体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响

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’１〇２；８５：對交代码．学号：２０１３４２３４０１２ＩＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＢＩＱＨｉ体外循环术对先天性心脏病儿窒ＮＯＤ信号的影响ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｂｙｐａｓｓｏｎｎｏｄｉａｎｄｙＮＱＤ２ｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎｗｉｔｈｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ研究生姓名杨清华指导鋪齡汪健专业名称儿科学硏究方向普外科所在院部儿科１自床医学院？＝＝Ｉ：． 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响中文摘要体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响中文摘要目的：探讨体外循环（cardiopulmonarybypass,CPB）对先天性心脏病(congenitalheartdisease,CHD)儿童NOD1和NOD2表达水平及功能的影响，为临床调控CHD患儿固有免疫状态，预防和治疗术后感染提供新思路。方法：收集CHD患儿CPB术前、术后、术后1d、3d、7d五个时间点外周血标本：1.分别采用NOD1的激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）全血刺激4h，采用ELISA技术检测上清中TNF-α和IL-6的水平2.采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs），分别用Real-timePCR技术和Westernblot技术检测各个时间点NOD1和NOD2的基因及蛋白水平；3.分别用NOD1的激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）刺激各个时间点PBMCs，Westernblot技术检测RIP2、NF-κBp65和MAPKp38信号活化水平，进一步评判CPB对NOD1和NOD2下游信号通路的影响。结果：1.经NOD1激动剂（Tri-DAP）或NOD2激动剂（MDP）刺激后，CPB术前外周血中的炎症因子IL-6和TNF-α的表达均明显上调。与术前比较，术后Tri-DAP刺激产生IL-6（P<0.01）和TNF-α（P<0.05）的水平受到明显抑制，术后1d开始恢复，术后7d恢复至术前水平。与术前比较，术后经MDP刺激产生IL-6的水平明显低于术前（P<0.05），术后1d恢复至术前水平；术后TNF-α的水平也低于术前，但差异无统计学意义。2.与CPB术前比较，CHD患儿NOD1的基因和蛋白水平以及NOD2的蛋白水平均在术后1d明显下降，差异有统计学意义（P<0.01），而术后各个时间点NOD2的基因表达水平与术前比较无明显差异。I 中文摘要体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响3.与CPB术前比较，术后CHD患儿PBMCs中RIP2的磷酸化水平以及下游信号通路NF-κBp65和MAPKp38均明显受到抑制，术后1d开始恢复，术后7d恢复至术前水平。结论：CPB术后NOD1和NOD2介导炎症因子表达的能力下降，无法针对病原体启动有效的固有免疫应答，这可能是导致CHD患儿术后感染风险升高的重要原因，其分子机制可能与CPB术后NOD1和NOD2下游信号转导受抑制存在密切关系。关键词：NOD1,NOD2，先天性心脏病，体外循环术，固有免疫作者：杨清华指导老师：汪健II 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响英文摘要TheinfluenceofcardiopulmonarybypassonNOD1andNOD2signalinginchildrenwithcongenitalheartdiseaseAbstractObjective：Toinvestigatetheeffectsofcardiopulmonarybypass(CPB)onNODreceptors(NOD1andNOD2)expressionandfunctioninchildrenwithcongenitalheartdisease(CHD),whichmayprovidenewwaytopreventandtreatthepostoperativeinfectionthroughmodulationofinnateimmunesignaling.Methods：PeripheralbloodsampleswerecollectedfromchildrenwithCHDatthefollowingtimepoints:beforeoperation,attheendofCPB,andatday1,day3,day7daysafterCPB.AllsampleswerestimulatedwithTri-DAPorMDPfor4hoursandthelevelsofIL-6andTNF-αintheculturesupernatantsweremeasuredbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).NOD1andNOD2geneandproteinexpressioninperipheralbloodmononuclearcells(PBMCs)ateachtimepointwerefurtherquantifiedusingqPCRandwesternblotingrespectively.Moreover,thephosphorylationlevelofRIP2、NF-κBp65、MAPKp38uponTri-DAPorMDPstimulationweremeasuredbywesternbloting.Results：1.Comparedwiththeunstimulatedgroups,theproductionofIL-6andTNF-αwasimprovedpreoperativelyuponTri-DAPorMDPstimulation.However,thelevelsofIL-6(P<0.01)andTNF-α(P<0.05)inducedbyTri-DAPweresignificantlysuppressedattheendofCPB,withreturningtothepreoperativelevelfromday1postoperatively;InresponsetoMDPstimulation,thereleaseofIL-6wassubstantiallydecreasedattheendofoperation,andrecoveryofthecytokinewasseenatday1afterCPB.TheproductionofTNF-αwasalsosuppressedattheendofCPB,buttherewasnostatisticallysignificantdifferencebetweenpreoperativeandpostoperativegroups.III 英文摘要体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响2.Atday1afterCPB,thegeneexpressionlevelofNOD1wasdecreasedobviously(P<0.01),theproteinlevelofbothNOD1andNOD2,whilenodifferencewasseeninNOD2geneexpressionbeforeandafterCPB.3.Consistentwiththeresultsobtainedfromcytokineresponseanalysis,thephosphorylationlevelofRIP2,p65andp38weremarkedlyinhibitedattheendofCPB.Fromday1postoperatively,RIP2,p65andp38phosphorylationinPBMCsweregraduallyrecovered,andthenreturnedtothepreoperativelevelonday7postoperative.Conclusions:CPBcausesasignificantreductionincytokineproductioninducedbyNOD1andNOD2,whichmayberesponsibleforinnateimmunitysuppressionandahighriskofpostoperativeinfection.ThepossiblemolecularmechanismmayberelatedtothereductionofRIP2,p65andp38phosphorylationandNODsignalinginhibition.Keywords:NOD1,NOD2，congenitalheartdisease，cardiopulmonarybypass，innateimmuneWrittenbyYangQinghuaSupervisedbyWangJianIV 