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密级：：论文编号中国农业科学院学位论文微针免疫埃博拉病毒糖蛋白亚单位疫苗的效果评价ＴｈｅＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＥｂｏｌａＶｉｒｕｓＧｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＳｕｂｕｎｉｔＶａｃｃｉｎｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄｂＭｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅｓｙ博士研究生：刘莹指导教师：武华研究员申请学位类别：农学博士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：特产研究所研究生院２０１８年６月 密级:论文编号:中国农业科学院学位论文微针免疫埃博拉病毒糖蛋白亚单位疫苗的效果评价TheEvaluationofEbolaVirusGlycoproteinSubunitVaccineImmunizedbyMicroneedles博士研究生：刘莹指导教师：武华研究员申请学位类别：农学博士专业：预防兽医学研究方向：动物疫苗与分子免疫学培养单位：特产研究所研究生院2018年6月 Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationTheEvaluationofEbolaVirusGlycoproteinSubunitVaccineImmunizedbyMicroneedlesPh.D.Candidate：YingLiuSupervisor：Dr.HuaWuMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccineandMolecularImmunologyJune2018 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目微针免疫埃博拉病毒糖蛋白亚单位疫苗的效果评价论文作者刘莹专业预防兽医学研究方向动物疫苗与分子免疫学培养单位（研究所、中指导教师武华特产研究所心）硕（博）姓名职称单位专业签名导师硕导□评博导□硕导□阅博导□人硕导□博导□答辩硕导□钱爱东教授吉林农业大学预防兽医学主博导席硕导□军事医学科学院军事王兴龙教授预防兽医学博导兽医研究所硕导□高丰教授吉林大学预防兽医学博导答硕导□王春凤教授吉林农业大学预防兽医学博导辩硕导□温永俊研究员内蒙古农业大学预防兽医学博导委硕导□中国农业科学院特产程世鹏研究员预防兽医学博导研究所员硕导□中国农业科学院特产闫喜军研究员预防兽医学博导研究所会议记录（秘书）范琳琳论文答辩时间地点2018年5月30日长春所区办公楼七楼会议室 摘要近年来，埃博拉病毒（EBOV）导致的疫情对全世界人类的安全带来巨大威胁。2014年西非爆发的埃博拉疫情造成了大量死亡，引起了全世界的关注。由于没有针对EBOV的特定药物和治疗，因此，疫苗被认为是控制该流行病最有希望和最有效的方法，开发有效且安全的埃博拉疫苗对于公共安全十分重要。EBOV的糖蛋白GP是病毒粒子上唯一的表面蛋白，负责调节与宿主细胞的吸附和融合，因此成为埃博拉疫苗研究的主要目标蛋白。GP的基因通过基因编辑，不仅编码结构蛋白GP，还编码分泌型糖蛋白（sGP），且占GP基因编码产物的70%。目前，疫苗的接种方式主要为肌肉注射（IM）,使用该种免疫方式的疫苗多为溶液，需要在冷藏或冷冻的条件下保存以保持疫苗的稳定性。最近的几十年，微针(MN)作为一种新的疫苗接种技术被广泛应用与皮内免疫研究中。皮肤是人体最大的免疫器官，其真皮层富含大量的树突状细胞、朗格汉斯细胞等多种免疫细胞，且丰富表达这两种抗原递呈细胞受体，可与包括单核细胞、巨噬细胞在内的其他免疫活性细胞结合，这使得皮肤成为免疫的理想部位。本研究针对EBOVGP进行亚单位疫苗的研究。在对GP及sGP进行三维结构的预测和比对后，发现sGP与GP氨基酸序列相同部分形成的空间结构高度相似，因此sGP或可作为GP的替代物。使用牛痘病毒真核表达系统成功表达EBOVGP与sGP,作为亚单位疫苗，分别使用MN与IM进行免疫，评价抗体水平。研究结果表明，MN免疫EBOVGP后刺激产生的抗体水平更高，约是IM免疫产生抗体水平的2倍，其中MN免疫产生抗体的中和抗体效价为900，而IM免疫产生的中和抗体效价为300；此外，MN免疫产生的抗体维持的时间更长，加强免疫后16周，MN免疫产生的抗体水平下降约30%，同抗原使用IM免疫，抗体水平下降约60%。使用sGP作为GP的替代抗原研究中，MN免疫较IM免疫仍然能够刺激产生更高水平的抗体，但产生的中和抗体效价无明显区别。为了进一步提高EBOVGP及sGP的免疫原性，我们首次在疫苗配方中加入佐剂Matrix-M并使用MN免疫。研究结果表明，Matrix-M可以显著提高MN和IM免疫GP或sGP亚单位疫苗所诱导的抗体反应，中和抗体效价显著增高，IgG水平约是无佐剂组的5倍，且可以诱导IgG2a的产生，多元化IgG亚型，平衡IgG1/IgG2a的比例。对免疫后小鼠进行致死性EBOV的攻毒试验，结果显示，无论抗原为GP或sGP,免疫方式为MN或IM，Matrix-M作为抗原成分的加入均可对小鼠提供100%的保护率，且小鼠无明显体重下降和临床症状。在无佐剂加入的攻毒试验中，使用MN免疫GP亚单位疫苗后，可对感染致死性EBOV的小鼠提供80%的保护,而IM免疫组的5只小鼠中只有1只存活。综上所述，使用MN免疫GP亚单位疫苗能够有效保护EBOV感染，佐剂Matrix-M的加入，使sGP成为GP有效的替代抗原成为可能。本研究为埃博拉疫苗的开发提供了新的实验及理论基础。关键词：埃博拉病毒，糖蛋白，亚单位疫苗，微针免疫I AbstractEbolavirus（EBOV）diseasehasbecomeagreatthreattohumansacrosstheworldinrecentyears.The2014EbolaepidemicinWestAfricacausednumerousdeathsandattractedworldwideattentions.SincenospecificdrugsandtreatmentsagainstEbolavirusdiseasewasavailable,vaccinationwasconsideredasthemostpromisingandeffectivemethodofcontrollingthisepidemic.DevelopmentofasafeandefficaciousEbolavirusvaccineisofhighimportancetopublichealth.Theglycoprotein(GP)isthesinglesurfacevirionstructuralcomponentofEbolavirusthatmediatesattachmenttoandfusionwithhostcells,soitisthemaintargetofEbolavaccinestudy.GPgenesencodeseveralformsofGPasproducswithuneditedandeditedtranscripts,especiallythesolubleGP(sGP)whichtakesup70%ofallproducts.Currently,vaccinationsarecommonlyadministeredviaintramuscular(IM)injectionofvaccines,whicharepreparedinsolutionandneedtobestoredunderfrozenorrefrigeratedconditionstomaintaintheirstability.Overthelastdecade,microneedle(MN)havebeenunderdevelopmentasanewvaccinedeliverytechnologyforintradermalvaccination.Theimmunizationtagetskinisthelargestimmunologicalorganofthehumanbody.Initsdermislayer,itislargelypopulatedbydendriticcells(DCs)angLangerhanscells(LCs).Additionally,theexpressionofToll-likereceptorsofDCsandLCs,combinationwithotherimmunologicallyactivecellsresidingintheskinincludingmonocytes,andmacrophagesmakeskinanidealtargetforvaccinedelivery.Inthisstudy,wefocusedonEbolaGPastheantigenofsubunitvaccine.Predictedthe3-dimensionalstructureofGPandsGPandcomparedthesameaminoacidesequencesthatsharedbetweenthesetwoproteins,theconformationstructuresareextramlysimilarwhichprovidethetheoreticalbasethatsGPmayapromisingalternativeantigenofGP.ThenweconstructedtherecombinantvacciniavirussystemwhichexpressEBOVGPandsGPsuccessfully.Assubunitvaccine,GPorsGPwereimmunizedandfurthercomparedtheimmuneresponsesinducedbyMNorIM.ComparisonofimmuneresponsesinducedbyMNimmunizedGPsubunitvaccineandtheIMadministeredGPinmiceshowedthatMNdeliveryofGPinducedhigherlevelsandlongerlastingantibodyresponsesagainstGPthanIMinjectionofthesamevaccineatthesamedose.TheantibodylevelofMNimmunizedGPis2-foldhigherthanIMinjection,andtheneutralizingantibodyis900byMNdeliverycomparedto300byIMadministration;After16weeksofsecondimmunization,theantibodylevelonlydropped30%ofMNdeliverymethodwhichIMadminiseredGPdropped60%.Inaddition,asthealternativeantigenofGP,sGPsubunitvaccinealsointroducedhigherandlongerlastingantibodyinducedbyMNthanIM,buttheneutralizingactivitesareinthesamelevel.Further,wefoundthatEBOVGPinformulationwithanadjuvant,Matrix-M,canbeefficientlyloadedontoMNsforthefirsttime.Co-deliveryoftheMatrix-MadjuvantwiththeGPsubunitvaccinessignificantlyenhancedinductionofantibodyresponsesandneutralizingactivityinducedbyMNdelivery,asalsoobservedforIMinjection.TheIgGlevelis5-foldhigherthansubunitvaccinewithoutadjuvant,andtheIgG2acanbeinducedonlyinadjuvantgroupswhichdiversifiedthesubtypesofantibodyandbalancedtheratioofIgG1/IgG2a.ResultsfromchallengestudiesshowedthatallmicethatII receivedtheadjuvantwithGPorsGPformulationbyMNorIMimmunizationswereprotectedfromlethalEBOVchallenge,withoutsignificantbodyweightlossandclinicalsymptoms.Further,4outof5micethatreceivedunadjuvantedGPbyMNimmunizationalsosurvivedthechallenge,whereasonly1outof5micethatreceivedtheunadjuvantedGPbyIMimmunizationsurvivedthechallenge.TheseresultsdemonstratethatMNdeliveryofEBOVGPsubunitvaccinescanoffereffectiveprotectionagainstEBOVinfection,andsGPisapromisingalternativeantigenofGPwiththepresenceofadjuvantMatrix-M.ThestudyprovidesnewexperimentalandtheoreticalbasisfordevelopmentofEbolavaccine.Keywords:Ebolavirus,Glycoprotein,Subunitvaccine,MicroneedlesIII 