《柯萨奇病毒B组5型野生型及假病毒小鼠模型的建立和初步应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文柯萨奇病毒B组5型野生型及假病毒小鼠模型的建立和初步应用姓名：郝晓甜学号：845031410010306专业：病原生物学研究方向：病毒疫苗质量控制导师姓名：梁争论研究员指导老师：毛群颖研究员二0一七年六月 学校代码：84503中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文柯萨奇病毒B组5型野生型及假病毒小鼠模型的建立和初步应用姓名：郝晓甜学号：845031410010306专业：病原生物学研究方向：病毒疫苗质量控制导师姓名：梁争论研究员指导老师：毛群颖研究员二0一七年六月 目录中文摘要............................................................................................................................1Abstract...............................................................................................................................3前言............................................................................................................................5第一部分CV-B5野生型乳鼠模型的建立及初步应用................................................10引言......................................................................................................................10一、实验材料..............................................................................................................10二、实验方法..............................................................................................................121CV-B5野生型乳鼠模型的建立...........................................................................121.1CV-B5病毒分离............................................................................................121.2乳鼠品系选择................................................................................................121.3乳鼠日龄选择................................................................................................121.4攻毒方式选择................................................................................................121.5攻毒剂量选择................................................................................................131.6攻毒后乳鼠组织病理变化............................................................................131.7免疫组织化学研究........................................................................................131.8攻毒后乳鼠各组织病毒载量研究................................................................142CV-B5野生型乳鼠模型的初步应用...................................................................162.1主动免疫效果评价........................................................................................162.2被动保护效果评价.......................................................................................163乳鼠模型颅内攻毒实验.......................................................................................163.1颅内攻毒剂量选择........................................................................................173.2颅内攻毒后乳鼠组织病理变化....................................................................173.3颅内攻毒后乳鼠免疫组化研究....................................................................17三、实验结果..............................................................................................................171CV-B5野生型乳鼠模型的建立...........................................................................171.1确定乳鼠品系................................................................................................171.2确定乳鼠日龄................................................................................................171.3确定攻毒方式................................................................................................181.4确定攻毒剂量及计算LD50...........................................................................191.5CV-B5对乳鼠模型的毒力及重复性研究....................................................201.6攻毒后乳鼠病理变化....................................................................................211.7免疫组织化学研究........................................................................................231.8攻毒后乳鼠各组织病毒载量研究................................................................24 2CV-B5野生型乳鼠模型的初步应用...................................................................252.1主动免疫效果评价........................................................................................252.2被动保护效果评价........................................................................................263乳鼠模型颅内攻毒实验.......................................................................................273.1确定颅内攻毒剂量及计算LD50...................................................................273.2颅内攻毒后乳鼠组织病理变化....................................................................283.3颅内攻毒后乳鼠免疫组化研究....................................................................30四、讨论......................................................................................................................30五、小结......................................................................................................................31第二部分CV-B5感染性克隆的构建及病毒拯救........................................................32引言......................................................................................................................32一、实验材料..............................................................................................................32二、实验方法..............................................................................................................341CV-B5cDNA全长序列扩增...............................................................................342CV-B5全长质粒构建...........................................................................................363CV-B5全长质粒酶切鉴定...................................................................................374CV-B5全长质粒测序...........................................................................................375CV-B5病毒拯救...................................................................................................386拯救病毒滴度检测...............................................................................................387拯救病毒乳鼠攻毒实验......................................................................................398CV-B5假病毒构建...............................................................................................39三、实验结果..............................................................................................................391CV-B5cDNA全长序列扩增...............................................................................392CV-B5全长质粒构建...........................................................................................403CV-B5全长质粒酶切鉴定...................................................................................404CV-B5全长质粒测序...........................................................................................415CV-B5病毒拯救...................................................................................................416拯救病毒滴度检测...............................................................................................417拯救病毒乳鼠攻毒实验.......................................................................................428CV-B5假病毒构建...............................................................................................42四、讨论......................................................................................................................42五、小结......................................................................................................................43第三部分CV-B5假病毒小鼠模型的建立及初步应用................................................44引言......................................................................................................................44一、实验材料..............................................................................................................44 