为0.2mHAc第19页 军事科学院硕士学位论文-1和0.15m乙酸铵（pH4.5）,0.8mLmin洗脱，TSKG3000SWxl色谱柱检测,柱温控制在40℃，样品进样量为每次20µL，检测器为RID,采用Sigma公司生产的右旋糖酐标准品,绘制三次方的标准曲线,检测菊糖相对分子质量。3.3标准曲线绘制分别精密称取一定量右旋糖酐标准品溶于0.15mol乙酸铵缓冲液中，配成5-1mgmL标准品溶液，在上述条件下分别进样，测得标准品色谱峰保留时间。绘制标准曲线以不同右旋糖酐标准品保留时间（retentiontime，RT）为横坐标，相应相对分子质量对数值（lgMw）为纵坐标。3.4菊糖样品分子量测定分别称取一定量三种不同来源菊糖，溶于0.15mol乙酸铵缓冲液中，配成5-1mgmL的样品溶液，按绘制标准曲线的色谱条件进样，得到三种不同来源菊糖的保留时间，然后根据标准曲线计算菊糖相对分子质量。4实验结果4.1右旋糖酐标准曲线绘制-1采用Sigma公司生产的右旋糖酐标准品，配制成浓度为5mgmL乙酸铵溶液，标准品的出峰时间如表1-7所示，采用三次方程形式拟合标准曲线。表1-7标准品分子量及出峰时间标准品出峰时间分子量17.0267000027.132270000310.6240000411.80915000513.4526000第20页 军事科学院硕士学位论文日志(M.W.)7.06.56.015.525.034.544.053.53.00.02.55.07.510.012.515.017.520.022.5min图1-6分子量标准曲线(三次方程：aX^3+bX^2+cX+d(X=x-T.LIMIT)T.LIMIT=0min;a=-1.243461e-003b=4.322967e-002c=-0.7748249d=9.393931R^2=0.9765901离差=0.1168672)4.1三种不同来源菊糖样品分子量测定将菊糖乙酸铵溶液按上述条件进样分析，色谱图如图7所示，经标准曲线计算得，菊糖-1平均分子量为2890；菊糖-2平均分子量为3657；菊糖-3平均分子量为5288；第21页 军事科学院硕士学位论文mV检测器A27.525.022.520.017.515.012.514.14910.07.55.02.50.0-2.5-5.0-7.5-10.0-12.5-15.0-17.5-20.00.02.55.07.510.012.515.017.5minAmV检测器A27.525.022.520.017.515.012.514.48810.07.55.02.50.0-2.5-5.0-7.5-10.0-12.5-15.0-17.5-20.00.02.55.07.510.012.515.017.5minBmV检测器A27.525.022.520.017.515.012.513.60310.07.55.02.50.0-2.5-5.0-7.5-10.0-12.5-15.0-17.5-20.00.02.55.07.510.012.515.017.5minC图1-7三种菊糖分子量出峰时间(A:菊糖-1B:菊糖-2C:菊糖-3)5讨论高效凝胶过滤色谱法具有灵敏度高、高效快速等特点，近年来开始广泛应用[42]于多糖等多种聚合物的分子量测定中，被认为是研究多种聚合物相对分子量及相对分子量分布最有效的手段之一。本实验参考相关文献，总结了一套用于菊糖分子量测定的高效凝胶过滤色谱方法，基本条件为：流动相为0.2mHAc和0.15m-1乙酸铵（PH4.5）,0.8mLmin洗脱，TSKG3000SWxl色谱柱检测,柱温控制在40℃，样品进样量为每次20µL,检测器为RID,采用右旋糖酐标准品,绘制三次方的标准曲线,以检测菊糖相对分子质量。菊糖分子是由D-果糖经β（2-1）糖苷键连接而成的线性支链多糖，末端常带有一个葡萄糖残基，DP在2-60之间，可分为短链菊糖和长链菊糖，其中平均聚合度≤9的菊糖为短链菊糖，而从天然植物中提取的菊糖常常同时含有短链和长链[43]两种。研究表明，发挥降糖效果的菊糖为特定聚合度菊糖类型，长链菊糖的长第22页 军事科学院硕士学位论文期发酵确保了其在结肠和局部系统发挥着更为持久和深远的益生元和免疫调节效[39]应，因此，菊糖的聚合度也是影响其降糖药效发挥的因素之一。本节实验从菊糖聚合度方面出发，测定三种不同来源菊糖分子量并进行比较，筛选特定类型菊糖用于下一步糖尿病药效实验。