目录前言...................................................................................................................................1材料与方法..........................................................................................................................3实验结果............................................................................................................................12讨论.................................................................................................................................21参考文献............................................................................................................................24结论.................................................................................................................................29综述.................................................................................................................................30中英文对照缩略词表.......................................................................................................41攻读学位期间撰写论文及科研情况.............................................................................43致谢.................................................................................................................................44 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响前言前言先天性心脏病(congenitalheartdisease,CHD)是指在胚胎发育时期由于心脏及大血管的形成障碍或发育异常而引起的解剖结构异常，或出生后应自动关闭的通道未能[1,2]闭合的情形。CHD是最常见的一类先天性畸形，约占各种畸形的28%，近年来随着产前诊断技术的不断进步，CHD患儿的发病率也大幅度升高。据统计，从1995年到现在，CHD患儿的发病率已增加到9.1‰，这意味着每年会增加CHD患儿135万[3,4]。随着体外循环术（cardiopulmonarybypass,CPB）、心肌保护及术后支持护理等医学技术的的飞速发展，CHD患儿的生存率得到了显著提高。但是，术后感染仍然[5,严重影响CHD患儿的康复。据报道，CHD患儿CPB术后的感染率高达16%~31%6]，感染已成为CHD患儿术后主要的并发症之一，因此进一步研究CPB术后易感的可能机制尤为必要。固有免疫细胞通过识别病原体表面具有特定结构的分子成分，即病原体相关分子模式（pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs），启动炎症反应，第一时间参与宿主防御。在这一过程中模式识别受体（patternrecognitionreceptors,PRRs）发挥重要作用，PRRs缺陷或功能障碍可导致儿童对多种病原体易感。PRRs主要包括Toll样受体(Tolllikereceptors,TLRs)和核苷酸结合寡聚域样受体(thenucleotidebinding[7]oligomerizationdomain—likereceptor,NLRs)两大类。NLRs是近年来新发现的一类PRR,在识别病原体介导炎症反应中起重要作用。NLRs分子结构域包含三部分:C-末端富含亮氨酸的重复系列（leucine-richrepeats,LRR）,主要负责探测和识别配体；位于分子中央的NOD（核苷酸结合寡聚化区），起着NOD寡聚化作用；N-末端caspase募集结构域（N-terminalcaspaserecruitmentdomain,CARD）,即蛋白-蛋白相互作用区，可与下游分子和效应蛋白结合，启动下游信号的转导。NLRs蛋白是一个多样的蛋白质家族，以N-末端结构域为基础，NLRs可以分成3个亚家族，也被称为CARD-containingNODs、PYD-containingNALPs和[8]BIR-containingNAIPs。NLRs涉及多种信号通路的激活，对各种各样的微生物群具有特异性，从而达到控制病原体的作用。NLRs蛋白的激活导致NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs）或半胱氨酸天冬氨酸酶激活，1 前言体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响从而介导炎症反应，连同其家族分泌物也与炎症疾病有关，说明这些分子在维持宿主[9-11]-病原体相互作用和炎症反应中有重要作用。现已发现，人的NLRs家族有22个成员，其中，NOD1和NOD2是该蛋白家族中最有代表性两个受体蛋白，识别细菌肽聚糖（peptidoglycan,PGN）衍生物的不同[12]结构核心模体.NOD1特异性的识别含有内消旋二氨基庚二酸(meso-DA)的PGN相[13,14]关分子，该分子主要存在于革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌；而NOD2则特异性识别PGN的保守成分胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)，该保守成分存在于[15,16]所有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中。虽然NOD1和NOD2识别的配体结构不同，但这两个蛋白都与下游的受体作用蛋白激酶-2（receptor-interactingproteinkinase2,[17,18]RIP2）分子相互作用，激活相同的信号转导通路—NF-κB活化通路和MAPKs信号转导通路，最终诱导炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等基因的表达,启动天固有免疫和炎[18，19]症反应,最终发挥杀灭病原体和抗感染的作用。RIP2具有酪氨酸激酶活性，通过其自身磷酸化作用，有效激活NF-κB转录因子。PradeepBist等报道，敲除RIP2基因的肺上皮细胞感染Acinetobacterbaumannii后，产生炎症因子的能力较正常肺上皮细胞明显受限，这与NF-κB信号转导通路的活性[18]降低有关.Kobayashi等报道，缺失RIP2的小鼠细胞中NOD1、NOD2不能激活NF-κB，[19]加入外源性的RIP2分子后，其活化能力又得到恢复,这说明RIP2是NOD途径中[20]激活NF-κB的关键蛋白。活化的RIP2除激活NF-κB外，还激活MAPKs途径。MAPKs途径是受体酪氨酸激酶、免疫受体、细胞因子受体和G-蛋白耦联受体等激活多重上游信号途径后的汇聚点,MAPK途径调控很多下游信号分子和转录因子,从而参[21]与基因调控。到目前为止已发现7种MAPK激酶，其中研究较多属MAPKp38。NF-κB信号通路在调控细胞核内基因表达方面起重要作用。MAPKp38和NF-κBp65分别作为MAPKs和NF-κB信号活化通路家族中的重要成员，与多种免疫相关疾病的[22,23]发生发展过程有关。这两条途径激活转录因子p65和p38转位到细胞核内，与启动子结合，启动固有免疫相关的靶基因表达。因此，我们拟收集CHD患儿CPB术前、术后、术后1d、3d、7d五个时间点的外周血标本，进一步研究CPB对NOD1和NOD2的影响，有助于了解CHD患儿术后易发感染的分子机制，为临床预防和治疗CHD患儿的术后感染提供新思路。2 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响材料与方法材料与方法一、实验材料1.