二、实验方法..............................................................................................................451CV-B5假病毒小鼠模型的建立...........................................................................451.1小鼠品系选择................................................................................................451.2攻毒方式及检测时间选择............................................................................451.3小鼠周龄选择................................................................................................451.4假病毒感染部位分布....................................................................................462CV-B5假病毒小鼠模型的初步应用...................................................................462.1主动免疫效果评价........................................................................................462.2被动保护效果评价........................................................................................46三、实验结果..............................................................................................................461CV-B5假病毒小鼠模型的建立...........................................................................461.1确定小鼠品系................................................................................................461.2确定攻毒方式及检测时间............................................................................471.3确定小鼠周龄................................................................................................481.4检测假病毒在小鼠体内分布........................................................................492CV-B5假病毒小鼠模型的初步应用...................................................................492.1主动免疫效果评价........................................................................................492.2被动保护效果评价........................................................................................50四、讨论......................................................................................................................51五、小结......................................................................................................................52总结..........................................................................................................................53综述..........................................................................................................................54参考文献..........................................................................................................................59缩略词表..........................................................................................................................66附表..........................................................................................................................67附录..........................................................................................................................68个人简历..........................................................................................................................72致谢..........................................................................................................................73版权声明..........................................................................................................................74 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文中文摘要柯萨奇病毒B组5型（CoxsackievirusB5,CV-B5）属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus），是引起病毒性脑炎和无菌性脑膜炎的主要病原体之一。此外，CV-B5还可引起上呼吸道感染、手足口病、急性肝炎、扩张性心肌炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、胰岛素依赖型（I型）糖尿病等多种疾病。然而，目前针对CV-B5感染引起的疾病尚无特异性治疗药物，也未见CV-B5疫苗及动物模型相关研究的报道。本研究应用CV-B5野生型毒株CV-B5/JS417建立了乳鼠模型。通过攻毒实验确定攻毒对象为3日龄BALB/c乳鼠，攻毒方式为腹腔注射，攻毒剂量为26LD50。取攻毒后濒死乳鼠的不同组织进行病理和免疫组化研究，结果显示肝脏、脑、脊髓、心肌以及后肢骨骼肌出现明显病变。应用建立的模型进行了疫苗主动免疫和被动保护效果研究。CV-B5灭活疫苗免疫母鼠后对其3日龄乳鼠腹腔攻毒，7获得母传抗体的保护效果，结果显示疫苗的ED50为3.05×10CCID50。应用CV-B5抗血清与CV-B5/JS417活病毒体外中和后腹腔注射乳鼠，结果显示抗血清体外中和可阻断CV-B5/JS417引起的乳鼠发病，抗血清含量和保护率呈现剂量效应关系。应用野生型CV-B5/JS417毒株构建CV-B5感染性克隆并进行病毒拯救。CV-B5/JS417感染Hela细胞后提取病毒RNA，逆转录合成cDNA，扩增全长序列后将PCR产物与pSVA载体连接，转化后提质粒获得CV-B5全长克隆质粒pSVA-CV-B5。pSVA-CV-B5与表达T7聚合酶的质粒共转染到Hela细胞中，细8胞病变后收获，得到病毒滴度为4.22×10CCID50/mL的拯救病毒，乳鼠攻毒实验表明病毒可致3日龄BALB/c乳鼠死亡。此外，在pSVA-CV-B5的基础上构建了CV-B5假病毒pCV-B5-Luc。利用荧光素酶标记的pCV-B5-Luc假病毒建立小鼠模型。确定攻毒对象为4周龄雌性BALB/c小鼠，攻毒方式为尾静脉注射，检测时间为攻毒后16h，攻毒后小鼠肝脏器官可检测到荧光信号。应用该模型进行疫苗主动免疫和被动保护效果研究，结果显示，将pCV-B5-Luc尾静脉攻击CV-B5灭活疫苗免疫后的小鼠，或采用CV-B5抗血清腹腔注射小鼠后尾静脉攻击pCV-B5-Luc，均可有效保护小鼠抑制假病毒感染。综上所述，本研究应用CV-B5野生型毒株建立了首个乳鼠模型，并应用该乳鼠模型对CV-B5灭活疫苗的主动和被动保护效果进行评价。同时构建了CV-B5感染性克隆及荧光素酶标记的假病毒，并基于该假病毒建立小鼠模型，通过活体成像技术观察CV-B5假病毒在小鼠体内的分布情况，与野生型毒株乳鼠模型比较。研究成果为CV-B5疫苗的研发及致病机理的研究奠定了基础。1 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文关键词：柯萨奇病毒B组5型，小鼠模型，感染性克隆，假病毒2 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文AbstractCoxsackievirusB5(CV-B5)belongstothegenusEnteroviruswithinthefamilyPicornaviridae.CV-B5isoneofthemajorpathogensassociatedwithviralencephalitisandasepticmeningitis.Inaddition,CV-B5couldalsocausevariousdiseasessuchasupperrespiratorytractinfection,hand,footandmouthdisease,acutehepatitis,expansionarymyocarditis,pancreatitis,flaccidparalysis,insulin-dependentdiabetes(typeI),etc.However,thereisstillnospecifictherapeuticdrugagainstCV-B5infectionsatpresent,andfewresearchesonvaccineandanimalmodelofCV-B5havebeenreported.Inthisstudy,aneonatalmousemodelwasestablishedusingawildtypestrainofCV-B5namedCV-B5/JS417.Theresultsofchallengetestshowedthat3daysoldneonatalmouseshouldbechallengedbyintraperitonealinjectionwiththedoseof26LD50.Differenttissuesfromthedyingmicewereharvestedforpathologicandimmunohistochemicaltests.Theresultsshowedthatthereexistedsignificantpathologicalchangesintheliver,brain,spinalcord,myocardiumandskeletalmuscleofthehindlegs.Theactiveandpassiveprotectiveeffectsofinactivedvaccinewerevaluedwiththisneonatalmousemodel.ThematernalmiceswereinjectedwithinactivedCV-B5vaccine.Their3daysoldbabieswerechallengedbyintraperitonealinjectionandtheywereobtainedtheprotectiveeffectsofthematernal-transferred7antibody.TheED50ofthevaccinewas3.05×10CCID50.WhenCV-B5/JS417wasneutralizatedbyantiserumofCV-B5invitrobeforeinjection,theresultsshowedthattheneutralizationofantiseruminvitrocouldblocktheinfectionofvirus,andthereexisteddose-effectrelationshipbetweenthecontentofantiserum.TheinfectiouscloneofCV-B5/JS417wasconstructedandtheviruswasrescuedbyusingit.TheRNAofCV-B5/JS417wasextractedfrominfectedHelacellsandcDNAwassynthesizedbythereversetranscription.Thewholegenomewasamplified,andthenthePCRproductionwasligatedintoadigestedpSVAvector.Theplasmidwasextractedaftertransformation,andafull-lengthcDNAclonepSVA-CV-B5wasgained.TheinfectiouscloneofCV-B5viruseswererecoveredafterco-transfectingpSVA-CV-B5intoHelacellswiththeplasmidexpressedT7polymerase.Thetiterof8theinfectiouscloneharvestedwas4.22×10CCID50/mL,and3daysoldneonatalmouseswerediedafterchallengedbytheharvestedvirus.Inaddition,apseudovirusofCV-B5pCV-B5-LucwasconstructedonthebasisofpSVA-CV-B5.AmousemodelwasestablishedwiththeluciferasemarkedpCV-B5-Luc.The3 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文primaryresultsdeterminedthechallengeobjectiveswere4weeksoldfemaleBALB/cmice,withtailintravenousinjectionmethod，andinspectiontimewas16hafterchallenging.Theresultsshowedthatthefluorescencecouldonlybedetectedinliver.Theactiveandpassiveprotectiveeffectsofinactivedvaccinewerealsovaluedwiththismousemodel.TheactiveprotectiveeffectwasgainedafterchallengingtheimmunizedmicewithpCV-B5-Lucbytailintravenousinjection.Additionally,whenthemicewerechallengedwithpCV-B5-LucbytailintravenousinjectionafterinjectedantiserumofCV-B5intraperitoneally,theantiserumcouldprotectthemiceagainsttheinfection.Inconclusion,thefirstneonatalmousemodelofCV-B5wasestablishedinthisstudy,andithadbeenusedintheevaluationoftheactiveandpassiveprotectiveeffectsofinactivatedCV-B5vaccine.Inaddition,theinfectiouscloneandluciferasemarkedpseudovirusofCV-B5wereconstructed.AmousemodelwasestablishedusingtheCV-B5pseudovirus.ThedistributionofCV-B5pseudoviruswasobservedbyinvivobioluminescenceimaging,whichwascomparedwiththeneonatalmousemodelestablishedbythewildtypestrain.TheresearchresultsnotonlylaidthefoundationfortheresearchanddevelopmentofCV-B5vaccine,butalsofortheresearchesonthenosogenesisandmechanisms.Keywords:coxsackievirusB5,mousemodel,infectiousclone,pseudovirus4 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文前言柯萨奇病毒B组5型（CoxsackievirusB5,CV-B5）是引起病毒性脑炎和无菌性[1-2]脑膜炎的主要病原体之一。CV-B5感染后，患者可出现头痛、发热、呕吐及腹泻等症状，轻者能自行缓解，严重者可导致颤抖、瘫痪等神经系统症状，甚至死亡。CV-B5引起的病毒性脑炎和无菌性脑膜炎呈全球范围分布，欧洲、北美、[3-6]南美和亚洲均有暴发或流行报道。此外，CV-B5还可引起急性肝炎、扩张性心[7-12]肌炎、胰腺炎、弛缓性麻痹以及胰岛素依赖型（I型）糖尿病等多种疾病。还有文献报道，CV-B5感染可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎等罕见[13-14]临床症状。近年来研究发现，CV-B5已成为引起手足口病（hand,footand[15-17]mouthdisease,HFMD）的主要病原体之一，在我国HFMD病例中检出比率较高。CV-B5感染可引起人类多种疾病，凸显了其重要的公共卫生意义。1CV-B5概况1.1病毒分类CV-B5是小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）的[18]成员。人肠道病毒（HumanEnterovirus,HEV）的分类如表1所示。按照早期分类，HEV分为5种，共64个基因型：（1）脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV），3个基因型；（2）柯萨奇病毒A组（CoxsackievirusA，CV-A），23个基因型；（3）柯萨奇病毒B组（CoxsackievirusB，CV-B），6个基因型；（4）埃可病毒（Echovirus，ECHO），28个基因型；（5）肠道病毒（Enterovirus，EV）68-71型。CV-B5属于[19]CV-B。现代分型是在血清学分类的基础上按照病毒序列进行分型，HEV可分[20]为HEV-A、HEV-B、HEV-C、HEV-D四个种群，CV-B5属于HEV-B。CV-B5[21]的原型株为1952年分离的Fulkner株，目前尚无公认的CV-B5基因分型。表1人肠道病毒（HEV）基因分型早期分型（Traditionaltaxonomy）现代分型（Currenttaxonomy）Poliviruses（PV）HumanEnterovirusA（HEV-A）PVI-IIICV-A2-8、10、12、14、16；EV-A71、76、89-92CoxsackievirusA（CV-A）HumanEnterovirusA（HEV-B）CV-A1-22、24CV-A9；CV-B1-6；ECHO1-7、9、11-21、24-27、29-33；EV-B69、73-75、77-88、93、95、98、100、101CoxsackievirusB（CV-B）HumanEnterovirusC（HEV-C）CV-B1-6PVI-III；CV-A1、11、13、17、19-22；EV-C95、96、995 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文Echovirus（ECHO）HumanEnterovirusD（HEV-D）ECHO1-7、9、11-21、24-27、29-33EV-D68、70、94Enterovirus（EV）EV68-711.2病毒基因组结构[22]CV-B5为单股正链RNA病毒，病毒基因组由5’非编码区（5’-UTR）、3’非编码区（3’-UTR）以及一个开放读码框（OpenReadingFrame,ORF）构成，[23]全长约7400bp。其中，5'-UTR由约740个核苷酸组成，包含控制CV-B5病毒[24]复制和翻译的区域，如内部核糖体进入位点。另外，该区域结构保守，经常[25]被用做设计PCR引物。3’-UTR含有多聚核苷酸尾巴（poly-A），与病毒RNA[26]复制密切相关。