6结论本实验采用高效液相凝胶过滤色谱法对三种菊糖分子量进行检测，结果显示菊糖-1分子量为2890；菊糖-2为3657；菊糖-3为5288，三种不同来源菊糖聚合度在2-60之间，为低聚果糖，但三种不同来源菊糖分子量差异较大，可能与不同来源菊糖提取方式、储存方式不同有关。第23页 军事科学院硕士学位论文第二章菊芋菊糖对正常大鼠糖代谢影响的研究一、正常大鼠灌胃菊糖后血糖等指标变化1实验目的研究表明，菊糖具备多种生理及保健功能，通常作为益生元，糖类脂肪的替[44]代物，性能改变剂被广泛应用，发挥着控血脂、降血糖、改善肠道等作用。Audrey[45]等在2016年报道，菊糖可直接抑制蔗糖酶，控制餐后血糖，HeeYun等在2009年指出菊糖可通过提高细胞膜葡萄糖转运体活性从而起到降糖作用，对抗糖尿病［46-47］。菊糖作为糖尿病患者食用品逐渐受到广泛青睐，本节实验希望通过给正常大鼠灌胃不同剂量菊糖，探讨菊糖对正常大鼠血糖、体重、摄食量的影响，以期为菊糖在人类糖尿病治疗中的应用提供安全性理论依据。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖：徐州汇美食品有限公司，规格:250g包，批号：20160530；生理盐水：石家庄四药有限公司，批号：1711023201。2.2仪器血糖仪：罗氏精采型血糖仪；-1血糖试纸：强生R5080，规格：50片盒；3K18低温高速离心机：美国SIGMA公司；冷藏柜：江苏白雪电器股份有限公司；ES-10K-4TS电子天平：长沙湘平科技发展有限公司。2.3实验动物Wistar雄性大鼠，SPF级，体重（200±20）g，购于军事医学科学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（军）-2012-0004，实验设施使用许可证SYXK（军）2007-004。第24页 军事科学院硕士学位论文3实验方法3.1实验原理本实验通过给正常大鼠灌胃4周菊糖，考察在灌胃过程中菊糖对正常大鼠空腹血糖、体重的影响。采用禁食过夜的动物，通过调整动物进食时间，观察菊糖对于正常大鼠摄食量的影响，首先监测给菊糖前动物每天的摄食量，作为基础摄[48]食量，用作自身对照；然后再监测灌胃菊糖后动物每天的摄食量；通过菊糖干预前后的比较，观察大鼠摄食量变化。3.2实验分组正常大鼠在SPF级动物房适应一周饲养后，按照体重随机分为4组，分别为-1-1正常对照组（Control）、菊糖低剂量组（0.5mgkg）、菊糖中剂量组（1mgkg）、-1-1菊糖高剂量组（2mgkg），每组8只。正常对照组灌胃空白溶剂水5mLkg。给药剂量按动物体重计算，给药前将菊糖溶于去离子水中，配成混悬液，现用现配。3.3体重及空腹血糖监测给药期间，每周称取每组大鼠的体重并记录，观察每组大鼠的体重变化情况。每周进行空腹血糖的监测，于提前一日将每组大鼠禁食，禁食12小时，尾尖采血，用血糖仪测定空腹血糖值。3.4摄食量监测将大鼠进食时间控制为每天7个小时。摄食量按所摄取的标准化饲料的重量-1进行计算。实验开始前，按照5mLkg灌胃空白溶剂，连续3天监测摄食量，作为基础摄食量。从第4天开始，动物和实验分组分别灌胃给予相应剂量的药物。连续4周监测各组动物每天的摄食量。为了避免出现较大个体差异，便于各实验组之间进行比较，本实验以自身对照的形式进行统计分析。3.5数据处理和分析使用SAS9.2处理结果。实验数据为定量资料且符合正态分布的以均数±标准差X±SD表示；定量资料不符合正态分布的以四分位数表示。因素（时间和药物剂量）效应分析采用析因设计一元定量资料的方差分析；各组间差异采用单因素方差分析；多个试验组分别与同一对照组比较采用Dunnett’st检验；各组之间多第25页 军事科学院硕士学位论文重比较采用LSD法的两两比较(P<0.05)差异有统计学意义。4实验结果4.1不同剂量菊糖对大鼠体重的影响对各组大鼠连续4周灌胃相应药物和空白溶剂，每周测定其体重并计算体重增长值。由表2-1和图2-1可知，正常组大鼠每周体重值均呈显著性增长（P<0.05），菊糖低、中、高剂量组的大鼠体重增长值与对照组相比均较低，第四周时，菊糖高剂量组的大鼠体重值增长显著缓慢（P<0.05），且具有统计学意义。