新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测

《新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

河南农业大学学术硕士学位论文题目新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测学位申请人姓名张伟强导师姓名陈丽颖教授学科专业预防兽医学研究方向动物分子病毒学与分子免疫学中国郑州年月 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书新城疫病毒ＨＮ蛋白的可溶性超表达与学位件肺＋ＩＩ如Ｉ免疫活性检测測艾迹目■张伟强预防兽医学陈Ｍ颖教授ＩＩＩ贵２署否如需保密，解密时间年月ｎ２若置＾独创性声明本人呈交论文是在导师指导Ｋ进行的研究工作及取得研究成果，除了文ｌｉｌ标注和致谢的地方外中特别加，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教巧机构的学位或证书而使用一过的材料。与我同工作的同志对本研究所做的，指导教师对此进行了审定任何贡献均已在论文中做了明确的说明。，并表示了谢意特此声明。研究生签名：泼端蓮导师溢名：庐唯从ｎ期〇＾＾月於＂Ｒ期：巧口：；ｗ铅《月円学位论文使用授权及知识产权归属承诺、必本人完全了解河南农业大学关于保存使用学位论文的规定，即学生须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交惟文、的印刷本和电子版本，并提供目录检索和阀览服务，可ｔｉｌ采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可ＵＡ用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。，业本人完全了解《河南农业大学知识产权》的有关规定毕保护办法在一署农业，就在的科表的所有论文，校期间从事研工作发第离开河南大学后、原始数据、归名单位为河南农业大学，试验材料申报的专利等知巧产权均，承担相应责任。河南农业大学所有则的法律，否注书。；保密学位论文在解密后适用于本授权签明研究生签导师證名学院领导名奉名旅命避（＝：必円月年Ｒ斯２ｃ年円期円期月日：冷《月？ 分类号密级河南农业大学学术硕士学位论文论文题目:新城疫病毒HN蛋白的可溶性超表达与免疫活性检测英文题目:SolubleoverexpressionandfunctionalidentificationoftheNDVHNprotein学位申请人：张伟强导师：陈丽颖教授专业：预防兽医学研究方向：动物分子病毒学与分子免疫学论文提交学位授予日期：日期： 致谢光阴似箭，岁月如梭，转眼间三年的研究生时光已如过眼云烟般匆匆而过，站在毕业的门槛上，回想起三年来的点点滴滴，我思绪万千，感慨万分。本论文是在导师陈丽颖教授和郭豫杰讲师的悉心指导下完成的。导师渊博的知识、精益求精的治学作风、诲人不倦的高尚师德、严谨的治学态度和高度的敬业精神深深地感染和激励着我。从论文选题、实验设计到论文的顺利完成，无不蕴含着导师的心血。值此论文完成之际，谨向尊敬的导师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！衷心感谢导师组宋长绪研究员、许兰菊教授、夏平安教授、陈陆教授、李新生副教授、菅复春副教授，杨霞副教授和常洪涛老师在完成学习任务和课题研究中对我的指导、帮助和大力支持！衷心感谢师兄秦运杰、刘中原、刘肖、张留君和师姐李英英、邵刘云、李娜娜、张秀方、王冬梅、杜东颖等在实验过程中给予的帮助和指导！衷心感谢三年来一直相互帮助、相互鼓励、一起探讨、共同进步的冯亚琼、李赛赛、卢彩景、郝俊芳、冯艳红、崔春晓、关艳静、宋爽、温丙言、舒俊超、孔江南等牧医工程学院2013级全体研究生们！有他们相伴，我的实验课题才能顺利的完成！衷心感谢师妹郭珍珍、刘玲玲、郭玉堃、张莹莹、和春昊、赵娣、马思续、张涵、冯延和师弟朱文明、郭嘉、刘起涛、申欢、陈磊、曾磊等对实验的顺利进行提供的大力帮助！衷心感谢院党总支、院办公室、院团委的各位领导和老师对我的鼓励和支持！感谢河南农业大学为我的成长和学习提供的优美环境和良好平台！再次衷心的感谢曾经给予我指导和帮助的全体老师！特别感谢辛勤抚育我成长，鼎力支持我学习的父母及亲人！他们的理解和支持使我在学校能够专心的完成学业。感谢在生活上给予我支持的亲朋好友，有他们的鼎力帮助我才能顺利的完成学业！最后，真心感谢所有引导我、帮助我、陪伴我成长的人！ 目录中文摘要·····································································1常用缩略词···································································31文献综述···································································41.1新城疫病毒的概述······················································41.1.1NDV形态特征与理化特性··········································41.1.2NDV的基因组特性················································41.1.3NDV的致病性····················································51.1.4ND的流行病学···················································61.2新城疫检测方法的研究··················································61.2.1临床症状和病理变化检测··········································71.2.2血清学诊断······················································71.2.3分子生物学诊断··················································81.3HN蛋白的研究进展·····················································91.3.1HN蛋白的结构···················································91.3.2HN蛋白的功能···················································101.3.3HN蛋白的应用··················································111.4融合标签·····························································121.4.1融合标签技术···················································121.4.2融合标签的特点·················································131.4.3载体上的标签···················································141.4.3.1His标签···················································141.4.3.2Grifin标签·················································141.4.3.3GST标签··················································141.4.3.4MBP标签··················································141.4.3.5NusA标签·················································151.4.3.6SUMO标签················································151.4.3.7Thioredoxin标签············································161.4.3.8proteinG标签···············································16 1.4.3.9γ-crystallin标签·············································161.4.3.10ArsC标签·················································161.4.3.11PpiB标签·················································162材料·······································································162.1质粒和菌株···························································172.2实验动物·····························································172.3主要仪器·····························································172.4主要试剂·····························································172.5常规溶液的配制·······················································173方法·······································································213.1目的基因和引物的合成·················································213.2重组表达载体的构建···················································213.2.1标签载体的构建··················································213.2.2大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备（CaCl2法）·················223.2.3重组质粒的转化················································233.2.4重组表达载体的构建··············································233.3重组质粒的鉴定·······················································243.3.1菌液PCR鉴定···················································243.3.2双酶切鉴定······················································243.4序列测定·····························································253.5重组HN蛋白诱导条件的优化············································253.5.1最佳IPTG诱导浓度的确定········································253.5.2最佳诱导温度的确定··············································253.5.3最佳Amp浓度的确定·············································253.5.4最佳诱导时间的确定··············································253.5.5最佳培养基的确定················································263.6重组HN蛋白表达量的鉴定·············································263.7重组HN蛋白的纯化···················································263.8重组HN蛋白形态学分析···············································27 3.9重组HN蛋白的免疫活性检测···········································273.9.1Westernblot检测·················································273.9.2间接ELISA检测·················································284结果与分析································································284.1重组表达载体的构建···················································284.1.1标签质粒和pET21b的双酶········································284.1.2目的基因与pET的双酶切·········································294.2重组质粒的鉴定·······················································294.2.1菌液PCR鉴定···················································294.2.2双酶切鉴定······················································294.3重组HN蛋白诱导条件的优化···········································304.4重组HN蛋白表达量的鉴定·············································314.5重组HN蛋白的纯化···················································324.6重组HN蛋白形态学分析···············································324.7重组HN蛋白免疫活性检测·············································334.7.1Westernblot检测·················································334.7.2间接ELISA检测·················································335讨论·······································································34全文总结····································································35参考文献····································································36英文摘要····································································45 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文摘要新城疫（Newcastledisease,ND）被称为亚洲鸡瘟或者伪鸡瘟。是由新城疫病毒（NDV）引起的急性高度接触性传染病。目前，新城疫在我国仍然十分流行，给我国的养禽业带来了巨大的经济损失，严重威胁我国养禽业的发展，故新城疫的防治十分重要。在我国主要以疫苗接种来防控该病的蔓延，使用传统疫苗可以预防新城疫，但与传统疫苗相比，将NDV基因组中一个或多个保护性抗原在原核或真核细胞中表达从而制备成亚单位疫苗更具有安全性能高、稳定性好、易于批量生产及生产成本低等优点。ND亚单位疫苗的制备主要以病毒囊膜表面的致病性糖蛋白为主。近年来新城疫亚单位疫苗的研究热点仍以HN蛋白为主，它与病毒的致病性和免疫原性密切相关，是决定病毒毒力的重要因素。而大量制备HN蛋白主要以大肠杆菌表达系统为主，大肠杆菌作为外源蛋白表达系统具有培养所需碳源价格便宜、细胞生长迅速和易于规模化培养等优点。然而，目前在大肠杆菌中高效表达可溶性外源蛋白还比较困难。有研究表明，在大肠杆菌表达系统中，采用融合标签与目的基因一起进行融合表达可以提高目的蛋白的可溶性表达量，然而，目前没有一个标签可以促进所有目的蛋白的可溶性表达。本试验采用融合表达的方法将人工合成的HN-SF基因分别与Grifin、GST、MBP、NusA、SUMO、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB这10种融合标签基因采用柔性接头进行连接，构建10个重组表达载体，经菌液PCR鉴定、双酶切鉴定及测序正确后，将这10个重组表达载体分别转入大肠杆菌BL21中，用不同条件进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，并用生物软件ImageJ分析并选出最佳诱导蛋白表达的条件，筛选出能够显著促进重组HN蛋白可溶性表达的标签。为了消除标签自身大小对表达量的影响，采用Westernblot对所表达蛋白的含量进行定量分析。同时检测纯化的重组HN蛋白能否形成衣壳样纳米颗粒，用透射式电子显微镜观察其形态结构，纯化的重组HN蛋白用免疫印迹和间接ELISA检测其免疫活性。结果表明，成功将合成的HN-SF基因连接到带有标签的10个表达载体上，经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确，表明成功构建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-NusA-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-ProteinG-TEV-HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-ArsC-TEV-HN-SF、6×His-PpiB-TEV-HN-SF的10个表达载体。用不同的条件进行诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测并用生物软件选出最佳诱导重组HN蛋白表达的条件为：诱导温度为16℃、IPTG的浓度为0.4mmol/L、Amp的浓度为200µg/mL和LB液体培养基培养。在最佳诱导条件下显示：10个重组表达载体中只有N-端连接ProteinG标签没有检测到目的蛋白的表达，其余9个重组载体都有目的蛋白的表达。用ImageJ软件对可溶性表达量进行定量分析表明，pET3-HN可溶性表达量最高（62.7%），1 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文其次分别为pET2-HN（42.2%）、pET5-HN（40.8%）、pET6-HN（40.4%）、pET1-HN（39.5%）、pET7-HN（36.0%）、pET10-HN（27.3%）、pET9-HN（26.8%）、pET4-HN（5.2%）。