临床样本：本研究所用临床样本来自于2014年5月~12月期间，在苏州大学附属儿童医院择期行CPB的CHD患儿44例,术前一般情况良好，无遗传综合症、先天性免疫缺陷、急性感染或炎症征象等，麻醉方法均标准化，用丙泊酚、瑞芬太尼、顺式阿曲库铵静脉诱导麻醉，以七氟烷、瑞芬太尼和顺式阿曲库铵维持麻醉，术中用多功能生命监护仪（CILIN-508，日本）监测，临床资料及数据见表1。年龄1.81±1.93男/女20/24体重（kg）10.08±3.49房间隔缺损（ASD）28室间隔缺损（VSD）11法洛四联症（TOF）5CPB时间（min）81.64±27.53主动脉夹闭时间（min）44.48±19.67重症监护室停留时间（day）1.97±0.26表1：行CPB手术的CHD患儿的临床资料。注：年龄、体重、CPB时间、主动脉夹闭时间、重症监护室停留时间均采用均值±标准差（x±SD）表示。2．主要试剂NOD1/NOD2、GAPDH引物苏州金唯智生物科技公司TrizolReagent美国GIBCO公司人血淋巴细胞分离液天津市灏洋生物制品科技有限责任公司RNA反转录酶RNA反转录酶RNA酶抑制剂RNA反转录酶SYRBGreen瑞士Roche公司随机引物标记瑞士Roche公司d-NTP瑞士Roche公司NOD1激动剂上海吉泰生物科技有限公司3 材料与方法体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响NOD2激动剂上海吉泰生物科技有限公司ELISA试剂盒杭州联科生物科技有限公司RPMI-1640培养基美国HyClone公司胎牛血清美国HyClone公司抗RIP2抗体美国CST公司抗P-RIP2抗体美国CST公司抗GAPDH抗体美国CST公司兔二抗美国SantaCruze公司抗P38抗体美国CST公司抗P-P38抗体美国CST公司抗P65抗体美国CST公司抗P-P65抗体美国CST公司3.主要仪器恒温水浴箱南京高倍德科技发展有限公司低温冰箱（-30℃）中国青岛海尔集团低温冰箱（-20℃）韩国三星公司超低温冰箱（-80℃）日本SANYO公司高速离心机(Labofuge400R)瑞典Heraeus公司TGL-16台式离心机上海医用分析仪器厂移液器Eppendorf公司BCM-1300A净化工作台苏净集团安泰公司高压蒸汽灭菌锅华利达实验设备有限公司电子天平美国双杰兄弟有限公司BioMate3S分光光度计美国赛默飞世尔科技有限公司DK-8D型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司电热手提式压力蒸汽灭菌锅上海医用核子仪器厂DK-600A型电热恒温水槽上海一恒科技有限公司计算机图像分析系统德国LEICA公司4 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响材料与方法光学显微镜上海齐跃生物科技有限公司电子分析天平TG328A上海天平仪器厂微波炉中国青岛海尔集团二、实验方法1.PBMC的分离1.1取一支无菌的15ml离心管(美国Corning公司)，加入3ml人外周血淋巴细胞分离液（Ficoll）。1.2取肝素抗凝血2ml与等量的PBS充分混匀，用吸管沿管壁缓慢叠加于淋巴细胞分离液分层液面上，注意保持清楚的界面，25℃，1600rpm/min，水平离心30min;1.3离心后,此时离心管中由上至下分为四层。第一层为血浆层。第二层为环状乳白色单个核细胞层,第三层为透明的分离液层,第四层为红细胞层,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。1.4用吸管小心吸取第二层环状乳白色单个核细胞层到另一15ml离心管中,向所得离心管中加入10mlPBS混匀细胞,25℃，1000rpm/min，水平离心10min,如此反复洗涤2-3次;1.5弃上清，移液枪吸取1mlPBS吹打管底沉淀，混匀后转移至一1.5ml无菌EP管中，25℃，15000rpm/min离心1分钟；1.6离心完毕后，小心倒掉上清，凉干，移液枪吸取1mlTrizol液反复吹打沉淀，混匀后置于-80℃低温冰箱保存。2.细胞因子的测定2.1取去血浆的抗凝全血50µl于48孔培养板中，分别加入含NOD1激动剂Tri-DAP(100ng/ml)、NOD2激动剂MDP(100ng/ml)的RPMI-1640培养基450µl，置于含5%CO2的37℃培养箱中培养4h；2.2将上述48孔培养板从37℃培养箱中取出，将含有全血的RPMI-1640培养基转移到1.5ml离心管中，2500rpm/min4℃离心10min,收集上清，置于-80℃冰箱中保存待测。2.3将保存于-80℃冰箱中的待测标本取出，室温溶解；2.4将溶解后的标本，依次加入ELISA试剂盒反应孔中，37℃孵育1h；5 材料与方法体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响2.5弃去反应后的标本液体，并加入洗涤液，静置5min，然后尽量拍掉洗涤液，如是反复5次，尽量洗尽游离未结合的反应物；2.6加酶标抗体，37℃孵育30min；2.7弃去反应后残余的酶标抗体，并加入洗涤液，静置5min，然后尽量拍掉洗涤液,反复5次，彻底洗涤未结合的酶标抗体；2.8加入终止液，待均匀变色后，迅速移至酶标仪下检测，并导出数据。3.总RNA提取及Real-timePCR检测3.1RNA提取3.1.1从-80℃低温冰箱中取出标本，置于冰上溶解后，加入200µl氯仿，震荡15s，室温静置5min，4℃，12000rpm离心10分钟，可见液体分为三层；3.1.2用移液枪小心吸取上层水相约500µl，转移至一新的1.5ml的离心管中，加等量的异丙醇混匀，在冰上静置10min；3.1.34℃，12000rpm离心10分钟，小心弃去上清，加入1ml75％乙醇（DEPC水配制），4℃，8000rpm离心5分钟；3.1.4弃上清，放于滤纸上吸干，加入1ml无水乙醇清晰沉淀，4℃，8000rpm离心5分钟；3.1.5尽量弃上清，并于滤纸上吸干，此时管底沉淀由白色转为透明表示已干。3.2RNA定量用适量无RNA酶的水溶解RNA沉淀。取10µl稀释100倍,用BioMate3S分光光度计测量OD260与OD280。以OD260/OD280的比值确定RNA的完整性与纯度(比值在1.8-2.0时为RNA样品的满意纯度),并依据OD260的值，计算RNA的量并进行稀释，以浓度为1µg/1µl为宜。3.3逆转录3.3.1将体系A加入200µl离心管中上下颠倒充分混匀并离心，于70℃温育5分钟。体系A：RandomPrimers8µlDEPC水2µl6 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响材料与方法总RNA2µl总体积12µl3.3.2之后迅速置于冰上5min3.3.3加入如下反应体系B，上下颠倒充分混匀后置于37℃温育60分钟，95℃5分钟。体系B：反转录缓冲液5µldNTP混合物1.3µlDEPC水4.7µlRNAsin核糖核酸酶抑制剂1µl反转录酶1µl总体积13µl3.4Real-timePCR检测3.4.1根据引物设计原则，以GAPDH为内参照物，从GenBank中检索人NOD1/NOD2基因序列，应用Primer5.0软件设计引物，由苏州金唯智生物科技有限公司合成相应引物，NOD1、NOD2以及内参照物GAPDH的上、下游引物的具体序列如下：GenenamePrimersequencesForwardprimer5′-CAGGTCTCCGAGAGGGTACTG-3′NOD1ReversePrimer5′-TGTGTCCATATAGGTCTCCTCCA-3′Forwardprimer5′-TGGACACAGTCTGGAACAAGG-3′NOD2ReversePrimer5′-CAGGACCCATACAGTTCAAAGG-3′Forwardprimer5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′GAPDHReversePrimer5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′3.4.2将2xSYBRPCRministerMix、cDNA、上下游引物、去离子水在室温下融化后上下震荡充分混匀，形成反应体系C。7 材料与方法体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响体系C：2xSYBRPCRministerMix10µlForwardprimer1µlReverseprimer1µlDeionizedwater3µlcDNA5µl总体积20µl3.4.3将此反应体系C混匀后分装到不同的离心管中。3.4.4将反应体系C加到PCR板中，每一个样品做三个复孔，然后将加好样品的PCR板置于荧光定量仪上，按照下述反应条件进行反应，共45个循环。反应条件：95℃预95℃15s延伸变性60℃15s72℃10min72℃30s10min45个循环45个循环3.4.5反应结束后做相应的溶解曲线和扩增曲线，运用LightCyler480自带的软件进行数据收集和定量分析。