目录第一章引言...................................................................................................................11.1埃博拉病毒.................................................................................................................11.1.1分类......................................................................................................................11.1.2形态结构..............................................................................................................11.1.3蛋白结构与功能..................................................................................................21.1.4生活周期..............................................................................................................61.2埃博拉疫情流行情况.................................................................................................81.3埃博拉疫苗研究进展.................................................................................................81.3.1非复制表达载体为基础的疫苗..........................................................................91.3.2可复制表达载体为基础的疫苗........................................................................101.3.3病毒蛋白抗原为基础的疫苗............................................................................111.4疫苗效果的影响因素...............................................................................................121.4.1抗原种类及配方................................................................................................121.4.2免疫途径............................................................................................................141.5本课题研究内容.......................................................................................................15第二章EBOVGP与SGP的表达、纯化与鉴定..........................................................172.1实验材料...................................................................................................................172.1.1细胞、质粒和病毒............................................................................................172.1.2主要试剂和仪器................................................................................................172.2实验方法...................................................................................................................172.2.1EBOVGP与sGP三维结构预测与比对.........................................................172.2.2EBOVGP与sGP重组牛痘病毒表达系统的构建..........................................172.2.3EBOVGP与sGP的真核表达..........................................................................182.2.4EBOVGP与sGP的纯化..................................................................................192.2.5EBOVGP与sGP的鉴定..................................................................................192.3实验结果...................................................................................................................192.3.1EBOVGP与sGP三维结构预测及比对.........................................................19IV 2.3.2EBOVGP与sGP重组牛痘病毒表达系统构建成功......................................202.3.3WesternBlot鉴定EBOVGP与sGP的表达...................................................212.4讨论...........................................................................................................................222.5小结...........................................................................................................................22第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价......................................................233.1实验材料...................................................................................................................233.1.1细胞、质粒和病毒............................................................................................233.1.2抗原....................................................................................................................233.1.3主要试剂和仪器................................................................................................233.1.4实验动物............................................................................................................233.2实验方法...................................................................................................................243.2.1EBOVGP亚单位疫苗（或与佐剂Matrix-M）包被于微针.........................243.2.2微针免疫EBOVGP亚单位疫苗的小鼠实验.................................................253.2.3ELISA测定EBOVGP亚单位疫苗免疫后结合抗体效价.............................263.2.4中和试验测定EBOVGP亚单位疫苗免疫后中和抗体效价.........................263.2.5免疫含佐剂Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗后小鼠致死性攻毒试验...283.3实验结果...................................................................................................................293.3.1定量ELISA测定微针的包被抗原量...............................................................293.3.2WesternBlot测定微针的包被抗原量..............................................................303.3.3EBOVGP亚单位疫苗微针免疫BABL/c小鼠诱导效价高且持久的抗体.303.3.4EBOVGP亚单位疫苗微针免疫BABL/c小鼠诱导的中和抗体效价高......333.3.5定量ELISA测定含佐剂Matrix-M的微针的包被抗原量.............................353.3.6WesternBlot测定含佐剂Matrix-M的微针的包被抗原量.............................353.3.7含Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗免疫诱导更高水平的抗体...............353.3.8含Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗诱导的中和抗体针对MLD以外.....383.3.9含Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗可为感染致死性EBOV的小鼠提供完全保护；微针免疫EBOVGP亚单位疫苗后保护率较高.......................................413.4讨论...........................................................................................................................433.5小结...........................................................................................................................44V 第四章微针免疫EBOVSGP亚单位疫苗效果评价....................................................454.1实验材料...................................................................................................................454.1.1细胞、质粒和病毒............................................................................................454.1.2抗原....................................................................................................................454.1.3主要试剂和仪器................................................................................................454.1.4实验动物............................................................................................................454.2实验方法...................................................................................................................464.2.1EBOVsGP亚单位疫苗（或与佐剂Matrix-M）包被于微针........................464.2.2微针免疫EBOVsGP亚单位疫苗的小鼠实验................................................464.2.3ELISA测定EBOVsGP亚单位疫苗免疫后结合抗体效价...........................474.2.4中和试验测定EBOVsGP亚单位疫苗免疫后中和抗体效价........................474.2.5免疫含佐剂Matrix-M的EBOVsGP亚单位疫苗后小鼠致死性攻毒试验..474.3实验结果...................................................................................................................494.3.1定量ELISA测定微针上包被抗原量...............................................................494.3.2WesternBlot测定微针上包被抗原量..............................................................494.3.