筛选出融合标签MBP能够有效促进HN蛋白可溶性表达。为了消除标签自身大小对表达量的影响，选出可溶性表达量最高的两组（GST组和MBP组），用抗His标签的抗体对其可溶性表达量进行定量分析，Westernblot结果表明最佳融合标签是MBP标签。随后对重组HN蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析无其它杂带，表明纯化的蛋白纯度高，用超滤管浓缩纯化产物，其浓度达到1.6mg/mL；在透射电子显微镜下观察重组HN蛋白能组装成衣壳样纳米颗粒的结构，经Westernblot和间接ELISA检测分析表明截短表达的重组HN蛋白主要抗原区域具有良好的反应性与特异性，显示出良好的应用前景。融合标签MBP能显著提高HN蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量，为解决HN蛋白不可溶性表达和可溶性表达量低这一难题提供了新的方法和思路，同时为研究NDV的作用机制、有效疫苗的研制及诊断试剂的研制和开发奠定了基础，且对病毒性疾病的防治提供了参考依据。关键词:新城疫；血凝素-神经氨酸酶；柔性接头；可溶性超表达；融合标签；疫苗；诊断试剂2 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文常用缩略词HNHemagglutinin-Neuraminidase血凝素神经氨酸酶HAHemagglutinin血凝素NANeuraminidase神经氨酸酶OIEOfficeofInternationalEpizootics世界动物卫生组织ORFOpenreadingframes开放性阅读框SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis丙烯酰胺凝胶电泳ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附分析NDVNewcastlediseasevirus新城疫病毒mRNAMessageRNA信使RNAcDNAComplementaryDNA与RNA互补的DNADNADeosyribonucleotideacid脱氧核糖核酸BpBasepair(s)碱基对RNARibonucleotide核糖核酸mLMilliliter毫升LBLuriaBertantMidiumLB细菌培养基AmpAmpicillin氨苄青霉素PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应ddH2ODoubleDustilledWater双蒸水IPTGIsopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷ODOpticaldensity光密度值PBSPhosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PBSTPhosphatebufferedsalineTween-20洗涤液BSABovineserumalbumin小牛血清白蛋白NCNitrocellulose硝酸纤维素PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SPFSpecificpathogenFree无特定病原体动物FFusionprotein融合蛋白3 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文1文献综述1.1新城疫病毒的概述新城疫（Newcastledisease,ND）又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，其病原新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员，为有囊膜的单链、不分节段的负极性RNA病毒[1]，引起鸡和火鸡高度接触性、烈性、急性传染病，常呈败血症经过。该病主要以呼吸困难、高热、神经紊乱、下痢、黏膜和浆膜出血为特征，是严重危害养禽业的一种禽类传染病[2,3]。OIE（世界动物卫生组织）将该病归为A类传染性疾病，我国将该病列为一类动物疾病。新城疫在我国仍然广泛流行，给我国的养禽业带来了巨大的经济损失，制约着我国养鸡业的发展以及禽类产品的出口，严重威胁养禽业的发展，同时对人类健康以及食品安全也存在着潜在的危害，故新城疫的预防和控制是当前急待解决的问题[4,5]。1.1.1NDV形态特征与理化特性NDV由核酸、核衣壳和囊膜组成，完整病毒颗粒呈现近似圆球形，直径为120~250nm，颗粒呈多边性，有不同长度的细丝。在囊膜的外层呈现放射状排列的突起物或称为纤突，长度约为8nm，内含有核衣壳，纤突有HN和F两种糖蛋白，刺激宿主产生具有抑制红细胞的凝集素和病毒中和抗体的抗原成分[6]。NDV的核酸由单股、负链、不分节段的RNA构成，分子量约占病毒粒子总质量的0.5％。此外，病毒粒子约有6％（w/w）的碳水化合物和约有20~25％（w/w）的脂质来源于受感染的宿主细胞。在蔗糖中病毒颗粒的密度为1.18~1.20g/ML[7]。病毒对外界环境的抵抗力较强，阳光需直射30min才能失去感染力，真空冻干病毒在30℃，可以存活30d，37℃可存活7~9d；55℃作用45min或60℃作用30min均可将其灭活[8]。病毒在4℃环境内可以存放几周，在-20℃环境可以存放几个月或在-80℃环境中可以存放数年，其感染力均不受很大的影响。在ND暴发控制后1~8周内，仍可在鸡舍、蛋巢、鸡蛋和羽毛中分离出病毒。病毒对化学试剂比较敏感。如NDV具有囊膜，对化学溶剂脂类、氯仿和乙醚很敏感；大多数去污剂也能将其迅速灭活；2%氢氧化钠、5%漂白粉、70%的酒精在20min即可将NDV灭活；3%~5%来苏尔、苯酚和甲酚5min内可将裸露的病毒粒子丧失感染力；在37℃的孵育器内，用0.1%福尔马林熏蒸6h便可将其灭活。它对pH很稳定，pH3~10不易被破坏。1.1.2基因组特性NDV是单股负链RNA病毒，基因组分子量约为5.6×106Da[9-13]。它有6个结构基因：NP、P、M、F、HN和L，分别编码核衣壳蛋白（NP）、磷酸化蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素神经氨酸酶（HN）和大分子量的RNA聚合酶（L）,基因组序列为：5’-L-HN-M-F-P-NP-3’[14,15]。所有NDV毒株的L、P和NP蛋白分子结构大部分都一样，而F蛋白和HN蛋白的氨基酸在不同毒株间差异性比较大，研究表明F和HN蛋白氨基酸差4 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文异性越大，其毒力差异也就越明显，因此F和HN蛋白是决定NDV抗原性强弱最为相关的两种糖蛋白。NDV和别的基因组为单股RNA的副黏病毒一样，含有一个位于3’端的启动子，基因组沉降系数为50s，病毒感染细胞后，在胞浆中产生三组mRNA，其指导沉降系数分别为35s、22s和18s[15,16]。其中，18smRNA含有编码除L蛋白外的其它五种蛋白的特异性mRNA片段；35smRNA是单一的特异mRNA片段，只编码L蛋白。Northern杂交验证表明，35s和18smRNA包含了NDV基因组的全部编码信息，而22s和18smRNA的编码区域有交叉的编码信息，这表明22smRNA可能与18smRNA有共同的共价连接产物。虽然22smRNA不含特异性片断，但转录产物与18smRNA转录产物十分相似，大多数代表顺反子信息。病毒基因组几乎全部参与上述六种蛋白的mRNA的转录，各基因组间均有一个保守序列3’-GAA。NDVmRNA的转录大部分是以A开始的，除L蛋白mRNA起始信号为3’-UGGCCAUCCU-5’外，其它5种mRNA之间均有一个保守的起始信号3’-UGGCCAUCUU-5’，又都以与mRNA互补的一个保守的多聚腺苷酸信号(PolyA)-信号N2为终止信号，即3’-UGGCCAUCUU-5’。mRNA的起始信号与N2信号之间的距离不等，通常在1~47个核苷酸之间[17]。此外，在大分子蛋白基因和血凝素神经氨酸酶基因的起始端分别还有一个41~50个核苷酸的小开放阅读框[18]。1.1.3NDV的致病性从分子流行病学可以将禽副粘病毒分为9个血清型，PMV-1至PMV-9。由于NDV所有分离株均表现出相同的抗原性，因此认为NDV只有一种血清型，属于禽副粘病毒Ⅰ型（PMV-1）。但从家禽和其它鸟类分离的病毒PMV-3与PMV-1有免疫交叉反应，证明NDV毒株间有抗原差异性。在病禽体内的所有组织、器官、体液和排泄物中，含毒量最高的器官是脑，肺和脾，含毒时间最长的是骨髓。从各个省份鸡群中分离到的NDV，对鸡的致病性有明显的区域差异性，根据感染鸡表现的症状不同，可以将NDV毒力分为以下几种致病类型：①强毒型毒株或速发型，易引起各个年龄阶段鸡的急性致死性感染；②中毒型毒株或中发型，可引起易感染的幼龄雏鸡的呼吸道和神经紊乱症状，造成致死性感染；③低毒型或无毒型即缓发型，表现出轻微温和的呼吸道感染或无症状肠道感染，不会造成大量死亡。目前，依据OIE提供的经典毒力致病性的测定指标，NDV的毒力分型必须要进行生物学试验测定3个致病性指数，依据1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI），鸡胚平均死亡时间（MDT）和6周龄鸡静脉注射致病指数（IVPI）来判定病毒毒力的强弱（表1）。由于一种指标数很难确定毒力的强弱，应该结合3种指数进行综合判断，欧洲国家药典有明文法律规定：当ICPI≥0.7时，即可判定NDV是强毒株，因此ICPI值对于判定毒株强弱是非常重要的。5 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文表1新城疫病毒毒力指标Table1VirulencemarkerofNDVstrains试验方法缓发型毒株中发型毒株速发型毒株MethodLentogenicMesogenicVelogenic接种HA在24以上的新鲜感染尿囊液于1日龄雏鸡脑内，用等渗无菌0.0-0.51.0-1.51.5-2.0盐水作1:10稀释，每只鸡接种50µl后的致病指数（ICPI）6周龄鸡静脉注射致病指数（IVPI）0.000.0-0.52.0-3.0最小致死量接种于10日龄雏鸡胚，＞9061-90≤60引起鸡胚死亡的平均时间（小时，MDT）病毒对红细胞凝集解脱的时间快快慢红细胞凝集素时的耐热时间（56℃，5515-20分钟）1.1.4ND流行病学禽类对本病都有易感性，主要侵害家禽和野生禽类。不同年龄阶段的鸡，对该病毒的易感性也有很大的差异，幼雏和中雏易感性最高，成年鸡易感性比较低。水禽（鸭、鹅）对本病有抵抗力，但研究表明水禽可以是该病毒的携带者。从鹦鹉、猫头鹰、鸵鸟、麻雀、白鸽、乌鸦、孔雀等241个物种中能分离到该病毒。近年来在我国出现对鹅、鹌鹑和鸽子也具有强烈致病力的NDV，表明NDV病毒扩大了侵染宿主的范围，这值得我们去防范该病。同时有研究表明NDV出现跨种间传播，例如哺乳动物人感染后表现出结膜炎或类似流感的症状。本病的主要传染源是病鸡以及排毒鸡，但对排毒的鸟类也不可忽视。受感染的鸡在出现临床症状前，其口腔、鼻分泌物和粪便中已能排出大量的病毒。在流行结束后的带毒鸡，常呈慢性经过，保留这种慢性带毒病鸡，是造成该病持续流行的主要原因。本病主要的传播途径是呼吸道和消化道，也可以通过带毒的鸡蛋而传播本病。创伤及带毒交配也可引起传染，非易感的宿主如飞禽、野禽、外寄生虫均可机械地传播ND病原。本病一年四季均可发生，但多数以春秋两季比较频繁，还取决于不同季节中新鸡更换的频率，周围鸡群流行情况和适于病毒传播的外界环境条件。近几年来，由于免疫程序不规范、药物的滥用或其它免疫抑制性疾病的发生，ND抗体水平不足以保护自身，常产生一系列不良的后果，如代谢病、并发病和继发病混杂感染，引起免疫鸡群发生非典型的症状和病变，还有一些病毒性疾病（如禽流感），它们与新城疫的临床症状极其相似，临床症状很难区分，增加了新城疫诊断的难度。研究表明一旦鸡群感染了NDV强毒，普通的疫苗免疫方法无法将其彻底清除，鸡群长6 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文期处于带毒状态，当鸡群免疫力降低的时，临床症状就会表现出来。1.2新城疫检测方法研究1.2.1临床症状和病理变化检测根据病程长短和临诊表现特征，NDV可以分为以下三种致病类型。最急性：鸡群无特征性症状，突然发病，发病迅速，死亡快，多见于幼龄雏鸡和疾病流行初期。急性：体温升高，食欲减退，甚至废绝，精神萎靡，蛋鸡停止产蛋或产畸形蛋。随着病情的发展，出现典型症状如呼吸困难，有粘液性鼻漏。嗉囊内含有大量酸臭液体内容物，倒提时常有大量内容物从口鼻中流出，粪便混有血液，稀薄如水，呈黄白色或黄绿色。亚急性或慢性：初期症状与急性类似，以后症状慢慢减轻，有时出现神经症状，动作失调，最终导致瘫痪或半瘫痪，成为带毒鸡，死亡率比较低。典型的病变为全身浆膜和黏膜卡他，充血、出血，胃肠出血和纤维素性肠炎[12,19]。但是由于新城疫毒株、宿主免疫力，环境和其它因素不同，临床症状和病理变化差异很大，缺乏可靠的临床诊断性，很难作出明确的诊断，只能作为初步诊断来参考，需要进行实验室检测才能确诊。1.2.2血清学诊断（1）血凝和血凝抑制试验由于NDV囊膜表面含有血凝素蛋白，可与红细胞表面受体相结合而发生凝集，又可在凝集反应过程中能够被NDV阳性血清所抑制，故常用HI和HA试验来定性或定量对分离的病毒及抗体进行诊断，在临床上具有重要的诊断意义。HI和HA试验过程比较简单方便、诊断迅速，灵敏度和准确性均高于微量法，也是实验室最常用于NDV的检测方法。（2）病毒中和试验中和试验是病毒与相对应特异性抗体相结合后，使病毒毒力减弱、甚至丧失对敏感动物或细胞的感染力。对于敏感的动物进行中和试验，由于存在个体差异、成本高、且有散播环境中病毒的危险，所以一般用培养的敏感细胞进行接种病毒进行试验，在显微镜下观察细胞是否出现病变，同时又能被相应特异性抗体所抑制来检测NDV。（3）酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)是把NDV主要保护性抗原或相应抗体包被在合适的载体上，加入酶标一抗或抗原，形成酶标记的抗原抗体免疫复合物，然后加入HRP标记的二抗，当反应一段时间后，加入终止液停止反应，通过比色测定，进而定量测出参与反应的抗原或抗体的含量。ELISA试验是目前应用最广泛、使用最多、发展最快的一种检测NDV抗原抗体的免疫检测技术，它具有敏感性好、特异性强、准确、操作简便、快速、稳定、抗原或抗体用量少和可以多次重复检测等优点。研究表明通过改进ELISA方法可以鉴别自然感染和以重组禽痘病毒表达NDVHN蛋白而制备成亚单位疫苗进行免疫的禽类，为能鉴别重组禽痘亚单位7 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文疫苗和活苗／灭活苗的免疫而产生的抗体奠定良好的基础[20]。（4）荧光抗体技术（IFA）荧光抗体技术是将荧光性涂料与特异性抗体蛋白相结合，制成荧光染料标记性抗体，荧光性抗体与抗原结合发生特异性抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，荧光染料标记在抗原抗体复合物上，在荧光显微镜下可观察到特定的荧光。该方法具有高敏感性、准确、速度快和操作简单，适用于快速诊断，为NDV的防控提供了快速的应对措施。1.2.3分子生物学诊断（1）反转录-聚合酶链式反应技术反转录-聚合酶链式反应技术又称RT-PCR技术，是一种选择性体外提取RNA病毒的核酸后，在反转录酶的作用下合成cDNA，以此为模板转录扩增合成DNA的过程，该法具有快速特异和操作简便等优点。不单适用于对鸡胚的检测，同时也适用于对病禽匀浆组织液的检测。同时它还可以检测判断出新城疫的致病类型。（2）核酸探针技术它是从分子杂交技术发展而来的，在获得已知病毒的特异性片段上标记放射性同位素或生物素作为探针，与病料的核酸进行碱基配对，如果待测核酸样品中有与探针互补的核酸序列，表明病料被特定病原体污染。由于它具有特异性好和灵敏度高，可以大量合成引物和探针，检测速度比较快，准确率高，同时还可避免向环境中散毒等优点，特别适合临床诊断和产品的进出口检疫。（3）基因芯片技术生物芯片技术是融合多种技术为一体的高新检测技术。其中以基因芯片应用范围最广，测序原理为：在一块基片表面固定大量设计好的已知序列的靶核苷酸，制备成芯片，用荧光标记物对经PCR扩增后的检测样品进行标记滴加在芯片上，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过洗涤后扫描，用图像显示杂交结果。通过确定荧光强度最强的探针位置，得到一组序列互补的序列。据此可重组出靶核酸的序列。同传统的核酸杂交技术相比较，基因芯片技术的突出优点可同时对大量的病料样品进行检测和分析，它具有无交叉反应性、准确率高、高特异性、样品需求量少、可重复性检测、稳定性好、费用低，弥补了传统核酸杂交技术的很多缺点，大大提高了检测效率。将生物芯片技术用于NDV疾病的诊断具有重大意义，为NDV的检测提供了一种新的方法思路，完全适用于NDV的大规模筛检和快速检测，有效解决了禽类及其产品出进口检疫问题。（4）胶体金免疫层析法胶体金免疫层析法（GI-CA)是近几年发展建立起来的利用免疫层析技术和胶体金技术相结合的一种免疫学快速检测诊断新技术，具有特异性强、灵敏高、简单、试纸条容易保存、快速直观和成本低等优点，近年来逐渐广泛应用于畜禽疾病诊断方面。高玲美等[21]用商品化的兔抗鸡二抗和纯化的兔抗鸡新城疫阳性血清包被在硝酸纤维素8 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文膜上分别作为质控线和检测线，建立了快速诊断鸡新城疫病毒的金标试纸条，结果表明此试纸条具有特异性强、稳定性高、准确率好和使用时简单方便等优点。戴荣四等[22]应用纯化的鸡新城疫阳性血清建立了鸡新城疫病毒抗原快速诊断试纸条，临床应用与HA结果符合率完全一致，此方法检测灵敏度高、特异强且速度快。李希友等[23]建立快速检测NDV胶体金试纸条，用制备的2株单克隆抗体分别作为包被蛋白和金标蛋白，试纸条特异性强、重复性好、稳定性强，试纸条在4℃能保存6个月、敏感性高于HA，同时与HA的符合率为95.8％。胶体金快速诊断试纸比传统的诊断方法更具有优势，其能准确及时的诊断，为疾病的防控和防治争取了大量的宝贵时间。1.3HN蛋白的研究进展1.3.1HN蛋白的结构统计NCBI上收录的HN蛋白的核酸序列，它的长度约为2.0kb，约占全基因组的13%~15%，含有一个长度约为1704bp~1851bp的ORF，编码的氨基酸有568~617个[24]。利用生物软件对收录的HN序列进行对比发现，尽管各毒株HN基因全长均约为2.0kb，但由于预测开放性阅性读框的长度和终止密码子的位置有差异，其翻译的多肽长度就有所不同。根据其多肽链长度大小把翻译出的HN蛋白分为三类：第一类为有生物活性的HN蛋白，编码的氨基酸约有568~572个，代表株为ITA/45，MIY/51、IBA/85、AUS/32，CHI/5和HER/33等；第二类也是有活性的HN蛋白，编码氨基酸为577个，代表株为B1/47、TEX/48、BAE/45和LAS/46等；第三类为无生物活性的前体HNo蛋白，编码氨基酸约为616~617个，主要是其C端有45个氨基酸的残基，需经水解酶酶切后才能转化成有生物活性的HN蛋白，代表株为QUE/66、ULS/65和D26/76等，以弱毒株为主。HN蛋白是NDV囊膜上重要的一种多功能糖蛋白，成熟的HN蛋白主要是四聚体寡聚糖蛋白，通过二硫键把亚单位相连形成二聚体，两个二聚体通过非共价二硫键相连形成四聚体[15]。HN蛋白靠近N末端是主要的疏水区，这表明HN蛋白是以N末端与NDV外膜相连接的。研究表明，靠近N末端的75个氨基酸残基中，第1-26个残基为胞质内区（尾部）；第27-48个残基是跨膜区（杆状部），其余为胞质外氨基酸（球形的头部）如图1所示。HN蛋白氨基酸的主要差异主要集中在N末端的第1-75位，76位到C末端的整个胞外区氨基酸的差异性比较小[24]。HN胞质区第4-26位氨基酸残基缺失时仍能在细胞内进行表达，除了促融作用减弱，其受体结合活性并没有改变。