4.Westernblot检测4.1提取PBMCs中的总蛋白按照上述实验方法提取CPB术前(TC)、术后即刻（T0）、术后1天（T1）、术后3天（T3）、术后7天（T7）5个时间点CHD患儿的PBMCs，加入1mlRPMI1640培养基，于光学显微镜（上海齐跃生物科技有限公司）下计数，每份样本的细胞浓度6标准化为1×10个/ml，将上述细胞分为两份，一份用含Tri-DAP(100ng/ml)和MDP(100ng/ml)的RPMI1640培养基，刺激上述细胞30min后加入RIPA裂解液，用于检测RIP2、NF-κBp65和MAPKp38信号活化水平，另一份直接加入RIPA裂解液8 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响材料与方法冰上裂解30min，用于检测NOD1和NOD2的蛋白表达水平。然后，4℃12000rpm离心10min，将上清转移至一干净的预先预冷的新的EP管中，将所有的蛋白样品先调至等浓度，并按比例加入蛋白缓冲液（loadingbuffer），开水煮沸10min,使蛋白变性，混匀后置-80℃冰箱保存以备蛋白检测。4.2Westernblot溶液的配制（1）10%分离胶ddH2O7.9ml30%Acrylamide6.7ml1.5MTris-Hcl(pH8.8）5.0ml10%SDS0.20ml10%APS0.20mlTEMED0.008ml（2）5%浓缩胶（10ml）ddH2O6.8ml30%Acrylamide1.7ml1.0MTris-HCl(pH6.8)1.25ml10%SDS0.1ml10%APS0.1mlTEMED0.01ml(3)10xTBS缓冲液NaCl80gTris-base24.2gHCl调pH至7.6,ddH2O定容到1000ml(4)1×TBST缓冲液10×TBS100mlddH2O900mlTween-201ml(5)5×电泳缓冲液Tris-base15.2gGlycine94.0g9 材料与方法体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响SDS5.0gddH2O定容到1000ml(6)10×转膜缓冲液(pH8.3)Tris-base30.3gGlycine144gSDS10gddH2O定容到1000ml(7）30%丙烯酰胺Arcylamide29gbis-Arcylamide1g加入ddH2O后37℃溶解，补水至100ml(8)1.5mol/LTris-HCl(pH=8.8)Tris-base18.15gddH2O80ml用浓HCl调定pH至8.8，ddH2O定容至100ml(9)1.0mol/LTris-HCl(pH=6.8)Tris-base12.1gddH2O80ml用浓HCl调定pH至6.8，ddH2O定容至100ml(10)10%SDSSDS10gddH2O定容至100ml4.3配胶用蒸馏水仔细清洗玻璃板并于60℃烘箱中烘干，将其对齐固定于支架上（确保两块玻璃板的下沿在一个平面）；按照一定比例配制10％的分离胶，混匀后灌入两块玻璃板中，蒸馏水压气泡；待分离胶充分凝固后，将上层蒸馏水倒掉，并用滤纸将残余水吸干。按照比例配制5%的浓缩胶，混匀后缓慢灌入分离胶上层，插上15孔的齿梳，避免产生气泡，等待其充分凝固。10 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响材料与方法4.4上样将配好的胶连同玻璃板一起放入装有电泳液的电泳槽中，双手小心将15孔的梳子从胶中拔出，确保电泳液的液面超过玻璃板上沿；在两侧孔中加入3µl蛋白Marker,其余每孔从左至右分别加入10µlTC、T0、T1、T3、T7五个时间点的蛋白提取液。4.5电泳接通电泳电源，先用60V电压电泳，待Marker指示带分离后，将电泳的电压改为100V，待溴酚蓝到达分离胶最下沿时停止电泳。4.6转膜按照NOD1、NOD2、RIP2、NF-κBp65、MAPKp38和GAPDH蛋白的KD值，根据Marker的指示带切除多余的胶，然后将含有目的蛋白的胶放入转膜夹中，夹子黑面-海绵-两张滤纸-含目的蛋白胶-PVDF膜-两张滤纸-海绵-夹子白面，确保各层之间无气泡（注意：PVDF膜预先用甲醇处理15s）；将转膜夹按正负顺序放入转膜槽中，225mA冰上恒流转膜1h，1h后取下NOD1、NOD2、GAPDH蛋白所对应处PVDF膜，一定要小心翼翼，防止膜移位。4.7封闭转膜后PVDF膜置于含5%的BSA封闭液中，室温下轻摇1-2h。4.8一抗孵育分别加入NOD1、NOD2、RIP2、NF-κBp65、MAPKp38和GAPDH多克隆抗体,抗体稀释比分别是1：1000、1：1000、1：1000、1：1000、1：1000、1：5000，与PVDF膜一起置于密封袋中，摇床上轻摇2h后，置于4℃冰箱过夜,次日，将密封袋从冰箱中取出，放在摇床上轻摇1h后，使其恢复至常温，取出PVDF膜TBST溶液洗涤3次，每次10min。4.9二抗孵育加入1：5000的二抗后轻摇1h,取出PVDF膜TBST溶液洗涤3次，每次10min。4.10显影采用BeyoECLPlus试剂盒和蛋白显影仪显影（BEYOTIME生物技术公司）。5、统计学分析采用Graphpad5.0软件对实验数据进行统计分析，各项实验数据均采用均值±标准差（x±SD）表示。组间比较采用单因素方差分析比较，P<0.05为差异有统计学意义。11 实验结果体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响实验结果1.一般情况CHD患儿在性别、年龄、体重、CPB时间、重症监护室停留时间及主动脉夹闭时间差异无统计学意义（P>0.05）,所有患儿没有感染征象，心功能良好，复查血常规均正常。2.NOD1和NOD2的激动剂刺激后IL-6和TNF-α的水平变化NOD1激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）刺激后，CPB术前外周血均明显表达炎症因子IL-6和TNF-α。与术前比较，术后Tri-DAP刺激产生IL-6（P<0.01）（图1A、表2A）和TNF-α（P<0.05）（图1B、表2B）的水平受到明显抑制，术后1d开始恢复，术后7d恢复至术前水平。与术前比较，术后经MDP刺激产生IL-6的水平明显低于术前（P<0.05），（图1C、表2A）术后1d恢复至术前水平；术后TNF-α的水平也低于术前，但差异无统计学意义(图1D、表2B).图1：NOD1激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）介导CPB手术前后不同时间点炎症因子的表达。注：*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.01。12 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响实验结果表2：NOD1激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）介导CPB手术前后不同时间点炎症因子的表达。注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD）表示，*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.01。3．NOD1和NOD2基因及蛋白表达水平反应结束后做相应的溶解曲线（图2）和扩增曲线（图3），并运用LightCyler480自带的软件进行数据收集和定量分析。我们发现，CHD患儿于CPB术后1天,NOD1基因表达水平明显降低，与术前比较有统计学意义（P<0.01），术后3天恢复到术前水平（P>0.05）（图4A、表3），NOD1的蛋白表达水平与其基因水平是相一致的（图5，6A，表4）；而NOD2的基因及蛋白水平存在一定的差异，CPB术后各个时间点NOD2的基因表达水平与术前相比无明显变化（图4B，表3），但NOD2的蛋白水蛋白水平在CPB术后1天明显低于术前（图5，6B，表4）。13 实验结果体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响图2：引物NOD1、NOD2、GAPDH的溶解曲线图3：引物NOD1、NOD2、GAPDH的扩增曲线。14 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响实验结果图4：CHD患儿CPB手术前后不同时间点NOD1和NOD2的基因表达水平注：**表示与TC相比P<0.01表3：CHD患儿CPB手术前后不同时间点NOD1和NOD2的基因表达水平.注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD）表示，**表示与TC相比P<0.0115 实验结果体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响TCT0T1T3T7GAPDHNOD1NOD2图5：CHD患儿CPB手术前后不同时间点外周血中PBMCs的NOD1和NOD2的蛋白表达。图6：CHD患儿CPB手术前后不同时间点外周血中PBMCs的NOD1和NOD2的蛋白表达。注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD），*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.0116 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响实验结果表4：CHD患儿CPB手术前后不同时间点外周血中PBMCs的NOD1和NOD2蛋白表达注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD）表示，*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.0117 实验结果体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响4．