ORF编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为3个前体蛋白（P1、P2、P3），其中P1前体蛋白编码[27-28]4个病毒衣壳蛋白VP1~4，P2和P3编码7个非结构蛋白2A~2C和3A~3D（图1）。图1肠道病毒基因组结构1.3病毒颗粒结构CV-B5病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24~30nm，无包膜和[29]突起。CV-B5的病毒外壳由VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白组成，病毒基因组RNA被包裹在外壳的内部，VP1、VP2和VP3三个多肽暴露在病毒[30][31]外壳的表面，而VP4包埋在病毒外壳的内侧与病毒核心紧密连接，病毒的[32]主要中和抗原表位位于VP1区（图2）。6 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图2肠道病毒颗粒结构1.4病毒入胞机制CV-B5作为一种无包膜病毒在进入哺乳动物细胞的过程中，首先需要附着到[33]细胞膜表面，接着找到病毒受体并与之结合，然后依赖受体介导的内吞作用[34]进入内吞小体，最后病毒在细胞内发生脱衣壳反应释放出病毒基因组，从而[35]开始病毒复制和蛋白翻译。在整个入胞过程中，CV-B5利用衰变加速因子（decayacceleratingfactor,DAF）和柯萨奇病毒腺病毒受体（coxsackieandadenovirnsreceptor,CAR）两种受体蛋白完成，其中DAF作为早期病毒与细胞附[36][37-38]着的受体，而CAR参与病毒进入及病毒复制过程。2CV-B5研究现状及存在的问题2.1动物模型目前，针对CV-B5感染引起的疾病尚无特异性的治疗药物，而PV和EV-A71两种肠道病毒疫苗的成功上市为CV-B5相关疾病的防控提供了方向。因此，为了防控CV-B5引起的疾病，亟需研发出安全、有效的CV-B5疫苗。良好的动物模型对于研究病毒的感染、致病机理以及评价疫苗保护效果和药物治疗效果至关重要。选择合适的动物是建立动物模型的关键。CV-B5作为HEV的一员，人类是其唯一的自然宿主，这使得关于CV-B5病原性及疫苗的研究变得复杂。因为与人类较近[39]的亲缘关系，灵长类动物成为人类传染病感染模型的理想动物，其中以黑猩[40-42]猩、食蟹猴、猕猴等较常见。但是由于受到伦理及经费的影响，使用非人灵长类动物进行大规模的疫苗评价工作不现实。在CV-B5动物模型研究方面，有文献报道，猪经CV-B5Faulkner株感染后可[43]在咽拭子及粪便中检测到病毒，但不引起临床疾病。有学者利用3-4周龄C3H/HeJ小鼠感染CV-B5后研究小鼠组织中病毒分布及病理变化，发现CV-B5感[44]染引起了胰腺炎。Zhong等发现CV-B5感染3-4周龄BALB/c小鼠，6d后小鼠出[45]现间质性肺炎和心肌炎。目前尚无针对CV-B5引起的重症或者HFMD开展的疫7 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文苗评价研究，亟需建立适用于CV-B5疫苗评价的动物模型。现阶段，国内外建立HEV动物模型及疫苗评价研究主要采用小于7日龄的乳[46]鼠，乳鼠模型具有饲养简单、动物来源方便、适宜大量应用特别是易于标准化[47]等优点。2011年刘娟等发现1日龄和7日龄ICR小鼠经腹腔感染EV-A71后，出现了精神萎靡、肢体瘫痪甚至死亡的症状，而21日龄小鼠则能自行恢复，从而建立了EV-A71乳鼠模型。Mao等建立了疫苗评价用CV-A16感染的新生儿乳鼠模型，[48]并通过被动保护实验证实了CV-A16灭活疫苗及VLP疫苗的保护效果，Zhang[49]等建立了CV-A6抗病毒药物和疫苗评价用乳鼠模型，为CV-B5动物模型的研究提供了理论基础和指导方向。2.2感染性克隆重组DNA技术是一种通过在DNA水平上对病毒的基因组进行修饰和改造来[50]了解病毒基因组结构和功能的技术手段。不过，对于复制周期不经过DNA过程的非逆转录RNA病毒而言，不能直接利用重组DNA技术来研究病毒基因组，而感染性克隆技术的出现为人们解决了这个难题。病毒的感染性克隆技术作为一种主要利用RNA病毒复制和转录特点的反向遗传技术，首先通过RT-PCR将病毒RNA构建成全长cDNA，然后在cDNA水平上利用重组DNA技术进行操作，最终[51]实现研究RNA病毒基因组结构和功能的目的。感染性克隆技术由于实现了病[52]毒的“复活”，又被称为“病毒拯救”。大部分感染性克隆的构建必须依赖于病毒全长cDNA，人们把构建得到的病毒全长cDNA克隆到合适的质粒载体中，然后对质粒载体进行人工改造，接着在转录启动子的作用下体外转录为RNA，最后将RNA转染到宿主细胞中合成具有感染性的病毒粒子；也可将含有全长cDNA的质粒直接转染到宿主细胞中合成病[53]毒RNA，最后再形成具有感染性的病毒粒子。PV是第一个被构建出全长cDNA[54]感染性克隆的RNA病毒。近年来的研究已经将感染性克隆技术应用到多种[55-56]RNA病毒，如猪圆环病毒、戊型肝炎病毒等。目前，已有CV-B3、ECHO-9、[57-59]CV-16等多种肠道病毒构建了感染性克隆，但是没有CV-B5感染性克隆的报道。2.3假病毒的研究及应用病毒依据不同的结构特征，可分为包膜病毒和非包膜病毒。包膜病毒假病毒是指一种病毒通过整合其他病毒的包膜蛋白形成的一种具有外源性病毒包膜却保持自身基因组特性的病毒。无包膜病毒假病毒的构建，需首先构建2个质粒，即衣壳蛋白表达子质粒和复制子质粒，其中复制子质粒为用报告基因替代病毒基因组中的衣壳蛋白序列。将病毒的衣壳蛋白表达子和转录为RNA的复制子共转8 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文染到真核细胞中，即可包装出与原病毒衣壳蛋白相同的假病毒。与活病毒相比，[60]假病毒为复制缺陷型，只能进行单轮感染，具有较好的安全性。假病毒技术作为近年来兴起的一种新型病毒学研究手段，被广泛应用于中和抗体检测、抗病毒药物筛选以及动物感染模型构建的研究中。目前已有EV-A71、[61-63]CV-A16、CV-B3等多种肠道病毒构建了假病毒。假病毒感染模型多采用成年小鼠，可直接通过活体观察疫苗免疫效果。相对于活病毒乳鼠模型感染日龄小，需免疫新生乳鼠或采用母传抗体来评价疫苗免疫效果，假病毒小鼠模型具有个体[64]差异小，操作简单，易于观察和检测等优点。Zhou等建立了EV-A71假病毒SCARB2转基因小鼠感染模型，通过活体成像技术观察感染后小鼠来评价疫苗免疫效果。3本研究的目的和意义本研究应用江苏省2013年HFMD患儿标本筛选、分离的野生型CV-B5/JS417病毒株，建立了首个CV-B5发病乳鼠模型，并进行了乳鼠组织嗜性研究及灭活疫苗保护效果评价，为CV-B5临床致病性的研究以及CV-B5疫苗的研发和评价做铺垫，对CV-B5引起重症和HFMD的防控具有至关重要的意义。同时，本研究构建了CV-B5全长cDNA感染性克隆及假病毒，为进一步了解CV-B5基因组结构和功能奠定了基础。此外，还利用构建的CV-B5假病毒与BALB/c小鼠结合，建立疫苗评价用假病毒小鼠感染模型，并进行CV-B5灭活疫苗在活体动物体内的主动免疫和被动保护效果评价，用于疫苗评价及病毒致病机制研究。4主要技术路线9 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文第一部分CV-B5野生型乳鼠模型的建立及初步应用引言良好的动物模型对于研究病毒的感染、致病机理以及评价疫苗保护效果和药物治疗效果至关重要。选择合适的动物是建立动物模型的关键。目前国内外研究发现，多种肠道病毒可使乳鼠发病甚至死亡，因此建立HEV动物模型及疫苗评价研究主要采用小于7日龄的乳鼠。乳鼠模型具有动物来源方便、饲养简单、适宜大量应用等优点。目前，EV-A71、CV-A16、CV-B3等肠道病毒均建立了疫苗或者抗病毒药物评价用乳鼠模型。本研究采用江苏省2013年HFMD患儿标本筛选、分离的野生型CV-B5/JS417病毒株建立了稳定的乳鼠致死模型，并且对疫苗主动免疫效果及被动保护效果进行了初步评价。一、实验材料1仪器仪器供应商移液器Eppendorf倒置显微镜Nikon恒温水浴箱Julabo高速离心机Beckman电子分析天平Sartorius37°C恒温CO2培养箱Revco无菌超滤膜（0.2μm）PallCorporation生物安全柜HEALFORCETMMagMAXexpress磁粒处理仪LifeTechnoligies超声波细胞破碎机Sonics&Materials7500FastPCR仪ABI2材料2.1细胞非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）购自美国模式培养物保藏所（AmericanTypeCultureCollection,ATCC）。2.2实验动物10 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文SPF级1、3、5、7、14日龄BALB/c乳鼠（每窝平均6~10只，每窝均带母鼠，按窝随机分组），8周龄BALB/c雌鼠、雄鼠均购自中国食品药品检定研究院实验动物中心。2.3CV-B5病毒CV-B5攻毒株和疫苗株均为本实验室分离纯化的野生型CV-B5/JS417致死毒株，分离自2013年江苏省HFMD患儿标本。CV-B5/JS417病毒使用Vero细胞进行传代扩增，将病毒感染的细胞反复冻融3次后于4℃下3900g离心10min，然后用0.2μm无菌滤膜过滤，分装冻存于-80℃。2.4CV-B5灭活疫苗CV-B5灭活疫苗为CV-B5/JS417病毒采用0.2%甲醛溶液于37℃摇床灭活3d制备而成。2.5CV-B5抗血清小鼠体外中和用CV-B5抗血清为CV-B5/JS417灭活疫苗免疫后小鼠血清，中和抗体滴度为768；免疫组织化学用CV-B5小鼠一抗为CV-B5/JS417灭活疫苗免疫后小鼠高效价血清，中和抗体滴度为6144。3主要试剂3.1试剂试剂生产商DMEM培养基Hyclone胰蛋白酶AMRESCOL-谷氨酰胺母液（0.1mol/L）Sigma青链霉素双抗AVL82270Gibco胎牛血清杭州四季青生物工程有限公司过氧化物酶阻断溶液福州迈新生物技术开发有限公司柠檬酸盐抗原修复液福州迈新生物技术开发有限公司中性树胶（水剂）福州迈新生物技术开发有限公司苏木素体细胞快速染色液福州迈新生物技术开发有限公司免疫组化用磷酸盐缓冲液福州迈新生物技术开发有限公司免疫组化用抗体稀释剂福州迈新生物技术开发有限公司酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物福州迈新生物技术开发有限公司11 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文即用型羊血清封闭液武汉博士德生物工程有限公司甲醇（分析纯）北京化工厂甲醛溶液（分析纯）北京化工厂3.2试剂盒试剂盒生产商TMMagMAX-96ViralRNAIsolationKit美国AMBIONIncTMOneStepPrimeScriptRT-PCRKit宝生物工程(大连)有限公司3.3免疫组织化学用试剂配制（1）磷酸盐缓冲液(PBS)：按照说明书配成0.01M，pH7.4的工作液。（2）柠檬酸盐抗原修复液：按照说明书配成0.01M，pH6.0的工作液。（3）CV-B5一抗工作液：用抗体稀释剂将CV-B5小鼠一抗进行稀释。（4）10%中性缓冲福尔马林：向100mL甲醛溶液加入900mL的0.01MPBS。二、实验方法1CV-B5野生型乳鼠模型的建立1.1CV-B5病毒分离本研究以2013年收集的江苏省邳州县HFMD患儿标本为研究对象，经Vero细胞分离、纯化后获得一株可稳定复制的病毒株，经全基因序列检测证实为CV-B5病毒，基因组全长为7370bp，命名为CV-B5/JS417。经病毒滴度检测，该CV-B58病毒株的病毒滴度为3.16×10CCID50/mL。1.2乳鼠品系选择7将CV-B5/JS417病毒以3.16×10CCID50/只的剂量，分别腹腔攻击6~10只SPF级1日龄BALB/c、C57BL/6、NIH、ICR及KM乳鼠。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。1.3乳鼠日龄选择7将CV-B5/JS417病毒以3.16×10CCID50/只的剂量，分别腹腔攻击6~10只SPF级新生1、3、5、7、14日龄BALB/c乳鼠。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。1.4攻毒方式选择采用CV-B5/JS417病毒，分别通过腹腔、颅内、口服三种方式攻击6~10只SPF12 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文7级3日龄BALB/c乳鼠，其中腹腔攻毒剂量为3.16×10CCID50，而颅内及口服方式6攻毒剂量为6.32×10CCID50。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。1.5攻毒剂量选择5将CV-B5/JS417病毒进行10倍系列稀释配置成从3.16×10~3.16CCID50的6个攻毒剂量，分别腹腔攻击6~10只SPF级3日龄BALB/c乳鼠，100μL/只；同时设置一组阴性对照，腹腔注射100μL含2%胎牛血清（Fetalbovineserum,FBS）的DMEM（2%DMEM）培养基。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。根据攻毒后乳鼠的死亡比率计算LD50，选择合适的CV-B5乳鼠模型攻毒剂量，然后在该剂量下进行6次重复实验确定CV-B5乳鼠模型的稳定性，每次实验攻击6~10只乳鼠。1.6攻毒后乳鼠组织病理变化（1）以1.5中确定的CV-B5腹腔攻毒剂量进行乳鼠模型攻毒实验，以攻毒后濒死状态乳鼠为研究对象，作为阴性对照乳鼠注射相同体积2%DMEM培养基。将小鼠麻醉后分别取脑、脊柱、心、肝、肺、肾、脾、肠和后肢肌肉等9个组织或器官放入10%福尔马林溶液中固定2d以上，然后用石蜡包埋后制成切片。（2）将切片分别浸泡在100%二甲苯I15min，100%二甲苯II15min，100%乙醇I5min，100%乙醇II5min，90%乙醇2min，80%乙醇5min，70%乙醇5min，自来水5min，去离子水5min水化，经HE染色进行组织病理学检查。1.7免疫组织化学研究1.7.1CV-B5免疫细胞化学为确定CV-B5抗血清（效价为6144）作为免疫组织化学一抗工作液的浓度，先用CV-B5/JS417进行免疫细胞化学，按照以下步骤进行实验。（1）制作细胞爬片：分别将CV-B5/JS417病毒感染3.5h、4h、4.5h的Vero细胞均匀涂于盖玻片上晾干，每个感染时间点5张切片，同时每个时间点设置一个细胞空白对照。（2）用4℃预冷甲醇固定10min，PBS洗3次，5min/次。（3）擦干PBS放于湿盒，滴加羊血清封闭液100μL，37℃孵育30min。（4）配工作浓度为1:50、1：100、1：300、1:500、1:1000的一抗工作液，实验组切片去掉封闭液，滴加100μLCV-B5一抗工作液37℃孵育1h；阴性对照组切片于37℃下继续封闭1h。13 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文（5）去掉CV-B5一抗工作液或血清封闭液，PBS洗3次，5min/次。擦干后放入湿盒，滴加100μL酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，37℃下孵育30min。（6）去掉酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，PBS洗3次，5min/次。擦干放于湿盒，滴加100μLDAB工作液，37℃显色5~10min，观察到棕黄色即可终止。（7）取出切片，自来水洗3次，5min/次。（8）滴加100μL苏木素染色15s，自来水洗后再于自来水中返蓝15min。（9）将切片分别浸泡在80%乙醇4min，90%乙醇4min，100%乙醇I4min，100%乙醇II4min，100%二甲苯Ⅰ15min，100%二甲苯Ⅱ15min切片组织透明。（10）光学树脂胶胶封片后于显微镜下观察。判定切片结果：强阳性-棕褐色；阳性-棕黄色；弱阳性-浅黄色；阴性-无着色。1.7.2攻毒后乳鼠免疫组化研究（1）将脱蜡水化后的免疫组化用切片缓慢放进盛有柠檬酸盐的抗高温微波盒中进行抗原修复，中高火微波加热10~15min，如有液体损失直接加入去离子水。室温自然冷却后取出切片，蒸馏水洗3次，5min/次。（2）取出切片滴加100μL过氧化物酶阻断溶液，37℃孵育15min。（3）将上述切片用PBS洗3次，5min/次。擦干PBS放入湿盒，滴加100μL羊血清封闭液，37℃孵育30min。（4）去掉实验组切片封闭液，滴加100μL1:500稀释的CV-B5一抗工作液37℃孵育1h；对照组切片继续于37℃封闭1h。剩余实验步骤同1.7.1中（5）~（10）。1.8攻毒后乳鼠各组织病毒载量研究为比较攻毒后乳鼠各组织在不同时间点的病毒含量变化，同时进一步验证攻毒后乳鼠组织病理变化，本实验进行了病毒载量研究，按照以下实验步骤进行。（1）重复腹腔攻毒建立CV-B5乳鼠模型实验，分别在攻毒后6h、12h、24h、72h、120h、168h共计6个时间点，将攻毒后乳鼠分别心脏穿刺取血，再无菌取脑、心、肝、肺、肾、脾、肠、脊髓以及后肢肌肉共计10处器官或组织，每个时间点设置3只乳鼠。将血样及组织称重后贮存在-80℃，备用。（2）实验前将上述组织以无菌PBS匀浆并稀释至10%（重量/体积），血样稀释至体积比为10%。组织样品再经过3次冻融循环后破碎放冰上，然后在4℃下TM3900g离心10min。取每个样品的上清液各50L，按照MagMAX-96ViralRNATMIsolationKit说明书，利用MagMAXexpress磁粒处理仪将上述组织中的病毒RNA提取出来。7-1-2（3）将3.16×10CCID50剂量的CV-B5病毒原液进行10倍系列稀释：10、10、14 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文-3-4-5-6-7TM10、10、10、10、10，取每个样品各50L，按照MagMAX-96ViralRNATMIsolationKit说明书，利用MagMAXexpress磁粒处理仪将这些病毒RNA提取出来。TM（4）将上述提取出来的RNA按照OneStepPrimeScriptRT-PCRKit说明使用ABI7500FastPCR仪进行一步法荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）测定不同时间点不同组织中CV-B5的病毒载量，以10倍系列稀释后的CV-B5病毒原液的病毒载量作为标准曲线。反应体系如下：1）按下列组份配置qRT-PCR反应液（反应液配制在冰上进行）Total20L2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10LTaKaRaExTaqHS0.4LPrimeScriptRTEnzymeMixII0.4LROXReferenceDyeDyeⅡ0.4LPCRForwardPrimer（10μM）0.4LPCRReversePrimer（10μM）0.4LProbe0.8LTotalRNA4.0LRNaseFreedH2O3.2L2)CV-B5qRT-PCR引物和探针序列引物/探针序列（5’-3’）PCRForwardPrimerATCTGCCTGCGTCTACTTCACTPCRReversePrimerCGCCTGTCGTGTTGTAACCAProbefam-TGAGAATTCAGGATCCAAACGCTATGC-BHQ13)进行RealTimeOneStepRT-PCR反应Stage1、2：反转录反应Reps：142℃5min95℃10sStage3：PCR反应Reps：4095℃5s15 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文60℃34s（5）根据qRT-PCR结果，按照CV-B5病毒稀释液浓度从低到高设定病毒载量1234567分别为10U、10U、10U、10U、10U、10U、10U做标准曲线，根据标准曲线计算组织样品中相对病毒稀释液的病毒载量，以Lg（U）表示。