跨膜区和胞质区对HN蛋白四聚体结构的形成是必要的，缺失一个或者完全缺失，都只能形成没有完整结构的二聚体蛋白。HN蛋白的胞外区可以分成靠近囊膜的柄状区和尾端的球状区，球状区上分布了单克隆抗体识别的全部受体结合位点、抗原位点和NA活性位点。9 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文Fig.StrutureofNDVHNprotein图1NDVHN蛋白结构示意图血凝素神经氨酸酶蛋白和融合蛋白一样拥有较保守的半胱氨酸残基和糖基化位点。HN蛋白有6个潜在的糖基化位点[25]，其中有2个位点（508aa和538aa）保守性较差，其余4个位点(119aa、341aa、343aa、433aa、481aa)保守性比较好。糖基化对于HN转运至细胞表面的影响不是很大，但对NA的活性则是必需的[26]。通过对HN蛋白膜外区的氨基酸序列分析表明HN蛋白有12个完全保守的半胱氨酸(Cys)残基，分别位于172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531和542处，这些Cys残基对于HN蛋白的成熟是至关重要的。衡量HN糖蛋白成熟的标志是结构依赖性抗原表位的出现。McGinnes用免疫沉淀、免疫荧光、免疫印记和蔗糖梯度沉淀的方法对半胱氨酸残基突变的蛋白进行定性分析，不同Cys残基的突变则可阻断HN蛋白成熟过程中抗原表位的出现。如l72或196位点的突变，阻断23抗原位点的出现；而542或l86、238、247、251、531的突变，阻断所有位点的出现：半胱氨酸344、455、461或465突变阻断除除抗原位点4外的其它抗原位点的出现。此外，12个保守Cys突变为丝氨酸对HN蛋白的生物活性均有很大的影响。另外，HN蛋白还有两个半胱氨酸残基易变区，一个易变区是胞浆区的第6位氨基酸，另一个是在外功能区的第123位氨基酸，它们对二聚体的二硫化有很大的促进作用。为了探索这两个非保守区的结构和功能，对这两个位点进行单突变或双突变都极大地减弱了NA的活性、吸附和融合作用，HN蛋白形成了寡聚体，使得突变体的抗原位点也发生了改变。表明HN序列非保守区出现蛋白寡聚体时会影响蛋白的分子生物学功能[27,28]。1.3.2HN蛋白的功能血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）是位于新城疫病毒(NDV)囊膜表面的一种重要的多功能糖蛋白，约有570个氨基酸残基组成[3,29]。该多功能蛋白具有两种相关而又相拮抗的生物学功能：一种是神经氨酸酶(NA)能催化唾液酸的分解，另一种吸附破坏含唾液酸的受体(HA)(鸡红细胞的血凝现象)[30]。NDV在感染过程中，HN蛋白主要负责识别宿主靶细胞表面的唾液酸受体，并与之结合吸附宿主细胞受体上，启动感染过程，在病毒的组织嗜性上起决定性作用。NA活性是防止在病毒增殖期间病毒粒子发生自身凝集现象。这两种生物学活性在NDV侵染过程中起着识别细胞表面受体、介导病毒颗粒吸附宿主细胞膜上，启动感染过程和对新生的子代病毒粒子具有加工和促使子代病毒粒子从感染细胞膜表面播散出来，与病毒10 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文致病性和免疫原性紧密相关，是决定病毒毒力的重要因素之一[1,31,32]。另外，HN蛋白与宿主细胞受体结合后，通过与F蛋白之间的相互作用，具有极强特异性的促进F蛋白和细胞膜融合的功能，病毒外膜表面的F融合蛋白能与靶细胞膜融合，使病毒颗粒进入细胞浆脱去核衣壳而进行子代病毒的复制[15,33,34]。HN糖蛋白是NDV最重要的致病性和免疫原性抗原之一，在免疫应答和致病过程中起着极为重要的作用，与NDV的毒力和致病性密切相关[35,36]。HN蛋白与NDV的毒力有一定关系。作为病毒囊膜表面的暴露糖蛋白，HN经受多种选择压力的作用。在NDV的进化过程中，HN基因按一定的几率发生同义置换；在免疫选择压力下，HN蛋白也因点突变而导致抗原位点的变化。因此，HN基因的改变在一定程度上能代表NDV进化的规律和趋势。近年来新城疫亚单位疫苗的研究热点仍以HN蛋白为主，HN是诱导动物产生免疫保护的主要保护性抗原蛋白之一，有研究表明制备的HN单克隆抗体(MAb)可以通过阻断病毒颗粒吸附宿主细胞膜上的唾液酸受体，从而中和NDV的感染。因此，NDVHN蛋白可以作为保护性抗原制备亚单位疫苗，刺激机体产生抗体，预防NDV的感染与传播[31,37]。同时还可以与多种疾病的有效保护性抗原肽基因串联到一起，制备成一个含有多种抗原肽的蛋白，形成一种联合多肽疫苗，用于疾病的预防。最近研究表明NDV具有诱导干扰素大量生成、提高机体抗肿瘤免疫进而引起肿瘤细胞的凋亡等功效。研究认为NDV具有抗肿瘤作用机制与其表面的HN糖蛋白密切有关。肿瘤细胞表面的唾液酸含量比正常细胞要高很多，肿瘤细胞可以通过唾液酸化的表面来有效的抵御宿主机体的免疫防御，进而促使肿瘤细胞扩散。而HN蛋白介导NDV吸附于肿瘤细胞表面，通过体内的F蛋白促使NDV侵染肿瘤细胞，由于HN具有类似流感病毒NA的活性，而NA具有水解肿瘤细胞细胞表面糖蛋白末端唾液酸的功能，这样可使肿瘤细胞的生物识别位点暴露出来，增加肿瘤细胞的免疫原性，使免疫监视细胞更容易识别、捕获和杀伤肿瘤细胞。同时诱导外周血液单核淋巴细胞表面表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，诱导肿瘤细胞的凋亡。同时还发现HN蛋白具有增加肿瘤细胞对淋巴细胞的粘附力、刺激并激活淋巴细胞的活化等多种生物功能，进而导致肿瘤细胞的快速凋亡[38-40]。1.3.3HN蛋白的应用HN蛋白是位于NDV囊膜表面重要的糖蛋白，可以诱导动物机体产生特异性抗体，是有效的免疫保护性抗原蛋白之一。利用分子生物学和基因重组技术，对NDVHN保护性抗原基因进行改造，克隆至无毒的原核或真核表达载体上，导入到合适的表达菌中表达HN蛋白，进而制备成亚单位疫苗，与传统疫苗相比，将NDVHN保护性抗原制备成亚单位疫苗更具有安全性能高、无毒性、稳定性好、易于批量生产及生产成本低等优点。研究表明针对该重组HN蛋白的单克隆抗体(MAb)可以通过阻断病毒颗粒吸附细胞上的唾液酸受体，从而中和NDV的感染[41]。因此HN抗原性基因已成为研究ND基因工程疫苗的首选基因，把11 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文HN蛋白制备成亚单位疫苗用于鸡群的保护一直是防控ND疾病的热点，深受学者的研究、认知和应用。HN蛋白还可用于诊断试剂盒的研发，贾清研制出以HN蛋白作为检测线，建立了能快速检测鸡群ND抗体的胶体金快速检测试纸条[42]；张进良以AIV-HAl、NDV-HN、IBV-N、IBDV-VP2和MG-VIhA1.2重组蛋白作为捕获抗原，制备出胶体金快速检测试纸条[43]。该诊断试剂盒具有无交叉反应、高灵敏度、特异性强、操作简便、快速准确、无需任何仪器设备等优点，对于养禽场快速诊断及防控病毒性疾病具有重大意义。HN蛋白还可以用于NDV抗体的检测，由于HN蛋白具有凝集感染宿主的红细胞、吸附破坏唾液酸受体等生物学特征，由此建立的血凝抑制试验(HI)是国际最常用于检测NDV阳性抗体的标准方法，HI法虽没有ELISA方法灵敏高，但是HI操作步骤简单、方便，而且用于检测的NDV抗体不需要很高的纯度。另外，HN蛋白还具有抑制肿瘤细胞的生长和扩散，提高机体的非特异性和特异性细胞免疫、暴露肿瘤细胞的抗原表位，使免疫细胞容易识别和杀伤肿瘤细胞[44]。因此HN蛋白在大肠杆菌中可溶性超表达为后续新型疫苗的研究、诊断试剂的开发及新型抗癌药物研究奠定了基础。1.4融合标签1.4.1融合标签技术随着基因组学、生物分子信息学以及蛋白组学的快速发展，重组蛋白技术也日趋成熟，该技术己经广泛应用于生物工程和医药等领域。然而，大规模生产所需有生物活性的重组蛋白仍是该技术中的瓶颈问题，如蛋白表达量低、表达的蛋白多数以包涵体形式存在及稳定性差等[45]。使用真核表达体系表达重组蛋白有技术不成熟、周期长，过程复杂，成本高等缺点。由于原核系统表达重组蛋白技术比较成熟，特别是大肠杆菌这种常用的经典菌，表达系统比较清楚、培养时间短、可大规模表达、易于操作等优点，是目前最简单最经济表达重组蛋白的宿主菌，因此目前首选大肠杆菌为宿主菌来探索增加重组蛋白可溶性表达的方法。由于原核表达系统缺乏分子伴侣蛋白、内质网和高尔基体等用于蛋白正确折叠形成天然结构的关键元件，蛋白翻译和结构折叠效率也十分有限[46]，表达产物多数为低活性的包涵体。人们为此采用了很多的方法来提高重组蛋白的可溶性表达,比如降低诱导表达蛋白的温度、改变表达菌、改变启动子、改变诱导表达的条件、采用分子伴侣和折叠调节因子共表达系统。然而，改变这些条件还是没有解决目的蛋白的可溶性表达。包涵体蛋白是活性很低的蛋白，对后期蛋白的研究和应用是不利的，因此利用原核系统表达重组蛋白还有许多问题有待解决。20世纪末，融合标签技术的发现给重组蛋白的发展带来了新的希望。融合标签技术是一种基因重组DNA技术，原理是利用DNA重组技术在靶蛋白编码基因的3’端或5’端以柔性接头连接某种特定标签的编码基因，构建好重组表达载体，导入适宜的表达菌来表达重组蛋白质[47-52]，融合标签按照分子量大小可以分为两大类:蛋白质大分子和多肽小片段。融合12 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文标签的初衷是为了简单重组蛋白的纯化，但是随着新的融合标签系统被发现和开发，其功能也逐渐多功能化。1.4.2融合标签的特点与传统技术相比，融合标签技术有以下优点：（1）增强外源重组蛋白的稳定性和可溶性表达。外源蛋白在表达菌内表达时大多数以包涵体的形式存在，这样导致很难获得大量所需有活性的重组蛋白质。有研究数据表明在表达的重组蛋白质中，可溶性表达的蛋白种类占总体蛋白的比例仅为13%-23%[53-55]，这样很难满足需求量很大有生物活性重组蛋白的大规模生产。为了避免包涵体形成，传统方法一般可以采用低温条件下诱导表达重组蛋白质，但这种方法有局限性，并非对所有重组蛋白质都有效。通过研究发现，融合标签能增强重组蛋白质的可溶性和稳定性，其机制有可能与融合标签可以帮助重组蛋白在细胞内完成正确的组装、折叠及形成天然的空间构象有关。研究表明采用一些高度可溶性的蛋白标签如NusA、Thioredoxin、ArsC等与重组蛋白进行融合表达，能十分有效地避免包涵体的形成，促进目的蛋白的可溶性表达[37,56-61]；MBP与SUMO标签也能促进重组蛋白的可溶性表达[62-66]。（2）融合标签能提高重组蛋白质的产量：由于外源蛋白质对于表达菌属于异质性物质。当外源蛋白质在表达菌内表达时，表达菌会调动自身各种机制来抑制外源蛋白质的大量表达，或经细胞内自身蛋白酶的作用对外源蛋白进行水解，从而导致目的蛋白不表达或表达量降低。研究表明当外源蛋白质与某些融合标签进行融合表达时，能够非常有效增加重组蛋白质的表达量，有学者认为融合标签可以转移形成的融合重组蛋白到细胞的其它隔间中，这样减少在表达菌中与蛋白酶接触的概率，同时促进重组蛋白的合成。如proteinG标签可以防止重组蛋白被胞内蛋白酶分解，从而提高重组蛋白的产量[67]；SUMO标签能抵抗蛋白酶水解，显著增加蛋白表达量，同时还能促进重组蛋白的可溶性表达；MBP与其它蛋白相融合后能显著增加重组蛋白的表达量，也能有效促进蛋白质的可溶性表达；GST、NusA、Trx、Ubiquitin等标签蛋白也能够有效提高与之相连的重组蛋白的表达产量[66,67-73]。（3）大量实验证实融合标签可以简化重组蛋白的纯化过程[74]：利用融合标签与包被在合适固相基质上特异性配体间的相互作用，进而可从复杂的提取物中对融合重组蛋白进行特异性结合，通过合适的洗脱液洗脱非特异性结合的蛋白，从而达到纯化的目的。有许多新型融合标签可供使用，目前常用重组蛋白纯化的标签有GST、MBP、His和表位标签。如His标签，可以利用镍离子亲和层析法进行纯化重组蛋白，纯化过程操作简单、快速，成本低廉，易于批量纯化等[75]。（4）用于控制蛋白质固定空间的取向及检测：研究蛋白之间的相互作用，描绘出蛋白质之间相互作用的图谱，这是研究蛋白质组学的重要内容，融合标签可以很好的实现重组蛋白的检测。（5）生物事件的可视化：由于体内环境十分复杂，体外模拟往往不能真实的反应体内发生的情况，利用融合标签技术可以准确有效观测出体内生物生化事件的发生、发展以及结果。融合标签也有其局限性，例如大分子蛋白质标签由于分子量大会消耗表达菌体自身更多的代谢能量，所以表达量比较低；由于它会改变重组蛋白的结构，可能会降低目的蛋白的稳13 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文定性和活性；降低重组蛋白的特异性，不利于后期重组蛋白的纯化；在蛋白结晶或抗体产生过程中，大分子蛋白标签需要切除；对于蛋白表达量的鉴定时候，大分子蛋白标签会干扰试验结果。多肽小片段蛋白标签由于分子量小，结构小，对融合蛋白质结构影响比较小，同时不需要从重组蛋白中切除，对可溶性表达和蛋白纯化影响较小，所以小分子多肽标签用途范围更广。1.4.3载体上的标签1.4.3.1His标签His标签(多聚组氨酸标签)是指该标签由6~10个连续组氨酸聚合组成，根据蛋白特异性来选择置于蛋白的氨基末端还是羧基末端。His标签常被用于鉴定重组蛋白的表达量情况和后期用于融合蛋白的纯化，是一种使用最广泛的纯化标签，原理是利用固定化金属离子亲和层析来纯化蛋白的标签[76]。His标签与其它标签相比有很多明显优势：对一些金属离子有高度的选择性和亲和力，组氨酸中的咪唑环容易与金属离子形成配位键牢固结合，从而有利于洗脱非特异性结合的蛋白；His标签与金属离子的结合不受尿素，胍等变性剂的影响；用于纯化的填料基质比较廉价；同时还可以从生进行多次循环利用；温和多样的洗脱条件（100~500mmol/L，咪唑，pH范围广，10mmol/LEDTA）。多聚组氨酸标签已经在原核生物和真核生物中得到广泛应用，得到了大量纯度较高的融合蛋白[77]，本研究使用的是6×His标签。1.4.3.2Grifin标签Galectins是一种凝集素,其家族有15名成员，Grifin标签是其成员之一。Grifin标签的跨膜转运和其它凝集素不一样，它是通过与小泡融合分泌到细胞外，这种方式可以避免Galectins和糖蛋白寡糖过早的结合，从而使融合蛋白完成正确的构象，发挥正常的生物学活性[78]。因此可以作为可溶性标签来增加融合蛋白的可溶性表达。1.4.3.3GST标签GST(Glutathione-S-transferase)即谷胱甘肽S-转移酶，它的分子量约为26kDa,首先在真核生物中被发现，但是该融合标签作为一种工具在原核表达系统中纯化蛋白比较成功，如在大肠杆菌中已经被广泛使用[79]。GST与被标记的蛋白进行融合，它作为一种分子伴侣可以高效促进蛋白完成正确折叠，形成有功能的区域、增强蛋白的可溶性和帮助重组蛋白免受蛋白酶的水解，稳定融合蛋白的结构[80]。该系统的另一个优势是可以和谷胱甘肽树脂紧密结合，融合蛋白可通过谷胱甘肽固相柱纯化，洗脱未结合的非特异性蛋白后，结合蛋白可用含游离的谷胱甘肽缓冲液进行洗脱，可以快速、条件温和地进行纯化，配体谷胱甘肽的成本比较低，从而达到低成本高效纯化重组蛋白的目的[81]。GST蛋白标签可以被自身特定的蛋白酶水解下来从而仅保留单一的重组蛋白，纯化后的蛋白已经广泛运用于科学研究的各个领域[82]。1.4.3.4MBP标签14 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文MBP(Maltose-bindingprotein）又称麦芽糖结合蛋白,它的分子量大小约为42kDa，由大肠杆菌K12菌株的基因编码的[83]。20世纪90年代首次将MBP作为融合标签与外源基因连接导入大肠杆菌中，进行重组蛋白的表达[84,85]，也是目前应用范围最广泛的促使外源蛋白可溶性表达的分子伴侣。MBP标签能促进重组蛋白折叠的机制可能是当重组蛋白合成后或刚从核糖体上释放时，MBP有效而快速的帮助其折叠成天然结构，并在分子伴侣系统的帮助下通过异构连锁反应促使下游正在折叠的重组蛋白完成正确的折叠[86]。同时MBP融合标签也可以降低胞内蛋白酶对重组蛋白的水解，提高表达产物的表达量和可溶性。由于MBP能够被直链淀粉树脂吸附，因此可使用直链淀粉树脂纯化，浓缩融合的重组蛋白。MBP即可在重组蛋白的C-末端融合，又可在重组蛋白的N-末端进行融合，此外，MBP还可以与小的亲和标签协同联合使用，如6×His标签，Poly–Arg标签[87]。由于MBP是大分子量的融合标签，为防止其对重组蛋白的高级结构和生物活性产生不良影响，一般纯化后将其切除。1.4.3.5NusA标签NusA(N-utilizationsubstanceA)即氮源利用物质A，又称转录抗终止因子，是大肠杆菌自身一种转录终止因子蛋白[88,89]，分子量约为55kDa。NusA融合蛋白标签表达系统由Davis首先从大量大肠杆菌蛋白库筛选得到的，Novagen对其进行商业化设计和开发利用，目前应用十分广泛。NusA蛋白可以促进目的蛋白的发卡结构完成正确折叠和终止，使一些在原核表达中不可溶的目的蛋白与NusA在N-端融合后变成可溶性表达[90]。有研究发现，通过NusA标签进行融合蛋白的表达时，不加NusA标签时融合蛋白的可溶度为64%，加上NusA标签融合蛋白的可溶度提高至95%[91]。研究在大肠杆菌表达趋化因子时发现，目的蛋白几乎是不可溶性表达，形成了大量低活性的包涵体，而加上NusA融合标签时，能得到大量活性较高的可溶性重组蛋白。人干扰素-γ、人白介素-3、牛生长激素等难溶解的蛋白在含有NusA标签的载体上都能实现了可溶性超表达[92-95]。综上所述，虽然NusA融合标签能大大提高重组蛋白的可溶性表达，但是活性有所下降，可能其对重组蛋白空间结构产生影响。由于NusA的分子量较大，导致靶蛋白的得率相对较低，因为大的融合标签需要消耗表达菌自身大量的代谢能。此外在需要对蛋白进行表达量鉴定和结构分析，需将NusA融合标签切除掉，以免对实验结果产生干扰。由于NusA融合标签不具有独立的纯化功能，和重组蛋白融合表达后不能用专门的亲和基质纯化，需要与其它标签联合使用，如和His标签联用[70]。1.4.3.6SUMO标签SUMO(Smallubiquitin-likemodifier-1）是一种泛素相关小分子修饰蛋白,大约由100个氨基酸残基组成，是一类广泛存在于真核生物中具高度保守序列的低分子量蛋白，与信号传导、蛋白核质运输以及细胞凋亡等多种生理过程有关。研究发现SUMO能抵抗蛋白酶的水解、显著促进重组蛋白的表达量、提高目的蛋白的可溶性表达，因此被用来作为融合标签广泛使用[73]。SUMO主要通过对靶蛋白以共价修饰的形式来调节融合蛋白的结构与功能[96]。15 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文研究发现SUMO能够促进重组蛋白完成正确的组装和折叠，提高其稳定性，从而提高重组蛋白可溶性；能抵抗蛋白酶水解、显著增加蛋白表达量[97,98]；虽然SUMO标签不能作为纯化标签进一步纯化重组蛋白，但其优势在于它本身可以通过自身特异性蛋白酶将其切除，是一个专一性的蛋白酶，因此被作为融合标签而广泛使用[99]。1.4.3.7Thioredoxin标签硫氧还蛋白(Thioredoxin)是一种广泛存在于原核、真核生物体内且序列保守的小分子氧化还原蛋白,它含有保守的结构：色氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸，分子量约为12kDa[100],具有氧化还原和抗凋亡、维持细胞内环境等生物学功能，同时还参与转录调节[101]。同时Thioredoxin标签还具有分子伴侣的功能，作为一种促溶性标签。硫氧还蛋白融合标签可以非常有效的避免包涵体的形成，促进目的蛋白的可溶性表达[102,103]。它有很强的折叠特性，能使重组蛋白完成正确折叠，进而促进可溶性表达，表达的融合蛋白热稳定性强。由于它具有分子量小、折叠很强、它的三级结构反映出它的氨基和羧基端非常适合和其它蛋白进行融合表达,促使重组蛋白基因进行高效的翻译，融合蛋白还可以用于纯化[104]，众多优点使它成为一种常用的融合标签。1.4.3.8proteinG标签G蛋白（proteinG）是细菌外膜蛋白，它是一种经典的纯化标签，可以与多个来源的IgG抗体进行特异性结合，方便纯化，同时还具有防止融合蛋白被蛋白酶降解的功能，进而提高重组蛋白的表达量[67]。