3EBOVsGP亚单位疫苗微针免疫诱导效价高且持久的抗体.........................494.3.4EBOVsGP亚单位疫苗不同途径免疫诱导的中和抗体效价相似.................524.3.5定量ELISA测定含佐剂Matrix-M的微针的包被抗原量.............................534.3.6WesternBlot测定含佐剂Matrix-M的微针的上包被抗原量.........................534.3.7含Matrix-M的EBOVsGP亚单位疫苗免疫诱导更高水平的抗体..............534.3.8Matrix-M对EBOVsGP亚单位疫苗产生的中和抗体效价无影响...............554.3.9含Matrix-M的EBOVsGP亚单位疫苗为感染致死性EBOV的小鼠提供完全保护..............................................................................................................................564.4讨论...........................................................................................................................584.5小结...........................................................................................................................58第五章全文结论.............................................................................................................60参考文献.............................................................................................................................61致谢.................................................................................................................................74作者简历.............................................................................................................................76VI 英文缩略表英文缩写英文全称中文名称EBOVZaireebolavirus埃博拉病毒（扎伊尔埃博拉病毒）GPglycoprotein糖蛋白sGPsecretedglycoprotein分泌型糖蛋白RNPribonucleoprotein核糖核蛋白RBDReceptorbindingdomain受体结合区域MLDMucin-likedomain粘蛋白样结构域RdRpRNA-dependentRNApolymeraseRNA依赖的RNA聚合酶NHPsNon-humanprimates非人类灵长动物pfuplaqueformationunit空斑形成单位VII 中国农业科学院博士学位论文第一章引言第一章引言1.1埃博拉病毒1.1.1分类埃博拉病毒（EBOV）是有囊膜的单股RNA病毒，属于单股负链病毒目（Mononegavirales），丝状病毒科（Filoviridae），埃博拉病毒属（Ebolavirus）(MahantyandBray,2004)。与EBOV同科的马尔堡病毒属（Marburgvirus）和Cuevavirus病毒属的病毒都具有相同的多相丝状结构，并且大部分可以引起人类的出血热(Check-Hayden,2014)。埃博拉病毒属迄今为止共发现5个病毒种，分别是扎伊尔埃博拉病毒（Zaireebolavirus,EBOV）、苏丹埃博拉病毒(Sudanebolavirus,SUDV)、本迪布焦埃博拉病毒(Bundibugyoebolavirus,BDBV)、大森林埃博拉病毒(TaïForestebolavirus,TAFV)和莱斯顿埃博拉病毒(Restonebolavirus,RESTV)(Kuhn,etal.,2010;Negredo,etal.,2011)。其中，扎伊尔埃博拉病毒是最致命的，共包括三种亚型，分别是Mayinga、Kikwit和Makona。Makona为2013年至2016年埃博拉疫情爆发的致病型，也是近年来所指的埃博拉病毒(Cook,etal.,2016)。1.1.2形态结构EBOV的病毒体成丝状圆柱形，包括病毒囊膜、基质和核衣壳三部分，病毒电子显微镜下结构如图1.1所示。核衣壳中的病毒基因组是一条线性的单股负链RNA，长度18959-18961bp(GenBank)，3’端没有poly(A)，5’端非帽子结构。该RNA共有7个基因，编码至少10个结构蛋图1.1电子显微镜下的EBOV拍摄者:Dr.FrederickMurphy；内容来源:美国疾病控制与预防中心Fig.1.1ElectronmicrographofEBOVByPhotoCredit:Dr.FrederickMurphy.ContentProviders:CDC1 中国农业科学院博士学位论文第一章引言白和非结构蛋白(Yu,etal.,2017)。从3’端到5’段分别编码核蛋白（NP）、病毒蛋白35（VP35）、VP40、糖蛋白（GP）、可溶性糖蛋白（sGP）、∆-多肽、小可溶性糖蛋白（ssGP）、VP30、VP24和RNA核糖核酸聚合酶蛋白（L）(Hoenen,etal.,2006;Martin,etal.,2016)。核衣壳NP、VP35、VP30和L蛋白与基因组RNA旋绕成螺旋形结构，该螺旋形结构直径约为80nm。核衣壳外侧为基质，VP40和VP24位于此处(Feldmann,etal.,1993)。基质外为病毒囊膜，将病毒包裹为直径约80nm，长度800-1000nm的丝状圆柱体。在囊膜的脂质双分子表面，站立着糖蛋白(glycoprotein，GP)形成的纤突，约7-10nm长，各纤突间距约10nm(Klenk,2004)。病毒结构示意图如图1.2所示。图1.2EBOV结构示意图Fig.1.2StructurediagramofEBOV1.1.3蛋白结构与功能EBOV基因编码的顺序为3’-先导序列-NP-VP35-VP40-GP/sGP-VP30-VP24-L-尾部序列-5’(图1.3）(Taylor,etal.,2010)，其中，3’端的先导序列和5’端的尾部序列为非转录序列，包含着重要的转录、复制及包装病毒的信号。3’端的472个核苷酸和5’端的731个核苷酸负责病毒中小基因组的复制，与病毒感染无关(Klenk,2004)。图1.3EBOV基因组编码顺序及长短比例示意Fig.1.3GenomeencodingsequenceandscaleschematicofEBOV1.1.3.1NPNP由739个氨基酸构成，可分为N端（约350个氨基酸）和C端（约400个氨基酸）。N端与RNA骨架上的磷酸二酯键结合，C端形成的球状结构与VP40相互作用(Baker,etal.,2016;Noda,etal.,2010)。N端36-351位氨基酸为高度保守的核心区域，与同科的马尔堡病毒和Lloviuvirus(LLOV)同源性极高，该区域对RNA的结合和NP的低聚化均有重要作用，此为NP的核心2 中国农业科学院博士学位论文第一章引言区域，其N端和C端半段结构为四聚体小叶，可形成带正电的凹槽，与RNA结合，形成螺旋结构，完成形成核衣壳的第一步(Dong,etal.,2015;Noda,etal.,2010;Ruigrok,etal.,2011)；已结合RNA凹槽的小叶可与邻近的NP结合，完成NP的低聚化，并与RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase,RdRp）作用形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）复合体(Kirchdoerfer,etal.,2015;Zhou,etal.,2013)。1.1.3.2VP35VP35的晶体结构显示其包含卷曲螺旋域，在溶液里形成四聚体，这种状态可以使其保持低聚化而有利于与RNA结合(Bale,etal.,2013;Bruhn,etal.,2017)。VP35有2个独立的结合区域，一个是N端的1-80位氨基酸，它与NPN端的1-450位氨基酸相互作用，精准融合形成NP-VP35复合体，该结构可通过占据NP的N端，阻止其与相邻的NP相互作用而防止NP提前低聚化(Kirchdoerfer,etal.,2015)；VP35N端的多肽还与NPC端区域的一个疏水位点高亲和、高特异性结合，形成了丝状病毒科NP特有的β-发夹结构。VP35的另一结合区域为80-340位氨基酸，其中80-120位和219-340位氨基酸均含有一个假定的卷曲螺旋区域(Kimberlin,etal.,2010;Kirchdoerfer,etal.,2015;Leung,etal.,2010)。VP35的C端与核衣壳初期形成相关，可能是通过与L的结合来指导NP参与RNA合成。当VP35被去除后，NPC端的疏水位点暴露，可使相邻NP的N端和C端相互作用，相互作用导致的空间结构变化使得NP蛋白从开放状态变为关闭状态，从而不利于结合RNA(Kirchdoerfer,etal.,2015)。在NP与RNA相互作用形成NP-RNA复合体过程中，VP35起到重要作用。首先，NPN端的低聚化结构与VP35N端多肽为竞争关系，VP35N端多肽通过阻止NP低聚化调节其与RNA的结合，VP35N端多肽可以逆转没有结合RNA的NP低聚化过程，对已结合RNA的低聚化NP则没有作用。在体外，这种结合形式抑制了RNA从NP-RNA复合体上的解离(Dong,etal.,2015)。在RNA复制过程中，RNA从NP-RNA中瞬时解离，VP35N端多肽迅速占据与RNA3’端结合的NP结合区，NP则无法与相邻的NP结合。VP35N端多肽的这种结合特性可以招募聚合酶——L蛋白到RNA转录位点，起始RNA的转录和复制(Kirchdoerfer,etal.,2015)。1.1.3.3VP40VP40是病毒囊膜下最丰富的病毒蛋白，对于维持病毒粒子的完整性、成熟性及与细胞膜形成聚合体过程中均具有重要作用(Hoenen,etal.,2010;Jasenosky,etal.,2001;Soni,etal.,2013;Stahelin,2014)。VP40包含两个不同的折叠区域，分别是N端（NTD）和C端（CTD），这两部分对于病毒蛋白的运输及结合于细胞膜均有重要作用(Bornholdt,etal.,2013;Harty,2009)。研究证明，NTC和CTD具有很少的接触点，它们不仅能精确地相互作用，而且可以各自单独形成不同的结构(Dessen,etal.,2000;Gomis-Roth,etal.,2003)。VP40在溶液中是二聚体，该结构由两个VP40的CTD相连组成，一定条件下可转变成六聚体结构，与带负电的膜内叶相互作用，是病毒基质蛋白组装和病毒出芽的重要前体。六聚体结构中，NTD构成坚硬整齐的核心区，CTD接口形成分层结构，既与病毒囊膜相连，又与病毒核衣壳相互租用，进而形成多层基质(Bornholdt,etal.,2013)。由于VP40的NTD构成了低聚物，CTD形成了灵活的疏水环(Adu-Gyamfi,etal.,2015)，因此，VP40具有静电和疏水两部分，可与质膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）相互作用，VP40可通过摩尔亲和力结合含有PS的膜，而PS在质膜内叶上可调节VP40的定位和低聚化(Adu-Gyamfi,etal.,2012;SoniandStahelin,2014)；VP40C端的疏水环可导致PS的形变及凹陷，使得VP40可以插入3 中国农业科学院博士学位论文第一章引言膜中(Noda,etal.,2007)。此外，VP40是第一个参与核形成的病毒蛋白，RNA结合与VP40形成的指环结构上具有起始转录的作用(Bornholdt,etal.,2013;Gomis-Roth,etal.,2003)。1.1.3.4GP与sGP、ssGP和∆-多肽GP基因上有7个连续尿苷构成的打滑区域，RdRp在此区域作用不顺畅，导致RNA转录时从该区域开始移码，完成RNA编辑过程。GP基因可以生成3种不同的mRNA，分别编码sGP，GP和ssGP前体（图1.4），三者比例约为14：5：1(Mehedi,etal.,2011)。GP为EBOV膜表面的糖蛋白，也称作GP1,2，细胞的早期感染由它调节。该蛋白由前体GP0水解而来，而前体GP0由GP基因完成RNA编辑后翻译得到，即在了GP1,2mRNA上多加一个腺苷酸。前体GP0经历了酰化、糖基化等成熟过程，先转运到内质网，再到高尔基体，被此处的弗林蛋白酶消化水解成GP1,2(Martin,etal.,2016;Zhou,etal.,2013)。GP1为胞外域，GP2为跨膜域，两者通过GP153位半胱氨酸和GP2609位半胱氨酸形成的二硫键连接，形成GP1,2。该蛋白三个单体通过GP1/GP2和GP2/GP2之间的相互作用，形成三聚体杯状结构(Simmons,2013)。杯状结构的球形顶部由GP1构成，GP2整齐排列，将该三聚体复合物锚定在膜上。GP1可分为4部分：基部、受体结合区域（RBD）、多聚糖帽子和粘蛋白样结构域（Mucin-likedomain,MLD）前3部分构成GP1的核心区(Lennemann,etal.,2014)。GP1基部的作用是与GP2相连，并形成相对稳定的融合前结构；RBD高度保守，已证明与细胞上一个或多个受体的相互作用有关；多聚糖帽子和MLD高度糖基化，掩盖很多蛋白部分，其中，多聚糖帽子是GP1杯状结构的外侧部分，仅有N-糖基化，可保护RBD不被抗体识别(Weissenhorn,etal.,1998)；MLD区域有N-和O-糖基化，在病毒吸附和免疫逃逸中均有重要作用，且是中和抗体的主要靶标(Lennemann,etal.,2014)。MLD通过自身的存在，避免GPRBD被识别，帮助GP成熟及功能化(Collar,etal.,2017;Wang,etal.,2017)。X射线晶体结构显示，多聚糖帽子和MLD包围在RBD周围(BeniacandBooth,2017)。跨膜区GP2将GP构成的复合物锚定在病毒膜上，参与控制病毒与细胞膜融合及进入细胞的过程。它可分为5部分：融合环、N端七肽重复区（HR1）、C端七肽重复区（HR2）、跨膜区和一个短的胞尾区。