2CV-B5野生型乳鼠模型的初步应用2.1主动免疫效果评价通过考察母传中和抗体能否保护3日龄BALB/c乳鼠免受CV-B5/JS417病毒的攻击来评价乳鼠主动免疫效果。本实验用甲醛灭活后的CV-B5/JS417疫苗及2%DMEM分别以1针和2针免疫方式腹腔接种8周龄雌性BALB/c小鼠，并令其与雄性小鼠交配，这些雌性小鼠在交配后28d左右产出乳鼠。待乳鼠生长到3日龄时，再将CV-B5/JS417按照确定的剂量进行腹腔攻毒，观察每窝乳鼠的存活率。（1）1针免疫保护效果评价：选择10只SPF级8周龄BALB/c雌鼠，随机分为4个实验组，1个对照组，2只小鼠/组。允许每组雌鼠与1只雄性BALB/c小鼠交配，87交配后2w分别腹腔免疫抗原含量分别为1.58×10CCID50、1.58×10CCID50、651.58×10CCID50、1.58×10CCID50的CV-B5灭活疫苗或2%DMEM培养基。免疫后约5~12d雌鼠生产，待出生后乳鼠生长至3日龄时，按照确定的攻毒剂量对实验组和对照组乳鼠分别腹腔攻击CV-B5/JS417病毒。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。（2）2针免疫保护效果评价：选择10只SPF级8周龄BALB/c雌鼠，随机分为4个实验组，1个对照组，2只小鼠/组。每只小鼠分别腹腔免疫抗原含量分别为87651.58×10CCID50、1.58×10CCID50、1.58×10CCID50、1.58×10CCID50的CV-B5灭活疫苗或2%DMEM培养基。免疫后1h，允许每组雌鼠与1只雄性BALB/c小鼠交配。初次免疫后2w分别以相同剂量的CV-B5灭活疫苗加免一针。加免后约5~12d雌鼠生产，待出生后乳鼠生长至3日龄时，按照确定的攻毒剂量对实验组和对照组乳鼠分别腹腔攻击CV-B5/JS417病毒。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。2.2被动保护效果评价将2%DMEM培养基和5个3倍系列稀释（即1:15、1:45、1:135、1:405、1:1215）3的CV-B5抗血清（中和抗体滴度为768）分别与3.16×10CCID50的CV-B5/JS417病毒于37℃孵育1h。选择6组SPF级3日龄BALB/c乳鼠，6~10只/组，分别腹腔注射上述6种样本100L/只。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。3乳鼠模型颅内攻毒实验16 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文3.1颅内攻毒剂量选择4将CV-B5/JS417病毒进行10倍系列稀释成范围为6.32×10~6.32CCID50的5个攻毒剂量，分别颅内攻击6~10只SPF级3日龄BALB/c乳鼠，20μL/只；同时设置1组阴性对照，颅内注射2%DMEM培养基，20μL/只。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。3.2颅内攻毒后乳鼠组织病理变化以3.1中确定的CV-B5颅内攻毒剂量重复攻毒实验，取濒死乳鼠组织进行病理研究，剩余实验步骤同1.6。3.3颅内攻毒后乳鼠免疫组化研究将颅内攻毒乳鼠组织切片进行免疫组化研究，剩余实验步骤同1.7.2。三、实验结果1CV-B5野生型乳鼠模型的建立1.1确定乳鼠品系为确定CV-B5乳鼠模型所用乳鼠品系，将CV-B5/JS417病毒分别腹腔注射57种不同品系的1日龄乳鼠，每个品系6~10只乳鼠。如图1.1显示，在3.16×10CCID50/只的攻毒剂量下，5种不同品系的乳鼠均出现不同程度的发病及死亡症状，其中C57BL/6、NIH、ICR、KM乳鼠在攻毒后4~6d存活率为25%~80%，而BALB/c乳鼠在攻毒后5d全部死亡。表明BALB/c小鼠对CV-B5病毒最敏感，因此选择BALB/c小鼠建立CV-B5攻毒模型。图1.1CV-B5/JS417对不同品系乳鼠的毒力作用1.2确定乳鼠日龄17 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文7为确定CV-B5乳鼠模型所用乳鼠日龄，将CV-B5/JS417病毒以3.16×10CCID50/只的剂量分别腹腔攻击6~10只1、3、5、7、14日龄BALB/c乳鼠。结果如图1.2所示：CVB5/JS417可使新生1、3日龄乳鼠出现发病症状并全部死亡，发病和死亡时间随乳鼠日龄的增长而延长；而对5、7、14日龄乳鼠，至攻毒后21日，乳鼠的存活率为50%及以上。因此选择3日龄BALB/c乳鼠建立CV-B5攻毒模型。图1.2不同日龄乳鼠经腹腔注射CV-B5/JS417后存活率1.3确定攻毒方式为确定CV-B5乳鼠模型合适的攻毒方式，将CV-B5/JS417病毒分别通过腹腔、颅内、口服方式攻击6~10只3日龄BALB/c乳鼠。结果如图1.3所示：三种攻毒方式均能使3日龄BALB/c乳鼠全部死亡。其中口服方式更加符合CV-B5自然感染途径，但是由于乳鼠日龄较小，口服方式不易操作，因此选择腹腔攻毒方式建立CV-B5乳鼠模型。同时，本实验对颅内攻毒方式进行了研究，比较两种攻毒方式攻毒后乳鼠组织嗜性的不同。图1.3经不同方式注射CV-B5/JS417后乳鼠存活率18 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文1.4确定攻毒剂量和计算LD50为了解腹腔攻毒方式CV-B5/JS417对乳鼠模型的毒力及确定攻毒剂量，将病5毒进行10倍系列稀释后腹腔攻击6~10只3日龄BALB/c乳鼠。在3.16×10~3.16CCID50/只稀释度攻击时，除了3.16CCID50/只稀释度乳鼠在攻毒后全部存活外，其他乳鼠均在攻毒后3~7d出现不同程度的消瘦、精神不振、颤抖、佝偻、脱毛、后肢瘫痪等症状，进而在5~11d出现死亡。将乳鼠发病症状分为5个等级（表1.1）。53如图1.4及图1.5显示，在3.16×10~3.16×10CCID50/只攻毒剂量下，3日龄BALB/c乳鼠的死亡比率均达100%，死亡时间分别为攻毒后4~11d。316CCID50/只和31.6CCID50/只剂量组乳鼠的存活率分别为28.5%和80%。3.16CCID50/只剂量组别未出现症状。以上结果显示，乳鼠的死亡比率呈现剂量-效应关系。根据攻毒时乳鼠的死亡情况，通过Reed-Muench法计算LD50为123CCID50。选择33.16×10CCID50/只（即26LD50/只）作为CV-B5/JS417100%稳定致死攻毒剂量。表1.1攻毒后乳鼠发病症状分级级别症状0健康1消瘦/精神不振2颤抖3佝偻/脱毛4后肢瘫痪5濒死/死亡图1.4经腹腔注射CV-B5/JS417后乳鼠发病症状呈攻毒剂量依赖性19 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图1.5经腹腔注射不同剂量CV-B5/JS417后乳鼠存活率1.5CV-B5对乳鼠模型的毒力及重复性研究为了验证CV-B5/JS417对乳鼠模型的毒力及保证乳鼠模型的重复性，在33.16×10CCID50/只（即26LD50/只）攻毒剂量下进行了6次重复实验。结果表明，在该剂量攻毒时，可保证攻毒后乳鼠全部出现消瘦、精神不振、佝偻、脱毛、后肢瘫痪等症状（图1.6），并最终死亡。乳鼠在攻毒后第3~5d开始发病，第8~11d全部死亡，死亡比率为100%，发病时间及死亡比率稳定，重现性良好（表1.2）。因此，采用26LD50/只剂量的CV-B5/JS417病毒腹腔攻击3日龄BALB/c乳鼠作为CV-B5乳鼠攻毒模型。图1.6乳鼠感染CV-B5/JS417后出现消瘦、佝偻、脱毛、后肢瘫痪症状的代表性照片20 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文表1.226LD50/只剂量CV-B5/JS417病毒攻毒时实验的重复性实验次数发病时间(d)开始死亡时间(d)全部死亡时间(d)死亡比率(%)148810023481003589100434910053410100634111001.6攻毒后乳鼠组织病理变化为了解腹腔攻毒方式CV-B5/JS417在乳鼠模型体内的组织病理变化，选择濒死乳鼠进行组织病理研究。如表1.3和图1.7显示：腹腔攻击CV-B5/JS417病毒后，乳鼠肝脏细胞坏死、炎性细胞浸润；大脑皮层、丘脑、中脑及脑桥神经细胞坏死伴血管周围炎性细胞浸润；脊髓全段神经细胞坏死伴胶质细胞反应；心脏心肌细胞局灶性嗜酸性变性坏死；后肢肌肉骨骼肌出现肌纤维嗜酸性坏死、坏死性肌炎以及肌芽组织再生修复肌纤维组织；脊柱旁肌肉肌纤维间质炎性细胞浸润。53同时研究发现，高剂量（3.16×10CCID50）比低剂量（3.16×10CCID50）腹腔注射CV-B5/JS417时，乳鼠肝脏细胞病变程度更严重。表1.3BALB/c小鼠腹腔感染CV-B5/JS417后组织病理改变情况器官/组织病理改变病变程度脑部大脑皮层神经细胞坏死伴炎性细胞浸润++丘脑、中脑、脑桥神经细胞坏死+脊髓脊髓全段神经细胞变性坏死伴胶质细胞反应++脊柱旁肌肉肌纤维间质炎性细胞浸润±后肢骨骼肌肌纤维坏死性肌炎++肌纤维嗜酸性变性、肌芽组织±心脏心肌细胞嗜酸性变性坏死±肝脏肝细胞坏死、炎性细胞浸润+注：“病变程度”栏中“-”表示未见明显病理学改变；“±”表示极轻度改变；“+”表示轻度改变；“++”表示中度改变；“+++”表示重度改变。21 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图1.7腹腔攻击CV-B5/JS417后BALB/c乳鼠组织HE染色结果图中A、C、E、G、I分别是对照组乳鼠的大脑皮层、脊髓、心肌、后肢骨骼肌、肝脏组织切片HE染色结果，B、D、F、H、J分别为实验组濒死乳鼠相应组织HE染色结果。由图可见，腹腔攻毒后乳鼠大脑皮层神经细胞坏死伴围管浸润（B）；脊髓神经细胞变性坏死伴胶质细胞反应（D）；心肌细胞嗜酸性变性坏死（F）；后肢肌肉骨骼肌肌纤维坏死性肌炎（H）；肝脏肝细胞坏死、炎性细胞浸润（J）。22 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文1.7免疫组织化学研究1.7.1CV-B5免疫细胞化学本实验采用CV-B5/JS417分别感染Vero细胞3.5h、4h、4.5h后用不同稀释度的CV-B5一抗工作液进行免疫细胞染色。结果显示，3个不同感染时间点均能呈现不同程度的显色，每个时间点显色程度随着一抗工作液稀释倍数的升高而减弱。其中，感染时间为4.5h、一抗工作液浓度为1:500稀释时，染色效果最好（图1.8）。图1.8CV-B5感染Vero细胞4.5h后免疫细胞化学结果A、B分别代表对照组和实验组1.7.2攻毒后乳鼠免疫组化研究为了解腹腔攻毒方式CV-B5/JS417在乳鼠模型体内的组织分布，选择濒死乳鼠进行免疫组化研究。如图1.9显示：腹腔攻击CV-B5/JS417病毒后，乳鼠的大脑皮层、脊髓、心肌、后肢骨骼肌、肝脏组织可见免疫组化阳性反应。23 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图1.9腹腔攻击CV-B5/JS417后BALB/c乳鼠组织免疫组化结果图中A、C、E、G、I分别是对照组乳鼠大脑皮层、脊髓、心肌、后肢肌肉、肝脏组织免疫组化结果，B、D、F、H、J分别为攻毒后濒死乳鼠大脑皮层、脊髓、心肌、后肢肌肉、肝脏组织免疫组化结果。由图可见腹腔攻毒后乳鼠大脑皮层（B）、脊髓（D）、心肌（F）、后肢肌肉（H）、肝脏（J）呈现免疫组化阳性反应。1.8攻毒后乳鼠各组织病毒载量研究24 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文将腹腔攻毒后不同时间点BALB/c乳鼠体内各器官或组织中的病毒载量进行比较，结果如图1.10所示：在攻毒后6~12h，乳鼠体内各器官或组织中病毒载量基本一致，均处于较低水平，肝脏和肠道病毒载量相对较高。在12~72h，肝脏、肠道以及脾脏中病毒载量明显上升，在72~168h之间呈现降低趋势。在12~24h之间，血、心脏、肺脏以及肾脏中病毒载量上升，在24~168h保持不变。在12~168h之间，脑、脊髓、后肢骨骼肌中病毒载量均呈现逐渐增长趋势，并且在120h达到最高值，在168h与120h无显著差异。根据以上结果推测：CV-B5/JS417病毒经腹腔攻击BALB/c乳鼠时，可能首先感染肝脏和肠道组织，经淋巴窦再次入血，通过血液循环到达体内多个组织或器官，最后在嗜病毒神经组织内大量增殖，如脑、脊髓等。图1.10攻毒后不同时间点乳鼠体内组织病毒载量2CV-B5野生型乳鼠模型的初步应用2.1主动免疫效果评价25 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文（1）如图1.11所示，对照组母鼠所产3日龄乳鼠在攻毒后第5d开始死亡，第10d全部死亡。而不同剂量的CV-B5灭活疫苗免疫母鼠一针后，可诱导乳鼠产生56不同程度的免疫保护，其中1.58×10CCID50和1.58×10CCID50剂量组乳鼠均在攻78毒后第13d全部死亡，1.58×10CCID50剂量组乳鼠存活率为30%，1.58×10CCID507剂量组乳鼠存活率为100%。经Reed-Muench法计算，抗原含量为3.05×10CCID50的CV-B5灭活疫苗一针免疫母鼠后可保护半数乳鼠存活，即一针免疫ED50为73.05×10CCID50。（2）如图1.12所示，对照组母鼠所产3日龄乳鼠在攻毒后第5d开始死亡，第10d全部死亡；而不同剂量的CV-B5灭活疫苗免疫母鼠两针后，可诱导乳鼠产生5中和抗体应答，并呈现剂量-效应关系，其中1.58×10CCID50剂量组乳鼠在攻毒67后第20d全部死亡，1.58×10CCID50剂量组乳鼠存活率为30%，1.58×10CCID50乳8鼠存活率为44.4%，1.58×10CCID50剂量组乳鼠存活率为100%。经Reed-Muench6法计算，抗原含量为9.58×10CCID50的CV-B5灭活疫苗两针免疫母鼠后可保护半6数乳鼠存活，两针免疫ED50为9.58×10CCID50。图1.11CV-B5母传保护一针免疫效果评价图1.12CV-B5母传保护两针免疫效果评价2.2被动保护效果评价26 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文如图1.13所示，对照组乳鼠在攻毒后第8d开始出现死亡，第10d全部死亡。而不同稀释倍数CV-B5抗血清灭活疫苗免疫母鼠两针后1:1215抗血清稀释组乳鼠在攻毒后第11d乳鼠全部死亡；1:405、1:135、1:45抗血清稀释组乳鼠存活率分别为28.6%、66.7%和83.3%，1:15抗血清稀释组乳鼠存活率为100%。与2%DMEM培养基相比，应用1:15、1:45、1:135及1:405稀释的抗血清与CV-B5/JS417体外中和可降低乳鼠的死亡率。经Reed-Muench法计算，CV-B5抗血清1:200稀释后与CV-B5/JS417体外中和1h可保护半数实验乳鼠存活，中和抗体ED50为3.8。图1.13CV-B5抗血清体外中和作用效果3乳鼠模型颅内攻毒实验3.1确定颅内攻毒剂量及计算LD50为了解颅内攻毒方式CV-B5/JS417病毒对乳鼠模型毒力并确定攻毒剂量，将病毒进行10倍系列稀释后分别颅内攻击6~10只3日龄BALB/c乳鼠。在46.32×10~6.32CCID50/只稀释度攻击时，除了6.32CCID50/只稀释度乳鼠全部存活外，其他乳鼠均在攻毒后出现不同程度的消瘦、精神不振、颤抖、佝偻、后肢瘫4痪甚至死亡。如图1.14显示，在6.32×10~632CCID50剂量下，乳鼠死亡比率均达100%，死亡时间分别为攻毒后4~11d。63.2CCID50剂量组乳鼠存活率为28.6%，6.32CCID50剂量组未出现症状。以上结果表明，乳鼠的死亡比率与攻毒剂量呈剂量-效应关系。根据攻毒后乳鼠死亡情况，通过Reed-Muench法计算LD50为31.7CCID50。选择632CCID50（即20LD50）为CV-B5/JS417颅内攻毒100%稳定致死剂量。27 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图1.14颅内攻击不同剂量CV-B5/JS417后乳鼠存活率3.2颅内攻毒后乳鼠组织病理变化为了解颅内攻毒方式CV-B5/JS417病毒在小鼠模型体内的组织病理变化，选择濒死乳鼠进行组织病理研究。如表1.4及图1.15显示：颅内攻击CV-B5/JS417病毒后，乳鼠大脑皮层神经细胞坏死伴围管浸润，大脑海马区、丘脑神经细胞坏死，中脑神经细胞坏死、围管浸润、软化灶，脑桥神经细胞嗜酸性坏死伴微管浸润；脊髓全段神经细胞坏死；心脏心肌细胞嗜酸性变性坏死；后肢骨骼肌出现肌纤维嗜酸性坏死、肌芽组织以及坏死性肌炎；脊柱旁肌肉肌纤维嗜酸性变性、坏死。表1.4BALB/c小鼠颅内感染CV-B5/JS417后组织病理改变情况器官/组织病理改变病变程度大脑大脑皮层神经细胞坏死伴围管浸润++海马、丘脑神经细胞坏死++中脑神经细胞坏死、围管浸润、软化灶++脑桥神经细胞嗜酸性坏死伴围管浸润+脊髓脊髓全段神经细胞变性坏死++心脏心肌细胞嗜酸性变性坏死+后肢骨骼肌肌纤维嗜酸性变性坏死、炎性细胞浸润、肌芽组织+脊柱旁肌肉肌纤维嗜酸性变性、萎缩±注：“病变程度”栏中“-”表示未见明显病理学改变；“±”表示极轻度改变；“+”表示轻度改变；“++”表示中度改变；“+++”表示重度改变。28 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图1.15颅内攻击CV-B5/JS417后BALB/c乳鼠组织HE染色结果图中A、C、E、G、I分别为对照组乳鼠大脑皮层、海马区、脊髓、心肌、后肢骨骼肌组织切片HE染色结果，B、D、F、H、J分别为攻毒后濒死乳鼠相应组织HE染色结果。由图可见，感染后乳鼠大脑皮层神经细胞坏死伴围管浸润（B）；大脑海马神经细胞坏死（D）；脊髓神经细胞坏死（F）；心肌细胞嗜酸性变性坏死（H）；后肢骨骼肌肌纤维嗜酸性变性坏死、炎性细胞浸润（J）。29 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文3.3颅内攻毒后乳鼠免疫组化研究为了解颅内攻毒方式CV-B5/JS417在乳鼠模型体内的组织分布，选择濒死乳鼠组织进行免疫组化研究。结果如图1.16所示，颅内注射的乳鼠在大脑皮层、丘脑和脊髓出现强阳性反应，与病理变化结果相一致；心肌组织和后肢骨骼肌没有出现阳性反应。结合组织病理及免疫组化结果推测：脑和脊髓可能是颅内攻毒时CV-B5在乳鼠体内的主要复制位点。图1.16颅内攻击CV-B5/JS417后BALB/c乳鼠组织免疫组化结果图中A、C、E分别是对照组乳鼠大脑皮层及海马、丘脑、脊髓组织切片免疫组织化学结果，B、D、F分别为攻毒后濒死乳鼠大脑皮层、丘脑、脊髓的免疫组织化学结果。由图可见颅内攻毒后乳鼠大脑皮层（B）、丘脑（D）、脊髓（F）呈现免疫组化阳性反应。四、讨论本研究选用2013年从江苏省HFMD患儿标本中分离得到的野生型CV-B5/JS417病毒株建立乳鼠模型。通过对乳鼠品系、日龄、攻毒方式和攻毒剂量的摸索，最终选择以26LD50/只剂量的CV-B5/JS417经腹腔攻击3日龄BALB/c乳鼠建立致死模型。该乳鼠模型死亡比率为100%，具有良好的可操作性和重现性。