1.4.3.9γ-crystallin标签γ-crystallin(γ-晶体球蛋白)在眼睛中大量的存在,对眼球的透光起着非常重要的作用[105]，在细胞质中呈现玻璃样的形态，由于它具有很高的可溶度，因而被用来增强融合蛋白的可溶性表达。1.4.3.10ArsC标签砷酸盐是一种有毒性的物质，它的三价和五价离子可以抑制许多生理反应过程。在多拷贝革兰氏阳性和阴性细菌的质粒中发现有编码砷酸盐抗性的操纵子，ArsC是砷酸盐的还原酶[59]，ArsC可以促进融合蛋白的可溶性表达，增强融合蛋白的活性。有研究表明在目的蛋白的N端加入ArsC标签，可以有效提高重组蛋白的可溶性和活性[60,106]。1.4.3.11PpiB标签Ppi即肽酰氟氨酰异构酶，它是细胞中蛋白完成折叠必不可少的酶，有两种形式，A和B,B酶与A酶相比缺失了一种疏水氨基酸，因此PpiB可以作为一种信号序列或者一种跨膜的辅助工具,在大肠杆菌的细胞质中可以被检测到，它与重组蛋白融合后可以转移重组蛋白到细胞其它隔间中，这样降低在表达菌中与蛋白水解酶接触的机会，同时也具有促进重组蛋白合成的功能[107]。16 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文2材料2.1质粒和菌株原核表达载体pET21b和大肠杆菌(Escherichiacoli，E．coli)DH5α和BL21(DE3)菌株由本实验室保存。2.2实验动物从河南省实验动物中心购买40只2日龄的健康商品肉雏鸡，该批雏鸡没有免疫过疫苗。2.3主要仪器移液枪Eppendorf,Germany超净工作台苏州净化恒温孵育器Eppendorf,Germany凝胶成像分析仪UVP自动高压灭菌锅SANYO,JapanPCR仪Biometra,Germany制冰机SANYO,Japan-20℃超低温冰箱Haier台式高速冷冻离5415R(Eppendorf,生化培养箱哈尔滨市东明医疗仪器心机Germany)厂台式小型离心机5424R(Eppendorf,申能博彩高精度数北京市六一Germany)控摇床涡旋振荡器IKA,Germany水浴锅金怡4℃低温冰箱Haier-80℃超低温冰箱SANYO,Japan5810R台式高速微量分光光度计Eppendorf,Germany大容量冷冻离心Eppendorf,Germany机-40℃超低温冰箱SANYO,Japan超声波破碎仪宁波东芝EPX800酶标检测美国热电公司仪2.4主要试剂DNAMakerDL2000、DL5000、MakerⅤ，限制性内切酶BamHI、XhoI、NdeI购自TaKaRa公司；Q5PCR高保真扩增酶，T4连接酶购自NEB公司；质粒切胶回收纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Agarose购自GENVIEW公司；四甲基乙二胺（TEMED）、2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液购自新迈捷；新城疫-法氏囊二联苗购于郑州市兽药市场；兔抗NDVHN蛋白阳性血清（一抗），HRP标记的山羊抗兔IgG（二抗）购于PLLABS公司；HRP标记的山羊抗鸡IgG购于博瑞生物科技有限公司。2.5常规溶液的配制（1）100mg/mL氨苄青霉素（Ampicillin）称取2.5g的Ampicillin粉末，加入ddH2O进行溶解，溶解后定容至25mL，用0.22um的滤膜过滤除菌，然后以每管1ml分装至高压过的1.5mlEP管中，-20℃保存。（2）LB液体培养基17 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文称取Tryptone5g，YeastExtract2.5g，NaCl5g，加入ddH2O充分溶解，定容至500mL，调节溶液pH值至7.0，高压蒸汽灭菌，4℃保存备用。（3）LB(Amp)液体培养基将1mL的Ampicillin加入1L的LB液体培养基中，使其终浓度为100µg/mL，4℃保存备用。（4）LB(Amp)固体培养基称取Tryptone2g，NaCl2g，YeastExtract1g，Agarpower3g加入ddH2O充分溶解，定容至200mL，高压蒸汽灭菌，待其冷却到60℃左右时，加入200µL的100mg/mLAmpicillin，使其终浓度为100µg/mL，在超净台内倒入一次性平皿中，待其冷却凝固后，缠上封口膜，倒置放于4℃保存。（5）50×TAE电泳缓冲液称取37.2gNa2EDTA·2H2O和242gTris，加入ddH2O充分溶解，加入57.1mL的冰醋酸充分混匀，用ddH2O将溶液定容至1L，常温放置备用。（6）1%琼脂糖凝胶准确称取0.5gAgarose，将其加入50mLTAE缓冲液中，加热反复沸腾三次，冷却至45℃作用，加入0.4µL的EB溶液液，混合均匀，倒入插有梳子的凝胶板中，冷却至其凝固然后拔掉梳子备用。（7）0.1MCaCl2溶液称取1.1gCaCl2，加入80mL的ddH2O中搅拌溶解，充分混合溶解后，定容至100mL，121℃条件下高压灭菌30min，冷却至室温后放入4℃保存备用。（8）肉汤培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，K2HPO42g，加入ddH2O定容至1L，调pH为7.4-7.6，高压蒸汽灭菌，4℃保存。（9）IPTG溶液（24mg/mL）称取0.6gIPTG置于25mL离心管中，加入20mL灭菌水，充分混合溶解后，定容至25mL。在超净台用0.22um的滤膜过滤除菌，然后以每管1ml分装至高压过的1.5mlEP管中，-20℃保存。（10）2mol/L的NaOH溶液用量程为100~200mL的塑料杯量取160mLddH2O（NaOH溶解过程中大量放热，有可能使玻璃烧杯炸裂），称取16gNaOH小心逐量加入到塑料杯中，边加边搅拌，待NaOH完全溶解后，用超纯水将溶液定容至200mL，将配制好的溶液转入塑料容器中，室温保存。（11）0.5MTris-HCl(pH=6.8)称取60.55gTris溶解于950mlddH2O，缓慢加浓盐酸调pH至6.8(溶液冷却至室温再调定PH值)，将溶液定容至1L，室温放置备用。18 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文（12）1.5MTris-HCl(pH=8.8)称取181.71gTris碱，加入ddH2O充分溶解，用超纯水将溶液定容至1L,加浓HCl调节pH为8.8，常温放置备用。（13）10%SDS称取10gSDS，加入ddH2O充分溶解，用ddH2O将溶液定容至100mL，室温保存备用。（14）40%丙烯酰胺（Acrylamide）：甲叉丙烯酰胺（Bis）（37.5:1）称取78gAcrylamide和2.08gBis，加入ddH2O充分溶解，用ddH2O将溶液定容至200mL，用磁力搅拌器搅拌过夜，第2天用滤纸进行过滤，盛装在棕色瓶中，4℃保存备用。（15）50%甘油量取50mLGlycerol，用ddH2O将溶液定容至100mL，混均匀后4℃保存备用。（16）10%APS称取1g过硫酸铵，加入ddH2O充分溶解，用ddH2O定容到10mL，4℃保存备用。（17）5×SDS-PAGE电泳缓冲液称取5gSDS，15.15gTris，94g甘氨酸，加入ddH2O充分溶解，定容至1L，4℃保存备用。（18）考马斯亮蓝R-250染色液称取考马斯亮蓝R-2501g，用量筒量取100mL冰乙酸，加入250mL的异丙醇，加入650mL的ddH2O充分搅拌溶解，用滤纸过滤除去杂物，室温保存备用。（19）考马斯亮蓝脱色液量取无水乙醇100mL，冰醋酸200mL,加入ddH2O定容至500mL，充分混匀室温保存备用。（20）10×转膜缓冲液（TranferBuffer）称取Tris30.8g，甘氨酸（Glycine）144.8g，加入ddH2O充分溶解，用ddH2O定容至1L，4℃保存备用。（21）8%分离胶和5%浓缩胶溶液组成成分（mL）8%分离胶5%浓缩胶超纯水3.33.251.5mol/LTris-HCl(pH=8.8)2.510%SDS0.10.0550%甘油240%Acry:Bis(37.5:1)20.37510%APS0.080.05TEMED0.0150.010.5mol/LTris-HCl(pH=6.8)1.25表28%分离胶和5%浓缩胶的成分Table2Thecompositionsof8%separatinggeland5%concentratedgel19 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文（22）5%脱脂奶粉称取5g的脱脂奶粉溶解于TBST溶液中，使其充分溶解，再用TBST将其定容至100mL。（23）含一抗（1:2000）的5%脱脂奶粉将6µL的小鼠抗His一抗加入到12mL的5%脱脂奶粉，混合均匀，-20℃保存备用。（24）含二抗（1:5000）的5%脱脂奶粉将2.4µL的山羊抗小鼠IgG二抗加入到12mL的5%脱脂奶粉，混合均匀，-20℃保存备用。（25）超滤液称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g置于1L烧杯中，加入950ml的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（26）LoadingBuffer（咪唑浓度10mM，pH8.0）称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g，咪唑0.681g置于1L烧杯中，加入约950mL的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（27）WashBuffer1（咪唑浓度20mM，pH8.0）称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g，咪唑1.362g置于1L烧杯中，加入约950mL的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（28）WashBuffer2（咪唑浓度50mM，pH8.0）称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g，咪唑3.405g置于1L烧杯中，加入约950mL的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（29）WashBuffer3（咪唑浓度100mM，pH8.0）称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g，咪唑6.81g置于1L烧杯中，加入约950mL的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（30）ElutionBuffer（咪唑浓度250mM，pH8.0）称取NaH2PO4.2H2O7.8g，NaCl29.25g，咪唑8.5125g置于1L烧杯中，加入约950mL的ddH2O后搅拌溶解，调节pH8.0，定容到1L，过滤杂质后4℃保存。（31）包被液（0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH为9.6）称取Na2CO31.5g，NaHCO32.93g溶解于800mlddH2O中，充分溶解后定容至1L，调节pH9.6，4℃保存备用。（32）封闭液（1%BSA的PBST溶液）称取BSA1g，溶于100mlPBST中，现用现配。（33）洗涤液（PBST，pH7.4）将Tween-200.5ml加入配制好的1LPBS缓冲液中，混和均匀，4℃保存备用。20 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文（34）底物液（TMB-过氧化氢脲溶液）底物A液：TMB0.01g，无水乙醇5ml，ddH2O45ml，充分混匀，4℃避光保存备用。底物B液：柠檬酸0.4665g，Na2HPO41.8325g，30%过氧化氢0.5ml，ddH2O50ml，4℃避光保存备用。用时将底物A液和底物B液按照1:1混合使用。（35）终止液（2MH2SO4）将11ml浓H2SO4缓慢滴加89mlddH2O中，边加边搅拌，充分混匀，4℃保存备用。（36）PBS缓冲液称取NaH2PO41.48g，Na2HPO414.5g，NaCl29.3g，加入ddH2O充分溶解，用ddH2O将溶液定容至1L，把pH调节到7.4，高压蒸汽灭菌，4℃保存。3方法3.1目的基因和引物的合成采用生物信息学方法，对HN基因序列进行分析，找出基因上的保守序列，去掉跨膜区和胞质区，把编码抗原表位的碱基连接起来，并通过大肠杆菌对密码子的偏爱性对序列进行优化，在序列5’-端加上BamHI酶切位点，序列的3’-端加上XhoI酶切位点，同时利用生物学分析软件设计合成一对针对HN蛋白主要抗原区的特异性引物，引物序列见表2，目的基因和引物由北京博尚生物公司合成。合成后目的基因片段长度为2094bp，一对特异性引物扩增HN的片段大小为1536bp。表3引物序列Table3PrimerssequenceHN引物碱基序列（5’-3’）产物长度（bp）HNPrimersNucleotidesequence(5’-3’)Productlength(bp)上游引物CGGGATCCTCTACCCCGCACGACPrimer-F1536下游引物CCGCTCGAGTTAAACACGGTCGTCTTTCAGGAPrimer-RTTTC3.2重组表达载体的构建3.2.1标签载体的构建通过生物信息软件NoeCloneDemo分析原核表达载体pET21b上的单酶切位点，找出合适的酶切位点BamHI和NdeI，然后合成含有单酶切位点BamHI，NdeI的10种标签，pET21b和带标签的10种质粒分别用BamHI和NdeI两种内切酶进行双酶切，酶切体系如下：QuickCutNdeI1µLQuickCutBamHI1µL10×QuickCutGreenBuffer3µL21 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文pET21b/带标签的10种质粒3µgddH2Oupto30μL总计30µL酶切产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，用SanPrep柱式DNA胶回收纯化试剂盒回收目的片段。将回收的线性化质粒pET21b与回收的带标签的10种质粒进行连接，连接体系如下：QuickCutNdeI/QuickCutBamHI双酶切带标签的10种质粒6.0µLQuickCutNdeI/QuickCutBamHI双酶切的pET21b质粒2.5µLT4DNA连接酶0.5µL10×T4DNA连接酶Buffer1.0µL总计10.0µL16℃孵育器上连接过夜。构建好的质粒命名为pET1-pET10，带融合标签的10种质粒见表4。表4带融合标签的10种质粒Table410plasmidswithdifferentfusiontag载体名称载体标签组成所携带标签大小（bp）pET16×His-Grifin-TEV502pET26×His-GST-TEV739pET36×His-MBP-TEV1189pET46×His-NusA-TEV1570pET56×His-SUMO-TEV385pET66×His-Thioredoxin-TEV412pET76×His-ProteinG-TEV256pET86×His-γ-crystallin-TEV619pET96×His-ArsC-TEV508pET106×His-PpiB-TEV5833.2.2大肠杆菌DH5α和BL21感受态细胞的制备（CaCl2法）（1）从-80℃冰箱取出冻存的大肠杆菌DH5α和BL21原始菌种，划线接种于LB琼脂平板上，置于37℃生化培养箱中培养过夜（12~16h）。（2）从新活化的菌落平板上挑取单个菌落，接种于5mL的LB液体培养基中，置于37℃摇床上振摇培养过夜。次日将该菌液以1%的比例接种于50mlLB液体培养基中，37℃摇床2~3h，扩大培养。当培养基出现浑浊后（通常为2~3h），每隔20~30min测一次OD600nm，直至OD600nm值为0.3~0.4，停止培养。22 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文（3）细菌培养液冰浴15min，转入50ml离心管中，于4℃5000r/min离心10min。（4）弃去上清，加入10ml预冷的CaCl2溶液（0.1M，已高压灭菌）重悬细胞，然后冰浴30min，于4℃5000r/min离心10min。（5）弃去上清液，加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液（如果感受态细胞不立即用于转化，加入0.1mol/LCaCl2/15%甘油，储存于-80℃冰箱，小心悬浮细胞，上述每步操作都在4℃进行）。（6）冰浴上轻轻吹打混匀，以每管150µL/管进行分装感受态细胞，此感受态细胞于4℃冰箱中放置2h以上，可直接用于转化。3.2.3重组质粒的转化（1）取DH5α感受态细胞150µL，加入10µL连接产物，混匀后冰浴30min。（2）在42℃水浴锅内热激90s，迅速再冰浴3min。（3）在超净台内加入500µL不含Amp抗生素的LB液体培养基，静置5min。（4）37℃，220r/min振摇培养1h，使菌液进行复苏。（5）8000r/min离心3min，弃上清，剩余约500µL重悬沉淀。（6）取出50µL重悬沉淀，加入8µlIPTG和40µLX-Gal，混匀后均匀涂布于含有100µg/mLAmp的LB固体平板上，37℃培养箱中培养14~16h。（7）将平板在4℃冰箱中放置3h，蓝白斑颜色对比更加明显。3.2.4重组表达载体的构建挑取平板上的单个白色菌落和含有目的基因的菌液进行扩大培养，然后使用上海生物工程有限公司的商品化SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取带标签质粒和含有目的基因的质粒。将带有融合标签的10个质粒（pET1-pET10）及含有合成目的基因的质粒，分别用BamHI和XhoI两种内切酶进行双酶切，酶切体系如下：QuickCutXhoI1µLQuickCutBamHI1µL10×QuickCutGreenBuffer3µLpET1-pET10/含目的基因的质粒3µgddH2Oupto30μL总计30µL37℃孵育器上孵育40min。酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用SanPrep柱式DNA胶回收纯化试剂盒回收目的片段。将回收的线性化质粒pET1-pET10，分别与回收的基因HN-SF进行连接，连接体系如下：QuickCutXhoI/QuickCutBamHI双酶切的HN-SF基因6.0µLQuickCutXhoI/QuickCutBamHI双酶切的pET1-pET10质粒2.5µLT4DNALigase0.5µL23 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文10×T4DNALigaseBuffer1.0µL总计10.0µL16℃孵育器上连接过夜，将构建好的重组表达质粒（如图2所示）转入至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于含Amp（浓度为100µg/mL）的LB固体平板上，37℃培养过夜。图2重组质粒示意图Fig.2Recombinantplasmidschematicdiagram3.3重组质粒的鉴定3.3.1菌液PCR鉴定挑取平板上的单个白色菌落至500µL含Amp(浓度为100µg/mL)的液体LB培养基中，37℃220rpm培养8h，取1µL菌液作模板，进行菌液PCR鉴定。菌液PCR体系：Q5聚合酶0.25µL5×Q5聚合酶缓冲液5µL5×Q5聚合酶Enhancer5µLPrimer-F（20μmol/L）0.5µLPrimer-R（20μmol/L）0.5µL菌液1µL2.5mMdNTP2µLddH2Oupto25µL总体系25µL反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。