融合环由511位和556位半胱氨酸形成的二硫键构成，包含一段疏水序列，可将膜融合假定多肽递呈于靶细胞膜附近并插入细胞膜中，完成膜融合的起始过程，对于病毒与细胞融合非常重要(Bar,etal.,2006;Watanabe,etal.,2000)；2个七肽重复区可以形成包含3个HR1和HR2的三聚体，该结构是GP2融合前的不稳定结构，它在低pH时重新排布，形成一个跨膜的六螺旋束，该旋束触发了细胞膜的打开，诱发融合(Malashkevich,etal.,1999)。为了保持融合前的特殊结构，GP1的基部将GP2的疏水融合多肽包裹防止其暴露(Mehedi,etal.,2011)。另外，在出芽过程中，GP2的跨膜区对于抵抗细胞膜上束缚蛋白对病毒的锚定作用，帮助成型的病毒离开宿主细胞非常重要(Gnirss,etal.,2014)。在EBOV中，最丰富的产物是没有进行RNA编辑的转录产物——前体sGPmRNA,通过它翻译合成产物——前体sGP。这个前体约60kDa，之后被细胞的弗林蛋白酶在C端324位氨基酸R-X-R-R切割，得到sGP和∆-多肽(Volchkova,etal.,1999)，得到的产物均不是病毒的结构蛋白。sGP与GP1,2、ssGP拥有相同的N端295个氨基酸(Volchkova,etal.,2015)。sGP含有6个N-糖基化位点，是第一个被发现拥有C-甘露糖糖基化的病毒蛋白(Pallesen,etal.,2016)。sGP由于没有跨膜区，其单体通过53位和306位半胱氨酸形成的二硫键水平方向结合(Falzarano,etal.,2006)，4 中国农业科学院博士学位论文第一章引言构成可溶性二聚体，大小约110kDa。sGP作为诱饵抗原，可与针对GP1,2的抗血清相互作用，通过结合针对GP1,2的抗体来影响宿主的体液免疫反应，以帮助病毒在细胞内存活(Pallesen,etal.,2016)。由于sGP在病毒合成中大量表达，广泛存在于细胞中，因此病毒感染或免疫时刺激产生的B细胞大多针对sGP。这种免疫方向的改变，可减少针对GP1,2的免疫反应(Lee,etal.,2008;图1.4EBOVGP基因产物(Martin,etal.,2016)Fig.1.4TheproductsofEBOVGPgene(Martin,etal.,2016)5 中国农业科学院博士学位论文第一章引言Mohan,etal.,2012;Sullivan,etal.,2011)。此外，sGP还具有抗炎症反应的作用，可在一定程度上恢复内皮细胞的屏障功能(Wahl-Jensen,etal.,2005)。∆-多肽是被泛素化的40个氨基酸多肽，在翻译后被O-糖基化高度修饰，再分泌到细胞外，其在细胞内存在的时间较sGP更长。∆-多肽被认为可以调节丝状病毒的进入，可通过结合细胞受体抑制EBOV进入目标细胞(Martin,etal.,2016;Radoshitzky,etal.,2011)。在电脑模拟中的分析显示，该肽很可能是毒力因子，可裂解形成毒力蛋白。ssGP是36kDa的小蛋白，由转录时+2移码得到的mRNA翻译而来。ssGP被大量N-糖基化，通过53位半胱氨酸形成的二硫键相互作用，形成约100kDa的二聚体。虽然ssGP的生化和结构特征与sGP序列相似，但ssGP并不具有sGP在内皮细胞上的抗炎症反应功能(Mehedi,etal.,2011)。1.1.3.5VP30VP30通过N端区域的低聚化形成六聚体(Hartlieb,etal.,2007)，与NP、VP35共同压缩基因组，在L辅助因子的作用下，合成病毒RNA(Kirchdoerfer,etal.,2015;Noda,etal.,2005)。VP30是基因组RNA包装和核衣壳组装中转录因子的激活蛋白，对病毒转录的起始起到正向调节作用；也是mRNA合成的延长因子，可以对mRNA起到稳定作用，对于病毒转录非常重要(Muhlberger,etal.,1999)。VP3029-31位、42-46位磷酸化的丝氨酸集团对于VP30行使功能至关重要，其作为辅助转录作用因子，有利于在NP转录时读通RNA的二级结构，且有助于基因接头在转录时保持连续性(Martinez,etal.,2008)。1.1.3.6VP24VP24是次要的基质蛋白，在生理条件下可以低聚化，优先形成四聚体，N端氨基酸是形成四聚体的重要部位。病毒的基质蛋白具有自组装成高度有序结构的能力，对于病毒粒子的组装和产生很重要，VP24作为病毒粒子中的一个小成分，与病毒粒子组装的组装必然相关(Hoenen,etal.,2006;Licata,etal.,2004)。VP24位于质膜和核附近区域，与质膜联系紧密。VP24被认为可阻碍IFN-α/β/γ信号通路，可与胞内转运蛋白相互作用，并可使核衣壳充分功能化(Hoenen,etal.,2006;Ramanan,etal.,2011)。1.1.3.7L该病毒蛋白与其他病毒中RdRp的作用相似。在EBOV中，它与NP、VP35和VP30协同作用，促进EBOV负链RNA基因组的逆转录及复制，进而形成病毒mRNA(Muhlberger,etal.,1999)。L的741-744位氨基酸是一个经典的四氨基酸GDNQ结构域，许多负链RNA的RdRp催化中心均包含该结构域。研究表明，改变GDNQ结构域会完全抑制病毒基因组的复制和转录，但不会影响L的表达或定位(SchmidtandHoenen,2017)。1.1.4生活周期1.1.4.1吸附EBOV通过跨膜病毒GP的顶端部分GP1与细胞表面因子的结合，吸附于目标细胞上(Chan,etal.,2001)。由于GP被多种糖链高度糖基化，因此所形成的多聚糖帽子可被细胞内的特定家族蛋白识别(Alvarez,etal.,2002)。GP1通过RBD与细胞的内体结合离细胞膜靠近。研究以证明，去唾液酸糖蛋白受体（ASGP-R）、树突状细胞特异性非整联蛋白（DC-SIGN）、人巨噬细胞半乳糖6 中国农业科学院博士学位论文第一章引言和乙酰半乳糖胺特异性C型凝集素（hMGL）以及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素（LSECtin/CLEC4G）都可与EBOVGP相互作用并促进病毒吸附。1.1.4.2吸收EBOV被吸收进宿主细胞有几条路径。已有实验证明，巨胞饮作用、病毒粒子的大小以及宿主细胞的自身属性是内化的关键因素(Aleksandrowicz,etal.,2011;Nanbo,etal.,2010;Saeed,etal.,2010)。根据EBOV假病毒为基础的研究得知，EBOV进入细胞依赖内吞作用酶——组织蛋白酶B/L和胆固醇，它们是细胞膜穴样微囊和脂筏的主要成分(Moller-TankandMaury,2014;Saeed,etal.,2010)。另外，pH可通过影响组织蛋白酶消化切割GP的过程，引起GP空间结构的改变，而影响GP与细胞膜融合。低pH条件有利于GP调节膜融合过程(Markosyan,etal.,2016)。GP被切割后，pH将不再影响GP诱导的细胞融合及内吞过程。1.1.4.3病毒脱壳及融合内吞过程后的下一个步骤是病毒膜与细胞内体小泡膜的融合。GP2对于完成膜融合过程非常重要，其融合区的核心疏水序列插入宿主细胞膜并起始膜融合过程(Bar,etal.,2006;Watanabe,etal.,2000)。GP2插入细胞膜后形成的跨膜六螺旋束不仅触发了细胞膜的打开，而且形成了病毒与细胞物质交换的通道(Malashkevich,etal.,1999)，病毒RNA和相关蛋白释放进入细胞质中进行病毒基因组的复制。目前，具体是哪种酶催化并加速膜融合的过程尚不清楚，但内体小泡和溶酶体相关因子可被半胱氨酸蛋白酶抑制子和低pH限制(Schornberg,etal.,2006)。1.1.4.4转录和复制在完成膜融合且病毒成分进入细胞质后，RNP复合体作为模板，在RdRp的作用下转录合成互补的正链RNA(cRNA)，再复制得到病毒基因组RNA，并包裹进病毒粒子中。其中，VP35通过抑制NP的低聚化将RNA从NP-RNA复合物上释放作为模板为关键一步。1.1.4.5组装及出芽在整个组装过程中，首先由NP与VP35、VP24共同组装成螺旋管样结构，进而形成核蛋白壳。完成组装的核蛋白壳NP螺旋与VP40C端的50个氨基酸相互作用(Baker,etal.,2016;Licata,etal.,2004;Noda,etal.,2006)，组装成半成熟的病毒粒子，VP40通过调节细胞微管将核蛋白壳转移到细胞表面，并与膜内叶相互作用，调节病毒出芽。NP在此过程中起到重要的控制作用，其N端影响NP-NP及NP-RNA的相互作用关，C端可改变NP-VP40的相互作用(Garcia-Dorival,etal.,2016;Mateo,etal.,2010)。为了加快病毒组装的效率，核蛋白壳在胞核区域的形成和累积与病毒粒子的包装同时进行。病毒粒子的包装包括GP的酰化作用，它是病毒粒子形成时的转录后修饰之一，该修饰过程结束后，GP与VP40在核内体中相遇，进而与VP40相互作用的核蛋白壳共同组装，完成成熟病毒粒子的出芽(Neil,etal.,2008)。出芽过程中，GP2与束缚蛋白的相互作用是一个主要过程。由于束缚蛋白是一个IFN-α诱导的基于细胞表面蛋白的细胞膜丝，可将病毒粒子扣留在细胞膜上(Lopez,etal.,2010;Neil,etal.,2008;VandeBurgt,etal.,2015)，因此GP2可抵抗束缚蛋白锚定作用的功能，帮助了病毒粒子的出芽。EBOV的长丝状形态，使其与普通的球形病毒借助囊泡出芽方式不同，它的核蛋白壳与质膜平行，以水平于细胞膜的方向顶出细胞，像“潜水艇式“出芽(Welsch,etal.,2010)。丝状病毒的出芽，除了在细胞膜上，还在细胞内膜、多泡体和次级内体上发生(Silvestri,etal.,2007)。细胞内的病毒粒子是一种病毒来源，在细胞间接触时，通过外泌体及信号通路依赖的过程将病毒粒子传7 中国农业科学院博士学位论文第一章引言递出去。这促进了EBOVGP诱导的感染，增加了本地病毒粒子浓度，进而增强了病毒的感染和传播。1.2埃博拉疫情流行情况EBOV最早于1976年同时发生的2例病例中发现，分别位于现南苏丹和刚果民主共和国，后者发生在名为埃博拉河的流域附近，该病毒以此命名。自那时以后，EBOV不时感染人类，在一些非洲国家造成小型爆发。1976年，由EBOVMayinga亚型引起的埃博拉疫情导致380例病例，死亡率88%；1995年，由Kikwit亚型引起的埃博拉疫情造成315例病例，死亡率81%(Cook,etal.,2016)。自EBOV发现到2012年，共有超过1590例病例报告(WHO.,2015)。2014年3月之后，西非多个国家经历了埃博拉疫情有史以来的最大爆发。截止2016年3月，该疫情共确认28616例病例，造成11310例死亡(WHO.,2016)。疫情首先在几内亚发现，之后跨越陆地边界，进入塞拉利昂和利比里亚。此后，埃博拉疫情虽结束大规模爆发，但仍有零星病例报告。目前为止，埃博拉疫情以地方性流行为主，集中在中非热带雨林和东南非洲热带大草原。疫情发生地虽然已从开始的苏丹、刚果民主共和国扩展到中非共和国、利比亚、加蓬、尼日利亚、肯尼亚、科特迪瓦、喀麦隆、津巴布韦、乌干达、埃塞俄比亚以及南非，但仍只局限于非洲内流行。除非洲大陆外，只有美国、英国、瑞士等个别国家报道过病例，但是均为参与诊治病人或参与调查研究人员导致的输入性感染或实验室意外感染。EBOV的流行特点为在个别国家、地区间歇性流行，在时空上有一定的局限性。目前还不清楚EBOV从何而来，但根据与其相似病毒的特性，科学家们认为该病毒是动物源性病毒，果蝠很有可能是其自然宿主(Leroy,etal.,2004)。人类可能在热带雨林与携带该病毒的动物（如猿、猴子、森林羚羊、豪猪等）亲密接触而导致感染。埃博拉疫情通过直接接触在人与人之间传播，破损的皮肤或黏膜与患者的血液、分泌物、器官和其它体液以及粘有这些体液的物品接触都会引起感染，与死者遗体接触的埋葬仪式是引起EBOV在非洲大规模爆发的主要行人类为之一。感染EBOV后，有2至21天的潜伏期，这期间，EBOV不会传染。潜伏期过后，将出现突然性的发烧、疲劳、肌肉疼痛、头痛和喉咙痛等早期症状。随后出现呕吐、腹泻、皮疹、肾功能受损和肝功能受损的症状。在某些情况下，会出现身体内出血和外部出血等症状，如牙龈出血、大便出血。实验室检测发现，病毒的感染还会导致白细胞和血小板计数的减少和肝酶的升高。1.3埃博拉疫苗研究进展由于2014年到2016年的埃博拉疫情的爆发，对公众健康造成了严重威胁，因此，多种针对埃博拉疫情的疫苗，如灭活病毒，病毒蛋白纯化，DNA疫苗，基于病毒载体的重组病毒，以及病毒样颗粒(VLPs)等研究迅速发展。由于EBOV的高致死率，使得在人类上进行疫苗的效价测评不可能直接完成，因此，美国食品和药物管理局(FDA)在2002年引入了“动物规则”，针对EBOV及其他高致命的人类病原体，首先在动物上进行疫苗或药物治疗的功效评价。在EBOV疫苗效果的评价中，与人类近源的非人类灵长动物（Non-humanprimates,NHPs）感染EBOV后产生的症状与人类极为相似，因此NHP被认为是最终评价EBOV疫苗的动物模型。NHP作为动物模型研8 中国农业科学院博士学位论文第一章引言究EBOV的限制体现在饲养成本过高和生物安全4级(BSL-4)实验室实验空间有限上，因此，实验室小动物是EBOV疫苗评估有价值的动物替代模型(Bowen,etal.,1977)，如小鼠和豚鼠。现已有在不同动物模型上正在进行或已经完成的临床实验，为埃博拉疫苗的研究提供了宝贵数据(Lambe,etal.,2017)。基于抗原免疫模式，EBOV疫苗可分为三类，包括非复制型表达载体为基础的疫苗，可复制病毒载体为基础的疫苗和病毒蛋白抗原为基础的疫苗。1.3.1非复制表达载体为基础的疫苗以重组腺病毒复制子为基础的疫苗是第一个可对NHPs感染EBOV提供保护的疫苗方法。在早期的研究中，首次免疫使用EBOVGPDNA，加强免疫使用表达GP的5型重组腺病毒，可对NHPs感染致死剂量的EBOV提供完全保护，这为疫苗可有效保护感染EBOV的NHPs提供了第一个证据(Sullivan,etal.,2000)。随后的研究证明，单次接种表达EBOVGP的重组腺病毒可以对NHPs感染致死剂量EBOV提供完全保护，并定义了最小保护剂量为1010空斑形成单位（plaqueformationunit,pfu）(Sullivan,etal.,2006)。然而，如此高剂量的疫苗才能对NHPs提供完全保护并不适合该疫苗的广泛应用，因为在GMP条件下难以完成该疫苗的大规模生产。在人体实验方面，表达EBOVGP的重组腺病毒5型已进行了I期临床试验，结果显示该疫苗在人类上已通过安全性测试(Ledgerwood,etal.,2010)。但是，无论个体接种109还是1010pfu剂量的疫苗，针对GP的抗体效价均很低，约为300，而在NHPs实验中，产生抗体效价超过2000。除了在人类上引起的免疫反应相对较低以外，使用5型腺病毒载体为基础的疫苗还面临着具有预存免疫的问题。临床试验的结果显示，免疫两种不同剂量的表达EBOVGP5型重组腺病毒疫苗，实验组中没有产生显著免疫反应的个体，个体体内均存在针对疫苗载体的预存免疫抗体(Ledgerwood,etal.,2010)。5型重组腺病毒疫苗存在预存免疫的问题在动物研究中也同样存在(Geisbert,etal.,2011)。