表2-1菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对体重的影响时间基础体重第一周第二周第三周第四周分组正常对照组219.1±15.14235.3±10.79*260.3±11.558*279.5±11.25*295.3±11.82*低剂量组0.5220.5±10.16232.0±11.75*253.6±13.89266.7±14.05*281.6±17.07-1gkg中剂量组1.0227.1±18.97242.5±23.81266.0±22.98276.9±28.92294.6±30.89-1gkg高剂量组2.0224.5±11.34238.5±11.78254.0±12.79266.5±16.6277.4±17.06-1gkg注：体重单位g,*.与自身基础体重相比差异显著(P<0.05)图2-1菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后体重增长值的变化-1-1-1注：低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg*.与对照组相比差异显著(P<0.05)第26页 军事科学院硕士学位论文4.2不同剂量菊糖对大鼠空腹血糖的影响以尾尖采血-血糖仪法测定各组大鼠的空腹血糖值。由表2-2可知，各组正常大鼠空腹血糖值接近，差异均无统计学意义。表2-2菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对空腹血糖的影响时间基础血糖第一周第二周第三周第四周分组正常对照组5.9±0.245.8±0.455.4±0.325.7±0.336.0±0.47低剂量组5.6±0.256.4±0.355.8±0.335.5±0.436.4±0.54-10.5gkg中剂量组6.2±0.506.3±0.305.6±0.235.4±0.246.2±0.33-11.0gkg高剂量组5.4±0.326.4±0.615.1±0.374.9±0.206.1±0.63-12.0gkg注：血糖单位mmol4.3不同剂量菊糖对大鼠摄食量的影响摄食量按所摄取的标准化饲料的重量进行计算，将大鼠的摄食时间调整为每天6小时，分别记录每组大鼠的基础摄食量和实验摄食量。结果如图2，在第四周时，低剂量组大鼠摄食量低于对照组，但两者在统计学上无明显差异；中、高剂量组与对照组相比，其摄食量降低差异显著（p<0.05），且随时间变化，摄食量逐渐降低。第27页 军事科学院硕士学位论文图2-2菊糖灌胃给予正常大鼠不同剂量后对摄食量的影响注：0表示基础摄食量，*.与对照组相比差异显著(P<0.05)-1-1-1低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg5讨论近年来，随着人们对各种植物多糖保健功能的深入了解，对其在糖尿病治疗[49-50]方面的探索已成为研究热点之一。本节实验从安全性角度出发，通过模拟菊糖长期给药过程，探讨菊糖对正常大鼠空腹血糖、摄食量以及体重的影响。为提高实验效率和实验效果，本实验在4周灌胃菊糖过程中，每周进行体重和空腹血糖的检测，每天进行摄食量的监测，在禁食时间、实验操作等尽可能保持一致。血糖是维持体内各器官和组织需要的基础，本实验结果显示菊糖的摄入对正常大鼠血糖无显著影响。正常大鼠摄食量保持在一定范围内，当给予菊糖后，菊糖低、中、高剂量组摄食量均低于正常对照组，且中、高剂量组可显著减少大鼠摄食量，差异具有统计学意义。对于体重，正常对照组大鼠每周都呈显著性增长，菊糖干预后，从第三周开始，中、高剂量组大鼠体重呈缓慢增长，与摄食量结果趋势一致。因此，本实验认为可能是因为菊糖可作为食物替代品，降低摄食量，从而减缓体重增长，具有减肥功效。第28页 军事科学院硕士学位论文6结论本实验从菊糖应用安全性角度出发，给正常大鼠灌胃4周菊糖，实验结果显示，菊糖干预后，菊糖对正常大鼠血糖值的改变无显著影响，但大鼠体重增长缓慢，摄食量减少，且随时间变化，摄食量逐渐降低。由此说明，菊糖可降低正常大鼠的摄食量，从而影响其体重增长，且随菊糖剂量升高，其影响作用有所增强，而对血糖等其他指标无显著不良影响。因此，长期服用菊糖对大鼠无毒副反应，而且菊糖可能会作为食物替代品，起到减肥功效。这为菊糖安全性以及进一步研究其对糖尿病的治疗作用提供了一定实验依据。第29页 军事科学院硕士学位论文二、单次和长期给菊糖对正常大鼠糖耐量的影响1实验目的本节实验主要目的是通过口服糖耐量实验，观察单次、长期给菊糖对正常大鼠血糖和胰岛素分泌功能的影响。