3.3.2双酶切鉴定24 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文PCR鉴定为阳性的菌液进行扩大培养，然后用DNA小提质粒试剂盒提取重组质粒，用BamHI，XhoI进行双酶切鉴定。酶切的反应体系如下：QuickCutXhoI1µLQuickCutBamHI1µL10×QuickCutGreenBuffer3µL重组质粒2µgddH2Oupto30μL总计30µL上述操作在冰上进行，充分混匀，37℃孵育器孵育40min,产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。3.4序列的测定将PCR扩增结果和酶切鉴定结果均为阳性的重组质粒送上海生工公司测序，并对测序结果进行序列比对，将测序正确的重组质粒转入大肠杆菌BL21中。3.5重组HN蛋白诱导条件的优化3.5.1最佳IPTG诱导浓度的确定在筛选最佳IPTG诱导浓度时，先将诱导表达的时间（12h）、培养基（LB液体培养基)、诱导温度（18℃）和Amp浓度(100µg/mL)固定。将BL21(DE3)表达菌培养至对数中期（OD600=0.5-0.8），加入诱导剂IPTG使其终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，在18℃条件下诱导12h，同时设立pET空载体诱导组、重组质粒未诱导2个对照，诱导结束后通过SDS-PAGE电泳对重组蛋白的表达量进行检测，用于确定最佳的IPTG诱导浓度。3.5.2最佳诱导温度的确定在最佳IPTG诱导浓度条件下筛选最佳诱导温度时，先将诱导表达的时间（12h）、培养基（LB培养基）和Amp浓度（100µg/mL）固定。将BL21（DE3）表达菌培养至对数中期（OD600=0.5-0.8），加入诱导剂IPTG至最佳诱导浓度，分别在16℃、18℃、32℃和37℃条件下诱导12h，pET空载体诱导组、重组质粒未诱导2个对照，诱导结束后通过SDS-PAGE电泳对重组蛋白的表达量进行检测，用于确定最佳诱导温度。3.5.3最佳Amp浓度的确定在最佳IPTG诱导浓度和温度条件下筛选最佳Amp浓度时，先将诱导表达的时间（12h）和培养基（LB液体培养基）固定。将BL21(DE3)表达菌在Amp浓度为100µg/mL、200µg/mL、300µg/mL和400µg/mL的LB液体培养基培养至对数中期（OD600=0.5-0.8），在最佳诱导温度和IPTG浓度条件下诱导12h，pET空载体诱导组、重组质粒未诱导2个对照，诱导结束后通过SDS-PAGE电泳对重组蛋白的表达量进行检测，用于确定最佳Amp浓度。3.5.4最佳诱导时间的确定25 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文在最佳IPTG诱导浓度、温度和Amp浓度条件下筛选最佳诱导时间时，先将诱导表达的培养基（LB液体培养基）固定。将含有正确重组质粒的BL21(DE3)表达菌在最佳Amp浓度条件下培养至对数中期（OD600=0.5-0.8），加入最佳IPTG的浓度，在最佳诱导温度条件下诱导之后分别诱导2h、4h、6h、8h、10h，12h，同时设立pET空载体诱导组、重组质粒未诱导2个对照，诱导结束后通过SDS-PAGE电泳对重组蛋白的表达量进行检测，用于确定最佳的诱导时间。3.5.5最佳培养基的确定在最佳IPTG诱导浓度、温度、诱导时间和Amp浓度条件下筛选最佳培养基。用肉汤培养基和LB液体培养基把BL21(DE3)表达菌培养至对数中期（OD600=0.5-0.8），加入最佳IPTG的浓度，在最佳诱导温度条件下诱导，同时设立pET空载体诱导组、重组质粒未诱导2个对照，诱导结束后通过SDS-PAGE电泳对重组蛋白的表达量进行检测，用于确定最佳培养基。用ImageJ软件对以上SDS-PAGE电泳分别进行灰度分析，确定最佳诱导条件，挑选出最优促使HN蛋白可溶性表达的标签。3.6重组HN蛋白表达量的鉴定为进一步比较目的蛋白的表达量，消除标签自身大小对表达量的影响，将可溶性表达量最高的两组诱导表达产物进行表达量的鉴定，方法如下：（1）按照常规试剂的配制方法配制8%的分离胶和5%的浓缩胶，在最佳诱导条件下选取可溶性表达量最高的两组上清样品进行变性处理，每组取5µL上样，120V电压跑1h，然后140V跑到结束。（2）电泳结束后，将玻璃板取出，去除浓缩胶，取出的分离胶平铺在用甲醇湿润过的硝酸纤维素膜（NC）上，该过程应避免胶块与膜之间产生气泡，在电泳槽中加入1×transferbuffer，然后在4℃的条件下，100V转膜80min。（3）电泳结束后，将NC膜在TBST中清洗一下，加入5%脱脂奶粉封闭2h。（4）封闭结束后，加入用5%脱脂奶粉稀释的小鼠抗His的一抗(1:2000稀释)，放置水平摇床上，4℃缓慢孵育过夜。（5）一抗孵育结束后，在室温下用TBST清洗NC膜，清洗三次，每次6min。（6）清洗完毕后，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG的二抗（1:5000稀释），放置水平摇床上缓慢孵育1h。（7）二抗孵育结束后，在室温下用TBST清洗NC膜三次，每次6min。（8）将NC膜上的TBST用吸水纸吸干，将膜平铺于保鲜膜上，将等体积混合的ECL发光液A液和B液加在NC膜上，反应3分钟，之后将NC膜放于暗盒内。（9）在暗室中将X光片放于暗盒中的NC膜上进行曝光，然后放于显影液中反应，用水清洗，放于定影液中，最后将X光片取出晾干，进行拍照。26 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文3.7重组蛋白的纯化在最佳条件下诱导表达蛋白，收集并重悬菌体，超声破碎细胞，4℃，10000r/min离心40min，收集上清，然后用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白。方法如下：（1）将Ni-Agarose填料混匀后，取1mL填料加入层析柱中，室温静置10min，待填料与溶液分离后把底部的出液口打开，让20%的CH3COOH通过出液口流出。（2）向装填好的柱中加入10倍柱体积（柱体积指的是填料的体积）的无菌超纯水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的平衡缓冲液LoadingBuffer平衡填料柱，平衡结束后即可上样。（3）将收集上清中的可溶性蛋白和填料混匀，先在4℃慢速震荡1h，4℃静置10min，打开层析柱开关让填料沉淀，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。（4）用适当体积的WashBuffer冲洗柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白。（5）用适当体积的ElutionBuffer洗脱柱子，收集洗脱峰（目的蛋白）。（6）洗脱后，依次使用10倍柱体积的无菌超纯水洗涤柱子，再用5倍柱体积的20%乙醇（V/V）平衡，然后4℃保存。（7）对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测蛋白的纯度，然后用超滤管浓缩并去除咪唑，用BCA试剂盒测纯化蛋白的浓度后-80℃分装保存。3.8重组HN蛋白的形态学观察取纯化好的重组HN蛋白100µL，4℃，10000r/min离心30min，然后滴加在碳膜300目网格上，待其充分吸收，用磷钨酸染色2h，晾干，通过透射电子显微镜进行观察网格，并拍下重组HN蛋白的形态结构。3.9重组HN蛋白的免疫活性检测3.9.1Westernblot活性检测（1）按照常规溶液的配方配置8%的分离胶和5%的浓缩胶，取变性处理的最佳组未诱导的全菌、诱导后的全菌和纯化的重组HN蛋白样品以每孔10µL上样，120V电压跑1h，然后140V跑到结束。（2）电泳结束后，将玻璃板取出，去掉浓缩胶，取出的分离胶平铺在用甲醇湿润过的硝酸纤维素膜（NC）上，该过程避免胶块与膜之间产生气泡，在电泳槽中加入1×transferbuffer，然后在4°C的条件下，100V转膜80min。（3）电泳结束后，将NC膜在TBST中清洗一下，加入封闭液封闭2h。（4）封闭结束后，加入用PBS稀释兔抗NDVHN蛋白阳性血清的一抗(1:100-500稀释)，放置水平摇床上4°C缓慢孵育1h。（5）一抗孵育结束后，在室温下用TBST清洗NC膜，清洗三次，每次6min。（6）清洗完毕后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG的二抗（1:1000-5000稀释），放置水平摇床上缓慢孵育1h。27 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文（7）二抗孵育结束后，在室温下用TBST清洗NC膜三次，每次6min。（8）将NC膜上的TBST用吸水纸吸干，将膜平展铺于保鲜膜上，将等体积混合的ECL发光液A液和B液加在NC膜上，反应3分钟，之后将NC膜放于暗盒。（9）在暗室中将X光片放于暗盒中的NC膜上进行曝光,然后放于显影液中反应，用水清洗，放于定影液中，最后将X光片取出晾干。3.9.2间接ELISA检测40只2日龄小鸡分三组，疫苗组20只，PBS组10只，SPF组10只；疫苗组和PBS组在7日龄，20日龄和40日龄分别接种新城疫-法氏囊二联苗和PBS缓冲液，SPF组不做任何处理；疫苗组和PBS组的鸡生活在相同环境中，SPF鸡生活在无菌环境中；45日龄开始采血，分离血清，-20℃保存备用。对王延辉间接ELISA方法进行改进[108]，将纯化后的重组HN蛋白适当稀释，使包被抗原浓度为0.01µg/µL，每孔100µL，37℃放置1h，4℃过夜包被ELISA反应板，包被好的反应板按如下操作。（1）用剪过枪头吸取300µLPBST液洗板5-6次，每两次之间间隔3min。（2）每孔加300µL封闭液（1％BSA+100mlPBST）37℃封闭2h。（3）弃去封闭液，用PBST洗板3-5次，弃去洗涤液，拍干板子，加入100µL待检测血清（1:100），37℃作用1h。（4）弃去血清，洗板2-5次，拍干板子，加入HRP标记的山羊抗鸡IgG二抗（1:3000-5000），每孔100µL，37℃作用1h。（5）弃去二抗，洗板4次，拍干，按照1:1比例加入底物A液和B液（现用现配），每孔100µL，37℃避光显色12min。取出后立即加入2mol/L硫酸终止反应，每孔50µL，立即用酶标仪测定在450nm波长的吸收值(OD450nm)，然后记录分析数据。4结果与分析4.1重组表达载体的构建4.1.1标签质粒和pET21b的双酶切带有标签的10个质粒和pET21b用BamHI和NdeI双酶切，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，每个泳道都有两个线性化的条带，且均切出与预期大小一致的条带，表明带有标签的10个质粒和pET21b质粒均被切开（图3）。图3pET21b和含有标签质粒的双酶切28 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文注:M，DL5000；1-10，带有标签的质粒；11，pET21b质粒Fig.3pET21bandplasmidswithfusiontagdigestedwithBamHIandNdeINotice:M,DL5000;1-10,plasmidswithfusiontag;11,pET21bplasmid4.1.2目的基因和pET的双酶切带标签的10个pET质粒和含有目的基因的质粒用BamHI和XhoI双酶切，经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，每个泳道都有两个线性化的条带，含目的基因的质粒在约2094bp处切出目的片段，且11个质粒均在5500bp左右处均切出与预期大小一致的条带，表明pET1-pET10和含有目的基因这11个质粒均被切开（图4）。图4pET1-pET10和含目的基因质粒的双酶切注:M，MarkerⅤ；1-10，质粒pET1-pET10，11，含目的基因的质粒Fig.4pET1-10andtargetgeneplasmidsdigestedwithBamHIandXhoINotice:M,MarkerⅤ;1-10,pET1-pET10plasmids;11,theplasmidwithtargetgene4.2重组质粒的鉴定4.2.1菌液PCR鉴定分别以转入10个重组质粒pET1-HN至pET10-HN的菌液DH5α为模板，进行菌液PCR鉴定，产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示均扩增到大小约为1563bp的片段，该片段大小与预期相一致（图5）。图5重组质粒的PCR鉴定注：M，DL2000；R，空白对照；1-10，重组质粒pET1-HN至pET10-HNFig.5IdentificationofrecombinantplasmidsbyPCRNotice:M,MarkerDL2000;R,Control;1-10,RecombinantpET1-HNtopET10-HNplasmids4.2.2双酶切鉴定取PCR鉴定为阳性的菌液进行扩大培养，用质粒小提取试剂盒提取10种重组质粒，重29 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文组质粒用XhoI和BamHI双酶切，产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，可见均切出大小为2094bp的片段，与预期目的片段大小相符。菌液PCR及双酶切鉴定均为阳性的质粒进行测序，测序结果经比对完全一致，表明10个重组载体构建成功。图6重组质粒的双酶切鉴定注：M，DL5000；1-10，重组质粒pET1-HN-PET10-HNFig.6IdentificationofrecombinantpET1-pET10plasmidsdigestedwithBamHIandXhoINotice:M,MarkerDL5000;1-10,RecombinantpET1-HNtopET10-HNplasmids4.3重组HN蛋白诱导条件的优化为了提高HN蛋白可溶性超表达，优化HN蛋白的诱导条件，试验结果表明，最佳诱导条件为：16℃诱导温度、IPTG的浓度为0.4mmol/L、Amp浓度为200µg/mL和LB液体培养基。18℃和37℃诱导温度下可溶性表达能力比16℃低，提高IPTG的浓度在最佳浓度以上对可溶性表达无显著差异，200µg/mL的Amp能提高可溶性表达，改变培养基只是改变菌体湿重，对可溶性表达无显著影响。如图A是16℃诱导12h，B为37℃诱导6h的SDS-PAGE电泳，结果显示10个融合蛋白中只有N-端连接ProteinG标签的蛋白没有检测到表达产物（图片和数据未列出），其余9个融合蛋白都有表达，且在最佳诱导条件下pET3-HN可溶性表达量最高（62.7%）。30 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文图79个重组质粒表达产物的SDS-PAGE分析注：M，蛋白质Marker；C,空白对照；C1未诱导的全菌；I，0.4mmol/L的IPTG诱导的全菌；P，破碎后沉淀；S,破碎后上清Fig.7TheSDS-PAGEanalysisfortheproductionsof9recombinantplasmidsNotice:M,ProteinMarker;C,control;C1,totalcellularproteinbeforeIPTGinduction;I,totalcellularproteinafter0.4mmol•L-1IPTGinducion;P,insolublefractionaftercellsonication;S,solublesupermatantaftercellsonication表5含有不同标签融合蛋白HN的表达水平和可溶性表达水平Table5ExpressionlevelsandsolubilitiesofHNrecombinantproteinscontainingdifferenttagsTagTagsizeFusionsizeExpressionlevel(%)Solubility(%)(kDa)(kDa)16℃37℃16℃37℃HNGrifin18.495.562.850.739.521.7(57.1kDa)GST28.6105.745.7042.20SFMBP43.5120.651.535.262.711.1(20.0kDa)NusA57.8134.949.505.20SUMO14.591.646.237.040.826.4Thioredoxin14.891.960.149.740.40ProteinG9.586.60000γ-crystallin24.0101.142.637.236.050.7ArsC18.895.959.566.526.80PpiB21.498.559.965.427.38.34.4重组HN蛋白表达量的鉴定为了消除GST和MBP标签自身大小对表达量的影响，进一步定量比较表达量最高的GST-HN和MBP-HN两组目的蛋白的可溶性表达量，取5µL两组上清样品经PAGE电泳后转膜，并与一抗、二抗作用显色（图8）。结果显示pET2-HN和pET3-HN组分别在105.7KD，120.6KD处出现了目的蛋白的荧光条带，且用ImageJ软件分析得出N-端连接MBP标签的融合蛋白可溶性表达量比连接GST融合标签的可溶性表达量多。31 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文图8Western-blot检测表达量注：1,pET3-HN未诱导全菌；2,pET3-HN上清；3,pET2-HN未诱导全菌；4,pET2-HN上清Fig.8WesternblotidentificationoftheexpressionlevelNotice:1,pET3-HNtotalcellularproteinbeforeIPTGinduction;2,thepET3-HNsolublesupermatantaftercellsonication;3,pET2-HNtotalcellularproteinbeforeIPTGinduction;4,thepET2-HNsolublesupermatantaftercellsonication4.5重组HN蛋白的纯化在最佳条件诱导表达后，超声破碎细胞，收集上清用镍离子亲和层析法纯化，对收集的洗脱液进行SDS-PAGE检测蛋白的纯度，用超滤管浓缩并去掉盐离子和咪唑，用BCA法测纯化蛋白的浓度为1.6mg/ml，SDS-PAGE显示蛋白纯化较好。（图9）图9纯化蛋白的SDS-PAGE分析注：M，蛋白质Marker；1,未诱导的全菌；2，0.4mmol/L的IPTG诱导的全菌；3，破碎后沉淀；4,破碎后上清；5，纯化HN蛋白Fig.9TheSDS-PAGEanalysisforpurifiedHNproteinNotice:M,ProteinMarker;1,totalcellularproteinbeforeIPTGinduction;2,totalcellularproteinafter0.4mmol/LIPTGinducion;3,insolublefractionaftercellsonication;4,solublesupermatantaftercellsonication;5,PurifiedHNprotein4.6重组HN蛋白的形态学分析进一步分析纯化的重组HN蛋白是否具有形成衣壳样纳米颗粒的能力，用透射式电子显微镜对纯化后的重组蛋白进行形态学分析。如图10（a，b）所示，重组蛋白能组装成直径32 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文为30~50nm的衣壳样纳米颗粒的结构。