值得注意的是，关于腺病毒载体的预存免疫问题可以使用喷雾免疫方式有效解决(Richardson,etal.,2013)，但这种方法涉及刺激鼻腔和气管，在人类上能否应用尚不明确；且在没有预存免疫的情况下使用该方式NHPs，只能提供部分保护。基于其它血清型的腺病毒疫苗在不同实验动物上也取得了一定的研究成果。血清型26和35的重组腺病毒疫苗在感染了EBOV的NHPs上实验，单次免疫可提供部分保护，两次免疫使用不同的抗原可提供完全保护(Geisbert,etal.,2011)。此外，基于猴子的腺病毒21型和黑猩猩的腺病毒7型重组腺病毒疫苗也已开发，并证明可在小鼠和豚鼠上诱导抵抗EBOV致死性攻毒的保护性免疫(Kobinger,etal.,2006;Roy,etal.,2006)。虽然使用腺病毒5型以外的血清型腺病毒可以克服其在人类上具有预存免疫性的问题，但它们的免疫原性在人类上还不足够清楚。因此，使用腺病毒作为重组疫苗载体，EBOV目标抗原所诱导产生的免疫反应有限，并很有可能妨碍通过加强免疫获得长效保护的可能性，此种情况曾发生在研究HIV疫苗的研究中，如编码HIV抗原的重组腺病毒所诱导的针对HIV的免疫反应在免疫后4到6个月迅速下降，而针对腺病毒载体的中和抗体在3年内依然维持高水平(Santra,etal.,2005)。若使用两次免疫不同抗原的方法使用此平台，有可能诱导有效的保护性免疫反应(Geisbert,etal.,2011)。委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)也被用于EBOV疫苗的开发。单独或共同表达EBOVGP和NP的VEEV可对感染致死性EBOV的小鼠和豚鼠提供保护(Pushko,etal.,2000)。有趣的是，小鼠和9 中国农业科学院博士学位论文第一章引言豚鼠在免疫了共同表达EBOVGP和NP的VEEV后可被完全保护，但小鼠只在免疫了单独表达EBOVNP的VEEV后可被完全保护，豚鼠只在免疫了单独表达EBOVGP的VEEV后可被完全保护。在恒河猴上的实验研究中，免疫单独或共同表达EBOVGP和NP的VEEV，即使在接种免疫107pfu后，仍不能在NHPs上提供免疫性保护(Geisbert,etal.,2002)。最近的一项研究结果表明，单独免疫表达GP的VEEV可对感染了致死性EBOV的实验动物提供免疫性保护，但免疫剂量需为1010pfu(Pushko,etal.,2000)。类似于腺病毒，高免疫剂量的需求和预存免疫的存在成为VEEV作为疫苗平台应用在人类上的主要障碍。除了重组腺病毒和VEEV，另一个疫苗载体基于昆津病毒。昆津病毒是黄病毒科的一员，已被开发并证明可在豚鼠模型上提供部分保护(Reynard,etal.,2011)。除了不可复制病毒复制子以外，DNA疫苗也可对感染了致死性EBOV的小鼠和豚鼠上提供保护(Grant-Klein,etal.,2012;Shedlock,etal.,2013)。表达EBOVGP的DNA疫苗也在人体上进行了I期临床试验，并证明具有安全性和免疫原性(Martin,etal.,2016)。删除了EBOV复制必需蛋白VP30的基因编码序列获得的复制缺陷型EBOV，可对感染了致命性EBOV的小鼠和豚鼠提供完全保护(Halfmann,etal.,2009)。DNA疫苗的优势是可以重复接种以刺激诱导保护性免疫反应。然而，到目前为止，单独的DNA疫苗的功效尚未在NHPs上评估，而该动物模型对埃博拉疫苗的发展更有意义1.3.2可复制表达载体为基础的疫苗重组水疱性口炎病毒（rVSV）通过反向遗传技术，将其自身糖蛋白替换为EBOVGP并表达制成疫苗(Marzi,etal.,2011)。单次免疫表达ZEBOVGP的rVSV可对感染了致死性EBOV的小鼠、豚鼠和NHPs均提供保护(Jones,etal.,2005;Jones,etal.,2007;Marzi,etal.,2011)。值得注意的是，这些被完全保护的免疫动物没有检测到病毒血症，说明了该疫苗平台具有潜在的安全性。这个疫苗平台已被应用到埃博拉病毒属和马尔堡病毒属的毒株，单次免疫多种毒株疫苗的混合物，可对感染致死性埃博拉和马尔堡病毒属多个毒株的NHPs提供保护(Geisbert,etal.,2009)。此外,该疫苗平台已被证明能够在NHPs感染EBOV后提供保护，说明该平台具有病毒感染暴露后治疗的潜力(Geisbert,etal.,2008)。VSV重组疫苗具有的高效性使它在EBOV疫苗研发上极具吸引力。然而，由于该疫苗平台具有自我复制能力，其作为人类疫苗的安全性还需要仔细研究。并且，该疫苗平台的大量应用将向人群引入人工制造的病毒，这是该疫苗平台及其它可复制病毒载体疫苗需要考虑的问题。重组的狂犬病病毒（RABV）也在最近的研究中用于埃博拉疫苗的研究。单次免疫表达EBOVGP的重组RABV可对感染EBOV的小鼠提供部分保护(Blaney,etal.,2011)，且在两次免疫后可对NHPs提供完全保护(Blaney,etal.,2013)。虽然基于重组RABV的埃博拉疫苗较基于重组VSV的埃博拉疫苗效价略低，但有趣的是，表达EBOVGP的灭活重组RABV依然可以对感染了致死性EBOV的NHPs提供部分保护，说明该疫苗平台在人类上作为灭活病毒疫苗的潜力。除了如VSV和RABV这些基于弹状病毒载体的埃博拉疫苗以外，基于副粘病毒载体的埃博拉疫苗也被开发。单次免疫只表达EBOVGP或共表达EBOVGP和NP的重组人类流感病毒3(HPIV3)可对感染了致死性EBOV的豚鼠提供保护(Bukreyev,etal.,2006)；进一步的研究表明，10 中国农业科学院博士学位论文第一章引言该疫苗平台还可在两次免疫后对NHPs提供完全保护(Bukreyev,etal.,2007)。为了避免HPIV3在人类上可能存在的预存免疫，将HPIV3表面糖蛋白F和HN基因删除，形成的新重组疫苗虽然复制能力降低，但仍然具有很高的免疫原性，能够在单次免疫后刺激保护性免疫反应并对感染致死性EBOV的豚鼠提供保护(Bukreyev,etal.,2009)。基于另一个副粘病毒——鸡新城疫病毒(NDV)的重组病毒疫苗也被开发，与重组HPIV3疫苗分别进行首次免疫和二次免疫后，在NHPs上体现出免疫原性(DiNapoli,etal.,2010)，但保护效果尚未报道。类似于VSV和RABV疫苗，这些新疫苗可能向人群中引入新的传染性病毒。大量表达EBOV蛋白的重组牛痘病毒(VV)可以诱导对抗EBOV感染的免疫反应。在豚鼠模型上对重组VV载体表达EBOVGP与sGP进行评估，仅有表达GP的重组VV在免疫后对感染致死性EBOV的豚鼠提供了部分保护，而未能对NHPs提供任何保护(Geisbert,etal.,2002)，说明该疫苗平台可能对埃博拉疫苗的研发意义不大。1.3.3病毒蛋白抗原为基础的疫苗尽管可复制载体疫苗在包括NHPs在内的各种动物模型中实验表现出了有效性，但其具有的自我复制能力确是一个安全问题；而非复制的病毒载体疫苗又具有预存免疫性，很有可能在加强免疫时诱导产生针对载体的免疫反应，从而抑制疫苗的免疫原性。相比较而言，以病毒蛋白作为抗原的疫苗则不存在这些问题。在早期的研究中，EBOV用甲醛灭活或热灭活的方法制备成疫苗(Lupton,etal.,1980)，免疫豚鼠后攻毒，由于使用的是未在豚鼠上传代适应的EBOV攻毒，因此13只Control组动物只有4只发生了致死性感染。后来的研究表明，灭活的埃博拉疫苗对感染致死性EBOV的NHPs不具有保护作用(Geisbert,etal.,2002)。有趣的是，使用光诱导烷化探针，即1,5-iodonaphthylazide(INA),加上紫外光照射得到的灭活EBOV，可对感染致死性EBOV的小鼠提供完全保护，而使用伽马射线灭活的EBOV免疫则不能提供同等保护(Warfield,etal.,2003;Warfield,etal.,2007)，说明灭活病毒的方法可影响病毒蛋白的结构和免疫原性，从而影响诱导的保护性免疫反应。因为灭活EBOV需要在BLS-4实验室进行操作，所以该种疫苗生产成本较高。EBOV糖蛋白GP组成的亚单位疫苗同样可预防EBOV的感染。利用重组杆状病毒表达系统，在昆虫细胞中生产EBOVGP蛋白并纯化，单独免疫豚鼠，或在DNA疫苗免疫后进行加强免疫，可诱导产生显著的抗体反应，但只有部分实验动物得到保护，且没有发现保护性和中和抗体效价具有相关性(Mellquist-Riemenschneider,etal.,2003)。病毒样颗粒（VLPs）也是一种很有吸引力的埃博拉疫苗形式(WarfieldandAman,2011;Yang,etal.,2008)。与基于病毒载体的疫苗相比，VLPs可以重复免疫。VLPs将几个病毒蛋白成分重排，形成多颗粒结构，并重新组装成完整的病毒粒子，它与可溶性抗原相比能够更好地诱导中和抗体的产生。VLPs还是抗原递呈细胞（如树突状细胞）的目标，可以更好地刺激抗体和细胞免疫反应。此外，VLPs具有高度的通用性，可以作为免疫刺激分子来增强免疫反应。在最初的研究中，将表达GP和VP40蛋白的DNA载体转染于人293T细胞中得到EBOVVLPs，这些VLPs被证明可以通过三次免疫接种诱导小鼠产生免疫应答(Warfield,etal.,2003)。之后，EBOVVLPs与佐剂混合后免疫，可对感染两倍致死剂量EBOV的小鼠提供完全保护(Warfield,etal.,2005)，对感染单倍致死剂量的豚鼠提供完全保护(Swenson,etal.,2005)，对NHPs提供部分保护(Warfield,etal.,11 中国农业科学院博士学位论文第一章引言2007)，首次为非病毒载体的疫苗可在NHPs动物模型上刺激产生保护性免疫反应提供了证据。昆虫细胞利用重组杆状病毒系统产生的VLPs与哺乳动物细胞产生的VLPs在形态和功能上类似(Ye,etal.,2006)，也可以对感染致死性EBOV的小鼠提供有效保护(Sun,etal.,2009)。昆虫细胞生产的VLPs具有产量高的特点，将大大降低VLP疫苗的生产成本；且与成熟的哺乳动物细胞系相比，昆虫细胞系生产的生物产品在人类等哺乳动物上使用，具有潜在的安全优势。1.4疫苗效果的影响因素由于现代病原环境的复杂和出于环境生物安全的考虑，使得基于弱化或灭活病毒的疫苗很难得到认证许可(Huang,etal.,2005)，因此现代疫苗的设计正从弱化或灭活病毒转向抗原更加明确的亚单位疫苗。亚单位疫苗使用的是确定且纯化过的抗原，包括蛋白，多肽和核酸，它们不仅具有免疫原性和安全性，而且可以快速的大量生产，以应对新的疫情爆发(Nabel,2013)。亚单位抗原的反应性较低，可以降低全身和局部反应的副作用，但不利于刺激有效的、持久的免疫反应。因此，亚单位疫苗通常与有效的佐剂联合使用，以激活和调节有效的免疫反应(Reed,etal.,2009;TandrupSchmidt,etal.,2016)。亚单位疫苗的有效性与特异性抗原、免疫刺激剂（如佐剂）、免疫方式相关。1.4.1抗原种类及配方传统上，疫苗指弱化活病原体、全灭活病原体，它们具有免疫原性，具有内在的免疫刺激能力，这对于诱导长期的保护性免疫是有意义的。然而，此方法的缺点是基于活病原体的副作用可能轻微，也可能严重，甚至危及生命(Huang,etal.,2005;RobinsonandAmara,2005)。因此，安全性问题限制了传统疫苗的开发和使用，使得更安全的亚单位疫苗成为近些年来疫苗开发和研究的主要抗原形式。在过去的30-40年间，疫苗学的发展取得了巨大的突破。重组DNA技术的引入为这些突破做出重要贡献，疫苗抗原种类多元化，各种亚单位疫苗取得重大研究进展(Rappuoli,2007)。1.4.1.1传统疫苗等非亚单位疫苗常规疫苗是基于活的弱毒病原，在自然条件下或实验室中弱化的病原体。使用减毒活疫苗的原理是模仿自然感染，疫苗免疫后产生有效的免疫应答反应。这种疫苗的优点是可产生强大的细胞和抗体反应，通常会实现长期保护。卡介苗（抗结核杆菌）、麻疹等都是这类疫苗(Bovier,2008)。因不同物种对同一种病毒敏感性不同，也可以成为疫苗使用的原理，如最早的天花疫苗使用的是牛痘中的脓液(Riedel,2005)。与弱毒疫苗相比，灭活疫苗的主要优势体现在安全性。由于这些疫苗是基于已被杀死的病原体，因此不会产生毒力恢复的可能性。然而，这也构成了一个与活疫苗相比的劣势，那就是由于不能复制导致抗原在体内被快速清除，从而降低疫苗免疫效率。与新的亚单位疫苗相比，因为大多数致病成分都被保留了下来，所以灭活疫苗可引起更强、更复杂的免疫应答。1.4.1.2亚单位疫苗亚单位疫苗是由一种或多种病原体成分组成的疫苗。亚单位疫苗的成分包括一种或几种在目标病原体结构中存在的核酸、重组多肽、蛋白质或多糖(Dudek,etal.,2010)。在安全性和生产成本12 中国农业科学院博士学位论文第一章引言方面，该疫苗较传统疫苗具有更大的优势，因为它由确定度和纯度很高的物质组成。亚单位疫苗的不可复制性所带来的安全优势和去除掉不需要的物质降低了非期望免疫应答的发生，使得该种疫苗非常具有吸引力(RobinsonandAmara,2005)。DNA疫苗代表了一种新的疫苗，因为其简单性以及与传统疫苗相比的其他优势而具有吸引力。DNA疫苗接种的原理是向免疫动物注射编码抗原的DNA以诱导免疫，而不是直接注射多肽或蛋白质。在DNA疫苗接种后，宿主细胞将产生由DNA编码的蛋白质(抗原)，并对这种特定的蛋白质产生免疫，随后诱导免疫反应(Senovilla,etal.,2013)。DNA疫苗的优势是其制作成本相对较低，且可以引起体液和细胞免疫反应。此外，DNA在室温下相当稳定(Bins,etal.,2013)，这使得DNA疫苗的储存不需要冷链运输，对于发展中国家疫苗项目的开展并保持有效性非常重要。迄今为止，还没有一种DNA疫苗被批准用于人类使用，一些DNA疫苗被批准/注册用于兽医用途(Bins,etal.,2013)。常见的病毒亚单位疫苗是将病毒的结构破坏，获得含有各种病毒成分的混合物；或者，亚单位疫苗可能由一个或多个病毒蛋白质、肽段组成。在某些情况下，这些成分本身是具有免疫原性的。流感的亚单位疫苗包括两个纯化的表面抗原血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。这两种蛋白质从季节性流感疫苗中选择三种毒株并结合在一起，成为三价疫苗。然而，在多数情况下，高度纯化的亚单位抗原缺乏内在的致病性，使得这些蛋白质的免疫原性较弱，通常需要联合佐剂使用。添加佐剂不仅能诱导有效的免疫反应，而且还能调节免疫反应(O'Hagan,2001;Reed,etal.,2009)。佐剂的使用还可以改变疫苗的使用剂量。1.4.1.3佐剂疫苗佐剂因其功能而非物质本身定义，其具有增强机体对疫苗抗原免疫的反应功能(O'HaganandDeGregorio,2009)，因此，疫苗佐剂包括各种各样的物质，从小型合成分子到天然物质的提取物，通常包括含各种成分的微粒，如乳剂、免疫刺激复合体和脂质体等(O'HaganandFox,2015)。铝盐佐剂是应用面最广的佐剂之一，已经在数十亿疫苗中使用70多年，在世界范围内和不同人群中，包括儿童、孕妇和老人，均有使用铝盐佐剂免疫的相关记录(ClementsandGriffiths,2002)。铝盐佐剂通常使用在廉价的单剂量液体疫苗中以辅助疫苗的储存和运输(GarconandVanMechelen,2011)。