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖：徐州汇美食品有限公司，规格:250g包，批号：20160530；葡萄糖：国药集团容生制药有限公司，批号：201608232.2仪器血糖仪：罗氏精采型血糖仪；-1血糖试纸：强生R5080，规格：50片盒；酶标仪：Elx800，BIO-TEK；3K18低温高速离心机：美国SIGMA公司；冷藏柜：江苏白雪电器股份有限公司；ES-10K-4TS电子天平：长沙湘平科技发展有限公司；酶标板振荡器：MM-1，海门市其林贝尔仪器厂；大鼠胰岛素试剂盒：Rat/MouseinsulinELISAKit，批号：EZRMI-13K。2.3实验动物Wistar大鼠，雄性，SPF级，体重（200±20）g，购于军事医学科学院实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK-（军）2012-0004，实验设施使用许可证SYXK（军）2007-0004。3实验方法3.1实验原理第30页 军事科学院硕士学位论文本实验选择单次和长期给予正常大鼠菊糖干预后，进行口服糖耐量实验。正常大鼠在口服糖耐量实验灌胃葡萄糖后，一般会在两个小时内恢复正常水平。因此，本实验希望观察菊糖对口服糖耐量实验这一过程中血糖变化情况。而且在给予葡萄糖之后，大鼠机体一定时间内处于高糖状态，在这种状态下，观察胰岛β细胞在葡萄糖刺激后，分泌胰岛素的能力，从而能够完整的评估药物对正常大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素功能的影响。3.2实验分组正常大鼠在SPF级动物房适应一周饲养后，按照体重随机分为4组，分别为-1-1正常对照组（Control）、菊糖低剂量组（0.5mgkg）、菊糖中剂量组（1mgkg）、-1菊糖高剂量组（2mgkg），每组8只，期间对照组大鼠正常状态下饲喂。3.3单次给药口服糖耐量实验动物适应一周饲养后，进行单次给药口服糖耐量实验。所有动物禁食过夜，-1不同分组灌胃相应药物或空白溶剂后，接着灌胃给50%葡萄糖2gkg，分别于给药前、给药后15min、30min、60min、90min、120min尾尖采血测血糖值。3.4长期给药口服糖耐量实验连续给药4周，动物末次给药后禁食过夜，不同分组灌胃相应药物或空白溶-1剂后，灌胃50%葡萄糖2gkg，分别于给药前、给药后15min、30min、60min、90min、120min尾尖采血测血糖值。3.5胰岛素反应分别于单次给药和长期给药口服糖耐量实验中，进行胰岛素含量的测定。即在灌胃相应药物前15min和灌胃葡萄糖后30min，毛细管眼眶静脉丛取血，采用ELASA法测血清中胰岛素含量，二者含量差异表示为胰岛素反应。3.6数据处理和分析使用SAS9.2处理结果。实验数据为定量资料且符合正态分布的以均数±标准差X±SD表示；定量资料不符合正态分布的以四分位数表示。因素（时间和药物剂量）效应分析采用析因设计一元定量资料的方差分析；各组间差异采用单因素方差分析；多个试验组分别与同一对照组比较采用Dunnett’st检验；各组之间多重比较采用LSD法的两两比较(P<0.05)差异有统计学意义。第31页 军事科学院硕士学位论文4实验结果4.1单次给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响以单次给菊糖方式测定快速给菊糖后对正常大鼠糖耐量及胰岛素敏感性的影响。由图2-3可知，各组在给予葡萄糖后，30min血糖值显著升高,60min血糖值开始下降。与正常对照组比较,菊糖各组血糖值无显著差异。由图2-4可知，菊糖中、高剂量组给糖后胰岛素变化量高于正常对照组，差异无统计学意义。图2-3单次给菊糖对正常大鼠口服糖耐量的影响-1-1-1注：低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg第32页 军事科学院硕士学位论文图2-4单次给菊糖对胰岛素反应的影响-1-1-1注：低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg4.2长期给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响连续给菊糖4周，于末次给菊糖进行口服糖耐量实验，观察长期给菊糖对正常大鼠糖耐量及胰岛素敏感性的影响。由图2-5可知，各组在给予葡萄糖后，30min血糖值显著升高,60min血糖值开始下降，逐渐恢复正常水平。菊糖低、中、高剂量组血糖值达峰值时均低于正常对照组，差异无统计学意义，由图2-6可知，各组给予葡萄糖后，与对照组相比，菊糖中、高剂量组胰岛素反应明显升高（p<0.05），表明菊糖可增加胰岛素敏感性，促进胰岛素的分泌。