图10透射式电子显微镜分析重组蛋白的形态学注：a，放大倍数为100000；b，放大倍数为200000Fig.10Morphologicalanalysisofrecombinantproteinbytransmissionelectronmicroscope(TEM)Notice:a,Themagnificationis100000;b,Themagnificationis2000004.7重组HN蛋白免疫活性检测4.7.1Westernblot检测取pET3-HN未诱导的全菌、诱导后的全菌和纯化的重组HN蛋白经SDS-PAGE电泳，然后转印至硝酸纤维素膜上，分别与一抗兔抗NDVHN蛋白的阳性血清(1:100-500稀释),二抗HRP标记的山羊抗兔IgG（1:1000-5000稀释）作用，结果如图11，该重组蛋白能与NDVHN蛋白的阳性血清发生特异性反应。图11表达产物Western-blot活性检测注：1,pET3-HN未诱导全菌；2，0.4mmol/L的IPTG诱导pET3-HN的上清；3,纯化后HN蛋白Fig.11WesternblotidentificationoftheexpressedproductsNotice:1,totalpET3-HNcellularproteinbeforeIPTGinduction;2,theinducedpET3-HNsolublesupermatantusedIPTGwithaconcentrationof0.4mmol•L-1;3,PurifiedHNprotein4.7.2间接ELISA检测用纯化的重组HN蛋白包被酶标反应板，与收集的20份阳性血清和20份阴性血清反应，33 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文试验结果如表6，疫苗组血清OD450nm值都在1.1以上，PBS组血清OD450nm值都在0.3-0.6之间，SPF组血清OD450nm值都在0.21以下，间接ELISA表明重组HN蛋白显示出良好的反应性和特异性。表6重组HN蛋白的间接ELISA分析Table6AnalysisofpurifiedrecombinantproteinbyindirectELISA疫苗组1.2591.4141.1811.4791.3391.3791.2771.4151.2721.4051.6141.4211.4961.4351.3211.3861.4651.2841.2411.375PBS组0.5770.5250.5380.5090.5710.4590.4390.4680.4320.375SPF组0.2030.1890.1780.1950.1960.2080.1840.1790.1680.1665讨论目前新城疫亚单位疫苗的研究热点仍以HN蛋白为主[109-111]。HN蛋白表达的相关研究不少，但目前存在的主要问题是表达的HN蛋白活性低和表达量少[112-116]。HN蛋白疏水区在接近N端的胞质内区和跨膜区形成的氨基酸残基，其结构严重阻碍了HN蛋白的表达，因此在设计HN基因时去除了胞质内区和跨膜区，减少其对表达过程的干扰，选择抗原性良好的抗原区域进行截短表达[117]。并按照大肠杆菌对密码子的偏爱性对HN基因进行优化。有研究表明Grifin、GST、MBP、NusA、proteinG、SUMO、MBP、Thioredoxin、ProteinG、γ-crystallin、ArsC、PpiB等蛋白标签能够有效提高与之相连的目的蛋白的可溶性表达量[67,118-122]。其机制可能是融合标签可以帮助目的蛋白在细胞中完成正确组装、折叠及形成天然的空间构象有关。本研究选用不同的融合标签与HN基因进行融合表达，表达载体带有6×His标签，可以利用镍离子亲和层析法进行纯化，纯化过程简单方便、快速、价格低和易于大量制备[123]。在融合标签与目的蛋白之间设计加入了TEV蛋白酶位点，使得表达的重组HN蛋白经TEV酶酶切后得到完整的HN蛋白；另外，在目的基因后面连接有纳米蛋白猪链球菌铁蛋白（SF），它具有促进重组HN蛋白形成衣壳样纳米颗粒，纳米颗粒在一定浓度范围内对细胞具有良好的生物相容性，有利于提高重组蛋白的水溶性及稳定性，改善其生物活性。试验结果显示10种标签质粒中只有ProteinG标签与HN蛋白相融合后未检测到目的蛋白的表达，其余9种融合标签都有不同程度促进重组HN蛋白的表达；分析ProteinG标签没有促进重组HN蛋白的表达，可能与其适应性有关，对于不同的蛋白，ProteinG标签促进蛋白表达的能力也不同[124]。Thioredoxin和SUMO标签比预期蛋白大，可能是表达的蛋白折叠形成大分子聚合物，电泳速度慢导致比预期结果大。从表达量及可溶性比较发现，16℃低温诱导重组HN蛋白的可溶性都要比同等条件下18℃和37℃诱导的要好，MBP和GST两组的可溶性最高，分别是62.7%和42.2%，特别是GST标签组，在37℃下没有目的蛋白的表达，而在16℃时表达量和可溶性分别提升至49.5%和5.2%，分析原因可能低温蛋白质合成的速度降低，从而有利于蛋白的折叠。提高IPTG的浓度在最佳浓度以上对可溶性表达无34 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文显著差异，200µg/mL的Amp能提高可溶性表达，高浓度反而降低目的蛋白的可溶性表达量。改变培养基只是改变菌体湿重，对可溶性表达无显著影响。做蛋白表达量分析时，分析的是融合蛋白，标签的大小会对结果有影响，所以我们选择了表达量和可溶性都相对较高的MBP和GST两组，用抗His标签的抗体，采用Westernblot的方法，用生物软件对可溶性表达量进行了定量分析，结果表明MBP标签组的融合蛋白表达量高于GST融合标签组。随后对MBP组的融合蛋白进行了纯化，SDS-PAGE分析无其它杂带，表明纯化的蛋白纯度高，用超滤管浓缩纯化产物，同时洗掉咪唑，使其浓度达到1.6mg/mL。由于HN蛋白后面连接有纳米蛋白SF，促进重组HN蛋白形成衣壳样纳米颗粒，在透射式电子显微镜下可以观察出重组HN蛋白形成了衣壳样纳米颗粒，增加重组HN蛋白对细胞的生物相容性，有利于提高重组HN蛋白的水溶性及稳定性，改善其生物活性。此外，经Westernblot和间接ELISA检测分析证明截短表达的HN蛋白主要抗原表位具有良好的特异性与抗原性，显示出良好的应用前景。全文总结1．本试验成功将合成的HN-SF基因连接到带有标签的10个表达载体上，经菌液PCR、双酶切和测序鉴定正确，表明成功构建含有6×His-Grifin-TEV-HN-SF、6×His-GST-TEV-HN-SF、6×His-MBP-TEV-HN-SF、6×His-NusA-TEV-HN-SF、6×His-SUMO-TEV-HN-SF、6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF、6×His-ProteinG-TEV-HN-SF、6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF、6×His-ArsC-TEV-HN-SF、6×His-PpiB-TEV-HN-SF的10个表达载体。2.本试验有9个载体pET1-HN-SF（携带Grifin标签）、pET2-HN-SF（携带GST标签）、pET3-HN-SF（携带MBP标签）、pET4-HN-SF（携带NusA标签）、pET5-HN-SF（携带SUMO标签）、pET6-HN-SF（携带Thioredoxin标签）、pET7-HN-SF（携带γ-crystallin标签）、pET9-HN-SF（携带ArsC标签）和pET10-HN-SF（携带PpiB标签）在上清中均有重组HN蛋白的表达，经对表达量进行定量分析得出pET3-HN可溶性表达量最高（62.7%），选出最佳诱导蛋白表达的条件为：诱导温度为16℃、IPTG的浓度为0.4mmol/L、Amp的浓度为200µg/mL和LB液体培养基培养。同时为了消除标签自身大小对表达量的影响，对两组可溶性表达量最高的重组蛋白进行定量分析，得出MBP融合标签对重组HN蛋白的可溶性表达量高于其它融合标签。3.对重组HN蛋白进行了纯化，得到纯度和浓度较高的重组HN蛋白。电子显微镜下观察到重组HN蛋白能组装成衣壳样纳米颗粒的结构。另外，经Westernblot和ELISA鉴定分析证实截短表达的HN蛋白主要抗原区域具有良好的反应性与特异性，这为以后大量表达、纯化和制备多克隆抗体，进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白在细胞融合中的相互作用奠定了基础，为后续研制鸡新城疫多表位基因工程疫苗及诊断试剂的开发提供了有利的条件。35 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文参考文献：[1]SunCX,WenHL,ChenYZ,etal.RolesofthehighlyconservedaminoacidsintheglobularheadandstalkregionoftheNewcastlediseasevirusHNproteininthemembranefusionprocess[J].BiosciTrends,2015,9(1):56-64.[2]TakahashiT,TakanoM,AgarikuchiT,etal.AnovelmethodfordetectionofNewcastlediseaseviruswithafluorescentsialidasesubstrate[J].JVirolMethods,2014,209:136-142.[3]AbsalonAE,Mariano-MatiasA,GarciaLJ,etal.CompletegenomeanalysisofvelogenicNewcastlediseasevirusreferencestrain"Chimalhuacan":evolutionofvirallineagesinMexico[J].VirusGenes,2014,49(2):233-236.[4]NallaiyanS,AbbadoraiR,SundaramoorthyS,etal.ProductionandapplicationofrecombinanthaemagglutininneuraminidaseofNewcastlediseasevirus[J].AsianPacificJournalofTropicalMedicine,2010,3(8):629-632.[5]DaiCX,KangH,YangW,etal.O-2'-HydroxypropyltrimethylammoniumchloridechitosannanoparticlesforthedeliveryofliveNewcastlediseasevaccine[J].CarbohydrPolym,2015,130:280-289.[6]崔保安,王淑芳,牛钟相等.动物微生物学[M].河南农业大学,1999:1-400.[7]殷震,刘景华主编.动物病毒学[M].北京：科学出版社,1997:736-750.[8]秦卓明.新城疫病毒流行株致病性和抗原性及其与F和HN基因变异的相关性[D].山东农业大学,2006,1-177.[9]KimLM,KingDJ,CurryPE,etal.Phylogeneticdiversityamonglow-virulencenewcastlediseasevirusesfromwaterfowlandshorebirdsandcomparisonofgenotypedistributionstothoseofpoultry-originisolates[J].JVirol,2007,81(22):12641-12653.[10]JinSQ,MengCC,DengJL,etal.Full-lengthgenomeanalysisoffourgenotype3letogenicNewcastlediseasevirusesisolatedfromdifferenthosts[J].BingDuXueBao,2012,28(4):394-402.[11]BiswasM,JohnsonJB,KumarSR,etal.IncorporationofhostcomplementregulatoryproteinsintoNewcastlediseasevirusenhancescomplementevasion[J].JVirol,2012,86(23):12708-12716.[12]程相朝.新城疫病毒的基因组与结构蛋白特征[J].河南科技大学学报,2004,24(1):20-25.[13]HuangHY,MengXW,LiX,etal.InductionofEffectiveAntitumorImmuneResponsebyCombinedAdministrationofhIL-18andNDVHN[J].ChemicalResearchinChineseUniversities,2011,27(5):836-840.[14]HaoH,ChenS,WuP,etal.GenomiccharacterisationoftwovirulentNewcastlediseasevirusesisolatedfromcrestedibis(Nipponianippon)inChina[J].Gene,2014,553(2):84-89.36 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文[15]CollinsPL,HightowerLE,BallLA,etal.TranscriptionalmapforNewcastlediseasevirus[J].JVirol,1980,35(3):682-693.[16]AlexanderDJ.AvianParamyxoviridae--recentdevelopments[J].Veterinarymicrobiology,1990,23(1-4):103-114.[17]SchaperUM,FullerFJ,WardMD,etal.Nucleotidesequenceoftheenvelopeproteingenesofahighlyvirulent,neurotropicstrainofNewcastlediseasevirus[J].Virology,1988,165(1):291-295.[18]王红宁.禽呼吸系统疾病[M].北京：中国农业出版社,2002.[19]蔡宝祥.家畜传染病学[M].中国农业出版社,2005.[20]MakkayaAM,KrellbPJ,NagyaE,etal.Antibodydetection-baseddifferentialELISAforNDV-infectedororvaccinatedchickensversusNDVHN-subunitvaccinatedchickens[J].Veterinarymicrobiology,1999,66:209-222.[21]高玲美,田夫林,牛钟相等.新城疫快速诊断试纸条的研制及初步应用[D].中国动物检疫,2004,21(8):22-23.[22]戴荣四,刘毅,胡仕凤等.鸡新城疫免疫胶体金诊断技术的研究[J].湖南农业大学学报,2006.[23]李希友,田夫林,张秀娥等.单抗标记检测新城疫病毒免疫胶体金试纸条的研制[J].西北农业学报,2006,19(6):1162-1165.[24]SakaguchiT,ToyodaT,GotohB,etal.Newcastlediseasevirusevolution.I.Multiplelineagesdefinedbysequencevariabilityofthehemagglutinin-neuraminidasegene[J].Virology,1989,169(2):260-272.[25]NagaiY,ShimokataK,YoshidaT,etal.ThespreadofapathogenicandanapathogenictrainofNewcastlediseasevirusinthechickembryoasdependingonthepretensesensifvityofthevirusglyeopmtcin[J].JournalofGeneralVirology,1979,45:263-272.[26]SagreraA,CobaledaC,BuitragoJM,etal.MembraneglycoproteinsofNewcastlediseasevirus:nucleotidesequenceofthehemagglutinin-neuraminidaseclonedgeneandstructure/functionrelationshipofpredictedaminoacidsequence[J].GlycoconjJ,2001,18(4):283-289.[27]McGinnesL,SergelT,MorrisonT,etal.MutationsinthetransmembranedomainoftheHNproteinofNewcastlediseasevirusaffectthestructureandactivityoftheprotein[J].Virology,1993,196(1):101-110.[28]McGinnesLW,MorrisonTG.ConformationallysensitiveantigenicdeterminantsontheHNglycoproteinofNewcastlediseasevirusformwithdifferentkinetics[J].Virology,1994,199(2):255-264.37 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文[29]DongD,GaoJ,SunY,etal.Adenovirus-mediatedco-expressionoftheTRAILandHNgenesinhibitsgrowthandinducesapoptosisinMarek'sdiseasetumorcelllineMSB-1[J].CancerCellInt,2015,15:20.[30]朱艳平,田献礼,李鹏等.新城疫病毒xx08毒株血凝素-神经氨酸酶基因主要抗原区原核表达及鉴定[J].河南农业科学,2012,41(7):134-137,154.[31]MotamediMJ,AmaniJ,ShahsavandiS,etal.InSilicoDesignofMultimericHN-FAntigenasaHighlyImmunogenicPeptideVaccineAgainstNewcastleDiseaseVirus[J].InternationalJournalofPeptideResearchandTherapeutics,2013,20(2):179-194.[32]CaoYC,LiT,WangGL,etal.ComprehensiveAnalysisandCharacterizationofLinearAntigenicDomainsonHNProteinfromGenotypeVIINewcastleDiseaseVirusUsingYeastSurfaceDisplaySystem[J].PlosOne,2015,10(6):e0131723.[33]周洁.鸡新城疫病毒单克隆抗体的制备与鉴定[D].河南农业大学，2009.[34]孔令辰,任涛.NDVRT-LAMP和多重RT-PCR诊断方法的研究[D].华南农业大学，2007.[35]刘加波,谢芝勋,唐小飞等.10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析[J].畜牧与兽医,2005,37(7):6-9.[36]张立娜,贾竞波.不同基因型新城疫病毒HN基因保守区域的克隆表达及免疫活性的比较[J].中国生物工程杂志,2008,28(5):93-98.[37]MoonHJ,ParkJE,YoonH,etal.DevelopmentofaNovelRecombinantHeamagglutinin-NeuramindaseElisa(rHN-ELISA)forEvaluationofHumoralImmunityinChickenVaccinatedAgainstNewcastleDiseaseVirus(NDV)[J].JournalofAnimalandVeterinaryAdvances,2010,9(23):2932-2939.[38]米志强,金宁一,龚伟.