多年来，铝盐佐剂是世界上唯一被批准的佐剂，但有研究证明，铝盐佐剂不能引起针对某些更复杂、具有挑战性的病原体的期望免疫应答强度，如针对疱疹病毒，疟疾疟原虫，艾滋病毒所需的更强的细胞免疫应答(BritoandO'Hagan,2014;DellaCioppa,etal.,2015)。因此，需要更有效的佐剂对抗各种疾病，并将对目标人群和动物的免疫风险控制在合理的范围内。Matrix-M是一种新型佐剂，其有效成分皂苷是从皂皮树中提取的，它可以诱导产生高且持久的广泛抗体反应，并平衡TH1和TH2型反应，包括刺激生物产生多种免疫反应类型，如小鼠IgG2a、多功能T细胞和细胞毒性T淋巴细胞(Pedersen,etal.,2012;Pedersen,etal.,2014)。Matrix-M佐剂促进了细胞向局部淋巴结的体液流动，创造了活化细胞的的环境，这些细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞(Bengtsson,etal.,2013;Magnusson,etal.,2013;Reimer,etal.,2012)。Matrix-M在临床前(Madhun,etal.,2009;Radosevic,etal.,2008;Skoberne,etal.,2013)和人类临床研究(Cox,etal.,2011)中显示了强有力的辅助活性，可诱导增强免疫反应。最近H7N9禽流感病毒颗粒样疫苗研究中，Matrix-M佐剂具有合理的安全性，并对疫苗免疫具有显著的剂量效应作用(Chung,etal.,2015)。13 中国农业科学院博士学位论文第一章引言1.4.2免疫途径免疫效果的好坏与接种方式有直接关系。疫苗抗原（如蛋白质和多肽药物）大多是大生物分子，在免疫上存在的问题包括低生物可用性，物理、化学、酶条件下的低稳定性(ShajiandPatole,2008)。目前常用的免疫途径大致可分为注射免疫和黏膜免疫，两者各有利弊。注射免疫是克服生物可用性问题的最有效手段，但这种免疫途径需要考虑公众的接受程度和成本问题(Groves,etal.,2015)。在选择合适的注射免疫接种途径时需要考虑的关键因素包括：1）解剖和生理因素，如淋巴结的位置、皮肤的厚度、血管化程度和有无免疫细胞亚群；2）抗原和佐剂的性质；3）疾病条件；4）所期望的免疫反应。黏膜免疫因其在预防感染中的关键作用而被广泛研究，因为许多病原体通过黏膜进入人体，所以为了刺激黏膜表面的免疫反应，疫苗需要刺激沿着黏膜衬里分布大的相关淋巴组织。黏膜免疫的一个特点是其分泌的IgA可与黏膜中的病原体结合，防止感染。此外，该种免疫途径通常不需要针头，这增加了其被公众接受的可能性。但为了刺激有效的黏膜免疫反应，仍然有许多障碍需要克服。关于注射免疫和黏膜免疫，常见的接种方式如下：1.4.2.1肌肉注射肌肉注射（IM）是一种常见的疫苗接种方式，已通过这条途径完成了免疫原性的优化和不良反应的降低(Zuckerman,2000)。使用该种方法免疫是因为，肌肉与皮下组织相比，血管化程度较好，但该部位不利于疫苗的体内贮藏和持续释放。IM可用于疫苗的首次免疫，再使用不同的接种方法加强免疫，会取得更好的免疫效果(Marjani,etal.,2015)。1.4.2.2皮内免疫皮内免疫（ID）是一种极具潜力的接种方式，因为其作用部位——真皮中含有有效的抗原递呈细胞（APCs）和其他免疫细胞，且该接种方法可以使用更小的针头进行免疫接种，对于有针头恐惧症的人来说更容易接受。与IM免疫相比，ID免疫接种后更容易发生注射局部反应，这对于提高免疫反应具有潜在的意义，尤其是那些对刺激免疫反应有障碍的人群（如老人）(Tsang,etal.,2014)。微针（Microneedle）是今年来大力研究的ID免疫工具，由于其针尖刚好刺破皮肤，停留或穿过角质层，可以避免大量出血并完成皮内免疫，并在多种疫苗研究中获得了很好的免疫效果(Choi,etal.,2013;WangandWang,2015;Zhu,etal.,2009)免疫反应的提高同时意味着可以减少病原和佐剂的免疫剂量(Zehrung,etal.,2013)，使疫苗生产更加容易且成本降低。该种方法通常用于佐剂疫苗(Herzog,2014)。1.4.2.3静脉注射和腹腔免疫当需要将疫苗运送到中心淋巴组织时，常使用静脉注射（IV）和腹腔免疫（IP）接种方式。它们常用在治疗癌症的疫苗上(AnassiandNdefo,2011)。在对恶性疟原虫引起的疟疾疫苗研究中，腹腔接种较肌肉注射和皮内免疫获得了更好的免疫效果(Richie,etal.,2015)。利用佐剂α-半乳糖基神经酰胺的疫苗也使用IV接种方式，因为该佐剂作用的NKT细胞位于骨髓和肝脏(Fujii,etal.,2002)。1.4.2.4口服免疫口服疫苗是一种方便的疫苗接种方法。与内脏相关的淋巴组织在产生口腔免疫反应中起着至关重要的作用。目前市场上的口服疫苗都是全细胞活或灭活疫苗(Lycke,2012)。用亚单位疫苗进行口服疫苗接种仍然是一个挑战，主要障碍包括：1）胃肠道内的环境条件恶劣，如胃中pH值低，14 中国农业科学院博士学位论文第一章引言肠道内的微生物和酶过多，可能会降解抗原；2）与内脏相关的淋巴组织对抗原的预处理可能导致抗原具有耐受性或反应性低；3）生物大分子在肠上皮细胞上具有低渗透性(DavittandLavelle,2015)。为了解决这些问题，研究人员正在开发新的疫苗配方以诱导有效的口服免疫。例如，乳剂、脂质体、聚合体纳米颗粒和VLP等基于颗粒载体的口服疫苗能够保护疫苗有效成分，使其免受体内条件的恶劣影响。为了增加黏膜表面疫苗的停留时间，还开发了黏合剂配方。例如，阳离子脂质体、壳聚糖纳米颗粒。它们具有表面正电荷，可与带负电荷的黏膜表面结合，延长其在胃肠道中的停留时间(Lai,etal.,2009)。另一种方法是开发可食用的疫苗。这些包括在植物材料(如生菜，土豆，西红柿)中表达疫苗抗原，然后被食用。如在玉米中高水平表达乙型肝炎表面抗原，然后浓缩获得含有抗原的玉米胚芽(Hayden,etal.,2015)。该制剂在小鼠体内引起强烈的黏膜和全身IgA反应，而在对照肌肉注射免疫实验中，从未检测到IgA反应。需要注意的是，在植物中疫苗抗原的表达量较低，免疫原性较低(ChanandDaniell,2015)。如果能够克服这些问题，这种方法是很有吸引力的。1.4.2.5鼻腔免疫鼻腔免疫是通过吸入进入使人体对病原体产生免疫的接种方式。大多数鼻腔疫苗是在脂质体、聚合颗粒、乳剂等微粒载体上形成后使用的。与鼻腔免疫有关的一个主要问题是鼻腔内的黏膜会对疫苗成分进行清除，这限制了鼻黏膜对抗原的有效吸收。为了克服这一问题，我们研究了使用黏附颗粒等不同的递呈抗原策略，用于亚单位抗原的高效鼻腔传递(Li,etal.,2015)，如甘露糖微球中含有的卵泡蛋白微粒可刺激小鼠体内产生抗原特异性抗体。此外，液体颗粒疫苗存在贮存稳定性的问题(ScherließR.Nasaladministrationofvaccines.In:FogedC,2015)，因此有研究使用喷雾干燥技术，开发鼻干粉疫苗配方以解决该问题(Scherliess,etal.,2015)。1.4.2.6透皮免疫皮肤首先与体外物质接触，成为防止病原体感染的主要屏障。皮肤由三层组成;角质层，表皮和真皮。角质层密集的角化细胞主要的物理屏障，存在于表皮和真皮中的朗格尔斯细胞(LCs)、真皮树突细胞(dDC)、巨噬细胞、肥大细胞和T细胞，可提供免疫保护(Lee,etal.,2013)。表皮LCs和dDC是皮肤中APCs的关键细胞。研究表明，LC更多地参与维持人体对环境抗原的耐受性(Seneschal,etal.,2012)，而dDC主要参与刺激效应和记忆免疫反应(Kaplan,2010)。因此，将疫苗成分通过角质层渗透到真皮层是透皮疫苗的关键。使用化学渗透增强剂、脂质胶体系统(RattanapakT,2015)。化学渗透促进剂通过与细胞间的脂质或角蛋白的相互作用，短暂地移除或破坏角质层屏障。用于皮肤传递的渗透增强剂包括醇、丙二醇和表面活性剂(阳离子和非离子)。脂质体也被广泛地用于透皮免疫(Maghraby,etal.,2008)，然而脂质体膜是细胞间皮肤渗透的不利条件。因此，研究人员开发出了具有弹性的脂质囊，如转移体和酶体，以便更有效地透皮渗透疫苗(Cevc,etal.,2002)，可引起强烈的免疫反应(HansenandLehr,2012;Li,etal.,2011)。1.5本课题研究内容本课题的目的是研究针对EBOV的亚单位疫苗。由于GP是EBOV粒子表面唯一被宿主识别的蛋白，具有较好的免疫原性，因此选择其完整结构蛋白形式GP和分泌型蛋白形式sGP为亚单位疫苗的抗原，纯化后免疫BALB/c小鼠。为比较不同免疫配方对免疫效果的影响，在两种抗15 中国农业科学院博士学位论文第一章引言原中分别加入佐剂Matrix-M，进行免疫效果评价。为比较不同的免疫方式对免疫效果的影响，两种抗原在有或无佐剂的情况下，使用微针进行皮内免疫，并与传统肌肉注射免疫方式进行比较。对免疫后的小鼠进行抗体免疫反应强度和持续性的相关评价。随后，对免疫后小鼠进行致死性EBOV攻毒，评价不同抗原、不同配方、不同免疫方式产生免疫应答的保护效果，为制备安全有效的EBOV亚单位疫苗提供实验基础。16 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定因选定EBOV表面唯一蛋白——糖蛋白GP及其可溶型糖蛋白——sGP作为本课题埃博拉疫苗的两个目标蛋白，所以对其真核表达，制备成亚单位抗原，以进行后续实验。2.1实验材料2.1.1细胞、质粒和病毒CV1细胞、HeLa细胞由实验室保存于-80℃，复苏后使用10%FBS的DMED培养；使用的所有的序列都是基于EBOVZaire毒株(ZEBOV)，Mayinga亚型(GenBank登录No.:U23187.1)。表达MayingaGP和sGP的pCAGGS质粒、牛痘病毒表达系统VVT7病毒和pRB21质粒由实验室保存于-20℃。2.1.2主要试剂和仪器DH5α大肠杆菌感受态细胞购自Invitrogen公司；胎牛血清（FBS）、DMEM、PBS购自Hyclone公司；FuGENE®HD转染试剂购自Promega公司；Ni-NTAagarose、质粒提取试剂盒、细胞DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；HRP标记的羊抗鼠IgG二抗购自Abcom公司；限制性内切酶、T4连接酶购自NEB公司；Phusion高保真DNA聚合酶、蛋白酶抑制剂、TMB显色液、ECL底物购自Thermo公司；BSA总蛋白质浓度测定试剂盒购自Bio-Rad公司；8×LEWbuffer、4×Elutionbuffer购自MachereyNagel公司。RIPA细胞裂解液（50MmTris,150mM氯化钠,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠，pH8.0）；免疫过EBOVGP和sGPDNA的小鼠血清保存于实验室。倒置荧光显微镜购自Zeiss公司；蛋白质电泳仪、转膜仪购自Bio-Rad公司。2.2实验方法2.2.1EBOVGP与sGP三维结构预测与比对GP与sGPN端的209个氨基酸序列一致，为研究该两种蛋白的结构及抗原位点差异，使用SWISS-MODEL对GP和sGP的三维结构进行预测。查询文献并预测氨基酸序列上可能形成化学键的位点，分别对GP和sGP进行多重聚合，GP形成三聚体，sGP形成二聚体，两者间的相同结构进行比对，分析其结构差异及进行后续实验的可能性及必要性。2.2.2EBOVGP与sGP重组牛痘病毒表达系统的构建将表达EBOVGP和sGP的pCAGGS质粒作为模板，设计带有限制性酶切位点AgeI和BsrI和His标签的引物（表2.1），通过PCR为目的基因加上指定位点，获得目的条带。PCR后产物与质粒pRB21同时使用限制性内切酶AgeI和BsrI酶切进行酶切，胶回收条带，使用T4连接酶16℃过夜连接，转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，使用100ng/ml的氨苄抗生素筛选阳性重组子，提取质粒备用。17 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定将CV1细胞铺种于6孔细胞板中，培养24小时，待细胞汇合度约90%时，将细胞培养液替换为细胞生长维持液（含2%FBS的DMEM）。在4个细胞孔中加入10倍梯度稀释的牛痘病毒VVT7各10µL，1孔中加入病毒原液作为对照，1孔留作空白对照，置于5％CO2、37℃培养箱培养1h后，弃上清，PBS洗2遍。使用FuGENE®HD转染试剂将连接于pRB21上的EBOVGP和sGP质粒分别转染于6孔中，转染试剂与DNA用量比为1：3，之后将细胞置于5％CO2、37℃培养箱培养24小时，持续观察。当细胞出现拉网状病变时，弃细胞上清，使用细胞刮收集细胞，于37℃和-80℃中冻融三次后，进行超声，超声条件为200瓦，超声3秒，间隔3秒，重复10次。超声后1000转/分钟离心5分钟后，取上清分装，保存于-80℃以备后续使用。表2.1构建GP与sGP重组牛痘病毒表达系统引物列表Tabe2.1TheprimersofconstructingGPandsGPrecombinantvacciniavirusexpressionsystem名称序列(5’-3’)退火温度备注GP-FGTGTACTAACCGGTATGGGCGTTACAgeI56.1℃GP-RTATTCTTGTACACTACACCACCACCACCACCACAAAGACAAATTBsrI;HissGP-FTGTACTAACCGGTATGGGCGTTACAgeI55.5℃sGP-RTATTCTTGTACATTACACCACCACCACCACCACGATGCGACACTBsrI;HisF13L-FACGGAACCCATTACCAAA52℃测序F12L-RCACGGCCTTCTTCATTTC将CV1细胞铺种于6孔细胞板中，培养24小时，待细胞汇合度约90%时，将细胞培养液替换为细胞生长维持液（含2%FBS的DMEM）。加入上述冻存病毒各10µL，置于5％CO2、37℃培养箱感作4小时后，弃上清，PBS洗2遍。将低熔点琼脂糖的温度控制在40℃左右给，按1：1混合2×DMEM，混匀后迅速轻轻加于细胞上，待琼脂糖凝固后，置于5％CO2、37℃培养箱培养36至48小时，持续观察。待实验孔较对照孔出现明显大蚀斑时，加入含有结晶紫的琼脂，置于加入37℃培养箱培养1小时。活细胞着色后，可明显区分阳性重组的大蚀斑与阴性的小蚀斑。将各大蚀斑挑取于提前一天铺种的CV1细胞24孔板中，置于5％CO2、37℃培养箱培养24小时，持续观察，当细胞出现拉网状病变时，收取细胞和上清，取一半液体标记好冻存于-80℃。另一半提取细胞DNA，使用设计的引物测序（表2.1），测序无误的病毒为种毒。2.2.3EBOVGP与sGP的真核表达将测序无误的表达EBOVGP与sGP牛痘病毒感染于汇合度约90%的HeLa细胞，添加细胞生长维持液（含2%FBS的DMEM）,置于5％CO2、37℃培养箱培养48小时。在表达GP的HeLa细胞中加入RIPA细胞裂解液，作用5至10分钟，收集裂解好的液体，1000×g离心5分钟，取上清；表达sGP的HeLa细胞直接取上清。将收集的两种上清pH调节为8.0，加入蛋白酶抑制剂。