RIP2、p38、p65信号活化水平的影响NOD1激动剂（Tri-DAP）和NOD2激动剂（MDP）刺激后，与CPB术前比较，CHD患儿PBMCs中RIP2（图7A、8A、9A，表5，6）、p38(图7B、8B、9B，表5,6)、p65(图7C、8C、9C，表5,6)的磷酸化水平均于术后明显受到抑制，术后1天逐渐上升，术后7天恢复至术前水平。图7：NOD1激动剂（Tri-DAP）和NOD2的激动剂（MDP）介导CPB手术前后不同时间点信号通路的活化。18 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响实验结果图8：NOD1激动剂（Tri-DAP）介导CPB手术前后不同时间点信号通路的活化。注：*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.01图9：NOD2的激动剂（MDP）介导CPB手术前后不同时间点信号通路的活化。注：*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.0119 实验结果体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响表5：NOD1激动剂（Tri-DAP）介导CPB手术前后不同时间点信号通路的活化。注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD）表示,*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.01表6：NOD2的激动剂（MDP）介导CPB手术前后不同时间点信号通路的活化。注：以上数据均采用均值±标准差（x±SD）表示,*表示与TC相比P<0.05,**表示与TC相比P<0.0120 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响讨论讨论PPRs介导的固有免疫应答是控制感染的关键。NOD1和NOD2作为新发现的PPRs，被越来越多的研究证实在识别胞内病原体，介导免疫应答及炎症反应中扮演重要角色[24]。而NOD分子表达缺失也被认为与多种细菌性感染关系密切。例如，NOD1缺陷小鼠感染C.difficile后中性粒细胞向感染灶趋化能力受损，体内细菌不能有效清除，感[25]染病情加重。而在L.monocytogenes感染模型中，NOD2缺陷小鼠表达β-防卫素的能[26]力明显下降，体内菌落数明显增加。此外，NOD1和NOD2均敲除的小鼠感染B.[27]anthracis后死亡率显著上升，由此可见，NOD功能缺陷或异常不但导致感染发生，并加重病情。在本研究中，我们发现CPB术后，NOD1的激动剂Tri-DAP刺激产生的IL-6和TNF-α的表达水平均明显受限，IL-6的表达水平在术后1天仍低于术前，术后3天恢复至术前水平，而TNF-α的释放在术后1天即恢复至术前水平。而CPB术后，NOD2的激动剂MDP诱导IL-6的表达水平较术前降低。这些结果表明，CPB术后，NOD1和NOD2介导炎症因子表达的能力均受到不同程度的削弱。机体免疫功能的正常发挥，除需要细胞与细胞间的直接接触外，更依靠各类细胞因子实现。IL-6和TNF-α是炎症急性期合成的重要介质，在抗感染免疫应答中发挥关[28]键作用。IL-6是调节细胞因子网络的关键成分，除参与B细胞的分化、增殖调节、抗体形成以外，还对骨髓造血干细胞定向分化起重要作用，引起炎症反应及较强的抗病毒活性。TNF-α可以诱导靶细胞抗病毒，激活巨噬细胞产生细胞因子，抑制肿瘤细胞的分裂增殖等。因此，固有免疫系统应对病原体产生IL-6，TNF-α等炎症因子不足可能是CHD患儿易感染的重要原因。NOD介导炎症因子表达的能力与NOD分子表达水平及下游信号活化水平密切相关，因此我们继续研究CPB对上述两部分的影响。我们发现，CHD患儿NOD2的基因表达水平在手术前后各时间点均无显著改变，而NOD1的基因和蛋白水平以及NOD2的蛋白水平只在术后1d明显降低，其余时间点与术前相比无明显差异。这些结果提示，手术后NOD1和NOD2介导炎症的能力下降可能与其表达水平无关。因此，我们进一步研究NOD下游信号转导在CPB围手术期是否发生变化。21 讨论体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响NOD1或NOD2分别与其配体(Tri-DAP或MDP)结合后诱导自身寡聚化，募集共同的下游分子RIP2，并与RIP2发生嗜同种CARD-CARD相互作用，随后，RIP2与IKK复合物相互作用，使NOD1或NOD2与IKK复合物（IKKs）连接，激活IKKs，从而使IKB[29,30]磷酸化进而被泛素化、蛋白酶降解，从而激活NF-κBp65,除此之外，NOD1/NOD2-RIP2信号通路还作用于MAPKp38，诱导炎症因子的转录和表达，最终[18,20]发挥抗感染的作用。已有研究发现，RIP2在NOD1和NOD2识别细菌产生炎性细胞因子固有免疫中发挥重要作用。它虽不能直接介导Tri-DAP和MDP等分子的信号转导，但它可与CARD作为接头蛋白,激活下游的NF-κB以及MAPK信号转导通路,最终诱导炎症因子的转录[31]和表达。Tigno-Aranjuez等报道，RIP2具有酪氨酸激酶活性，通过其自身磷酸化作用，有效激活NOD信号转导通路，相反，使用酪氨酸激酶抑制剂使RIP2的磷酸化受[32]阻，导致无法正常传导NOD信号。这表明RIP2的磷酸化对NOD信号的有效转导起重要作用。ShimadaK等报道，RIP2-/-小鼠感染肺炎衣原体3天时，其支气管肺泡液内[33]的IL-6水平明显低于野生型小鼠，死亡率也明显升高。BistP等报道，敲除RIP2基[18]因的小鼠感染革兰氏阴性菌后，介导炎症反应的能力较野生型小鼠明显降低。NF-κBp65和MAPKp38是调节全身炎症反应综合征至关重要的细胞内信号转导通路。适当的炎症反应是机体的一种自我保护，而当促炎症介质过度产生，则对机体是有害的，可导致多种炎症性疾病，如癌症、动脉粥样硬化、关节炎等。PichananIntayoung等报道，克班宁注射液可抑制NF-κBp65和MAPKp38信号活化通路，减少[34]炎症介质的产生，从而延缓疾病的发展过程。黄辉等报道，胃灌注地塞米松，MAPKp38磷酸化蛋白和NF-κBp65蛋白水平明显降低，进而抑制了多种细胞因子和炎性介质的释放，以达到缓解哮喘的作用；LiYP等报道，CPB术后NF-κBp65和MAPKp38[6]的活化受阻，细胞因子TNF-α、IL-6明显减少。由此可见，RIP2及其介导的NF-κBp65和MAPKp38磷酸化在NOD信号活化中发挥关键作用。因此，我们比较CPB手术前后各时间点RIP2、NF-κBp65和MAPKp38的磷酸化水平，结果显示，经NOD1的激动剂Tri-DAP刺激，CPB术后RIP2、NF-κBp65和MAPKp38的磷酸化水平均较术前明显降低，术后7d恢复至术前水平。而经NOD2的激动剂MDP刺激，CPB术后RIP2、NF-κBp65和MAPKp38磷酸化水平也明显下降。由此可见，CPB术后炎症因子表达下调与RIP2、NF-κBp65和MAPKp38的磷酸化水22 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响讨论平降低密切相关。CHD患儿RIP2、NF-κBp65和MAPKp38的活性下降，导致NOD1和NOD2不能有效识别病原体，无法及时介导炎症发生，启动固有免疫应答，可能与CPB术后易发感染关系密切。[35-37]多项研究表明，CPB术后机体免疫功能紊乱是导致各种并发症发生的关键。因此，深入研究CPB对免疫系统的影响显得尤为重要。CPB时血液与循环管道和氧合器接触，器官缺血再灌注损伤，体温过低，手术损伤等因素共同引起全身性炎症反应。同时，抗炎介质（如IL-10和TGF-β）大量释放促使免疫功能下降，诱导机体免疫功能抑制。这些因素均可以导致CHD患儿免疫平衡被破坏，继而引发免疫功能异常，无法[38-40]有效抵御病原体。然而，涉及其中的分子机制十分复杂。最近，有研究指出，NOD信号可以不依赖RIP2途径进行传递，而NOD2的激动剂MDP也可以不激活RIP2，[41-43]直接与NLRP3和NLRP1结合，介导炎性小体活化及炎症发生。因此，CPB是否也影响NOD下游RIP2非依赖信号通路的活化，究竟何种信号通路在NOD介导的炎症因子释放以及固有免疫应答中起主要作用，仍有待进一步探究。综上所述，我们首次发现CPB术后NOD1和NOD2不能有效介导炎症因子IL-6和TNF-α的表达，接头蛋白RIP2以及下游信号通路NF-κBp65和MAPKp38活化受抑制，且术后1dNOD1、NOD2表达水平降低。这些结果提示，CHD患儿心脏病手术后NOD分子功能异常，无法针对病原体启动固有免疫应答，可能是导致CHD患儿术后易发生感染的重要原因，其分子机制可能为CPB术后RIP2以及下游信号通路NF-κBp65和MAPKp38活化磷酸化受抑制，无法正常传导NOD信号。总之，进一步研究CHD患儿手术后NOD分子功能及信号传递的变化，将有助于深入认识CPB对免疫系统，特别是固有免疫系统的影响，为预防和治疗CHD患儿术后感染提供实验依据。