新城疫病毒HN基因构建的核酸疫苗抗肿瘤作用研究[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(2):93-96.[39]薛立娟,龚伟,葛涛.新城疫病毒pIRHN核酸疫苗构建和表达及对肿瘤细胞的影响[J].中国免疫学杂志,2002,18(5):338-340.[40]刘一尘,程相朝,张春杰.新城疫病毒HN抗肿瘤机制研究进展[J].安微农业科学,2008,36(32):14102-14134.[41]王斌,刘培欣,李涛等.抗新城疫病毒HN蛋白单链抗体的原核表达及其功能鉴定[J].中国预防兽医学报,2014,36(5):383-386.[42]贾清.鸡新城疫抗体检测试纸条的研制及初步应用[D].华中农业大学,2010.[43]张进良.鸡的主要病毒性疫病抗体快速检测方法的建立和应用研究[D].华中农业大学,2010.[44]魏林,戴建新,孙树汉等.新城疫病毒HN基因真核表达质粒的构建及其抗肿瘤作用的38 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文初步研究[J].第二军医大学学报,2000,21(6):515-518.[45]ChayenNE.Turningproteincrystallisationfromanartintoascience[J].Currentopinioninstructuralbiology,2004,14(5):577-583.[46]WidmannM,ChristenP.Comparisonoffoldingratesofhomologousprokaryoticandeukaryoticproteins[J].TheJournalofbiologicalchemistry,2000275(25):18619-18622.[47]王娅宁,李淑娟.融合标签技术及其应用[J].科技经济市场,2009,6.[48]蔡燕,翁亚光,施琼等.着丝粒特异性蛋白CENP-Ⅰ的原核表达、纯化及抗体制备[J].西南大学学报,2008,30(2):143-148.[49]谢浩,郭小明.融合标签技术在膜蛋白结构研究中的应用[J].生物技术通讯,2009,20(1):138-146.[50]李树龙,姜颖,贺福初等.稳定同位素标签技术在定量蛋白质组研究的应用[J].生命的化学,2005,25(5):362-364.[51]王云龙,李忠信,李恒思等.Flag标签抗原的偶联及其单克隆抗体的应用研究[J].动物医学进展,2011,32(1):38-43.[52]HearnMT,AcostaD.Applicationsofnovelaffinitycassettemethods:useofpeptidefusionhandlesforthepurificationofrecombinantproteins[J].JMolRecognit,2001,14(6):323-369.[53]YoungCL,BrittonZT,RobinsonAS,etal.Recombinantproteinexpressionandpurification:Acomprehensivereviewofaffinitytagsandmicrobialapplications[J].BiotechnologyJournal,2012,7(5):620-634.[54]MarblestoneJG,EdavettalSC,LimY,etal.ComparisonofSUMOfusiontechnologywithtraditionalgenefusionsystems:enhancedexpressionandsolubilitywithSUMO[J].Proteinscience:apublicationoftheProteinSociety,2006,15(1):182-189.[55]ChambersSP,AustenDA,FulghumJR,etal.High-throughputscreeningforsolublerecombinantexpressedkinasesinEscherichiacoliandinsectcells[J].ProteinExprPurif,2004,36(1):40-47.[56]MarcoAD.Two-stepmetalaffinitypurificationofdouble-tagged(NusA-His6)fusionproteins[J].Natureprotocols,2006,1(3):1538-1543.[57]MinhTN,KooBK,ThuTTV,etal.ProkaryoticSolubleOverexpressionandPurificationofBioactiveHumanGrowthHormonebyFusiontoThioredoxin,MaltoseBindingProtein,andProteinDisulfideIsomerase[J].PlosOne,2014,9(3).[58]LinAA,WalthersD,ZuberP,etal.ResidueSubstitutionsNeartheRedoxCenterofBacillussubtilisSpxAffectRNAPolymeraseInteraction,RedoxControl,andSpx-DNAContactataConservedcis-ActingElement[J].Journalofbacteriology,2013,195(17):3967-3978.39 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文[59]DiorioC,CaiJ,MarmorJ,etal.AnEscherichiacolichromosomalarsoperonhomologisfunctionalinarsenicdetoxificationandisconservedingram-negativebacteria[J].JBacteriol,1995,177(8):2050-2056.[60]SongJA,LeeDS,ParkJS,etal.AnovelEscherichiacolisolubilityenhancerproteinforfusionexpressionofaggregation-proneheterologousproteins[J].EnzymeMicrobTechnol,2011,49(2):124-130.[61]DoBH,RyuHB,HoangP,etal.SolubleProkaryoticOverexpressionandPurificationofBioactiveHumanGranulocyteColony-StimulatingFactorbyMaltoseBindingProteinandProteinDisulfideIsomerase[J].PlosOne,2014,9(3):10.[62]TilevaM,KrachmarovaE,IvanovI,etal.ProductionofaggregationpronehumaninterferongammaanditsmutantinhighlysolubleandbiologicallyactiveformbySUMOfusiontechnology[J].Proteinexpressionandpurification,2016,117:26-34.[63]HuetS,GorreH,PerrocheauA,etal.UseoftheNanofitinAlternativeScaffoldasaGFP-ReadyFusionTag[J].PlosOne,2015,10(11).[64]GuerreroF,CiraganA,IwaiH,etal.TandemSUMOfusionvectorsforimprovingsolubleproteinexpressionandpurification[J].Proteinexpressionandpurification,2015,116:42-49.[65]EisenhardtN,ChauguleVK,KoidlS,etal.AnewvertebrateSUMOenzymefamilyrevealsinsightsintoSUMO-chainassembly[J].NatureStructural&MolecularBiology,2015,22(12):959-967.[66]KapustRB,WaughDS.Escherichiacolimaltose-bindingproteinisuncommonlyeffectiveatpromotingthesolubilityofpolypeptidestowhichitisfused[J].ProteinSci,1999,8(8):1668-1674.[67]曹丽娟.超酸性蛋白融合标签对大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的作用研究[D].华东师范大学,2008.[68]ButtTR,JonnalagaddaS,MoniaBP,etal.UbiquitinfusionaugmentstheyieldofclonedgeneproductsinEscherichiacoli[J].ProcNatlAcadSciUSA,1989,86(8):2540-2544.[69]KorfU,KohlT,ZandtHVder,etal.Large-scaleproteinexpressionforproteomeresearch[J].Proteomics,2005,5(14):3571-3580.[70]MarcoVDe,StierG,BlandinS,etal.ThesolubilityandstabilityofrecombinantproteinsareincreasedbytheirfusiontoNusA[J].BiochemBiophysResCommun,2004,322(3):766-771.[71]ChopraAK,BrasierAR,DasM,etal.ImprovedsynthesisofSalmonellatyphimuriumenterotoxinusinggenefusionexpressionsystems[J].Gene,1994,144(1):81-85.[72]BoubakriH,SeghezziN,DuchateauM,etal.TheAbsenceofPupylation(Prokaryotic40 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文Ubiquitin-LikeProteinModification)AffectsMorphologicalandPhysiologicalDifferentiationinStreptomycescoelicolor[J].Journalofbacteriology,2015,197(21):3388-3399.[73]Raran-KurussiS,KeefeK,WaughDS,etal.PositionaleffectsoffusionpartnersontheyieldandsolubilityofMBPfusionproteins[J].Proteinexpressionandpurification,2015,110:159-164.[74]LamlaT,ErdmannVA.TheNano-tag,astreptavidin-bindingpeptideforthepurificationanddetectionofrecombinantproteins[J].ProteinExprPurif,2004,33(1):39-47.[75]耿岗.新城疫病毒HN蛋白主要抗原区域的表达与活性检测[J].畜牧与兽医,2013,45(5):53-56.[76]LiuH,NaismithJH.Asimpleandefficientexpressionandpurificationsystemusingtwonewlyconstructedvectors[J].ProteinExprPurif,2009,63(2):102-111.[77]TerpeK.Overviewoftagproteinfusions:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2003,60(5):523-533.[78]孙娅丽,李宏基,韩立强等.猪GRIFIN基因克隆与组织分布[J].江西农业学报,2010,22(4):15-17.[79]PurbeyPK,JayakumarPC,DeepalakshmiPD,etal.GSTfusionvectorwithcaspase-6cleavagesiteforremovaloffusiontagduringcolumnpurification[J].Biotechniques,2005,38(3):360,362,364passim.[80]WuX.OppermannUHigh-levelexpressionandrapidpurificationofrare-codongenesfromhyperthermophilicarchaeabytheGSTgenefusionsystem[J].JChromatogrBAnalytTechnolBiomedLifeSci,2003,786(1-2):177-185.[81]SmithDB,JohnsonKS.Single-steppurificationofpolypeptidesexpressedinEscherichiacoliasfusionswithglutathioneS-transferase[J].Gene,1988,67(1):31-40.[82]HarperS,SpeicherDW.PurificationofproteinsfusedtoglutathioneS-transferase[J].MethodsMolBiol,2011,681:259-280.[83]DuplayP,HofnungM.Tworegionsofmatureperiplasmicmaltose-bindingproteinofEscherichiacoliinvolvedinsecretion[J].JBacteriol,1988,170(10):4445-4450.[84]KapustRB,TozserJ,FoxJD,etal.Tobaccoetchvirusprotease:mechanismofautolysisandrationaldesignofstablemutantswithwild-typecatalyticproficiency[J].ProteinEng,2001,14(12):993-1000.[85]SachdevD,ChirgwinJM.Fusionstomaltose-bindingprotein:controloffoldingandsolubilityinproteinpurification[J].MethodsEnzymol,2000,326:312-321.[86]RoutzahnKM,WaughDS.Differentialeffectsofsupplementaryaffinitytagsonthe41 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文solubilityofMBPfusionproteins[J].JStructFunctGenomics,2002,2(2):83-92.[87]HamiltonSR,O'DonnellJBJr,HammetA,etal.AMP-activatedproteinkinasekinase:detectionwithrecombinantAMPKalpha1subunit[J].BiochemBiophysResCommun,2002,293(3):892-898.[88]ShinDH,NguyenHH,JancarikJ,etal.CrystalstructureofNusAfromThermotogamaritimaandfunctionalimplicationoftheN-terminaldomain[J].Biochemistry,2003,42(46):13429-13437.[89]FarnhamPJ,GreenblattJ,PlattT,etal.EffectsofNusAproteinontranscriptionterminationinthetryptophanoperonofEscherichiacoli[J].Cell,1982,29(3):945-951.[90]HarrisonRG,BagajewiczMJ.PredictingthesolubilityofrecombinantproteinsinEscherichiacoli[J].MethodsMolBiol,2015,1258:403-408.[91]TurnerP,HolstO,KarlssonEN,etal.OptimizedexpressionofsolublecyclomaltodextrinaseofthermophilicorigininEscherichiacolibyusingasolublefusion-tagandbytuningofinducerconcentration[J].ProteinExprPurif,2005,39(1):54-60.[92]MagistrelliG,GueneauF,MuslmaniM,etal.ChemokinesderivedfromsolublefusionproteinsexpressedinEscherichiacoliarebiologicallyactive[J].BiochemBiophysResCommun,2005,334(2):370-375.[93]LaVallieER,DiBlasioEA,KovacicS,etal.AthioredoxingenefusionexpressionsystemthatcircumventsinclusionbodyformationintheE.colicytoplasm[J].Biotechnology(NY),1993,11(2):187-193.[94]LangleyKE,BergTF,StricklandTW,etal.Recombinant-DNA-derivedbovinegrowthhormonefromEscherichiacoli.1.Demonstrationthatthehormoneisexpressedinreducedform,andisolationofthehormoneinoxidized,nativeform[J].EurJBiochem,1987,163(2):313-321.[95]HaelewynJ,LeyMDe.Arapidsingle-steppurificationmethodforhumaninterferon-gammafromisolatedEscherichiacoliinclusionbodies[J].BiochemMolBiolInt,1995,37(6):1163-1171.[96]HannounZ,GreenhoughS,JaffrayE,etal.Post-translationalmodificationbySUMO[J].Toxicology,2010,278(3):288-293.[97]MalakhovMP,MatternMR,MalakhovaOA,etal.SUMOfusionsandSUMO-specificproteaseforefficientexpressionandpurificationofproteins[J].JStructFunctGenomics,2004,5(1-2):75-86.[98]WangH,XiaoY,FuL,etal.High-levelexpressionandpurificationofsolublerecombinantFGF21proteinbySUMOfusioninEscherichiacoli[J].BMCBiotechnol,2010,10:14.42 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文[99]MarblestoneJG,EdavettalSC,LimY,etal.ComparisonofSUMOfusiontechnologywithtraditionalgenefusionsystems:enhancedexpressionandsolubilitywithSUMO[J].ProteinSci,2006,15(1):182-189.