每4个175cm2细胞培养瓶加入500µLNi-NTAagarose，于4℃翻转混匀过夜，使Ni-NTAagarose与蛋白充分结合。留作种毒的细胞，在PBS洗1遍后，使用细胞刮将细胞收集，至于-80℃冷冻，37℃融化后，进行超声，超声条件为200瓦，超声3秒，间隔3秒，重复10次，至病毒液颜色均匀，无沉淀。超声后1000×g离心5分钟，取上清，分装，作为种毒存于-80℃。18 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定2.2.4EBOVGP与sGP的纯化含有His标签的GP和sGP，在4℃与Ni-NTAagarose充分结合后，1000×g离心5分钟，弃上清，加入5ml1×LEWbuffer清洗三遍，每次1000×g离心5分钟去掉清洗后液体。分别加入500µL、300µL、200µL1×Elutionbuffer洗脱与Ni-NTAagarose结合的目标蛋白GP和sGP,每次1000×g离心5分钟后，分别收集洗脱后液体。2.2.5EBOVGP与sGP的鉴定2.2.5.1样品制备洗脱后的目标蛋白GP和sGP使用BSA总蛋白质浓度测定试剂盒测定浓度，加入0mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml的BSA标准品于96孔酶标板，每个浓度重复二孔，做标准曲线，再加入目标蛋白GP和sGP，同样重复二孔，于590nm波长测定各试验孔吸光值，计算目标蛋白GP和sGP的总浓度。根据测定的目标蛋白GP和sGP浓度，按每孔1µg的样品量与6×ProteinLoadingBuffer混合煮沸10分钟，至于冰面5分钟后，用于后续鉴定。2.2.5.2WesternBlot鉴定配置12%的SDS-PAGE胶进行电泳，加入蛋白Marker、样品蛋白（GP或sGP）、阳性对照和阴性对照上样，电泳条件：80V，20分钟，之后调整电压至120V，直至溴酚蓝跑出电泳胶。将SDS-PAGE、CV膜和厚滤纸浸泡于转膜液中平衡5分钟，按厚滤纸-SDS-PAGE凝胶-CV膜-厚滤纸的顺序由转膜仪负极向正极依次放好，接通电源，10V转膜1小时。取出CV膜，使用5%脱脂奶粉PBST溶液室温封闭1小时。封闭后，用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟；按1：500将免疫过EBOVGP或sGPDNA的小鼠血清稀释于2%BSA中，作为一抗，4℃孵育过夜。第二天，用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟，按1：4000将HRP标记的羊抗鼠IgG二抗稀释于5%脱脂奶粉PBST溶液中，室温孵育1小时。用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟。加入ECL底物作用于CV膜2分钟，于暗室内使胶片曝光，再显影定影。2.3实验结果2.3.1EBOVGP与sGP三维结构预测及比对预测GP三维结构形成的三聚体。如1.1.3.4所述，GP153位半胱氨酸和GP2609位半胱氨酸柔性连接成GP1,2，再通过GP2间的相互作用形成杯状结构的同源三聚体，GP1形成球状顶，如图2.1所示，绿色，黄色和洋红色部分分别为顶部的三个GP1，红色和橙色部分为与其相连的两个GP2(第三个GP2未显示)。将sGP与GP的三维结构比对结果如图2.1，蓝色部分为sGP的一个单体，可见蓝色部分与绿色部分结构高度重合，两者三维结构相似性极高，既有可能具有相似的免疫原性。sGP形成的二聚体可通过53位和306位半胱氨酸相互作用形成的二硫键提高稳定性，与GP1、GP2相连使用的都是53位半胱氨酸，因此，sGP的另一个单体（棕色部分）能够对GP2形成空间位阻，防止其被抗体识别，进而影响病毒与细胞的融合。19 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定图2.1EBOVGP与sGP三维结构预测及比对图Fig.2.1PredictionandcomparisondiagramofEBOVGPandsGPthree-dimensionalstructure2.3.2EBOVGP与sGP重组牛痘病毒表达系统构建成功以表达GP和sGP的pCAGGS质粒为模板，使用设计的带有酶切位点和His标签的引物，进行PCR，得到目的条带，如图2.2所示。图2.2GP与sGPPCR电泳图Fig.2.2AmplificationofGPandsGPgenesbyPCR将连接于pRB21的GP和sGP重组质粒转染于感染了牛痘病毒VVT7的细胞中，经过蚀斑克隆筛选实验，获得阳性重组牛痘病毒，如图2.3中更大的蚀斑圈。20 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定图2.3GP与sGP重组牛痘病毒蚀斑情况Fig.2.3TheplaugesofGPandsGPrecombinantvacciniavirus2.3.3WesternBlot鉴定EBOVGP与sGP的表达为鉴定抗原特异性，将Ni-NTAagarose纯化后的EBOVHis-GP与His-sGP进行SDS-PAGE和WesternBlot，使用免疫过EBOVGP或sGPDNA的小鼠血清，按1：500稀释于2%BSA中作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG1：4000稀释于5%脱脂奶粉PBST溶液中作为二抗，化学发光显色，暗室中显影定影后结果如图2.4、图2.5：图2.4GP纯化后WesternBlot鉴定图Fig.2.4WesternblotofpurifiedGP21 中国农业科学院博士学位论文第二章EBOVGP与sGP的表达、纯化与鉴定图2.5sGP纯化后WesternBlot鉴定图Fig.2.5WesternblotofpurifiedsGP2.4讨论GP不仅是唯一存在与病毒表面被免疫细胞识别的结构蛋白，而且在病毒吸附、吸收和与细胞膜融合过程中均起到重要作用，因此，GP是大多数EBOV疫苗研究的重点，并且普遍认为，抗GP的抗体反应是预防EBOV感染的关键(Falzarano,etal.,2011)。很多研究已证明，针对EBOVGP抗原的疫苗能够成功的保护EBOV的感染(Blaney,etal.,2013;Herbert,etal.,2013)。由于GP形成的是三聚体结构，且其结构上含有糖基化修饰位点，因此需要真核表达系统体外表达该蛋白并完成修饰，以得到结构更完整的蛋白。经牛痘病毒表达系统表达出的GP，蛋白大小无误，且经SDS-PAGE变性后，蛋白形成的单体在WesternBlot检测中清晰可见。牛痘病毒表达系统作为外源蛋白的表达平台，具有蛋白表达含量高、可进行糖基化位点修饰等优点，可以满足小型实验动物的实验需求，具有一定的应用价值。本实验使用该平台得到的GP产量高、纯度高，为后续实验打下坚实基础。GP基因的主要产物sGP在病毒感染过程中大量分泌，已有研究证明，sGP可以有效调节免疫接种引起的抗GP抗体反应(Mohan,etal.,2012)。由于sGP是截短GP基因的编码产物，它的大部分序列与GP重合，具有很大的潜力可以作为GP蛋白的替换物。本实验通过预测GP与sGP的三维结构并进行比对发现，sGP与GP氨基酸重合区形成的空间结构高度相似，从理论上证明了sGP可作为GP替代品的可能型。由于sGP没有跨膜区和包膜区，所以sGP为分泌性蛋白，更适合大规模生产。与GP相似，使用牛痘病毒表达系统表达sGP，表达量高，条带单一，得到的产物可用于后续实验。2.5小结对EBOVGP及sGP的三维结构进行预测和比对发现，sGP与GP氨基酸序列相同区域形成的空间结构高度相似，sGP极有潜力成为GP的替代蛋白，因此，真核表达EBOVGP与sGP，并成功构建GP与sGP的牛痘病毒表达系统。经该系统表达，分别得到表达量高、条带单一的GP与sGP蛋白，与蛋白理论大小一直，可以被特异性抗体识别，为后续实验打下基础。22 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价经表达、纯化、鉴定无误的GP作为亚单位抗原，或与佐剂结合，对小鼠进行免疫。分别使用微针及注射器为工具，比较皮内免疫与肌肉注射两种免疫方式对GP亚单位疫苗免疫效果的影响，评价抗体水平，并攻毒试验评价该亚单位疫苗的保护率。3.1实验材料3.1.1细胞、质粒和病毒293T细胞、HeLa细胞和JC53细胞由实验室保存于-80℃，复苏后使用10%FBS的DMED培养；表达EBOVMakonaGP、MayingaGP和去除掉MayingaGPMLD的GP-MDpCAGGS质粒由实验室保存；构建假病毒的骨架质粒SG3由实验室保存;小鼠适应性MayingaEBOV保存于美国德克萨斯州生物医学研究所。3.1.2抗原第二章由牛痘病毒表达系统表达纯化、定量后的EBOVMayingaGP由实验室保存；杆状病毒表达系统表达纯化后的MakonaGP在GMP条件下生产，由Novavax公司提供；佐剂Matrix-M由Novavax公司提供。3.1.3主要试剂和仪器胎牛血清（FBS）、DMEM、PBS购自Hyclone公司；FuGENE®HD转染试剂、LuciferaseAssaySystem购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自Qiagen公司；ECL底物购自Thermo公司；免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清保存于实验室；HRP标记的羊抗鼠IgG二抗购自Abcom公司；蛋白酶抑制剂、TMB显色液、ECL底物购自Thermo公司；8×LEWbuffer、4×Elutionbuffer购自MachereyNagel公司;BSA总蛋白质浓度测定试剂盒购自Bio-Rad公司；DEAE-Dextron购自Sigma公司；RIPA细胞裂解液（50MmTris,150mMNaCl,1%NP-40,0.5%脱氧胆酸钠，pH8.0）、包被液（0.02%（w/v）磷酸二氢钠，0.29%（w/v）磷酸氢二钠，0.8%（w/v）氯化钠，pH8.0）、细胞固定液（0.8%（v/v）戊二醛、2.2%（v/v）甲醛稀释于100ml无Ca2+、无Mg2+的PBS中，储存于4℃）、细胞染色液（4mgX-gal、0.04M氯化镁、0.04M铁氰化钾、0.04M亚铁氰化钾稀释于10ml无Ca2+、无Mg2+的PBS中，现配现用）、免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清、氯胺酮、甲苯噻嗪、采血针保存于实验室。倒置荧光显微镜购自Zeiss公司；荧光素酶测量仪购自Promega公司；蛋白质电泳仪、转膜仪购自Bio-Rad公司；金属微针由佐治亚理工学院（GeorgiaInstituteofTechnology）提供。3.1.4实验动物6-8周龄的BalB/c小鼠由埃默里大学（EmoryUniversity）动物资源部饲养;小鼠EBOV致死性攻毒试验在德克萨斯州生物医学研究所（TexasBiomedicalResearchInstitute）BSL-4实验室中完成。23 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价3.2实验方法3.2.1EBOVGP亚单位疫苗（或与佐剂Matrix-M）包被于微针3.2.1.1微针包被微针由不锈钢片构成，厚度75µm，并电解抛光。1个微针有5个长度为500µm的针尖，50µm厚，200µm宽(图3.1)。使用浸蘸工艺将两种EBOV——MayingaGP和MakonaGP分别包被于微针上。首先将两种GP分别进行微量过滤，浓缩到10mg/ml，再重悬于包被溶液中。包被溶液由1%（wt/vol）羧甲基纤维素钠盐，0.5%（wt/vol）促黄体素F-68NF和5mg/ml的目标蛋白GP构成。承载包被溶液的容器由两层构成：底层和表层，两层均由聚甲基丙烯酸甲酯构成。表层有7个洞：5个洞（直径400µm）对应微针的一排，另2个大洞（直径1.5mm）对应两端的补给通道。包被溶液（40µL）装入特定容器中的补给通道，在安装了视频摄像头的显微镜监控下进行手动包被。微针共浸蘸9次，每次浸蘸间隔30秒以进行干燥。微针针尖包被的过程由微动台精确监控并手动控制。干燥好的微针放入特定容器中，加入干燥剂，4℃保存。需要包被佐剂Matrix-M的微针，通过同样的浸蘸工艺，按1：1与GP共同包被于微针上。图3.1微针与普通针头对比图Fig.3.1Comparisonofmicroneedleandsyringeneedle3.2.1.2微针上抗原ELISA定量为测定微针上包被的GP含量，每一批包被的微针取三排溶解于在200µL的PBS中，4℃过夜。取50µL包被ELISA板，做3孔重复。在同一块ELISA板上包被已知浓度的GP蛋白并做倍比稀释，以得到标准曲线，用于计算微针上的GP含量。包被好的ELISA板4℃静置过夜。第二天弃掉孔中包被液体，使用PBST清洗3遍，每孔加入200µl5%脱脂乳粉PBST溶液，37℃静置封闭1小时。弃掉孔中封闭液体，使用PBST清洗3遍，按1：500加入免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清作为一抗，室温孵育2小时。弃掉孔中一抗，使用PBST清洗3遍，加入稀释于2%BSA24 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价PBST溶液的HRP标记山羊抗小鼠作为二抗，稀释比例1：4000，37℃孵育1小时。使用PBST清洗3遍，每孔加入50µlTMB显色液，显色5分钟，每孔加入50µl0.2mol/LHCl终止液。终止后于酶标仪波长450nm测量各孔吸光值。根据标准曲线，计算微针上目标蛋白GP的含量。3.2.1.3微针上抗原WesternBlot鉴定与定量为鉴定微针上包被的GP特异性，每一批包被的微针取三排溶解在200µL的PBS中，4℃过夜。取40µL溶解液并加入适量6×ProteinLoadingBuffer混合煮沸10分钟，至于冰面5分钟后备用。配置12%的SDS-PAGE胶进行电泳，加入蛋白Marker,样品蛋白，阳性对照和阴性对照上样，80V电泳20分钟后，调整电压至120V，直至溴酚蓝跑出电泳胶。将SDS-PAGE凝胶、CV膜和厚滤纸浸泡于转膜液中平衡5分钟，按厚滤纸-SDS-PAGE凝胶-CV膜-厚滤纸的顺序由转膜仪负极向正极依次放好，接通电源，10V转膜1小时。取出CV膜，用0.1%PBST冲洗，使用5%脱脂奶粉PBST溶液室温封闭1小时。封闭后，用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟后，按1：500将免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清稀释于2%BSA中，作为一抗，4℃孵育过夜。第二天，用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟后，按1：4000将HRP标记的羊抗鼠IgG二抗稀释于5%脱脂奶粉PBST溶液中，室温孵育1小时。