23 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综述体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响综述NLRs在感染、免疫、疾病方面的研究进展杨清华综述汪健审校摘要：NOD样受体(NOD-likereceptors,NLRs)是近年来新发现的一类模式识别受体，他们通过识别胞浆内病原相关分子模式和损伤相关分子模式，在固有免疫应答中发挥重要作用。NLRs蛋白是一个多样的蛋白质家族，按N-末端结构域划分，NLRs可以分成4个亚家族：NLRA，NLRB,NLRC以及NLRP，按其功能划分，NLRs可以分为炎性小体的形成、信号转导、转录激活、以及自噬作用。除了识别病原相关分子模式和损伤相关分子模式，NLRs在调节细胞凋亡和早期发育方面，也发挥着重要作用。因此，NLRs与多种感染性和免疫性疾病的发生发展密切相关。本文就NLRs在感染、免疫和疾病方面的作用作一简单综述。关键词：固有免疫，模式识别受体，NOD样受体固有免疫应答由固有免疫细胞和分子介导，其主要特点是固有免疫细胞识别多种“非己”异物共同表达的分子，对多种病原微生物或其产物均可应答，并迅速产生免疫效应。固有免疫细胞通过模式识别受体（pattern-recognitionreceptors,PRRs）识别病原微生物的病原体相关分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMPs）或损伤相关分子模式（damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs）,激活固有免疫系统，启动固有免疫应答，从而形成了宿主抗病原微生物感染的第一道防线。PRRs主要包括Toll样受体（Toll-likereceptors,TLRs）和NOD样受体(NOD-likereceptors,NLRs)两[1]大类。另外还包括RLRs和MDA5及C型凝集素家族。其中，NLRs是近年来发现的细胞质内的PRRs。NLRs通过识别PAMPs和DAMPs能迅速启动固有免疫，并能通过信号转导启动适应性免疫，在机体的免疫防御中发挥重要作用。目前已知NLRs家族由22个成员[2,3]组成，他们的基因突变与人类许多疾病相关。多项研究证实，NLRs的作用不仅仅30 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响综述局限于免疫，在感染及临床疾病方面也充当了重要的角色。本文就NLRs在感染、免疫和疾病方面的作用作一简单综述。NLR家族的分类和结构NLR家族蛋白结构域包含三部分：分子中央的NOD,N-末端的受体域，C-末端富含亮氨酸的重复系列（leucine-richrepeats,LRRs）。位于分子中央的NOD（核苷酸结合寡聚化区），起着NOD寡聚化作用。N-末端受体结构域，即蛋白-蛋白相互作用区，可与下游分子和效应蛋白结合，启动下游信号的转导。C-末端富含亮氨酸的重复系列参与受体的结合和传导活化信号。另外，以N-末端结构域为基础，NLRs可以分成4[3]个亚家族：NLRA，NLRB,NLRC以及NLRP。NLRA亚家族仅仅包含MHC-II反式激活因子(CIITA)一个成员。与NLRA类似，NLRB亚家族也只有一个成员，NAIP。而NLRC亚家族包括6个家庭成员：NLRC1(NOD1),NLRC2(NOD2),NLRC3,NLRC4,NLRC5,NLRCX1。尽管NLRC3,NLRC5和NLRCX1N-末端的受体域尚未得到命名，但由于他们的系统同源性，[3-5]而同时被归为NLRC亚家族。NLRP亚家族包括14个成员，分别是NLRP1-14.研究[2]发现，NLRP10中缺乏富含亮氨酸的重复序列，只能充当信号适配器的作用。NLRs的功能NLRs识别配体的种类繁多，如病原微生物（肽聚糖、鞭毛、病毒RNA、真菌菌丝等）、宿主细胞（ATPs、胆固醇晶体、尿酸等）以及环境衍生物（明矾、石棉、紫外线、皮肤刺激物等）。大部分NLRs可以作为PRRs识别以上配体，从而激活炎症反应。活化的NLRs表现出各种各样的功能，如：炎性小体的形成、信号转导、转录激[4]活、以及自噬作用。下面，我们将从以上这四个方面逐一论述。炎性小体的形成炎性小体,也称为炎症小体，是胞浆内PRRs参与组装的多蛋白复合物，是固有免疫系统的重要组成部分。炎性小体能够识别PAMPs和DAMPs，招募和激活促炎症蛋白酶-胱冬肽酶-1（Caspase-1）,活化的Caspase-1切割IL-1β和IL-18的前体，产生相应[6][6]的成熟细胞因子。炎性小体的活化还能够诱导细胞的炎症坏死。IL-1β是调停炎症反应的关键角色，因此IL-1β的过度产生与许多自身炎症性疾病有关，如痛风和周期[7,8]性发热综合征等。目前已经确定多种炎性小体参与了针对多种病原体的宿主防御[2,6]反应，病原体也已经进化出多种相应的机制来抑制炎性小体的活化。31 综述体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响[6]炎性小体是由病原相关激活物或无菌活化剂激发形成。炎性小体的病原相关激活物包括细菌（穿孔素、鞭毛、MDP）、病毒（RNA和M2蛋白）、真菌（菌丝、酵母聚糖）和寄生虫（疟原虫）的PAMPs。无菌活化剂包括DAMPs的自身衍生物（ATP、[6]胆固醇、葡萄糖、透明质酸）和环境派生的刺激剂（明矾、紫外线、皮肤刺激物）。当NLRs识别PAMPs和DAMPs时，NLRs通过pyrin-pyrin域的相互作用招募凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingCARD,ASC），随后，[9]Caspase-1通过CARD-CARD域与ASC联合，完成炎性小体的形成。NLRP1含有CARD域能够不通过ASC直接与Caspase-1的前体相互作用形成炎性小体。尽管NLRC4结构中不含有pyrin域，但可以形成两种类型的炎性小体。如NLRC4炎性小体招募ASC导[10]致IL-1β和IL-18的产生，不招募ASC时，则导致细胞凋亡。NAIP和NLRC4组成NAIP-NLRC4炎性小体依赖于其对细菌鞭毛蛋白和III型分[11]泌系统的识别。因此，NAIP和NLRC4与细菌的易感性有关。激活NLRP1的配体有细菌产物（如炭疽杆菌产生的致命毒素）、胞壁酰二肽（MDP，细菌脂多糖的重要[12]组成成分之一）及ATP。NLRP1在相应配体及相关蛋白的作用下发生活化，形成具有功能的炎性复合体发挥相应作用。NLRP3炎性小体可以被多种内源性成分激活，如ATP、尿酸、β-淀粉样蛋白，同时还可以接受多种外界微生物的刺激，如病毒、细[13]菌、真菌等。NLRP7能够识别细菌的抗菌肽。信号转导NOD1和NOD2识别细菌肽聚糖（peptidoglycan,PGN）衍生物的不同结构核心模体.NOD1特异性的识别含有内消旋二氨基庚二酸(meso-DA)的PGN相关分子，该分子主要存在于革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌；而NOD2则特异性识别PGN的保守成分胞壁酰二肽(muramyldipeptide,MDP)。虽然NOD1和NOD2识别的配体结构不同，但这两个蛋白都与下游的受体作用蛋白激酶-2（receptor-interactingproteinkinase2,RIP2）分子相互作用，激活相同的信号转导通路——NF-κB活化通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs）信号转导通路，最终诱导炎性细[14,15]胞因子表达,启动固有免疫和炎症反应,发挥杀灭病原体和抗感染的作用。与NOD1/NOD2相反，NLRC3和NLRP2/4通过修饰TNF和TNF受体关联因子-6（TRAF6）[16-18]负性调节NF-κB信号转导通路。另外，研究发现NLRP6和NLRP12也是NF-κB信号转导通路的负性调节者。32 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响综述信号活化主要组织相容性复合体（MHC）I和II类分子的抗原提呈是适应性免疫应答的核心。因此，如何调节MHC基因及其配体分子是适应性免疫应答的关键。早在1993年，NLRA被发现是MHCII类分子基因表达的反式激活因子。后来也有研究者在淋巴细胞综合征病人的细胞中发现，NLRA完全纠正了MHCII类分子的缺陷。这种罕见的遗传缺陷疾病的特点是重度联合免疫缺陷和其组织中完全缺乏MHCII类分子的表达[19,20]。最近研究表明，NLRC5对MHCI类分子基因的表达起着不可或缺的作用。虽然MHCI和II类分子的表达依赖于多种转录因子，如NF-κB，IFN,RFX,CREB1,ATF1[19,20]和NEY，但NLRA和NLRC同样参与调控MHC的表达。自噬作用自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身代谢需要和某些细胞器的更新。自噬是一个在进化上高度保守的过程，不仅能分解损坏的细胞器、蛋白，还能激活固有免疫细胞。此外，自噬作用能够作为抗原呈递给适应性免疫细胞，从而启动适应性免疫应答。研究发现，NOD1和NOD2激活后，与ATG16L1连接在一起，将ATG16L1链接在细胞膜上，从而诱导细胞对入侵病原的自噬作用，消灭病原体，进一步将抗原呈递给+[21]CD4T细胞，进而激发免疫反应。