[100]GleasonFK,HolmgrenA.Thioredoxinandrelatedproteinsinprocaryotes[J].FEMSMicrobiolRev,1988,4(4):271-297.[101]高建波.硫氧还蛋白的生物学功能及与人类疾病的关系[J].中国医药指南,2013,11(18):90-92.[102]HammarstromM,HellgrenN,BergSvanDen,etal.RapidscreeningforimprovedsolubilityofsmallhumanproteinsproducedasfusionproteinsinEscherichiacoli[J].ProteinSci,2002,11(2):313-321.[103]DummlerA,LawrenceAM,MarcoAde,etal.SimplifiedscreeningforthedetectionofsolublefusionconstructsexpressedinE.coliusingamodularsetofvectors[J].MicrobCellFact,2005,4:34.[104]LaVallieER,LuZ,Diblasio-SmithEA,etal.ThioredoxinasafusionpartnerforproductionofsolublerecombinantproteinsinEscherichiacoli[J].MethodsEnzymol,2000,326:322-340.[105]GreilingTM,HouckSA,ClarkJI,etal.Thezebrafishlensproteomeduringdevelopmentandaging[J].MolVis,2009,15:2313-2325.[106]SongJA,LeeDS,ParkJS,etal.AnovelEscherichiacolisolubilityenhancerproteinforfusionexpressionofaggregation-proneheterologousproteins[J].EnzymeMicrobTechnol,2011,49(2):124-130.[107]HayanoT,TakahashiN,KatoS,etal.Twodistinctformsofpeptidylprolyl-cis-trans-isomeraseareexpressedseparatelyinperiplasmicandcytoplasmiccompartmentsofEscherichiacolicells[J].Biochemistry,1991,30(12):3041-3048.[108]王延辉,薛飞,朱元茂等.牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白的截短表达与活性检测[J].中国预防兽医学报,2007:865-869.[109]YangX,ZhouY,LiJ,etal.Recombinantinfectiousbronchitisvirus(IBV)H120vaccinestrainexpressingthehemagglutinin-neuraminidase(HN)proteinofNewcastlediseasevirus(NDV)protectschickensagainstIBVandNDVchallenge[J].ArchVirol,2016.[110]FirouzamandiM,MoeiniH,HosseiniD,etal.ImprovedimmunogenicityofNewcastlediseasevirusinactivatedvaccinefollowingDNAvaccinationusingNDVHNandFgenes[J].JVetSci,2015.[111]冉旭华,闻晓波,赵喜红等.新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达[J].生物技术,2008,18(3):11-14.43 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文[112]RajmaniRS,GandhamRK,GuptaSK,etal.HNProteinofNewcastleDiseaseVirusInducesApoptosisThroughSAPK/JNKPathway[J].ApplBiochemBiotechnol,2015,177(4):940-956.[113]LiT,WangG,ShiB,etal.ComprehensiveAnalysisandCharacterizationofLinearAntigenicDomainsonHNProteinfromGenotypeVIINewcastleDiseaseVirusUsingYeastSurfaceDisplaySystem[J].PlosOne,2015,10(6):1-14.[114]JiangY,HuJ,GuoY,etal.ConstructionandimmunologicalevaluationofrecombinantLactobacillusplantarumexpressingHNofNewcastlediseasevirusandDC-targetingpeptidefusionprotein[J].JBiotechnol,2015,216:82-89.[115]刘艳华,丁壮,常爽等.血清Ⅰ型鸭源副粘病毒HN蛋白基因的遗传变异及原核表达[J].中国兽医学报,2007,27(3):315-318.[116]罗晶璐,齐岩,任涛等.新城疫病毒HN基因主要抗原位点区段的原核表达[J].华南农业大学学报,2009,30(4):90-93.[117]田莉莉,李丽.新城疫病毒HN基因的截短表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用[J].中国家禽,2012,34(6):29-32.[118]YangFang,PanYY,ChenYZ,etal.ExpressionandpurificationofCanisinterferonalphainEscherichiacoliusingdifferenttags[J].Proteinexpressionandpurification,2015,115:76-82.[119]JiangDW,LiuYC,WangAP,etal.Highlevelsolubleexpressionandone-steppurificationofIBDVVP2proteininEscherichiacoli[J].BiotechnolLett,2016.[120]陈相剑,项灵娇,严雪妮等.小分子泛素相关修饰物SUMO及其融合表达[J].氨基酸和生物资源,2015,37(3):21-24.[121]马超.新型克隆载体和融合表达载体的构建[D].南京师范大学,2010.[122]ReutenR,NikodemusD,OliveiraMB,etal.Maltose-BindingProtein(MBP),aSecretion-EnhancingTagforMammalianProteinExpressionSystems[J].PlosOne,2016,11(3):1-15.[123]LiXM,SongSY,PeiYX,etal.OrientedandreversibleimmobilizationofHis-taggedproteinsontwo-andthree-dimensionalsurfacesforstudyofprotein-proteininteractionsbyaQCMbiosensor[J].SensorsandActuatorsB-Chemical,2016,224:814-822.[124]吴珊珊,朱芸,陈珊珊等.融合标签在蛋白质可溶性表达中的应用进展[J].化工进展,2014,33(4):993-998.44 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文SolubleoverexpressionandfunctionalidentificationoftheNDVHNproteinSupervisor:Prof.ChenLi-yingMasterCandidate:ZhangWei-qiangAbstract:Newcastledisease(ND)isknownastheAsianfowlplagueorpseudofowlplague,itisanacuteandhighlycontagiousdiseasecausedbyNewcastlediseasevirus(NDV).Atpresent,NewcastlediseaseisstillverypopularinChina,sincethediseasehasbrokenout,ithasbroughthugeeconomiclose,itmaybringagreatthreattothedevelopmentofthepoultryindustry,soitisveryimportanttocontrolNewcastledisease.Inourcountry,itismainlydependentonvaccinetopreventandcontrolthespreadofNewcastledisease,UsingtraditionalvaccinecanpreventNewcastledisease,butcomparedwiththetraditionalvaccine,oneormoreprotectiveantigengeneinNDVgenomeisexpressedinprokaryoticoreukaryoticcellsandproduceasubunitvaccinehavingmorehighperformancesecurity,goodstability,easeofmassproductionandlowproductioncost.PreparationofNDsubunitvaccinesmainlybaseonpathogenicglycoproteinofvirusenvelopesurface.InrecentyearsNewcastlediseasesubunitvaccineresearchisstillfocusedonHNprotein,HNproteinisanimportantprotectiveantigen,whichcloselyrelatedtothepathogenicityandimmunogenicityofthevirus,whichisimportantfactortovirusvirulence.ThemassproductionofHNproteinmainlybasedonE.coliexpressionsystem,Escherichiacoliasaforeignproteinexpressionsystemhastheadvantageoftrainingrequiredforcarbonpriceischeap,cellsgrowfastandeasytolargescalecultivation.However,itisstilldifficulttoefficientexpressheterologoussolubleproteinsinE.coli.StudieshavereportedthatusedthefusiontagwithtargetgenetogetherinE.coliexpressionsystemcouldincreasetheyieldofthetargetprotein,however,atpresent,Thereisnoalabelcanpromotethesolubleexpresasionofallthetargetproteins.Inthisexperiment,weusedfusiontagsforfusionexpression.ThemethodusedflexiblejointstoconnecttheHN-SFproteingenewithGrifin,GST,MBP,NusA,SUMO,Thioredoxin,ProteinG,γ-crystallin,ArsC,PpiB10kindsoffusiontaggene,thenthe10recombinantvectorsweretransformedintoE.coliBL21afterbacteriaPCRidentification,enzymedigestionandsequencingidentification.Expressionwas45 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文inducedwithdifferentconditions,thentherecombinantHNproteinswereidentifiedbySDS-PAGEelectrophoresisandselectedwhichonewasthebestfusiontagtopromotetherecombinantHNproteinsolubleoverexpression.InordertoeliminatethesizeoftagsaffectingthesolubleyieldofrecombinantHNprotein,itwasanalyzedbyWesternblot.TofurtheranalyzepurifiedrecombinantHNproteincouldretaintheabilitytoformcapsid-likeparticles,theelectronmicroscopyanalyseswereperformed.ThepurifiedrecombinantHNproteinwasusedtoestablishanindirectELISAandWesternblotfordetectingitsantigenicityandspecificity.TheresultsshowedthattheHN-SFtargetgeneconnectedwithtentaggedvectorswassuccessful,afterbacteriaPCRidentification,enzymedigestionandsequencingidentification,tenexpressionvectorswithdifferentfusiontagswereconstructedSuccessfully.Whichcontained6×His-Grifin-TEV-HN-SF,6×His-GST-TEV-HN-SF,6×His-MBP-TEV-HN-SF,6×His-NusA-TEV-HN-SF,6×His-SUMO-TEV-HN-SF,6×His-Thioredoxin-TEV-HN-SF,6×His-ProteinG-TEV-HN-SF,6×His-γ-crystallin-TEV-HN-SF,6×His-ArsC-TEV-HN-SF,6×His-PpiB-TEV-HN-SF.Expressionwasinducedwithdifferentconditions,thentheexpressionproteinswereidentifiedbySDS-PAGEelectrophoresisandselectedthebestconditionstopromotetherecombinantHNproteinsolubleoverexpression.theoptimalinductionconditionsasinductiontemperaturewas16℃,theconcentrationofIPTGwas0.4mmol/L,theconcentrationofAmpwas200µg/mLandLBliquidmedium.Undertheoptimalinductionconditionsdisplaying,10recombinantexpressionvectoronlyN-terminalconnectedwithProteinGlabeldidnotdetecttheexpressionofthetargetprotein,theremainingrecombinantexpressionvectorexpressedthetargetproteins.QuantitativeanalysissolubleexpressionofdifferenttagsbyImageJsoftwareshowedthat,pET3-HNsolubleexpressionwasthehighest(62.7%),followedbypET2-HN(42.2%),pET5-HN(40.8%),pET6-HN(40.4%),pET1-HN(39.5%),pET8-HN(36.0%),pET10-HN(27.3%),pET9-HN(26.8%),pET4-HN(5.2%).ScreenedoutMBPfusiontagcouldeffectivelypromotetherecombinantHNproteinsolubleexpression.Inordertoeliminatethesizeoftagaffectingthesolubleyieldoffusionprotein,twogroupswereselectedwhichthesolubleexpressionwasthehighest(GSTandMBPgroup),andusedanti-Histagantibodyforquantitativeanalysisitssolubleexpression,WesternblotresultsshowedthatthebestfusiontagwasMBPtag.SubsequentlythepurityofpurifiedrecombinantHNproteinwashigh,whichwasidentifiedbySDS-PAGE,purifiedproteinwasconcentratedbyultrafiltrationandtheconcentration46 河南农业大学2016届预防兽医学硕士学位论文ofitwas1.6mg/mL;Throughatransmissionelectronmicroscope,wecouldseetherecombinantHNproteinwasassembledlikeastructureofcapsid-likenanoparticles,TheindirectELISAandWesternblotexperimentidentifiedthatthetruncatedrecombinantHNproteinhadagoodspecificityandantigenicity,itshowedagoodprospect.MBPtagsolvedtheproblemstheHNgeneinsolubleorlesssolubleexpressioninEscherichiacoliandthesolubleoverexpressionoftherecombinantHNproteinwasthebasisforresearchingtheNDVmechanism,thefollow-upvaccineanddiagnosticreagentsdevelopment,andhadanimportantreferenceforthepreventionandtreatmentofviraldiseases.Keywords:NDV;Hemagglutinin-Neuraminidase;flexiblejoints;fusiontags;vaccine;diagnosticreagents47