用0.1%PBST漂洗3次，每次10分钟后，加入ECL底物作用于CV膜2分钟，于暗室内显影定影胶片。3.2.2微针免疫EBOVGP亚单位疫苗的小鼠实验3.2.2.1免疫计划6-8周龄的BalB/c雌性小鼠25只随机分成5组，每组5只。各组免疫计划如表3.1所示：表3.1两种GP亚单位疫苗进行MN和IM免疫计划分组情况Table3.1ThescheduleoftwoGPsubunitvaccinasimmunizedbyMNandIM组别免疫方式免疫抗原与剂量GP0-MN微针MayingaGP5µg/只GP0-IM注射器MayingaGP5µg/只GP-MN微针MakonaGP5µg/只GP-IM注射器MakonaGP5µg/只Control无无免疫时间与采血时间如下图所示：第0周第4周首次免疫加强免疫第2周第6周第20周第一次采血第二次采血第三次采血图3.2微针免疫GP亚单位疫苗及采血时间轴Fig.3.2ThetimelineofGPsubunitvaccineimmunizationandbloodcollection25 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价3.2.2.2免疫小鼠GP0-MN与GP-MN小组的小鼠需进行腹部脱毛。使用氯胺酮和甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉。氯胺酮使用量为100mg/kg，甲苯噻嗪使用量为0.5mg/kg。每只小鼠体重约20g，取适量麻醉剂稀释于PBS中，每只小鼠所需麻醉剂稀释液终体积为100µL，腹腔注射。待小鼠身体瘫软后，将小鼠按平躺姿势放好，取适量脱毛膏，涂抹于腹部，等待1分钟后，用打湿的厚纸巾将脱毛膏和腹部鼠毛一起擦拭清除。腹部脱毛完成后，取微针3片扎插在腹部脱毛区，扎插时须有明显刺破皮肤感。微针在小鼠腹部站立停留2分钟后，方可取下。待所有小鼠麻醉剂失去作用，眼球恢复红色后放回鼠笼。GP0-IM与GP-IM组的小鼠采用后腿肌肉注射免疫。按计划免疫量将抗原稀释于50µLPBS中，注射于小鼠单条后腿。Control小组的小鼠不进行任何操作。3.2.2.3免疫EBOVGP亚单位疫苗后小鼠血清收集使用颌下静脉血采集方法对小鼠采血。左手拇指、食指与中指将小鼠头部固定，无名指与小指将小鼠尾巴固定，暴露出颌下静脉，血管位于下颌骨后方咬肌边缘，右手持采血针，刺破颌下静脉丛血管，血液即流出，将血液收集于灭菌离心管中，编号备用。采血后的小鼠，用灭菌干棉球压迫止血后，放回原笼。收集的鲜血在37℃静置1小时，待血液凝固后，3000转/分钟离心10分钟，收集上清，保存于-20℃备用。3.2.3ELISA测定EBOVGP亚单位疫苗免疫后结合抗体效价血清样品中抗EBOVGP的IgG检测使用间接ELISA方法。先进行预实验摸索最佳抗原包被量和血清稀释度：将纯化鉴定无误的GP分别按0.1、0.5、1、2µg/ml稀释于包被液中，96孔ELISA板中每孔加入50µl，4℃静置过夜。第二天弃掉孔中包被液体，使用PBST清洗3遍，每孔加入200µl5%脱脂乳粉PBST溶液，37℃静置1小时封闭。弃掉孔中封闭液体，使用PBST清洗3遍，阳性血清和阴性血清样品稀释于2%BSAPBST溶液，以1：100作为起始浓度，3倍倍比稀释至1：900，每孔50µl，室温孵育2小时。弃掉孔中一抗稀释液，使用PBST清洗3遍，加入稀释于2%BSAPBST溶液的HRP标记山羊抗小鼠二抗，稀释比例1：4000，37℃孵育1小时。使用PBST清洗3遍，每孔加入50µlTMB显色液，显色5分钟，每孔加入50µl0.2mol/LHCl终止液。终止后于酶标仪波长450nm测量各孔吸光值。比较阳性样品OD值/阴性样品OD值，其值最大的孔所对应的抗原包被量和血清稀释度为最佳条件。最终确定纯化的抗原以1µg/ml的浓度，50µl的剂量包被于ELISA板，IgG标准品起始量为5ng/孔，血清样品以1：100作为起始检测浓度。检测血清样品中抗GP的IgG含量与预实验方法一致，包被抗原时在同一块ELISA板上包被小鼠待检测抗体型IgG的标准品，通过IgG标准曲线计算出各血清样品IgG免疫后水平。3.2.4中和试验测定EBOVGP亚单位疫苗免疫后中和抗体效价3.2.4.1埃博拉假病毒的制备将表达EBOVMakonaGP、MayingaGP的pCAGGS质粒与构建假病毒的骨架质粒SG3使用FuGENE®HD转染试剂共转染于汇合度约70%的293T细胞，置于5％CO2、37℃培养箱培养。26 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价24小时和48小时后，收集上清，1000×g离心5分钟去细胞碎片，取上清，400µl每离心管分装，冻存于-80℃备用。在原细胞上加入等量的10%FBSDMEM，置于5％CO2、37℃培养箱培养。再过24小时后，收集上清，1000×g离心5分钟去细胞碎片，取上清，400µl每离心管分装，冻存于-80℃备用。3.2.4.2细胞染色测定埃博拉假病毒的病毒滴度JC53细胞为可以表达CD4、CCR5，使其对HIV为骨架的假病毒敏感。JC53细胞基因中还含有β-半乳糖苷酶基因及荧光素酶基因。这两个基因在HIVTat蛋白存在的情况下，可诱导表达。β-半乳糖苷酶可将X-gal分解为蓝色，感染了假病毒的细胞则可在镜下着色后计数；荧光素酶基因可通过仪器测定表达含量。两种方法都可以对感染了假病毒的细胞进行精确计数。将JC53细胞提前一天铺种于96孔细胞培养板中，细胞密度1.5-2×104孔，置于5％CO2、37℃培养箱培养。第二天将假病毒融化，加入到铺种好的细胞孔中。第一孔50µl假病毒，按3倍倍比稀释分别加入到第二孔等，设无假病毒细胞对照。将细胞打孔剂DEAE-Dextron稀释于2%FBSDMED维持液，加入细胞，每孔50µl，DEAE-Dextron终浓度40µg/ml。置于5％CO2、37℃培养箱培养48小时。48小时后，弃上清，PBS清洗一遍，加入50µl细胞固定液，室温静置10分钟，弃掉固定液，PBS洗三遍，加入50µl细胞染色液，37℃孵育1小时。弃掉染色液，PBS洗三遍，另加入50µlPBS保持细胞湿润，直接在倒置显微镜下计数染色细胞，计算病毒滴度。3.2.4.3荧光素酶定量测定埃博拉假病毒的病毒滴度将JC53细胞提前一天铺种于96孔细胞培养板中，细胞密度1.5-2×104孔，置于5％CO2、37℃培养箱培养。第二天将假病毒融化，加入到铺种好的细胞孔中。第一孔50µl假病毒，按3倍倍比稀释分别加入到第二孔等，设无假病毒细胞对照。将细胞打孔剂DEAE-Dextron稀释于2%FBSDMED维持液，加入细胞，每孔50µl，DEAE-Dextron终浓度40µg/ml。置于5％CO2、37℃培养箱培养48小时。48小时后，弃上清，PBS清洗一遍，加入50µl1×Reporterlysisbuffer，置于-80℃冷冻，再置于室温融化，共冻融三次后，使用荧光素酶定量仪测定各孔荧光素酶含量，根据病毒对照与空白对照计算病毒滴度。3.2.4.4中和试验将实验血清样品于56℃灭活30分钟，包括待测血清、阳性血清和阴性血清。将JC53细胞提前一天铺种于96孔细胞培养板中，细胞密度1.5-2×104孔，置于5％CO2、37℃培养箱培。将待测血清、阳性血清和阴性血清样品稀释于无FBSDMED中，以1：100作为起始浓度，进行3倍倍比稀释。再将测好病毒滴度的假病毒按MOI=0.1稀释于无FBSDMED中。50µl稀释好的血清与50µl稀释好的假病毒液混合在一起，另设置无血清的假病毒对照和DMEM对照，在无菌条件下，于37℃孵育1小时。取前一天铺种好的JC53细胞板，弃细胞培养液，加入已孵育1小时的血清与假病毒混合液，共100µl。将细胞打孔剂DEAE-Dextron稀释于6%FBSDMED维持液，加入细胞，每孔50µl，DEAE-Dextron终浓度40µg/ml。置于5％CO2、37℃培养箱培养48小时。48小时后，弃上清，PBS清洗一遍，加入50µl1×Reporterlysisbuffer，置于-80℃冷冻，27 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价再置于室温融化，共冻融三次后，使用荧光素酶定量仪测定各孔荧光素酶含量。在阴阳性对照读值的参照下，以最少抑制50%病毒的血清稀释倍数作为血清样品的中和抗体效价。3.2.5免疫含佐剂Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗后小鼠致死性攻毒试验3.2.5.1免疫计划及攻毒试验6-8周龄的BalB/c雌性小鼠25只随机分成5组，每组5只。各组免疫计划如表3.2所示：表3.2含Matrix-M的MakonaGP亚单位疫苗MN和IM免疫计划分组情况Table3.2ThescheduleofMakonaGPsubunitvaccinawithorwithoutMatrix-MimmunizedbyMNandIM编码免疫方式免疫抗原与剂量GP-MN微针MakonaGP5µg/只GP-IM注射器MakonaGP5µg/只GPadj-MN微针MakonaGP5µg+Matrix-M5µg/只GPadj-IM注射器MakonaGP5µg+Matrix-M5µg/只Control无无免疫时间与采血时间如下图所示：第0周第4周第12周首次免疫加强免疫致死性攻毒第2周第6周第一次采血第二次采血图3.3含Matrix-M的EBOVGP亚单位疫苗免疫、采血及攻毒时间轴Fig.3.3ThetimelineofGPsubunitvaccinewithMatrix-Mimmunizationandbloodcollection3.2.5.2免疫小鼠使用与3.2.4.2同样的方法，将需要进行微针免疫的GP-MN与GPadj-MN组的小鼠需进行腹部脱毛。小鼠完全麻醉后，取微针扎插在腹部脱毛区，停留2分钟后取下。待所有小鼠麻醉剂失去作用，眼球恢复红色后放回鼠笼。GP-IM与GPadj-IM组的小鼠采用后腿肌肉注射免疫。按计划免疫量将抗原稀释于50µLPBS中，注射于小鼠单条后腿。Control组小鼠不进行任何操作。3.2.5.3免疫后小鼠血清收集使用颌下静脉血采集方法对小鼠采血。具体操作同3.2.2.3。收集的鲜血在37℃静置1小时，待血液凝固后，3000转/分钟离心10分钟，取血清存于-20℃保存备用。3.2.5.4对免疫GP亚单位疫苗后小鼠进行致死性EBOV攻毒适应于小鼠的MayingaEBOV在VeroE6细胞上增殖，于BSL-4实验室中测定病毒滴度。小鼠免疫后转移到BLS-4实验室，经过4周的适应期后，对小鼠进行致死性MayingaEBOV攻毒，28 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价攻毒剂量为103个pfu，攻毒方式为腹腔注射。攻毒后，每天监测小鼠的体重变化、疾病症状并进行临床评分，及时记录死亡情况，观察直到第36天，对存活下来的小鼠进行安乐死。发病死亡和安乐死的小鼠均进行无害化处理。3.2.5.5ELISA评价EBOVGP与Matrix-M免疫小鼠后结合抗体效价血清样品中抗EBOVGP的IgG、IgG1和IgG2a检测使用间接ELISA方法。先进行预实验摸索最佳抗原包被量和血清稀释度，具体操作同3.2.3。最终确定纯化的抗原以1µg/ml的浓度，50µl的剂量包被于ELISA板，IgG标准品起始量为5ng/孔，IgG1和IgG2a标准品起始量为10ng/孔，血清样品以1：100作为起始检测浓度。检测血清样品中抗GP的IgG、IgG1和IgG2a含量与预实验方法一致，包被抗原时，在同一块ELISA板上包被小鼠待检测抗体型IgG、IgG1或IgG2a对应标准品，制定标准曲线，并计算出各血清样品IgG、IgG1或IgG2a免疫后水平。3.2.5.6中和试验测定EBOVGP与Matrix-M免疫小鼠后中和抗体效价分别使用MakonaGP、MayingaGP、MayingaGP-MD三种埃博拉假病毒进行中和试验。具体步骤同3.2.4。3.3实验结果3.3.1定量ELISA测定微针的包被抗原量为对包被于微针上的抗原进行定量，将微针溶解于PBS中，作为抗原包被于ELISA96孔板中，使用免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，于酶标仪450nm读数，制作GP0标准曲线，计算微针上抗原GP0的含量（图3.4）：图3.4GP0标准曲线及GP0-MN在标准曲线上的各点Fig.3.4ThestandardcurveofGP0andquatitativeELISAofGP0coatedonMN使用同样的方法对包被于微针上的抗原进行定量，将微针溶解于PBS中，作为抗原包被于ELISA96孔板中，使用免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，于酶标仪450nm读数，制作GP标准曲线，计算微针上抗原GP的量（图3.5）：29 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价图3.5GP标准曲线及GP-MN在标准曲线上的各点Fig.3.5ThestandardcurveofGPandquatitativeELISAofGPcoatedonMN3.3.2WesternBlot测定微针的包被抗原量为对包被于微针上的抗原进行定量，将微针溶解于PBS中，制备成蛋白样品，与标准量GP0或GP共同进行SDS-PAGE电泳，详细步骤见3.2.1.3。WesternBlot鉴定，使用免疫过EBOVGPDNA的小鼠血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，结果如图3.6所示：图3.6GP0与GP包被在MN上WesternBlot定量图Fig.3.6CharacterizationofGP0andGPcoatedonMNbywesternblot3.3.3EBOVGP亚单位疫苗微针免疫BABL/c小鼠诱导效价高且持久的抗体3.3.3.1首次免疫后微针可诱导更高水平的IgG为了评价EBOVGP亚单位疫苗对小鼠的免疫效力，分别使用微针免疫和肌肉注射两种途径免疫接种小鼠，每组5只，接种剂量和途径见3.2.2.1。接种后按图3.2的计划按时采集、分离小鼠血清，测定免疫后抗体IgG水平。由于免疫两种EBOVGP亚单位疫苗，因此分别对两种蛋白进行抗体水平评价。首次免疫后，4组免疫小鼠均产生针对GP0的抗体IgG。使用1wayANOVA方法进行数据统计分析，该组实30 中国农业科学院博士学位论文第三章微针免疫EBOVGP亚单位疫苗效果评价验数据差异具有极显著性（p<0.0001），具有统计学意义。其中，GP0-MN组产生的抗GP0IgG最高，约为15ng/ml，较GP0-IM组、GP-IM组和Control组抗GP0IgG水平差异均具有极显著性（P<0.001）；GP-MN组产生的抗GP0IgG水平次之，约为8ng/ml，与GP0-MN组比较，IgG水平差异具有显著性（0.01
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