该攻毒剂量可导致被攻击乳鼠出现消瘦、精神不振、颤抖、佝偻、脱毛、后30 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文肢瘫痪等多种神经系统症状。病理检查结果显示受攻击乳鼠的大脑皮层、丘脑、中脑、脑桥、脊髓均可见神经细胞嗜酸性坏死；心脏心肌细胞以及后肢肌肉骨骼肌细胞变性坏死；肝脏肝细胞坏死。经免疫组化研究证实以上组织均呈现CV-B5病毒阳性反应，表明CV-B5/JS417攻毒可引起实验乳鼠出现病毒性脑炎、病毒性脊髓炎、病毒性肝炎和坏死性肌炎，并最终导致死亡。与人体感染CV-B5引起的病毒性脑炎、扩张性心肌炎、急性肝炎、弛缓性麻痹等临床症状基本一致。为进一步了解病毒在BALB/c乳鼠体内的动态转归，本课题开展了病毒载量研究。根据结果推测，CV-B5/JS417经腹腔进入乳鼠后，首先感染肝脏和肠道组织，经淋巴窦入血后通过血液循环散播至全身各组织，并于72h后大量入侵脑、脊髓和肌肉组织，导致乳鼠出现一系列神经系统症状并最终死亡。而以颅内方式攻毒结果显示，脑和脊髓病变更为严重，其中大脑皮层、海马、丘脑、中脑、脑桥以及脊髓全段呈现不同程度的病变，乳鼠死亡时间缩短，进一步提示CV-B5具有强烈的嗜神经性。为进一步证实CV-B5模型的可靠性，本研究采用灭活CV-B5疫苗主动免疫及抗-CVB5中和抗体被动阻断保护实验，分别对疫苗免疫母鼠所生乳鼠和被动给予抗-CVB5中和抗体的乳鼠进行腹腔攻毒。结果显示主动免疫可保护实验动物免受致死剂量CV-B5的攻击，并呈现出了良好的剂量效应关系。被动保护结果显示抗-CVB5中和抗体具有良好的保护作用，进一步证明了CV-B5乳鼠致死模型的可靠性和实用性。综上所述，本研究在首次建立了一个稳定的、可导致神经系统病变的CV-B5乳鼠致死模型，可引起乳鼠出现多种与人类临床症状相近的发病症状。该模型可用于疫苗、药物以及致病机制等CV-B5基础研究，为开展CV-B5相关研究提供了可靠的研究工具。五、小结1.本研究应用江苏省2013年HFMD患儿标本中分离的CV-B5/JS417病毒株，建立首个CV-B5疫苗评价用野生型乳鼠模型。攻毒模型为3日龄BALB/c乳鼠，攻毒途径为腹腔攻毒，攻毒剂量为26LD50，可导致实验乳鼠出现典型症状及死亡。2.组织病理、免疫组化及病毒载量研究表明，CV-B5具有较强的嗜神经性。3.应用该乳鼠模型进行灭活疫苗的主动和被动保护效果评价，显示良好的剂量7效应关系，验证了中和抗体的保护作用，母传保护ED50为3.05×10CCID50。CV-B5抗血清中和抗体ED50为3.8。31 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文第二部分CV-B5感染性克隆的构建及病毒拯救引言病毒的感染性克隆技术，又称“病毒拯救”，是一种反向遗传操作技术，该技术人为地使RNA病毒经历DNA中间阶段，通过对DNA进行操作来研究RNA病毒基因组的结构和功能。感染性克隆的成功构建为人们进行RNA病毒的研究提供了强有力的工具。近年来的研究已经将感染性克隆技术应用到多种RNA病毒，如猪瘟病毒、猪圆环病毒、戊型肝炎病毒等。目前，CV-B3、ECHO-9、CV-16、EV-A71等多种肠道病毒已经成功构建了全长cDNA感染性克隆，但是尚无CV-B5感染性克隆的相关报道。本研究利用CV-B5/JS417病毒株成功构建了CV-B5全长cDNA感染性克隆，并将拯救后的病毒进行病毒滴度检测及乳鼠攻毒实验，验证病毒的毒力。此外，本研究在CV-B5全长cDNA克隆的基础上构建了CV-B5假病毒，为第三部分CV-B5假病毒小鼠模型的建立奠定了基础。一、实验材料1仪器仪器供应商紫外凝胶成像系统Bio-Rad光学显微镜OLYMPUSNanoDrop微量核酸检测仪Thermo-Fisher分光光度计Eppendorf细胞计数仪MilliporeCO2细胞培养箱ThermoPCR扩增仪Bio-Rad移液器Eppendorf常温离心机Eppendorf低温高速离心机EppendorfMilli-Q超纯水器MILLIPORE超净工作台海尔琼脂糖凝胶电泳仪北京市六一仪器厂电热恒温水浴箱北京市长风仪器仪表公司恒温培养箱上海一恒科技有限公司旋转摇床海门市其林贝尔仪器制造有限公司32 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文2级生物安全柜北京东联哈尔仪器制造有限公司2材料2.1细胞人宫颈癌细胞（Helacell）、Verocell均来源于ATCC，培养于含有5%CO2的37℃细胞培养箱中。2.2病毒CV-B5病毒为本实验室分离自2013年江苏省HFMD患儿标本的野生型CV-B5/JS417病毒株。2.3菌液表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌液为本实验室保存。3主要试剂3.1试剂试剂生产商TrizolLifetechnologies琼脂糖Biowest新生小牛血清HycloneDMEM培养基ThermoFisherScientificPhusion超保真DNA聚合酶NewEnglandBiolabsSal1、Not1限制性内切酶NewEnglandBiolabspSVA载体Sigma-Aldrich氯仿北京化工厂异丙醇北京化工厂无水乙醇北京化工厂DNAMarker天根生化科技(北京)有限公司In-Fusion连接酶宝日医生物技术北京有限公司TOP10感受态细胞北京康为世纪生物技术有限公司3.2试剂盒试剂盒生产商TMSuperScriptIIIRT反转录试剂盒Lifetechnologies33 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文DNA凝胶回收试剂盒中科瑞泰（北京）生物科技有限公司质粒小提试剂盒天根生化科技(北京)有限公司jetPRIMEkit转染试剂盒北京达科为生物技术有限公司二、实验方法1CV-B5cDNA全长序列扩增1.1提取CV-B5病毒感染细胞的总RNA36（1）取10L3.16×10CCID50的CV-B5/JS417病毒感染510Hela细胞。（2）感染48h后，待80~90%细胞发生病变（CPE）时，在去掉细胞上清的细胞中直接1mLTrizol，充分混合室温裂解5min。（3）加入1/5体积的氯仿，手动剧烈混合15s，于4℃12,000g离心15min。（4）取上层水相并转移到新1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，充分混合，室温沉淀10min。于4℃12,000g离心10min。（5）弃上清，加入1mL冰冷75%乙醇，于4℃7500g离心5min。（6）充分弃上清，室温晾干RNA沉淀，加入DEPC处理水溶解沉淀。TM1.2利用SuperScriptIIIRT逆转录获得CV-B5病毒cDNA（1）在PCR管中配置以下反应体系Total12LRandomprimers1LOligo（dT）12-181LTotalRNA1gdNTPmix1LDEPC处理水补足12L（2）于PCR仪中65℃加热5min，然后置于冰上迅速冷却。（3）冷却后短暂离心使液体收集在离心管底部，然后加入以下试剂Total7L5XFirststrandbuffer4L0.1MDTT2LPNAaseOUT1LTM（4）加入1LSuperScriptIIRT，并混匀。（5）置于PCR仪内，25℃加热10min，然后42℃加热延伸50min，最后70℃加热15min以灭活逆转录酶。34 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文（6）PCR结束后，收获逆转录产物，即得到CV-B5cDNA。1.3进行CV-B5cDNA全长序列扩增（1）设计CV-B5全长序列引物（引物由Invitrogen公司合成并经过PAGE纯，化，引物CV-B5-NotI-T7-5UTR-F：5’-TCAAGAATTGCGGCCGCGTAATACGACTCACTATAGGTTTTAAAACAGGCTGTGGG-3’;CV-B5-SalI-polyA-3’-UTR-R：5’-CATGAGAATTGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)。根据设计的引物用Phusion高保真聚合酶对2.1.2获得的CV-B5cDNA进行PCR全长序列扩增。PCR反应体系如下：Total10L2phusionHigh-Fidelity5L正向引物（10uM）0.4L反向引物（10uM）0.4LCV-B5cDNA0.4L二甲亚砜（DMSO）0.2L无菌超纯水3.5L（2）采用温度梯度PCR反应条件：98℃2min98℃10s55/60/65℃20s40个循环72℃4min(15s/Kb)72℃10min10℃forever1.4电泳，并进行产物回收。（1）通过电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的胶块切下，放入1.5mL离心管中，称重。（2）根据胶块的重量，按每100mg胶加200L的比例加入溶胶液Diffusionbuffer。（3）将离心管置于55℃水浴10min，间或混匀，以促进胶中的DNA扩散到溶液。（4）将上述溶液移入吸附柱中，室温放置2min，然后于10,000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（5）向吸附柱中加入500LWashSolution，于10,000rpm离心1min，倒掉收35 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（6）重复实验步骤（4）一次。（7）将空吸附柱和收集管放入离心机，12,000rpm离心2min。（8）将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30~50LElutionBuffer，室温静置1~2min，12,000rpm离心1min。（9）将所得到的DNA溶液置于-20°C保存或用于后续实验。2CV-B5全长质粒构建2.1酶切反应用Not1、Sal1酶切pSVA载体，反应体系如下：Total50L10限制性内切酶缓冲液5LSal1酶0.5LNot1酶0.5LpSVA载体5.8L（5g）无菌超纯水38.2L将上述酶切体系加入1.5mL离心管中，37℃酶切2h，电泳，按1.4实验步骤进行切胶回收，得到酶切后的载体。2.2连接反应用In-Fusion酶将1.5中酶切后的pSVA载体与1.4回收得到的DNA进行连接反应，反应体系如下：Total5L5In-Fusion1LpSVA载体2.5LDNA1.5L将上述连接反应体系加入1.5mL离心管中，50℃连接15min后放冰上，得到连接产物。2.3连接产物转化到感受态细胞（1）取1.6得到的连接产物5L加入到100LTOP10大肠杆菌感受态细胞中，于冰上孵育20min。（2）将感受态细胞移至42℃水浴热激90s，放冰上2min。（3）加入800L无双抗LB液体培养基，置于37℃摇床上复苏30min~1h后，4000rpm离心3min。36 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文（4）去掉部分培养基后重悬，然后用涂布棒或者玻璃珠将重悬后的细胞涂布在含有氨苄青霉素的LB固体平板上。（5）将LB平板置于37℃培养箱中培养过夜。2.4挑取单克隆待上述LB平板培养过夜后长出单克隆，用枪头分别挑取克隆进行菌落PCR，然后选取对应的10个阳性单克隆加到含Amp抗性的LB液体培养基中于37℃摇床培养。当大肠杆菌生产到平台期时，收集大肠杆菌菌液。2.5提取质粒将上述收集的大肠杆菌菌液离心后按照天根质粒小提试剂盒说明书进行操作，提取上述10个阳性克隆质粒。3CV-B5全长质粒酶切鉴定（1）将上述提取得到的10个质粒分别加入Not1、Sal1双酶及Not1单酶，于37℃酶切2h。每个质粒得到2个酶切产物，即：单酶切产物和双酶切产物。（2）将10个质粒及分别得到的酶切产物共60个样品进行跑胶，观察条带大小进行鉴定。4CV-B5全长质粒测序4.1质粒分段测序将1.10酶切鉴定后的CV-B5阳性质粒，送到奥科公司进行测序。由于CV-B5质粒片段较长，因此从两端分别设计引物，同时进行双向测序。引物设计如表所示。引物序列详见附表。表2.1CV-B5全长cDNA克隆质粒的引物名称正向引物（Forward）反向引物（Reverse）CV-B5-T7-FpSVA-seq-RCV-B5-seq-1-FCV-B5-seq-2-RCV-B5-seq-3-FCV-B5-seq-4-RCV-B5-seq-5-FCV-B5-seq-6-RCV-B5-seq-7-FCV-B5-seq-8-RCV-B5-seq-9-FCV-B5-seq-10-F4.2获得全长序列37 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文将测序得到的核苷酸序列应用DNASTAR中的SeqMan软件进行拼接，获得CV-B5cDNA质粒全长序列。5CV-B5病毒拯救5.1提取T7RNA聚合酶质粒将表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌液加到含有氨苄青霉素的适量LB培养基中，于37℃摇床上进行培养，扩增后收集大肠杆菌细胞，然后按照1.9中实验步骤提取质粒。5.2转染按照jetPRIMEkit转染试剂盒说明书，将CV-B5全长cDNA质粒与T7RNA聚合酶质粒共转染到Hela细胞中。（1）取50L稀释缓冲液（jetPRIMEbuffer）加入到1.5mL离心管中，然后依次加入T7RNA聚合酶质粒和CV-B5全长cDNA质粒各0.25L。（2）向上述溶液中加入1L转染试剂（jetPRIMEreagent），混匀，室温放置10min。（3）将上述溶液全部加到500L铺好的24孔板Hela细胞中，每板细胞同时设置CV-B3CPE对照、EV-A71GFP对照以及细胞空白对照。然后将24孔板置于含5%CO2的37℃培养箱中。（4）细胞培养24h后观察细胞出现病变（CPE）情况，如果出现CPE则说明质粒转染成功。5.3收毒与保存（1）将3.2中转染后出现CPE的细胞取出，于4℃，12,000rpm离心15min后收取上清。取100L上清感染Hela细胞，2d后观察出现CPE情况。（2）上述能使Hela细胞出现CPE的上清即为CV-B5全长cDNA感染性克隆。将上清用0.2m无菌滤膜过滤，分装、保存于-80℃冰箱中。6拯救病毒滴度测定采用细胞培养半数感染量方法（cellcultureinfectivedose50%,CCID50）对CV-B5/JS417全长cDNA感染性克隆进行病毒滴度测定，此方法基于最高稀释度下CV-B5病毒在Vero细胞中CPE的形成，是测定病毒滴度的标准方法。（1）准备一瓶Vero细胞，计数，用10%DMEM培养基将细胞稀释到浓度为5110/mL。（2）在稀释管中依次加入0.9mL2%DMEM培养基，其中第1管中再加入0.1mL38 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文病毒保存液，混匀。（3）从第1管中吸取0.1mL溶液加入第2管中，依次倍比稀释至最高稀释度。（4）用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。（5）最后4~5个稀释液加入96孔板中，每孔0.1mL，每个稀释度8孔，一排阴性对照。阴性对照孔中加入0.1mL2%DMEM用于监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。（6）用8道排枪在2块96孔板中每孔加入100L已配浓度的Vero细胞悬液。（7）将2块96孔板放在含5%CO2的37℃培养箱中培养7d。（8）7d后于倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。（9）计算每一排出现阳性的孔数，如果以你选个对照中无任何CPE并且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性，最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。7拯救病毒乳鼠攻毒实验按照第一部分建立的CV-B5乳鼠模型：SPF级3日龄BALB/c乳鼠，分别采用48.43×10CCID50和843CCID50剂量拯救的CV-B5病毒颅内攻击6~10只3日龄乳鼠，20L/只。同时设置阴性对照颅内注射2%DMEM培养基，20L/只。连续21d每日观察乳鼠的存活状态和发病症状并记录，计算乳鼠存活率。8CV-B5假病毒的构建根据本研究第二部分1.1中构建的pSVA-CV-B5质粒构建荧光素酶标记的CV-B5假病毒，该部分实验由本实验室其他成员完成。三、实验结果1CV-B5cDNA全长序列扩增将RT-PCR得到的CV-B5全长cDNA用Phusion高保真聚合酶进行PCR全长序列扩增。PCR产物跑胶结果如图2.1所示：CV-B5cDNA全长约7.5kb。因此，成功构建了CV-B5全长cDNA克隆。39 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图2.1CV-B5全长cDNA的PCR扩增结果2CV-B5全长质粒构建将Not1、Sal1酶切后的pSVA载体与CV-B5全长cDNA的PCR产物用In-Fusion酶连接，将连接产物转化后提质粒获得CV-B5全长克隆质粒pSVA-CV-B5质粒，如图2.2为CV-B5全长质粒图谱。图2.2CV-B5全长质粒图谱3CV-B5全长质粒酶切鉴定将提取的10个CV-B5全长cDNA质粒、Not1单酶切产物以及Not1、Sal1双酶切产物进行跑胶，跑胶结果如图2.3。其中CV-B5-1、2、4、5、6、7、8、9、10质粒及酶切产物跑胶后条带大小正确，而CV-B5-3条带大小不正确。将酶切鉴定正确的全部质粒根据设计好的5对引物进行测序。40 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图2.3CV-B5全长cDNA质粒酶切鉴定结果4CV-B5全长质粒测序将得到正确的CV-B5全长cDNA质粒进行测序，各段测序结果进行拼接后比对，发现所有质粒测序结果相同。将拼接得到的CV-B5质粒全长序列在网上提交，得到Genbank号：KY303900，全长7370bp。测序结果详见附录。5CV-B5病毒拯救将转染细胞后出现CPE的收获液取100L感染Hela细胞，2d后观察实验组细胞出现CPE，如图2.4所示。将出现CPE的细胞收获，反复冻融3次，于4℃，3900g离心30min后收获上清即为获救的病毒。图2.4CV-B5感染性克隆感染Hela细胞后发生CPE图6拯救病毒滴度检测8将拯救病毒感染Vero细胞进行滴度检测，1w后得到滴度结果为4.22×10CCID50/mL。41 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文7拯救病毒乳鼠攻毒实验4分别采用8.43×10CCID50和843CCID50的CV-B5拯救病毒颅内攻击6~10只3日龄BALB/c乳鼠，20L/只。结果显示2个实验组乳鼠在攻毒后均出现不同程度的消瘦、精神不振、颤抖、脊柱佝偻、后腿瘫痪发病症状，最后全部死亡。4如图2.3所示：对照组乳鼠在颅内注射2%DMEM培养基21d内全部正常，8.43×10CCID50组乳鼠在攻毒后第3d开始出现死亡，第7d全部死亡；843CCID50组乳鼠在攻毒后第3d开始出现死亡，第9d全部死亡。图2.5BALB/c乳鼠感染CV-B5感染性克隆后存活率8CV-B5假病毒构建根据本研究第二部分2.1中构建的pSVA-CV-B5质粒成功构建了荧光素酶标[65]记的CV-B5假病毒，命名为pCV-B5-Luc。四、讨论病毒的感染性克隆技术人为地使RNA病毒经历DNA中间阶段，通过对DNA进行操作来研究RNA病毒基因组的结构和功能，是研究RNA病毒的一种反向遗传技术手段。