此外，Lupfer等人还发现感染甲型流感病毒后，NOD2-RIP2信号转导通路具有调节NLRP3炎性体的作用，进一步证实NOD2与自噬之[22]间的关系。NLRP4通过联合自噬基因Beclin1，以达到负性调节自噬过程。NLRs的临床相关性NLRs作为PRR，在抵御病原体的过程中起着至关重要的作用，除此之外，他们也有与病原检测无关的其他作用，如细胞凋亡等。NLRs异常与感染、炎症、癌症等多种疾病相关，因此，理解他们在这些疾病发病机制中的作用，可能有利于帮助我们为预防和治疗这些疾病研发新药物和新方法。全基因组关联分析已经表明，NLRs基[6]因的单核苷酸多态性与大量炎症疾病和自身免疫性疾病有关。NLRs与自身炎症性疾病自身炎症性疾病（auto-inflammatorydisease,AID）是由于基因突变使编码蛋白发生改变，导致固有免疫失调而引起的全身性炎症反应。AID通常没有自身抗体或抗原33 综述体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响特异性T淋巴细胞，参与炎性损伤过程的主要是单核巨噬细胞，而非T、B淋巴细胞。而自身免疫性疾病（auto-immunediseases,AD）是适应性免疫系统失调导致产生自身[23]反应性B或T细胞，最终引起组织炎症反应和损伤。鉴于NLRs在炎症反应中的重要作用，NLRs的畸形与多种AID有关。AID主要包括一组单基因遗传病，如家族性地中海热（familialmediteraneanfever,FMF）、Cryopyrin相关周期性综合征（NLRP3）、白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏症（IL1RN）和Blau综合征（NOD2）等。目前多数学者[24]认为，AID还包括一些多基因疾病，如克罗恩病和痛风等。大多数AID可归因于IL-1的过度产生，从而导致炎症反应。例如，FMF是目前世界上最常见的遗传性AID，其主要临床特点是发作性发热、腹痛、胸痛和关节炎。FMF是由于编码pyrin蛋白的MEFV基因突变形成的，该蛋白的作用是能够下调炎症反应，如果该基因发生突变，则不能[7]发挥这一调节作用。虽然MEFV基因并不属于NLRs家族，但是MEFV的基因突变可导致Caspase-1的失调，进而激活NLRP3导致炎症反应。NLRs炎性小体相关性疾病NLRs家族中的一些成员均可形成炎性小体发挥炎症反应，但目前研究较多的便属NLRP3。NLRP3能够识别多种内源性和外源性的DAMPs，如尿酸、明矾、二氧化硅、石棉等。下面，我们将简要介绍一下NLRP3与痛风、矽肺、石棉肺和Cryopyrin相关周期性综合征等AID的相关性。[25]痛风是一种常见的代谢性疾病，是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病。然而，在尚未发现尿酸可激活NLRP3炎性小体之前，我们并不清楚尿酸是如何导致炎症反应的，与尿酸反应后，NLRP3活化形成炎性小体，从而诱发IL-1产生，最终[26]导致痛风关节病的发展。近来一些随机试验表明，IL-1阻断疗法可显著缓解急性[7]痛风病人的疼痛并减少发作次数。矽肺又称硅肺，是由于长期吸入大量二氧化硅粉尘所引起，以肺部广泛的结节性纤维化为主的疾病。石棉肺是因长期吸入石棉粉尘而引起的以肺间质纤维化为主要病变的职业性尘肺。最近一项研究表明，二氧化硅和石棉会导致肺泡巨噬细胞激活[27]NLRP3炎性小体，诱发IL-1β产生，最终导致肺纤维化。Cryopyrin相关周期性综合征(CAPS)是一种比较罕见的AID，包括家族性寒冷性自身炎症综合征（FCAS）、Mucklewell综合征（MWS）及婴儿慢性神经、皮肤、关[28]节综合征（CINCA），以反复发作性炎症反应、发热、关节痛及荨麻疹为主要临34 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响综述[28-30]床特征。CAPS系NLRP3基因突变，导致NLRP3炎性小体过度活化，IL-1β异[31]常产生。据报道，IL-1阻断疗法可明显改善CAPS病人的临床症状。自20世纪20年代以来，明矾就被用于免疫佐剂，而其中的活化机制尚不清楚。最近有研究者报道了明矾与NLRP3炎性小体之间的联系，明矾可以促进接种疫苗的肌肉组织局部坏死，释放DAMPs,如尿酸。DAMPs和明矾本身均可以激活NLRP3炎[31]性小体，从而提高疫苗的免疫反应。充分理解明矾佐剂在免疫反应中所扮演的角色有利于研发新疫苗。除NLRP3炎性小体以外，其他NLR炎性小体也与许多疾病的发展有关。NLRP1炎性小体功能缺失或下调是自身炎症性疾病的基础。候选基因分析及全基因关联分析指出NLRP1启动子或编码区域的基因变异与人类多种自身炎症性疾病有关，如白癜风、乳糜泻、阿尔兹海默病、自身免疫性甲状腺病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、[32-34]类风湿关节炎等。NLRP2基因突变与贝克威思-威德曼综合征（BWS）有关，BWS是一种先天过度生长的疾病。孕妇的NLRP7基因突变与反复性葡萄胎有关，并且[35,36]NLRP7基因在睾丸精原细胞瘤和子宫内膜癌中呈高表达。NLRP12基因突变与[37]过敏性皮炎和遗传性周期性发热综合征有关。非NLRs炎性小体相关性疾病‘克罗恩病（Crohnsdisease,CD）是一种慢性肠道炎症性疾病,是全胃肠道节段性全层炎症性病变。尽管在许多克罗恩病患者中并未发现NOD2基因突变，但有研究显示NOD2基因突变与克罗恩病有关。研究表明，NOD2基因发生突变，使LRR区域发生氨基酸互换，终止密码子提前，氨基酸缺失，NF-κB活性减弱，继发性免疫过度激[4,38]活，导致CD发生。NOD2基因的突变和单核苷酸多态性（SNPs）与Blau综合症的发生有关，其主要表现为家族性肉芽肿性关节炎，虹膜睫状体炎和皮肤肉芽肿。而且，特应性湿疹、过[39]敏性皮炎、麻风病和结核病易感性也均与NOD2基因突变有关。另外，NOD1基因[40]的多态性与哮喘和过敏性肠道疾病相关。Ⅱ型裸淋巴细胞综合征（BLS），由于缺乏MHCⅡ类分子，也被称为遗传性MHCⅡ类分子缺陷，是一种严重的遗传性免疫缺陷病。多数BLS患者具有严重的免疫缺陷,表现为迟发型超敏反应能力低下,对抗原抗体应答反应缺失,对各种微生物的易感性增高,甚至导致重症联合免疫缺陷病35 综述体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响(severecombinedimmunodeficiencydisease,SCID),有些患者在儿童时期因病原体感染而死亡。NLRA基因突变使MHCⅡ类分子表达能力受限，从而影响其提呈经过加工的抗原给CD4+T淋巴细胞，最终导致免疫缺陷。因此，BLS的患者有待基因疗法为其带来福音。NLRA的基因突变也存在于B细胞淋巴瘤患者中，如经典霍奇金淋巴瘤和原发纵膈大B淋巴瘤。此外，有研究还发现，NLRA的基因改变降低了原发纵膈大B淋巴瘤患[41]者的生存率。总结NLRs是先天性免疫的主要调节机构，继续研究这些蛋白的功能和信号转导更有利于证明这一说法。NLRs是存在于细胞胞浆内重要的模式识别受体，其主要作用在于识别病原相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式(DAMPs)，通过形成炎性复合体和激活NF-κB、IRF、MAPK信号转导通路，从而诱导免疫应答。NLRs的免疫防御作用对宿主而言是至关重要的，但当其调节异常或缺失时，也会引发许多严重问题。全基因组关联分析已经发现NLRs基因的单核苷酸多态性与大量炎症疾病和自身免疫性疾病有关。尽管对NLRs蛋白功能和作用已取得了显著进展，但仍有待研究。具体来说，目前仍不清楚NLRs如何与各种多态样受体相互作用。同样，一些下游与NLRs信号有关的事件如NF-κB、应力激酶、IFN应答、自我吞噬和其他过程的激活也有待研究。更重要的是，NLRs蛋白的药理学调制的治疗方法大部分仍未开发。除此之外，还有许多问题有待解决，如不同的NLR蛋白之间是否存在相互作用，它们与其他固有免疫受体又通过怎样的作用机制共同调节固有免疫和特异性免疫。对这些问题的回答将为我们研究人类抗感染、抗肿瘤和探索相关疾病的防治提供新的切入点。36 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响综述参考文献[1]PontilloA,VendraminA,CatamoE,etal.ThemissensevariationQ705KinCIAS1/NALP3/NLRP3geneandanNLRP1haplotypeareassociatedwithceliacdisease[J].AmJGastroenterol,2011,106(3):539-544.[2]ZhongY,KinioA,SalehM.FunctionsofNOD-LikeReceptorsinHumanDiseases[J].FrontImmunol,2013,4:333.[3]TingJP,LoveringRC,AlnemriES,etal.TheNLRgenefamily:astandardnomenclature[J].Immunity,2008,28(3):285-287.