第33页 军事科学院硕士学位论文图2-5长期给菊糖对大鼠口服糖耐量的影响-1-1-1注：低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg图2-6长期给菊糖对胰岛素反应的影响-1-1-1注：低剂量组0.5gkg;中剂量组1.0gkg;高剂量组2.0gkg5讨论口服糖耐量实验是一种葡萄糖负荷试验，用以了解胰岛β细胞功能和机体对[51]血糖的调节作用，也是评价体内药物降糖效果的重要指标，李晓月等表明，菊芋菊糖干预能够降低小鼠胰岛素抵抗状态时的血糖水平、胰岛素和胰岛素抵抗指［52］数，能够改善胰岛素抵抗状况。本实验通过单次给菊糖和长期给菊糖口服糖耐第34页 军事科学院硕士学位论文量实验两部分观察菊糖对血糖的调节作用和对胰岛素敏感性的影响。实验结果表明，单次给菊糖进行实验，菊糖对于整个过程中血糖的调节无显著影响，大鼠在两个小时内逐渐恢复正常血糖水平，无异于正常对照组；而长期给菊糖进行实验，菊糖可降低大鼠达峰值时的血糖水平，并提高胰岛素的敏感性。6结论以单次和长期两种给菊糖方式测定菊糖干预对正常大鼠糖耐量及胰岛β细胞的影响。两次实验大鼠血糖水平均在30min达峰值，60min开始逐渐恢复，单次给菊糖对于血糖水平和胰岛素反应均无显著性影响，表明单次给菊糖对正常大鼠糖代谢作用不显著；长期给菊糖，与正常对照组相比，菊糖组可降低峰值时血糖水平，且可提高胰岛素敏感性，这为菊糖安全性以及进一步研究其对糖尿病的治疗机制提供了实验依据。第35页 军事科学院硕士学位论文第三章菊芋菊糖对糖尿病模型大鼠的降糖作用研究1实验目的近几年，随着对肠道菌群研究的深入，饮食干预和益生菌治疗等方法成为糖尿病治疗新策略。本实验主要目的就是探讨菊糖对糖尿病模型大鼠降糖效果的影响，以及菊糖对糖尿病大鼠体重、胰岛素是否具有改善作用。2实验材料2.1药品与试剂-1菊糖：徐州汇美食品有限公司，规格:250g包，批号：20160530；链尿佐菌素：美国sigma公司，规格：S0130-5g，批号：WXBC3087V;盐酸二甲双胍：上海麦克林生化科技有限公司，规格：M813341-25g，批号：C10083330；枸橼酸：美国sigma公司，规格：250g，批号：BCBS8093V。2.2仪器血糖仪：罗氏精采型血糖仪；-1血糖试纸：强生R5080，规格：50片盒；3K18低温高速离心机：美国SIGMA公司；冷藏柜：江苏白雪电器股份有限公司；酶标板振荡器：MM-1，海门市其林贝尔仪器厂；酶标仪：Elx800，BIO-TEK；大鼠胰岛素试剂盒：Rat/MouseinsulinELISAKit，批号：EZRMI-13K；ES-10K-4TS电子天平：长沙湘平科技发展有限公司。2.3实验动物Wistar雄性大鼠，SPF级，体重（200±20）g，购于斯贝福公司，实验动物生产许可证号：SCXK-（京）2016-0002，实验设施使用许可证SYXK（军）2007-0004。第36页 军事科学院硕士学位论文3实验方法3.1实验原理本实验通过灌胃菊糖4周，观察菊糖对糖尿病模型大鼠降糖作用。首先利用化学药物链尿佐菌素（STZ）破坏大鼠胰岛β细胞正常功能，导致胰岛素分泌不足，从而引起不同程度的糖尿病。将造模成功的大鼠灌胃菊糖4周，观察菊糖对糖尿病大鼠血糖、体重以及胰岛素等影响。3.2试剂的配制3.2.1枸橼酸溶液配制-1称取一定质量枸橼酸，配制成0.05molL（pH=4.5）的枸橼酸水溶液。3.2.2链尿佐菌素溶液配制-1为保证链尿佐菌素溶液稳定，称取一定量链尿佐菌素，使其溶0.05molL枸-1-1-1橼酸水溶液中，配制浓度为40mgmL、50gmL、60mgmL，现用现配。3.2.3菊糖混悬液配制称取一定质量菊糖溶于去离子水中，配制成5%菊糖混悬液，现用现配。3.3糖尿病大鼠模型建立3.3.1链尿佐菌素溶液剂量筛选正常大鼠在SPF级动物房适应一周饲养后，按照体重随机分为3组，分别为-1-1链尿佐菌素低剂量组（40mgkg）、链尿佐菌素中剂量组（50mgkg）、链尿佐-1菌素高剂量组（60mgkg），每组7只。各组大鼠禁食24小时后，尾静脉一次性注射相应STZ剂量，96小时后，观察各组空腹血糖值。观察指标为，三次测量大鼠空腹血糖值，当空腹血糖值均≥16.7mmol时，则认为造模成功，以此来筛选造模成功率最高的最适剂量。3.3.2建立糖尿病大鼠模型根据筛选出最适链尿佐菌素剂量，建立实验所用的糖尿病大鼠模型。