利用感染性克隆技术得到的CV-B5全长cDNA克隆质粒具有许多优点：（1）质粒能够长期保存，每次使用只需取微量进行转染后扩增。（2）质粒可以有效地避免CV-B5活病毒多次传代容易造成基因变异的缺点。（3）全长cDNA克隆质粒可以在DNA水平上进行基因改造，比如本实验室基于CV-B5全长cDNA克隆质粒构建的CV-B5假病毒等。（4）全长cDNA克隆质粒还有许多用途，如作为载体应用于qRT-PCR等。本研究通过提取病毒RNA、RT-PCR、全长序列扩增、构建重组质粒、酶切鉴定、全长质粒测序、细胞产毒等一系列实验成功构建了CV-B5感染性克隆。经细胞和动物实验证实该拯救克隆与母本毒株具有相同的致细胞病变能力，并同样可导致受攻击乳鼠出现消瘦、精神不振、颤抖、佝偻、后腿瘫痪等症状，最终全42 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文部死亡。CV-B5感染性克隆的构建对于今后开展CV-B5病毒的结构和功能研究具有重要意义，也为本研究第三部分开展CV-B5假病毒小鼠模型的研究奠定了基础。五、小结1.本研究以野生型CV-B5/JS417病毒株为原材料成功构建了CV-B5全长cDNA感染性克隆。82.感染性克隆成功产毒，滴度为4.22×10CCID50/mL，与野生型毒株相近，完成病毒拯救。3.拯救病毒可致3日龄BALB/c乳鼠死亡，与野生型毒株毒力相近。43 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文第三部分CV-B5假病毒小鼠模型的建立及初步应用引言假病毒技术作为一种新型病毒学研究手段已经被应用到多种高致病性病毒的检测中。与活病毒相比，假病毒为复制缺陷型，只能进行单轮感染，具有较好的安全性。目前已经建立了多种假病毒体系，如HIV、HCV、EV-A71、CV-A16以及本研究第二部分构建的CV-B5假病毒等。在假病毒动物感染模型构建研究中，多采用成年小鼠，可直接通过活体观察疫苗免疫效果，如EV-A71假病毒SCARB2转基因小鼠感染模型。相对于活病毒乳鼠模型日龄小、需免疫新生乳鼠或采用母传抗体来评价疫苗免疫效果，假病毒小鼠模型具有个体差异小，操作简单，易于观察和检测等优点。本研究利用第二部分构建的pCV-B5-Luc假病毒，建立疫苗评价用CV-B5假病毒小鼠模型。一、实验材料1仪器仪器供应商光学显微镜OLYMPUSCO2细胞培养箱Thermo电热恒温水浴箱北京市长风仪器仪表公司IVISspectrum动物体内可见光成像系统Xenogen2材料2.1细胞Vero细胞来源于ATCC。2.2CV-B5假病毒CV-B5假病毒pCV-B5-Luc为本实验室构建并保存，经qPCR检测该假病毒7为1×10copies/mL。2.3CV-B5抗血清CV-B5抗血清为CV-B5/JS417灭活疫苗免疫8周龄BALB/c小鼠后抗血清，中和抗体滴度为786。2.4CV-B5灭活疫苗CV-B5灭活疫苗为CV-B5/JS417病毒采用0.2%甲醛溶液于37℃摇床灭活3d44 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文制备而成。2.5实验动物本实验所用雌性BALB/c、ICR、NIH、C57以及KM小鼠均来自中国食品药品检定研究院验动物中心。3试剂试剂生产商DMEM培养基Lifetechnologies胎牛血清杭州四季青生物工程有限公司戊巴比妥钠SigmaLipofectamine2000转染试剂LifetechnologiesPassiveLysisBuffer细胞裂解液PromegaD-LuciferinSodiumSalt荧光素酶底物BDMonolight™二、实验方法1CV-B5假病毒小鼠模型的建立1.1小鼠品系选择6用5×10copies的单轮感染pCV-B5-Luc假病毒分别尾静脉攻击4周龄雌性BALB/c、C57BL/6、NIH、ICR、KM小鼠，每种品系3只小鼠，共15只。分别在攻毒后16h将上述5组小鼠腹腔注射100L戊巴比妥钠进行麻醉，同时腹腔注射100L荧光素酶底物，10min后用活体成像仪观察小鼠体内pCV-B5-Luc假病毒发光部位并检测荧光信号强度。1.2攻毒方式及检测时间选择用单轮感染pCV-B5-Luc假病毒分别通过尾静脉、腹腔、颅内三种途径攻击一组4周龄雌性BALB/c小鼠，3只小鼠/组，共9只，其中尾静脉和腹腔注射剂76量为1×10copies，颅内注射剂量为1×10copies。分别在攻毒后16h、24h两个时间点将上述3组小鼠用戊巴比妥钠进行麻醉，同时腹腔注射100L荧光素酶底物，10min后用活体成像仪观察小鼠体内pCV-B5-Luc假病毒发光部位并检测荧光信号强度。1.3小鼠周龄选择7用1×10copies的单轮感染pCV-B5-Luc假病毒分别通过尾静脉攻击3、4、5、6周龄雌性BALB/c小鼠，2只小鼠/组，共8只。分别在攻毒后16h将上述4组45 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文小鼠用戊巴比妥钠进行麻醉，同时腹腔注射100L荧光素酶底物，10min后用活体成像仪观察小鼠体内pCV-B5-Luc假病毒发光部位并检测荧光信号强度。1.4检测假病毒在小鼠体内分布将上述活体成像后的3、4、5周龄BALB/c小鼠各取1只进行解剖，分别取3只小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、胸腺、肠、皮肤、肌肉以及后腿等11个组织或器官在活体成像仪下观察组织中荧光信号。2CV-B5假病毒小鼠模型的初步应用2.1主动免疫效果评价6通过对小鼠腹腔注射CV-B5灭活疫苗免疫后再尾静脉攻击5×10copies的pCV-B5-Luc假病毒，16h后活体成像检测荧光信号，通过荧光信号的减少量评估疫苗主动免疫效果。同时，小鼠内眦采血检测pCV-B5-Luc中和抗体含量，分析主动免疫抗体产生与病毒保护之间的关系。（1）一针剂：选择6只4周龄雌性BALB/c小鼠，实验组和对照组各3只。对照8组注射2%DMEM；实验组腹腔注射CV-B5灭活疫苗（抗原含量为1.58×10CCID50），免疫一周后分别对6只小鼠尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒，在攻毒后16h进行小鼠活体成像检测。（2）两针剂：选择3只3周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射CV-B5灭活疫苗（抗原8含量为1.58×10CCID50）后10d进行第二针免疫，免疫后4d对3只小鼠分别尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒，在攻毒后16h进行小鼠活体成像检测。同时，以一针剂组对照小鼠作为对照进行评估。2.2被动保护效果评价将CV-B5抗血清（效价为768）经3倍系列稀释为1:5、1：15、1:45，然后选择12只4周龄雌性BALB/c小鼠，分为3个实验组，1个对照组，3只小鼠/组，给实验组小鼠分别腹腔免疫100L稀释好的CV-B5抗血清，对照组小鼠腹腔注射2%7DMEM。30min内给每只小鼠尾静脉攻击1×10copies的pCV-B5-Luc假病毒。16h后进行小鼠活体成像检测，通过与对照小鼠比较荧光信号发光部位和强度差异评价被动保护效果。三、实验结果1CV-B5假病毒小鼠模型的建立1.1确定小鼠品系46 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文pCV-B5-Luc假病毒分别尾静脉攻击4周龄雌性BALB/c、C57BL/6、ICR、NIH、KM小鼠后16h检测发光部位及发光强度（如图3.1中1、2、3、4、5）。根据检测结果显示，4周龄雌性BALB/c小鼠活体成像荧光效果最好。因此，确定采用4周龄雌性BALB/c小鼠建立CV-B5假病毒小鼠模型。图3.1不同品系小鼠感染CV-B5假病毒16h后活体成像结果1、2、3、4、5分别代表BALB/c、C57BL/6、ICR、NIH、KM小鼠感染CV-B5假病毒后活体成像检测图。1.2确定攻毒方式及检测时间pCV-B5-Luc假病毒分别通过尾静脉、腹腔、颅内三种途径攻击4周龄雌性BALB/c小鼠后16h检测发光部位及强度（如图A1、B1、C1），在攻毒后24h检测发光部位及强度（如图A2、B2、C2）。检测结果横向比较表明，尾静脉途径注射pCV-B5-Luc假病毒小鼠活体成像发光最显著。根据检测结果纵向比较表明，在攻毒后16h比24h小鼠活体成像发光显著。因此确定pCV-B5-Luc假病毒小鼠模型的攻毒方式为尾静脉注射，检测时间为攻毒后16h。47 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图3.2CV-B5假病毒经不同攻毒途径感染BALB/c小鼠后活体成像结果A1、A2分别为BALB/c小鼠经尾静脉攻毒16h、24h后活体成像检测图；B1、B2分别为BALB/c小鼠经腹腔攻毒16h、24h后活体成像检测图；C1、C1分别为BALB/c小鼠经颅内攻毒16h、24h后活体成像检测图。1.3确定小鼠周龄pCV-B5-Luc假病毒通过尾静脉攻击3、4、5、6周龄雌性BALB/c小鼠，在攻毒后16h活体成像仪检测小鼠体内假病毒发光部位（结果分别如图1、2、3、4）。结果显示，在4、5周龄小鼠的结果最好，因此，确定pCV-B5-Luc假病毒敏感小鼠的周龄为4周龄。综合以上结果，我们确定选择雌性4周龄、雌性、BALB/c小鼠通过尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒方式建立CV-B5假病毒小鼠模型。图3.3不同周龄BALB/c小鼠感染CV-B5假病毒后活体成像结果48 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文1、2、3、4分别代表3、4、5、6周龄BALB/c小鼠感染CV-B5假病毒活体成像图。1.4检测假病毒在小鼠体内分布将图3.3中活体成像后的3、4、5周龄BALB/c小鼠各取1只进行解剖，分别取3只小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胃、胸腺、肠、皮肤、肌肉以及后腿等11个组织在活体成像仪下观察组织中荧光信号。结果如图3.4所示，pCV-B5-Luc假病毒攻击小鼠后只在肝脏部位检测到荧光信号。综合以上结果可以发现，小鼠通过尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒后均在腹部荧光显色，检测组织则只在肝脏部位存在荧光信号。因此可初步确定小鼠肝脏部位存在pCV-B5-Luc假病毒的结合位点，肝脏组织是pCV-B5-Luc假病毒单轮感染部位。图3.4CV-B5假病毒在小鼠体内组织分布结果（1）、（2）、（3）分别代表3、4、5周龄BALB/c小鼠感染CV-B5假病毒组织分布图。（4）代表小鼠组织对应的名称2CV-B5假病毒小鼠模型的初步应用2.1主动免疫效果评价如图3.5所示，经CV-B5灭活疫苗主动免疫程序后尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒检测活体成像结果显示：一针剂组和两针剂组小鼠体内荧光信号均比对照组小鼠体内荧光信号荧光信号弱。检测免疫后小鼠体内CV-B5中和抗体含量，发现一针免疫后中和抗体效价为53，两针免疫后中和抗体效价为465，与活体成像结49 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文果相符合。因此，CV-B5灭活疫苗可保护BALB/c小鼠抑制pCV-B5-Luc假病毒的感染，且两针免疫保护效果比一针免疫保护效果好。图3.5CV-B5灭活疫苗主动免疫保护活体成像图图3.6CV-B5灭活疫苗主动免疫保护活体成像荧光强度图2.2被动保护效果评价将CV-B5抗血清（效价为768）经3倍系列稀释为1:5、1:15、1:45，然后分别腹腔注射4周龄BALB/c小鼠，对照组小鼠腹腔注射2%DMEM培养基。在30min内通过尾静脉注射pCV-B5-Luc假病毒，攻毒后16h进行小鼠活体成像检测。结果如图3.7及图3.8所示：与对照小鼠相比，CV-B5抗血清免疫小鼠发光强度降低。结果表明，CV-B5抗血清可阻止pCV-B5-Luc假病毒对小鼠的感染，随着抗血清稀释倍数的升高，假病毒荧光信号强度逐渐升高，中和抗体保护效果逐渐减弱。图3.7CV-B5抗血清被动免疫保护活体成像图50 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文图3.8CV-B5抗血清被动免疫保护活体成像荧光强度图四、讨论近年来，假病毒因具有较高的安全性和便于操作的优势被广泛应用于SARS[66-67]病毒、禽流感病毒等高致病性病原的检测中。本研究利用本实验室构建的pCV-B5-Luc假病毒在BALB/c小鼠上建立了CV-B5假病毒小鼠模型。该假病毒具有以下特点：（1）pCV-B5-Luc假病毒颗粒的核衣壳蛋白来源于CV-B5/JS417野生型病毒，因此在抗原性方面与野生型病毒一致。（2）pCV-B5-Luc假病毒颗粒的基因组RNA为缺陷型CV-B3亚基因组RNA，只能进行单轮感染，因此在实验操作上更安全。（3）该CV-B3亚基因组RNA含有萤火虫荧光素酶报告基因，可[65]通过检测荧光素酶活性实现对病毒感染的检测。CV-B5假病毒小鼠模型与野生型乳鼠模型相比具有以下优势：（1）CV-B5假病毒小鼠模型避免使用野生型病毒，操作更安全。（2）可进行可视化检测，更直观、更便于观察。（3）成年小鼠免疫系统发育完善、易于操作，且可进行主动保护研究，解决了野生型病毒只能感染乳鼠，必须采用母传抗体保护以间接评价疫苗免疫效果的局限性。本研究通过对小鼠品系、周龄、攻毒方式以及检测时间等一系列实验条件的摸索，将pCV-B5-Luc假病毒安全、可实现活体观察的特点与成年小鼠相结合，建立了CV-B5假病毒小鼠模型。经疫苗主动免疫和中和抗体被动保护结果证实该模型可用于CV-B5灭活疫苗免疫效果评价和研究。通过pCV-B5-Luc假病毒在小鼠体内的组织分布检查发现，pCV-B5-Luc假病毒通过尾静脉进入小鼠体内后，在小鼠肝脏部位观察到荧光信号，而脑部等神经组织中未见发光。这与CV-B5活病毒在临床及小鼠体内引起病毒性脑炎等神经系统症状不同，推测是由于pCV-B5-Luc假病毒仅能进行单轮感染无复制能力，因此不会出现在动物体内大量增殖继而侵犯大脑和脊髓的现象，对于假病毒感染肝51 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文脏组织的机制仍需进一步的研究。本研究为阐明CV-B5小鼠感染和致病机制提供了佐证，也为开展CV-B5疫苗等相关研究提供了新方法和新思路。五、小结1.应用构建的pCV-B5-Luc假病毒，选择4周龄雌性BALB/c小鼠，采用尾静脉攻毒方式，建立CV-B5假病毒小鼠模型，该模型具有安全、快速、可视化的特点。2.单轮感染pCV-B5-Luc假病毒在BALB/c小鼠体内的感染部位主要为肝脏。3.小鼠主动免疫和被动保护实验结果显示，CV-B5灭活疫苗诱导的中和抗体和抗血清均可抑制pCV-B5-Luc假病毒感染。52 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文总结1.应用CV-B5/JS417病毒株建立首个CV-B5野生型乳鼠模型可应用于药物和疫苗评价。2.应用CV-B5乳鼠模型进行了灭活疫苗主动和被动保护效果评价，结果显示良好剂量效应关系，验证了中和抗体的保护作用。3.应用野生型CV-B5/JS417病毒株构建CV-B5感染性克隆并进行病毒拯救。4.利用CV-B5感染性克隆构建CV-B5假病毒，并建立了基于假病毒的小鼠模型，该模型具有安全、快速、可视化的特点。53 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文综述柯萨奇病毒B组5型的研究进展引言柯萨奇病毒B组5型（CoxsackievirusB5,CV-B5）属于小核糖核酸病毒科[6]（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus）。人类肠道病毒包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、埃可病毒以及肠道病毒68-71型，[19]CV-B5为柯萨奇病毒B组（CoxsackievirusB,CV-B）的一员。CV-B5感染后[68]引起的轻症包括上呼吸道感染、腹泻以及手足口病等，也可引起病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎以及糖尿病等多种重症疾病[8-11][69]，CV-B5感染为导致胰岛素依赖型（I型）糖尿病的主要诱发因素之一。还有文献报道表明，CV-B5感染可引起短暂性失语症和小儿急性横贯型脊髓炎[13-14][70-71]等罕见临床症状。CV-B5与多起世界范围的病毒性脑炎暴发有关。本文对CV-B5的病原学、流行病学、实验室诊断以及动物模型等方面的研究进展做一综述。1病原学柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）是一种常见的人类肠道病毒，可引起HFMD、病毒性脑炎、心肌炎等多种疾病。CV最初是在1948年美国纽约市柯萨奇镇的一次脊髓灰质炎病毒流行中通过乳鼠分离成功。此后研究表明CV包括A、B两组，[72]A组（A1~22、24），B组（B1~6）。CV-B5原型株为Fulkner株，于1952年首次从患者中分离得到。CV-B5为单股正链RNA病毒，病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，直径24~30nm，无包膜和突起。CV-B5基因组全长约7400bp，基因组仅有一个开放阅读框及2个非编码区（5’-UTR和3’-UTR）构成。开放阅读框编码含2194个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白被病毒自身编码的蛋白酶进一步水解为3个前体蛋白（P1、P2、P3），其中P1前体蛋白编码4个病毒衣壳蛋白（VP1~4），P2和P3编码7个非结构蛋白（2A~2C和3A~3D）。5’-UTR由大约740个核苷酸组[73]成，包含控制病毒基因组复制和翻译的区域，如内部核糖体进入位点；3’末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴（poly-A），与病毒RNA复制密切相关。CV-B5利用衰变加速因子（decayacceleratingfactor,DAF）作为病毒与细胞附着的受体，但是依赖于柯萨奇病毒腺病毒受体(coxsackievirusandadenovirus[74]receptor，CAR)参与病毒进入和病毒复制过程。2流行病学54 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文2.1流行概况CV-B5引起的无菌性脑膜炎、病毒性脑炎呈世界范围分布，欧洲、北美、南美和亚洲均有暴发或流行报道，发病年龄主要集中于18岁以下的青少年人群，多[75-76]发于夏秋季节。近年来在我国HFMD病例中检出较高比率的CV-B5感染，表明CV-B5可引起重症疾病流行的同时，也可导致轻症HFMD的流行。2.1.1欧洲2000年5月~9月，比利时暴发一次大规模的无菌性脑膜炎，122份病人脑[77]脊液被检测为CV阳性，其中CV-B5占15.6%(19/122)。2003年3月~2004年12月，希腊从49例无菌性脑膜炎患者脑脊液中检测到19例为肠道病毒阳性，[78]并用细胞培养分离出6种病原体，其中4例为CV-B5感染。2000-2004年法国肠道病毒监测中共2757例患者为非脊髓灰质炎肠道病毒感染，其中CV-B5感染[79]患者为184例（占6.7%）。