[4]MottaV,SoaresF,SunT,etal.NOD-likereceptors:versatilecytosolicsentinels[J].PhysiolRev,2015,95(1):149-178.[5]SchroderK,TschoppJ.Theinflammasomes[J].Cell,2010,140(6):821-832.[6]DavisBK,WenH,TingJP.TheinflammasomeNLRsinimmunity,inflammation,andassociateddiseases[J].AnnuRevImmunol,2011,29:707-735.[7]JesusAA,Goldbach-ManskyR.IL-1blockadeinautoinflammatorysyndromes[J].AnnuRevMed,2014,65:223-244.[8]OzkuredeVU,FranchiL.Immunologyinclinicreviewseries;focusonautoinflammatorydiseases:roleofinflammasomesinautoinflammatorysyndromes[J].ClinExpImmunol,2012,167(3):382-390.[9]KuferTA,SansonettiPJ.NLRfunctionsbeyondpathogenrecognition[J].NatImmunol,2011,12(2):121-128.[10]MiaoEA,LeafIA,TreutingPM,etal.Caspase-1-inducedpyroptosisisaninnateimmuneeffectormechanismagainstintracellularbacteria[J].NatImmunol,2010,11(12):1136-1142.[11]KofoedEM,VanceRE.InnateimmunerecognitionofbacterialligandsbyNAIPsdeterminesinflammasomespecificity[J].Nature,2011,477(7366):592-595.[12]Chavarria-SmithJ,VanceRE.TheNLRP1inflammasomes[J].ImmunolRev,2015,265(1):22-34.[13]KhareS,DorfleutnerA,BryanNB,etal.AnNLRP7-containinginflammasomemediatesrecognitionofmicrobiallipopeptidesinhumanmacrophages[J].Immunity,2012,36(3):464-476.[14]BistP,DikshitN,KohTH,etal.TheNod1,Nod2,andRip2axiscontributestohostimmunedefenseagainstintracellularAcinetobacterbaumanniiinfection[J].Infect37 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体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响中英文对照缩略词表中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称CPBcardiopulmonarybypass体外循环CHDcongenitalheartdisease先天性心脏病NLRNOD-likereceptorsNOD样受体PAMPsPathogen-associatedmolecularpatterns病原相关分子模式PRRsPatternrecognitionreceptors模式识别受体RIP2Receptorinteractingprotein2蛋白激酶2NF-κBNuclearfactor-κ-geneblinding核转录因子κBMAPKMitogen-activatedmolecularpatterns丝裂原活化蛋白激酶TNF-αTumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子IL-6Interleukin-6白介素-6PICUPediatricIntensiveCareUnit儿童重症室MDPMuramyldipeptide胞壁酰二肽LPSlipopolysaccharides脂多糖Ssecond秒Hhour小时Minminute分钟Rpmrevolutionsperminute转/分钟PBMCsperipheralbloodmononuclearcells外周血单个核细胞NOD1-/-knockoutNOD1genotype敲除NOD1基因NOD2-/-knockoutNOD2genotype敲除NOD2基因cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸mRNAMessengerribonucleicacid信使核糖核酸PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验ODOpticaldensity光密度41 中英文对照缩略词表体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响MFIMeanfluorescenceintensity平均荧光密度DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液NIKNF-κBinducingkinase核因子相关酶IKKIκBkinase丝/苏氨酸蛋白酶42 体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响攻读学位期间撰写论文及科研情况攻读学位期间撰写论文及科研情况一、参与课题体外循环对先天性心脏病儿童NOD信号的影响；江苏省2015年普通高校研究生创新计划项目，项目主要负责人。二、论文1、YanLi,QinghuaYang,JieHuang,YiPingLi,JianPan,XingFeng,XueGuangZhang,JiangHuaiWang,JianWang.TheclinicalsignificanceofplasmaB7-H3levelsinpediatricpatientswithdifferentdegreesofsurgicalstress.BMCpediatr.(共同第一作者)已修回2、QinghuaYang;JianyiLiao;JieHuang;YipingLi;etal.CardiopulmonarybypassdownregulatesNODsignalingandinflammatoryresponseinchildrenwithcongenitalheartdisease.PLOSONE,修改中.43 致谢体外循环术对先天性心脏病儿童NOD信号的影响致谢时光荏苒，岁月如梭。转眼间，三年的硕士研究生生活即将结束，回首往昔，一幕幕画面刹那间涌上心头，有辛酸，有泪水，有丰收，也有喜悦。当繁华尽展，尘埃落定，这一切终将变成我人生的财富。在苏州大学的求学历程，对我来说弥足珍贵，值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、爱护、帮助我的人们表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。首先向我的导师汪健教授，表示衷心的感谢和敬意！初见导师感觉是一位严师，但那句“有什么事情尽管讲，我定会尽全力帮助你”，完全打破了那份威严，更多的却是父亲般的温暖，也正如他所说的那样，在三年的研究生生活中给予我莫大的帮助，在本论文的选题及研究过程中，离不开汪老师的指导与帮助。感谢我所在的科室黄顺根主任、张芳护士长及潘江、陈璐璐、支文贤、朱安秀、常丽君老师对我临床工作的悉心指导与帮助，使我的临床能力得到很大的提升。感谢我的师兄向永军、唐如泽，同窗李晓、王雪芹、周直成及师弟夏天、刘小波对我临床工作和生活的帮助。感谢儿科研究所李毅平、金美芳、李刚、李之珩、谢翌老师对我的实验课题设计、基础实验的规范操作以及论文书写给予的指导及帮助。感谢苏州大学附属儿童医院外科黄志见、殷炜、王杭州、廖健毅、王勇强、徐金老师在工作中的无私帮助和生活中的热情关爱。感谢儿科系曹丽寅主任、胡小燕书记给予我悉心的鼓励和支持，帮助我成长。特别感谢我的父母和男朋友秦雪云，对我无微不至的照顾、关爱、支持和包容，他们的支持是我前进的动力，是我学习生活的坚强后盾，让我顺利安心地完成学业。最后，衷心感谢在百忙之中评阅论文以及莅临答辩的各位专家、教授！44 巧輩化－戟謠１辭辭惡Ｖ’：，．—表；户。為？议客、等■苏州方！蠢締—牽，’硕±学论貧护祈某．叫＇—霄１，＾．ｉ．門＾学和做．一；：护ｌ一：一一：：；一ｉ一Ｖｎ－＞言：＇，：ｙ起ｖ：讀＇。點一．＾一拭．：：醫品．：一：＇’觀／誦琶ｙ．Ｊ．．．一营昔￡？．；＇；ｒ；馬立．７：；：Ｉ．：：：ｌ；：ｆＶ苗一德—＇：，／－ｉ：’旁ｙｓ妥；？．．：：ｍ－：＇，；＾＾ｉ＇ｌ：ｘｉ＇二挤；＇ｉ：；；Ｉ野、ｌ＇＇－式．．转。＇．面Ｊ＇表整。鈔ｒ＇Ｖ点ｉ議：．好肖：茜ｌ齊＇＇．Ｙ＇孔ｉｉ片专ｉ：巧。扛Ｊ．ｉ罕仆ｉ接王ｉ黃專ｉ窜麵－Ｉ誦＂ｉｉ—ｉｉｉ＾—Ｉ－．—．ｊ’ｉ－．＿’ｎ６Ｖ■心Ｉｉｒ＇一；；