将所有-1大鼠适应一周饲养后，禁食24小时，尾静脉一次性注射链尿佐菌素50mgkg，96小时后观察大鼠空腹血糖值，同样，选择血糖值稳定≥16.7mmol的糖尿病模型第37页 军事科学院硕士学位论文大鼠用于降糖药效实验研究。3.4实验分组将造模符合要求的糖尿病大鼠与同批正常大鼠，按照体重随机分为4组，分-1别为正常对照组（Control）、模型对照组（Model）、菊糖给药组（1gkg）、阳-1性对照组（二甲双胍200mgkg），每组14只。正常对照组和模型对照组灌胃空-1白溶剂水0.1mLkg。给药剂量按动物体重计算，给药前将菊糖溶于去离子水中，配成混悬液，现用现配，每天一次，连续四周。3.5血糖监测于造模前用血糖仪测定所有大鼠空腹血糖值，作为基础血糖水平。在尾静脉大剂量注射链尿佐菌素后，测定造模后血糖值，选择符合要求的糖尿病大鼠模型，然后再对给药4周后大鼠的空腹血糖值进行长期观察。3.6体重监测在造模前称量大鼠体重，作为基础体重；灌胃给菊糖4周后，每周称量所有大鼠的体重并记录，观察每组大鼠的体重变化情况。3.7胰岛素测定灌胃给菊糖4周，于末次给菊糖后，进行胰岛素含量的测定。即在灌胃菊糖后，毛细管眼眶静脉丛取血，静置离心取血清，采用ELASA法测血清中胰岛素含量，评价胰岛β细胞功能。3.8统计学分析所有数据采用X±SD形式表示，由Microsoftexcel2013、Origin7.5、GraphPadPrism5软件进行数据整理和制图。使用SAS9.2处理结果，单因素多水平一元定量资料分析方法分析；多重比较采用LSD法两两比较（P<0.05差异有统计学意义）。4实验结果4.1糖尿病大鼠模型建立4.1.1筛选最适链尿佐菌素溶液剂量第38页 军事科学院硕士学位论文设置链尿佐菌素低、中、高三个剂量进行糖尿病大鼠模型的建立，以筛选最-1适造模剂量，结果（图3-1）显示，STZ低剂量组(40mgkg）3只血糖低于模型-1标准，4只符合要求，模型成功率57.14%；STZ中剂量组(50mgkg）7只血糖符-1合要求，且没有死亡，模型成功率100%；STZ高剂量组(60mgkg）4只符合要求，3只死亡，模型成功率57.14%，以上表明，建立糖尿病大鼠模型最适剂量为-150mgkg。图3-1不同剂量链尿佐菌素造模后大鼠血糖水平-1-1-1注：STZ-4040mgkg;STZ-5050mgkg;STZ-6060mgkg4.1.2选择可用糖尿病大鼠模型-1一次性尾静脉注射50mgkgSTZ溶液，破坏大鼠胰岛β细胞，选择空腹血糖值≥16.7mmol的大鼠作为糖尿病模型，共筛选到42只大鼠可用于下一步药效实验。4.2菊糖对糖尿病大鼠空腹血糖的影响如表3-1所示，所有大鼠基础血糖水平稳定在5.44±0.40mmol；给药前，模型对照组、菊糖给药组和阳性对照组血糖均高于正常组（P<0.05），模型组、菊糖组和阳性对照组血糖值均无统计学差异；给药后，模型组空腹血糖值基本稳定；菊糖组和阳性组于给药4周显著降低，血糖值低于模型组（P<0.05）,表明菊糖可降低糖尿病大鼠空腹血糖值，且菊糖组效果与阳性组相当。第39页 军事科学院硕士学位论文表3-1基础、给菊糖前以及给菊糖后大鼠血糖值(X±SD，n=14)组别基础血糖值给菊糖前给菊糖4周正常对照组5.45±0.415.14±0.435.80±0.57模型对照组5.53±0.5029.03±5.08*31.03±2.54*菊糖组5.41±0.4230.41±3.29*26.96±5.76*#二甲双胍组5.39±0.2929.19±4.42*27.09±6.37*#注：血糖值mmol，*.与正常对照组相比P<0.05#.与模型对照相比P<0.05-1-1注：菊糖组:1gkg二甲双胍组:200mgkg图3-2各组大鼠基础血糖值水平-1-1注：菊糖组1gkg阳性组(二甲双胍)200mgkg第40页 军事科学院硕士学位论文图3-3各组给菊糖前血糖值水平-1-1注：菊糖组1gkg阳性组(二甲双胍)200mgkg图3-4各组给菊糖4周后血糖值水平-1-1注：菊糖组1gkg阳性组(二甲双胍)200mgkg4.3菊糖对糖尿病大鼠体重的影响如表3-2所示，给菊糖前，菊糖组、二甲双胍组和模型对照组体重均低于正常对照组（P<0.05），菊糖组、阳性组和模型对照组均无统计学差异；给药后，模型第41页 军事科学院硕士学位论文组体重继续减轻，阳性组略有降低，菊糖组基本保持稳定，且菊糖组、阳性组与模型组间有统计学差异；表明菊糖可维持糖尿病大鼠体重稳定。