1998~2007年西班牙肠道病毒监测结果显示，十年间共收集到86404份临床样本，主要为无菌性脑膜炎，出现发烧、呼吸道感染疾病及急性迟缓性麻痹症状，6867份样本检测为肠道病毒阳性，其中228例（4.2%）[80]CV-B5阳性。2.1.2北美洲[4]CV-B5分别在1961、1972、1983年在美国引起三次流行，2005年美国纽约[42]报道的脑炎病例中CV-B5感染占40%（14/35）。2.1.3南美洲1998年12月~2003年12月，巴西从1022例脑膜炎患者的脑脊液中分离出162[5]株（15.8%）肠道病毒，其中CV-B5占3.7%（6/126）。2.1.4亚洲2005年韩国首尔24例无菌性脑膜炎患者中，15例（62.5%）为CV-B5感染[6][81]；2009年韩国肠道病毒感染中，CV-B5占19.6%（21/107）。2008年6月~10月印度发生了一起脑炎疫情，共收集到90份脑脊液，经PCR检测37份为肠道病毒阳性，其中15份出现细胞病变，通过中和实验确定8份为CV-B5感染[82]（53.3%）。1999年1月~2006年12月我国台湾进行一项回顾性研究，192例CV-B阳性患者中24例（12.5%）为CV-B5感染，其中91.7%的患者出现发[83]热症状，50%的患者确诊为无菌性脑膜炎。2005年7月~8月我国山东省兖州市暴发的一起脑膜炎中共分离出58株病毒，[84]其中54株（93.1%）为CV-B5，2009年6月~9月山东省临沂市一场无菌性脑膜55 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文炎中共2104例患者（98.6%<16岁），收集了42份脑脊液样本进行病毒分离，其中[2]17份(40.5%)为CV-B5感染。2009年7月河南省郑州市43例儿童无菌性脑膜炎患者中，平均年龄为6.5岁（1~13岁），从这些患者脑脊液中共分离出16个CV-B5[85]病毒株，其中14例为重症患者。2002-2012年浙江省1180份脑炎患者临床样本[71]中共检测得到225份为肠道病毒阳性，其中17.8％(40/225)为CV-B5感染，2013年该地区239份病毒性脑膜炎患者样本中共分离出56株肠道病毒，其中CV-B5占[86]35.7%（20/56）。近年来，我国发生多起CV-B5引起的HFMD流行。2009年4月~5月山东省临沂市110例儿童手足口病患者的咽拭子和血清样本中，14例（12.7%）为CV-B5[78]感染，其中11例（78.6%）表现出神经系统症状。2010年吉林省长春市暴发了一起HFMD疫情，16份咽拭子中检出3份（18.75%）为肠道病毒阳性，经血清学[15]和分子生物学技术诊断发现均为CV-B5。2010年福建省在HFMD病原学监测中，[87]从HFMD病例中分离得到４株CV-B5。2.2分子流行病学目前尚无公认的CV-B5基因分型的依据，而CV-B5VP1区编码病毒衣壳蛋[88]白，为表面抗原表位所在区，是病毒分型依据的主要区域。2011年，RezigD等在前期研究的基础上，将分离于北非的27个CV-B5病毒株与其他14个国家的77个CV-B5病毒株进行VP1序列比对和进化树分析，结果显示所有的CV-B5[22][2]可分为2个分支，4个基因型和10个亚型。2013年，ChenP等基于CV-B5全长VP1核苷酸序列差异对我国山东省58个CV-B5病毒株进行进化树分析，将CV-B5分为4个基因型，其中A组包括2个早期的病毒株，分别为Faulkner株和分离于1974年的Ecuador株；B组为包括SVDV在内的少数毒株；C组和[89]D组包括从1970s~2000s的大部分基因型。2013年，HenquellC等根据CV-B5的VP1和3CD区序列分析将CV-B5分为A、B两个基因型，其中A基因型比B基因型具有更多的可变氨基酸位点，在进化上表现出较高的多样性。另外有文献报道，2005年从我国山东省、韩国、法国、白俄罗斯等国家分离得到的CV-B5病毒株属于同一基因型，而2000年云南分离的病毒株与1998年从山东分离株属于另一种基因型，提示CV-B5基因型的改变可能与时间变化而非地区分布相关[17]。3实验室诊断3.1病毒分离CV-B5分离可采用传统的细胞病变法（cytopathogeniceffects,CPE）：用咽56 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文拭子、肛拭子、直肠拭子、疱疹液或组织液等标本，经青霉素和链霉素处理后接种于单层易感细胞，待出现典型的CPE后，收集细胞并进行病毒分离。另外，从脑组织或脑脊液中分离病毒是诊断CV-B5所致病毒性脑炎最可靠的方法之一，[2]但脑组织标本难收集且病毒含量低，从脑脊液中分离病毒的阳性率很低。3.2PCR检测PCR作为一种分子生物学检测技术，具有操作简单、快速、灵敏度和特异度高等特点，已被广泛地用于肠道病毒的诊断。目前有关CV-B5序列测定的报道多[90]是基于CV-B5VP1区域设计引物应用RT-PCR方法进行检测。段晶晶等建立了CV-B5巢式RT-PCR，为CV-B5感染的流行病学调查和实验室检测提供了一种更为快速、敏感和可靠的手段。3.3抗原检测目前，快速抗原检测方法（rapidantigendetection,RAD）用于多种肠道病毒的诊断，该方法基于细胞培养的接种离心，结合间接免疫荧光方法快速检测病毒[91]抗原。RadovanovJ等通过与常规细胞培养法比较，评估了RAD的有效性：同时用两种方法检测了70份无菌性脑膜炎患者的临床样本，共检出包括CV-B5在内的11种肠道病毒。对比发现RAD的灵敏度和特异性高达94.4%和100%，但是常规检测需要3~13d，RAD检测仅需3d，提示RAD可作为CV-B5临床样本的快速诊断方法。3.4抗体检测血清学检测是肠道病毒诊断的常规方法，主要包括酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA)及中和抗体检测方法。目前，应用ELISA法测定血清或脑脊液中的特异性抗体是病毒性脑炎病原诊断的一种重要[92]方法。BomanJ等建立了一个以CV-B5为包被抗原的间接ELISA方法，用以检测19例患者血清中IgA、IgG、IgM。结果发现，13例患者血清IgM阳性，14例患者血清IgA阳性，同时对64份健康人血清检测发现有2人IgA阳性，IgM均为阴性。肠道病毒感染宿主后可产生特异性中和抗体，中和抗体通过改变病毒表面的构型抑制病毒吸附或侵入，从而阻止病毒在细胞内复制和增殖。传统CPE法作为一种常见的血清中和抗体检测方法，已经在EV-A71、CV-A16以及CV-B3病毒上[93-95]得到广泛应用，但目前未见采用CPE法检测CV-B5中和抗体的相关报道。4动物模型理想的动物模型对于研究CV-B5的致病机理、药物治疗效果以及疫苗保护效57 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文果评价至关重要。有文献报道，猪经CV-B5Faulkner株感染后可在咽拭子及粪便中检测到病毒，但不引起临床疾病。不过在攻毒后28d用猪水泡病病毒（Swine[]VesicularDiseaseviru,SVDV）再次感染，则5/6的猪会出现水泡样病变。有学者利用3~4周龄C3H/HeJ小鼠先后进行了CV-B3和CV-B5感染后小鼠组织中病毒分布及病理变化的研究，发现CV-B3感染可导致该小鼠出现胰腺炎和心肌炎，而[][]CV-B5感染只引起胰腺炎。Zhong等在研究盐酸阿比朵尔（Arbidol）抗CV-B5病毒效果的过程中，用CV-B5感染3~4周龄BALB/c小鼠，6d后小鼠出现间质性肺炎和心肌炎。5小结CV-B5引起婴幼儿中HFMD流行，且易导致18岁以下人群无菌性脑膜炎或病毒性脑炎的暴发和流行，凸显了CV-B5感染引起疾病的公共卫生意义。对CV-B5引起的重症疾病目前尚无有效的治疗手段，目前尚未见CV-B5疫苗研发的报道。因此，应关注CV-B5致病性和流行病学特征，建立诊断方法及疫苗评价用动物模型，开展CV-B5疫苗的研发，为CV-B5相关疾病的防控提供基础。58 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文参考文献[1]MaH,HuangX,KangK,etal.RecombinationinhumancoxsackievirusB5strainsthatcausedanoutbreakofviralencephalitisinHenan,China[J].ArchVirol,2013,158(10):2169-2173.[2]ChenP,TaoZ,SongY,etal.AcoxsackievirusB5-associatedasepticmeningitisoutbreakinShandongProvince,Chinain2009[J].JMedVirol,2013,85(3):483-489.[3]BöttnerA,DaneschnejadS,HandrickW,etal.AseasonofasepticmeningitisinGermany:epidemiologic,clinicalanddiagnosticAspects[J].PediatrInfectDisJ,2002,21(12):1126-32.[4]KopeckaH,BrownB,PallanschM.GenotypicvariationincoxsackievirusB5isolatesfromthreedifferentoutbreaksintheUnitedStates[J].ViruRes,1995,38:125-136.[5]DosSantosGP,SkrabaI,OliveiraD,etal.EnterovirusmeningitisinBrazil,1998-2003[J].JMedVirol,2006,78(1):98-104.[6]LeeST,KiCS,LeeNY.MolecularcharacterizationofenterovirusesisolatedfrompatientswithasepticmeningitisinKorea,2005[J].ArchVirol,2007,152(5):963-970.[7]Sesti-CostaR,SilvaGK,Proenca-MódenaJL,etal.TheIL-33/ST2pathwaycontrolscoxsackievirusB5-inducedexperimentalpancreatitis[J].JImmunol,2013,191(1):283-292.[9]ColliML,NogueiraTC,AllagnatF,etal.Exposuretotheviralby-productdsRNAorCoxsacKievirusB5triggerspancreaticbetacellapoptosisviaaBim/Mcl-1imbalance[J].PloSPathog,2011,7(9):e1002267.[9]齐宗利，张瑜庆，胡军．病毒感染与1型糖尿病[J]．生命的化学，2016，36(1)：45-49．[10]KimKW,HoA,Alshabee-AkilA,etal.CoxsackievirusB5InfectionInducesDysregulationofmicroRNAsPredictedtoTargetKnownType1DiabetesRiskGenesinHumanPancreaticIslets[J].Diabetes,2016,65(4):996-1003.[12]姚昕，卞莲莲，毛群颖，等．柯萨奇病毒B组5型研究进展[J]．国际生物制品学杂志，2015，38(5)：234-238．[12]ClavellM,BarkemeyerB,MartinezB,etal.Severehepatitisinanewbornwithcoxsackievi-rusB5infection[J].ClinPediatr(Phila),1999,38(12):739-741.[13]EndresAS,HelmsT,SteinftihrerS,eta1.TransientbrocaaphasiainanelderlyrnancausedbycoxsackievirusB5[J].JNeurol,2002,249(9):1318-1319．[14]MinamiK,TsudaY,MaedaH,etal.AcutetransversemyelitiscausedbyCoxsackievirusB5infection[J].JPaediatrChildHealth,2004,40(1-2):66-68.[15]HanJF,JiangT,FanXL,etal.RecombinationofhumancoxsackievirusB5inhand,foot,andmouthdiseasepatients,China[J].EmergInfectDis,2012,18(2):351-353.59 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中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文全称HEVHumanenterovirus人肠道病毒PVPoliovirus脊髓灰质炎病毒ECHOEchovirus埃可病毒CVCoxsackievirus柯萨奇病毒CV-B5CoxsackievirusB5柯萨奇病毒B组5型EV-A71Enterovirus71肠道病毒71型HFMDhand,footandmouthdisease手足口病5’-UTR5’-untranslatedregion5’端非编码区3’-UTR3’-untranslatedregion3’端非编码区ORFOpenreadingframe开放阅读框DAFdecayacceleratingfactor衰变加速因子CARcoxsackieandadenovirnsreceptor柯萨奇病毒腺病毒受体ATCCAmericanTypeCultureCollection美国模式培养物保藏所FBSFetalbovineserum胎牛血清PBSPhosphatebuffersaline磷酸盐缓冲液DMSODimethysulfoxide二甲基亚砜PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应RADrapidantigendetection快速抗原检测方法CPEcytopathiceffect细胞病变法ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定CCID5050%ofcellcultureinfectivedose细胞培养半数感染量LD5050%oflethaldose半数致死量ED5050%ofeffectivedose半数有效量66 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文附表CV-B5全长cDNA克隆质粒测序引物序列引物名称引物序列CV-B5-T7-FTAATACGACTCACTATAGGGpSVA-seq-RGACACACATTCCACAGCTGGCV-B5-seq-1-FAACACAGCAAAATGGGAGCTCCV-B5-seq-2-RGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCV-B5-seq-3-FTGGTTACAGTGATAGGGTAAGGCV-B5-seq-4-RATACCACCGCGCACAAAGTAGCV-B5-seq-5-FGCTTACCCACGATGTTAACACCV-B5-seq-6-RGCCATACACAGCATCCTCTAGCV-B5-seq-7-FACAGGTGAGGCAGTGGAGAGCV-B5-seq-8-RCCATCCTTATCCACCAGCTCCV-B5-seq-9-FGGCAGGCAACGTGAATTTTGCV-B5-seq-10-FGCAACACTCTTCATCGCACG67 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文附录CV-B5全长cDNA克隆质粒测序结果CTTGTGCGCCTGTTTTATCTACCCCCTCCCCAATGTAACGTAAAAGCACAAATCAAGTGGTCAATAGATGGCCCAGTATGCCAACTGGGTTTAGACCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAAGCTGCTCACGCGGCTGAAGGAGAAAACGTTCGTTACCCGGCCAACTACTTCGAGAAGCCTAGTACCACCATGAAGGATGCGCAGTGTTTCGTTCAGCACAACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCAATCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGCTGGCGGCCTGCCCATGGGGTTACCCATGGGACGCTTCAATTCCGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCCAACTGCGGAGCAAGCACCCACAAACCAGTGGGCTGTTTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTACACTGGCTGCATATGGTGACAATTGAAAGATTGTTGCCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACAAACAGAGCTATTATCTACTTGTTTGTCGGCTTTGTACCGTTGAATTTCAAAGTTGTAAAAACCCTAATCTTCATCTTAACACTCAACACAGCAAAATGGGAGCTCAAGTATCAACACAGAAGACTGGTGCACACGAAACCGGTTTGAGTGCTAGTGGTAACTCCATCATCCACTATACAAATATAAATTATTATAAGGATGCCGCCTCAAACTCAGCAAATAGACAGGACTTCACTCAAGATCCAGGGAAGTTTACAGAACCTGTGAAGGACATTATGATCAAGTCGATGCCTGCTCTCAACTCTCCGTCAGCAGAGGAGTGTGGTTACAGTGATAGGGTAAGGTCCATCACCTTGGGTAATTCAACTATAACAACTCAGGAGTGTGCAAATGTGGTTGTAGGATATGGAGTGTGGCCCACCTATTTAAAGGATGATGAAGCAACAGCAGAAGACCAACCTACGCAACCAGACGTGGCTACGTGCAGGTTTTACACGCTTGAATCCGTAATGTGGCAACAGAGCTCGCCGGGGTGGTGGTGGAAATTCCCTGACGCACTATCTAACATGGGCTTGTTCGGGCAAAACATGCAATACCATTACCTTGGAAGGGCTGGATACACGGTGCACGTGCAGTGCAATGCATCTAAATTTCATCAGGGGTGTCTGTTGGTAGTATGTGTGCCAGAGGCGGAGATGGGGTGCGCCACGTTGGCCAATAAACCTGACCAGAAGAGCCTGAGCAACGGGGAGACCGCCAACATGTTTGAATCCCAAAACTCCACAGGGCAGACAGCAGTCCAGGCCAACGTGATTAATGCTGGTATGGGGGTTGGAGTCGGCAATCTGACCATATTCCCGCATCAGTGGATCAACCTGCGCACTAACAATAGTGCGACGATTGTCATGCCGTACATAAATAGTGTGCCCATGGATAACATGTTTAGGCACAATAACTTCACCCTTATGATCATCCCGTTTGCCCCGCTGAGTTATAGTACAGGTGCTACCACATACGTGCCAATTACAGTGACAGTGGCGCCGATGTGTGCTGAATACAATGGGTTGCGCTTGGCCGGCAAGCAGGGCTTACCCACGATGTTAACACCTGGTAGTAACCAGTTTCTCACATCTGATGATTTCCAATCTCCCTCAGCTATGCCACAGTTTGATGTCACCCCTGAAATGGATATCCCAGGGCAGGTCAACAACTTGATGGAAATCGCAGAGGTGGACTCCGTGGTACCCGTTAATAACACTGAAGGGAAAGTGTTATCCATTGAGTCATACCAGATCCCTGTTCAGTCGAATTCAACAAACGGTTCCCAGGTCTTTGGGTTTCCACTGATGCCAGGAGCTAGCAGTGTATTGAACAGGACACTGTTGGGGGAAATATTAAACTACTACACCCATTGGTCGGGCAGCATCAAGTTAACATTCATGTTCTGTGGGTCAGCAATGGCAACGGGCAAATTCCTGCTGGCGTATTCACCACCAGGTGCTGG68 