表3-2给菊糖前及给菊糖后大鼠体重值变化(X±SD，n=14)组别给菊糖前给菊糖4周正常对照组265.7±11.92383.0±13.49模型对照组263.6±13.93239.6±21.47*菊糖给药组267.7±9.25272.6±26.59*#二甲双胍组268.1±15.65260.9±22.51*#注：体重g，*.与正常对照组相比P<0.05#.与模型对照相比P<0.05-1-1菊糖组1gkg阳性组(二甲双胍)200mgkg4.4菊糖对糖尿病大鼠胰岛素分泌的影响如表3-3所示，菊糖组、二甲双胍组和模型组均未检测到胰岛素含量，表明菊糖改善糖尿病大鼠并没有通过促进胰岛β细胞分泌胰岛素。表3-3给药后大鼠胰岛素水平组别OD值浓度正常对照组0.237±0.1171.232±0.813模型对照组0.081±0.024ND菊糖给药组0.070±0.005ND二甲双胍组0.066±0.005ND注：胰岛素单位，mgmL，ND-未检测到5讨论糖尿病（diabetesmellitus，DM）目前已成为世界性公共卫生问题，严重危害人类健康。糖尿病及其并发症不仅严重影响糖尿病患者的生活质量，同时也是致残、致死的重要原因。因此，为阐明糖尿病及其并发症的发病机制和治疗，第一步就是建立合适的糖尿病动物模型。目前，实验室糖尿病动物模型制备方法多采用化学药物诱导，化学药物常用的有四氧嘧啶和链尿佐菌素，由于部分四氧嘧啶导致糖尿病动物模型可自发缓解，因此，本实验选用尾静脉大剂量注射链尿佐菌素。链尿佐菌素（STZ）是一种含硝基的化合物，进入体内后可特异性破坏胰岛β细胞。破坏机制有如下几个方面：当大剂量注射STZ时，STZ可直接破坏胰岛β细胞；还可通过引起β细胞内辅酶I（NAD）浓度下降，辅酶I依赖性能量和蛋白第42页 军事科学院硕士学位论文质代谢停止，最终导致胰岛β细胞死亡；还可通过诱导一氧化氮合成，激活自身免疫过程，从而破坏胰岛β细胞。当小剂量注射STZ时，可少量破坏体内胰岛β细胞，通过级联放大效应，STZ致死的胰岛β细胞可作为抗原被巨噬细胞吞噬，在胰岛局部发生炎性细胞浸润，并活化释放IL-1、TNF-α等炎症因子杀伤正常胰岛β细胞，从而放大细胞损伤效应，最终诱发糖尿病。链尿佐菌素易溶于水，但会在数分钟内分解成气体，所以其水溶液在室温下极不稳定，需在低温和pH4条-1件下进行配制并保存。本实验选用的是将链尿佐菌素溶于0.05molL枸橼酸溶液中配制并使用。建立稳定糖尿病大鼠模型需要选择合适的大鼠、造模药剂量、给药方式、禁食时间等，综合考虑以上因素，本实验确定的最终造模条件为：Wistar雄性大鼠-1180-220g禁食24小时，尾静脉大剂量注射链尿佐菌素50mgkg。糖尿病典型症状表现为“三多一少”，即多饮多食多尿，体重减轻。本次实验受实验条件限制，针对以上症状，采用目测观察。所有大鼠均在相同条件下饲养，观察到的结果为正常对照组大鼠垫料隔天换一次，仍很干燥，水壶一天加一次水，而建立的糖尿病大鼠模型，需要一天加三次水，5个小时左右垫料便会湿透，一天需换两次垫料。对于体重变化，正常组大鼠体重每周呈显著增长，而模型组大鼠，在基础体重与正常组相当的情况下，逐渐减轻，给药4周后，显著低于正常对照组，菊糖组则基本保持体重恒定，表明菊糖具有改善糖尿病大鼠日益消瘦的作用。本实验得到的结果，给药4周后，模型组空腹血糖值基本稳定，而菊糖组显著低于模型组，降糖效果与二甲双胍相当，表明菊糖对糖尿病大鼠空腹血糖具有改善作用。但是本实验阳性对照组使用的二甲双胍达到的降糖效果并不十分显著，血糖值水平略低于模型组，但是具有统计学意义，分析原因可能为本实验用大剂量STZ破坏大鼠胰岛β细胞，导致大量β细胞死亡，而二甲双胍的作用机制通过提高胰岛素的敏感性而增加外周葡萄糖的利用，以及抑制肝、肾过度的糖原异生，所以在本实验糖尿病大鼠胰岛β细胞被大量破坏的情况下，二甲双胍可在给予胰岛素后起到辅助降糖作用。因此，对于阳性对照药的筛选需要在下一步实验中进一步改善和证实。本实验通过对血清胰岛素检测，发现菊糖并不会促进胰岛β细胞分泌胰岛素，为我们下一步探讨机制提供理论依据。6结论链尿佐菌素所致糖尿病大鼠模型，具有典型的“三多一少“症状，模型稳定性好且成功率高。对模型大鼠灌胃4周，结果显示菊糖可显著降低糖尿病大鼠空腹血糖值，且降糖效果与二甲双胍相当；也可改善糖尿病大鼠体重减轻的症状，提高糖尿病大鼠生活质量，但对糖尿病大鼠胰岛素分泌无明显影响。因此，菊糖对于第43页 军事科学院硕士学位论文糖尿病的改善具有积极作用，也为我们进一步探讨菊糖降糖机制提供新思路。第44页 军事科学院硕士学位论文第四章结论与展望本论文旨在探讨菊糖安全性和对糖尿病降糖及肠道菌群调节作用机制。首先，对三种不同来源的菊糖进行质量考察，采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对菊糖中铜、砷、镉、汞、铅五种重金属元素含量进行评价，三种不同来源菊糖中五种重金属元素含量均不超过国家标准；建立液质联用方法同时检测菊糖中那格列奈、二甲双胍等14种非法添加降糖药物，所选的三种不同来源菊糖均不含以上14种降糖药物；利用紫外分光光度法测定菊糖含量，苯酚-硫酸法测定总糖含量，DNS法检测还原糖含量，最终测得菊糖-1中菊糖含量占比69.52%，菊糖-2中菊糖含量占比95.80%，菊糖-3中菊糖含量占比89.32%，三种不同来源菊糖含量差异较大；建立高效凝胶过滤色谱(HPGFC)方法对菊糖进行分子量测定，结果显示三种不同来源菊糖聚合度在2-60之间，为低聚果糖，菊糖-1分子量为2890，菊糖-2为3657，菊糖-3为5288。综合以上结论，本实验选择的三种不同来源的菊糖具备较好的药学性质及质量，均可用于下一步药效实验探讨。其次，从菊糖使用安全性方面入手，通过给正常大鼠灌胃不同剂量菊糖，探讨菊糖对正常大鼠糖代谢的影响，以期为菊糖在人类糖尿病治疗中的应用提供安全性理论依据。菊糖干预后，对正常大鼠空腹血糖值无显著影响，却能够减少大鼠摄食量，减缓其体重增长，且随菊糖剂量升高，此影响作用有所增强。菊糖对正常大鼠无毒性，可能会作为食物替代品，起到减肥的功效。最后，将菊糖作为糖尿病治疗的新策略，探讨菊糖对糖尿病模型大鼠降糖效果影响，以及菊糖可能发挥降糖作用机制，即对肠道菌群的调节作用。利用链尿佐菌素破坏大鼠胰岛β细胞，导致胰岛素分泌不足，最终诱发糖尿病，通过灌胃4周菊糖，观察其对糖尿病模型大鼠血糖、体重、胰岛素等指标的影响，菊糖可显著降低糖尿病大鼠空腹血糖值，且降糖效果与二甲双胍相当；也可改善糖尿病大鼠体重减轻的症状，提高糖尿病大鼠生活质量。因此，菊糖对于糖尿病的改善具有积极作用。综上分析，本论文从多个方面对菊糖质量进行考察，对菊糖的安全性，降糖效果和机制也进行了深入探讨。菊糖对正常大鼠无显著影响，但对于糖尿病的改善具有积极作用，因此本实验对于菊糖安全性以及研究其对糖尿病的治疗作用具有重要的作用，为现代医学糖尿病治疗策略提供了一定理论参考和研究思路。第45页 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军事科学院硕士学位论文作者在学期间取得的学术成果[1]郭臻，孟志云，朱晓霞等.植物低聚果糖菊粉对正常大鼠糖代谢的影响研究,解放军药学学报.(已接收)[2]郭臻，孟志云，窦桂芳.三种市售菊粉的质量考察，食品工业.（在投）第50页 军事科学院硕士学位论文主要简历基本情况姓名：郭臻性别：女民族：汉出生年月：1993年8月籍贯：山东临沂学习经历2011-2015年泰山医学院药学院药学专业理学学士2015-2018年军事科学院军事医学研究院在读药理学硕士硕士期间论文发表情况：[1]郭臻，孟志云，朱晓霞等.植物低聚果糖菊粉对正常大鼠糖代谢的影响研究[J].解放军药学学报.第51页 军事科学院硕士学位论文致谢笔落于此，看似漫长的硕士生涯即将结束了。回望这三年，一幕幕出现在脑海中，像刚发生一样，心中倍感充实，感慨良多。在这里，我不仅学到了知识，更收获了老师和同学们的关心和爱护。在论文完成之际，我要向给予我关怀和帮助的老师、同学和亲人们致以最诚挚的谢意！衷心感谢我的导师窦桂芳研究员在学习和生活中给予了我无微不至的关怀，为我提供优越的学习环境，对于陌生的领域创造条件让我去探索，我的每一点进步都凝聚了导师的心血。您渊博的知识、开阔的视野、严谨的治学态度、实事求是的科学态度和宽以待人的处世风范，永远值得我学习。感谢我的老师孟志云研究员，感谢您一直以来对我的指导，在实验方案的设计、实验过程、实验结果的分析讨论以及论文撰写给予悉心指导和帮助。感谢我的老师朱晓霞老师，是您让整个实验室有了家的感觉，让我学习和生活在这里，倍感温暖，感谢您对我课题的帮助，感谢您在我受挫的时候鼓励我。感谢孙文种、甘慧、顾若兰和吴卓娜老师在实验过程给我提供的帮助。感谢实验室师兄师姐师妹同学对我的支持和帮助，特别感谢韩鹏、李俭、董晓娜、刘桃云、李京峰、王伟、刘晓亚、牛立云、干长姣等师兄师姐对我动物实验的大力指导和协助。感谢我的室友齐琦、李梅陪我一同成长。最后，谨以此文献给我挚爱的父母和家人，深深感谢你们对我求学道路的支持和理解！第52页