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文TGCACCGACTACACGCAAGGAGGCAATGCTGGGCACTCATGTGATCTGGGATGTGGGGTTGCAATCGAGCTGCGTGTTGTGCATTCCATGGATCAGTCAAACACACTATAGATACGTGGTTGTGGATGAATATACTGCTGGTGGGTATATAACATGTTGGTACCAGACGAACATTGTGGTGCCTGCGGACACCCAAAGTGATTGCAAGATCTTGTGTTTTGTGTCGGCTTGCAACGATTTCTCTGTCAGGATGCTCAAGGATACGCCCTTTATAAAGCAGGACAACTTCTACCAAGGGCCCACAGGTGAGGCAGTGGAGAGGGCTATTGCACGCGTCGCTGACACCATTGGGAGCGGTCCAGTCAACTCAGAGTCTATTCCAGCCTTGACTGCCGCAGAAACGGGACATACGTCACAGGTGGTACCAGCAGACACAATGCAAACCAGACATGTAAAAAACTATCATTCAAGATCGGAGTCGACGGTGGAGAACTTTCTGTGTAGATCAGCATGCGTCTTTTACACCACATATAGAAATCATGGTACTGATGGTGACAACTTTGGTTATTGGGTGATCAGCACGCGCCAGGTGGCTCAACTACGGCGCAAGCTTGAGATGTTTACATATGCAAGATTTGATCTCGAGCTAACCTTTGTGATCACGAGCACTCAAGAACAGTCCACCATAAAAGGCCAGGATTCACCAGTGCTCACACATCAAATCATGTATGTGCCCCCAGGTGGCCCAGTGCCTACGAAAGTGAATAGCTACAGCTGGCAGACGTCCACCAACCCTAGCGTGTTCTGGACAGAAGGGAGTGCACCACCCCGTATGTCAATACCGTTCATCAGCATAGGTAATGCATATAGTATGTTCTATGATGGGTGGGCGAAGTTTGACAAGCAAGGAACATATGGTATAAATACACTAAATAACATGGGGACACTGTACATGAGACACGTGAATGATGGCAGCCCCGGCCCAATTGTGAGTACCGTACGCATATACTTCAAACCAAAGCATGTTAAGACATGGGTTCCAAGGCCACCCAGATTATGCCAGTACCAGAAGGCAGGCAACGTGAATTTTGAACCTACTGGTGTGACCGAAAGTAGGACAGATATAACAACTATGCAGACCACCGGTGCCTACGGACAGCAATCAGGCGCTGTGTATATTGGCAACTACAGAATAGTGAACAGACATCTCGCAACCCACACTGATTGGCAGAACTGTGTGTGGGAGGATTACAACAGGGACCTACTAGTCAGCACAACCACAGCCCACGGCTGTGACACTATAGCCAGATGTCAATGCACAACCGGGGTGTATTTTTGTGCCTCAAGGAATAAACATTACCCAGTCACCTTTGAAGGCCCGGGTCTCGTGGAAGTCCAAGAGAGTGAGTATTACCCCAAGAGATACCAGACACATGTCTTGCTTGCCGTGGGCTTTTCAGAGCCAGGAGACTGCGGAGGTATCCTGAGATGTGAACATGGTGTTGTTGGTATCGTAACCATGGGTGGTGAGGGTGTTGTTGGCTTTGCCGATGTGCGTGACCTTCTATGGTTGGAGGATGACGCAATGGAGCAGGGCGTGAAGGACTACGTGGAACAGCTCGGAAATGCTTTTGGATCTGGCTTCACCAACCAAATTTGTGAGCAGGTTAACCTTCTCAAAGATACATTGATTGGTCAAGATTCCATCCTAGAGAAGTCCCTTAAAGCTCTGGTCAAAATCATTTCAGCACTAGTGATTGTGGTGAGAAACCACGATGACCTAATAACAGTGACTGCCACCCTGGCCCTTATTGGATGCACATCATCACCGTGGCGCTGGCTTAAGCAGAAGGTGTCACAATATTATGGGATACCCATGGCTGAGCGACAAAACAACGGGTGGCTTAAGAAGTTCACAGAAATGACCAATGCTTGCAAAGGGATGGAATGGATCGCAATCAAAATCCAAAAGTTTATAGATTGGCTCAAGGTTAAAATCTTACCGGAAGTGAGGGAGAAGCATGAATTCCTGACCAGGCTCAAGCAACTCCCACTTCTGGAAAGCCAAATTGCCACCATTGAGCAAAGTGCGCCATCCCAGGGTGACCAGGAACAGCTTTTCTCAAATGTACAATACTTTGCTCACTATTGTAGAAAATACGCTCCTCTATACGCTGTTGAGGCCAAGAGAGTGTTCGCTCTTGAAAAG69 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文AAAATGAGCAACTACATACAGTTCAAGTCCAAATGCCGTATTGAGCCTGTATGCCTGCTCTTACATGGGAGCCCCGGGGCTGGCAAGTCGGTCGCCACTAATCTAATTGGGCGGTCCTTAGCTGAGAAGCTTAACAGTTCAGTATACTCCTTGCCACCCGACCCAGATCACTTCGATGGTTACAAACAACAAGCCGTCGTGATTATGGATGATCTATGTCAAAATCCAGATGGTAAGGACGTGTCCCTGTTCTGTCAAATGGTTTCCAGCGTGGATTTCGTACCACCAATGGCTGCACTCGAAGAGAAAGGGATTTTATTCACCTCCCCTTTTGTCCTAGCATCCACGAATGCAGGCTCCATTAATGCACCAACGGTCTCAGATAGCCGAGCTTTAGCCAGGAGGTTCCATTTTGACATGAATATAGAGGTAATTTCAATGTATAGTCAAAATGGAAAAATCAACATGCCCATGTCAGTGAAAACGTGCGATGAAGAGTGTTGCCCAGTCAATTTCAAAAGATGCTGCCCCCTCGTGTGCGGGAAGGCCATCCAGTTTATTGATAGAAGGACACAGGTGAGGTACTCCCTGGATATGTTGGTCACTGAGATGTTCAGAGAGTACAACCATAGACACAGTGTGGGGGCAACCCTTGAGGCGCTGTTCCAAGGCCCGCCAGTTTACAGGGAGATCAAGATTAGTGTTGCACCTGAAATCCCGCCACCACCAGCAATTGCAGATTTGCTAAAATCAGTGGACAGCGAGGCAGTGAGGGAATACTGTAAGGAGAAGGGATGGCTAGTTCCTGAGGTTAACTCCACTCTTCAGATTGAGAAGCACGTCAGCAGGGCATTCATATGCCTCCAAGCACTAACAACCTTTGTCTCTGTGGCCGGAATCATATATATCATTTACAAGTTATTTGCAGGGTTCCAGGGTGCGTACACAGGGATGCCCAATCAAAAGCCCAAAGTGCCAACATTAAGACAAGCCAAGGTGCAAGGTCCCGCTTTTGAATTTGCCGTAGCTATGATGAAGAGGAATTCTAGCACGGTAAAAACAGAATATGGTGAATTCACCATGCTGGGCATCTATGATAGATGGGCTGTCCTCCCGCGCCACGCCAAACCCGGACCAACTATCCTCATGAACGATCAAGAAGTTGGCGTGCTGGATGCAAAAGAGCTGGTGGATAAGGATGGTACAAACCTTGAACTTACACTGTTGAAACTCAATCGGAATGAGAAATTTAGAGACATCAGAGGGTTTCTCGCCAAGGAGGAAGTGGAAGTCAATGAAGCTGTTTTGGCAATAAACACTAGCAAATTTCCAAACATGTACATCCCCGTGGGGCAGGTCACAGACTATGGTTTTCTGAATTTAGGTGGCACCCCCACGAAGAGAATGCTTATGTACAACTTCCCAACTAGGGCAGGCCAGTGTGGTGGTGTCCTCATGTGTACCGGCAAGGTACTGGGGATACATGTTGGTGGAAACGGCCACCAGGGCTTTTCTGCTGCACTTCTCAAGCATTACTTTAATGATGAGCAAGGTGAGATTGAATTTATAGAAAACTCAAAAGATGCAGGGTTCCCAGTCATCAACGCACCGAGTAAGACCAAACTGGAACCAAGCGTTTTCCACCAAGTTTTTGAGGGTAACAAGGAACCAGCAGTTCTCAGAAATGGCGACCCACGCCTCAAAGCCAATTTTGAGGAGGCTATTTTCTCAAAGTACATTGGAAATGTTAACACGCATGTAGATGAGTACATGCTAGAGGCAGTGGACCACTATGCAGGGCAATTGGCCACCCTAGACATCAACACTGAACCCATGAAACTAGAGGATGCTGTGTATGGCACCGAAGGGTTAGAGGCTCTCGACTTGACAACAAGTGCGGGATACCCTTACGTTGCACTGGGCATCAAGAAGAGAGACATACTGTCAAAAAAGACTAAAGACTTGACCAAACTGAAAGAGTGTATGGACAAATATGGACTAAACCTGCCAATGGTGACATATGTAAAAGATGAACTCAGATCAGCGGAAAAGGTGGCTAAGGGGAAATCTAGGCTTATTGAGGCATCTAGCCTGAATGATTCTGTAGCAATGAGGCAAACATTTGGAAACCTATATAAGACATTTCACCTAAACCCTGGAATTGTGACGGGCAGCGCGGTCGGATGTGATCCCGATCTTTTCTGGAGT70 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文AAAATACCTGTAATGCTGGACGGACATCTCATAGCTTTTGATTACTCCGGATACGACGCTAGTCTGAGCCCTGTATGGTTCGCCTGTTTGAAGCTGCTGCTTGAGAAACTTGGGTACTCACACAAGGAGACAAACTACATTGATTACTTATGCAACTCACACCATCTGTACAGGGACAAACACTACTTTGTGCGCGGTGGTATGCCCTCAGGGTGCTCTGGCACCAGCATTTTCAATTCAATGATCAACAACATTATAATTAGAACACTAATGTTGAAGGTGTACAAAGGTATTGATTTGGATCAATTCAGAATGATTGCATATGGTGACGATGTAATTGCCTCATACCCGTGGCCCATTGATGCATCACTGCTCGCTGAGGCAGGCAAAGGCTATGGATTGATCATGACACCAGCAGATAAGGGGGAGTGCTTTAATGAGGTGACTTGGACCAACGTTACCTTCCTGAAAAGGTACTTCAGAGCGGATGAGCAATACCCTTTCTTGGTCCACCCAGTTATGCCCATGAAGGATATACACGAATCCATCAGATGGACAAAAGATCCAAAGAACACCCAAGACCACGTGCGATCCCTGTGCCTATTGGCTTGGCACAACGGGGAGCACGAATATGAGGAGTTTATCCGCAGGATTAGGAGCGTCCCAGTAGGGCGCTGTTTAACTCTACCTGCGTTCTCAACCCTGCGCAGGAAATGGTTGGATTCCTTCTAAATTAGAGACAATTTAGCATAATATTAAATTGGCTTAACCCTGCCGCACTTACCGAACTAGACAACGGTGCGGCAGGGGTAAATTCTCCGCATTCGGTGCGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA71 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文个人简历基本情况姓名：郝晓甜性别：女出生年月：1990年1月政治面貌：中共党员籍贯：河南省安阳市教育背景2014年9月-2017年7月中国食品药品检定研究院硕士2010年9月-2014年7月河南大学生命科学学院本科硕士期间发表论文1.郝晓甜，高帆，毛群颖，梁争论.柯萨奇病毒B组5型的研究进展[J].中国生物制品学杂志,2017,04:433-437.2.郝晓甜,陈盼,吴星,梁争论.我国戊型肝炎病毒流行特征及其疫苗的应用[J].中国生物制品学杂志,2016,06:649-653.3.郝晓甜,陈盼,吴星,梁争论.柯萨奇病毒B组3型和肠道病毒71型入胞机制比较研究[J].中国病毒病杂志,2016,02:105-112.4.郝晓甜,陈盼,毛群颖,邵杰,林惠娟,罗震,吴星,梁争论.柯萨奇病毒A组16型中和抗体假病毒荧光定量检测方法的建立及初步应用[J].中国病毒病杂志,2016,01:6-11.5.陈盼,郝晓甜,吴星,梁争论.戊型肝炎病毒疫苗的研发和评价[J].微生物学免疫学进展,2015,05:55-59.6.林惠娟,吴星,高帆,陈盼,郝晓甜,周旭,梁争论.鼠源戊型肝炎病毒IgG抗体定量检测方法的建立[J].微生物学免疫学进展,2016,04:17-20.7.GaoF,BianL,HaoX,etal.SeroepidemiologyofCoxsackievirusB5ininfantsandchildreninJiangsuprovince,China[J].VirolJ.(已投稿)8.ChenP,WuX,SuY,HaoX,etal.DevelopmentofapseudovirusbasedassayformeasuringneutralizingantibodiesagainstCoxsackievirusB5[J].JVirolMethods.2017,246:20-26.9.WuX,ChenP,LinH,HaoX,LiangZ.HepatitisEVirus:CurrentEpidemiologyandVaccine[J].HumVaccinImmunother.2016,16:1-8.10.ChenP,WuX,MaoQ,GaoF,HaoX,etal.ArapidandquantitativeassayformeasuringneutralizingantibodiesagainstCoxsackievirusB3[J].JVirolMethods.2016,232:1-7.72 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文致谢时光荏苒，岁月如梭，三年研究生时光马上就要结束了。入学时的情景仿佛昨日一般，而今又要打点行装步入新的人生旅程。求学经历充实而美好，在即将画上句点之际，我心绪万千，不胜感慨。在我完成学业及毕业论文的过程中，得到了老师、同学以及朋友的支持和帮助，在此表示衷心感谢！感谢我的导师梁争论研究员，感谢您收我为学生，感谢您带我来到肝炎病毒疫苗室这个大集体，感谢您对我的谆谆教导和悉心关怀。三年前因缘幸会恩师，您的教诲将让我终生受益。我在三年研究生期间点点滴滴的成长，都离不开老师的悉心栽培。您严谨治学的态度、勤奋工作的热情、宽厚仁慈的胸怀、积极乐观的生活态度都让我钦佩，是我今后努力学习的典范。感谢肝炎病毒疫苗室所有老师、师兄、师姐、师弟、师妹三年来对我课题和生活上的帮助。感谢毛群颖研究员、吴星研究员、陈盼师姐在课题进展及论文修改方面对我的帮助和鼓励。感谢姚昕师兄、高帆师兄、卞莲莲师姐、王一平师姐、孙世洋师兄、邵杰师兄、张军楠师姐、林惠娟师姐、苏瑶师妹、杨策师弟、杜瑞晓师妹、付莹师妹、董方玉师妹、胡亚林、肖霞、张盼、罗震等在学习和生活中给予的关心、鼓励和帮助，感谢你们给我带来的快乐和感动。感谢郎书惠老师对我课题中免疫组化以及病理方面给予的帮助和指导。感谢北京生命科学研究所李文辉老师、隋建华老师以及两个实验室的师兄、师姐、师弟、师妹，我的课题得以顺利进行离不开你们的支持和帮助。我很荣幸在三年前来到中国食品药品检定研究院，也很幸运能够在这里完成我的硕士研究生生活。感谢三年时间出现在我生命中，陪伴我走过这一段旅程的每一个人，是你们给我的人生增添了绚丽的色彩。这些经历都将会是我青春的回忆中最美好的一段。感谢人事教育处孙国顺老师在生活和学习中给予的关心和帮助。感谢2014级所有研究生同学的友爱互助，这份情谊是值得珍藏一生的宝贵财富！最后感谢我的父母、亲人、朋友一直以来给予我的关心和支持，感谢你们的理解与包容、支持与关爱，感谢你们为我默默付出和承担的一切！在以后的人生道路上，我一定会加倍努力，好好生活，用心报答所有关心和支持我的人。73 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文版权声明任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人，未经本论文作者同意，不得将本论文转借他人，亦不得随意复制、抄录、拍照或以任何方式传播。否则，引起有碍作者著作权之问题，将可能承担法律责任。中国食品药品检定研究院学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名：日期：年月日74 中国食品药品检定研究院硕士研究生学位论文学位论文使用授权说明本人完全了解中国食品药品检定研究院关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：按照所要求提交学位论文的印刷本和电子版本；所有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；所可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；所可以公布论文的部分或全部内容，并可将论文编入有关数据库进行检索。（保密论文在解密后遵守此规定）论文作者签名：导师签名：75
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