氧化苦参碱抑制神经病理性疼痛作用与HVDCCs辅助亚基相关性的研究

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学校代号10162学号201420100121LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine硕士学位论文氧化苦参碱抑制神经病理性疼痛作用与HVDCCs辅助亚基相关性的研究学位申请人徐榕雪指导教师姓名杨丽专业名称药理学申请学位类型学术学位论文提交日期二○一七年三月 目录一、摘要................................................................-1-中文论著摘要........................................................-1-英文论著摘要........................................................-4-二、英文缩略词表........................................................-8-三、正文................................................................-9-前言................................................................-9-材料与方法.........................................................-13-实验结果...........................................................-29-讨论...............................................................-46-结论...............................................................-49-四、本研究创新性的自我评价.............................................-50-五、参考文献...........................................................-51-综述...............................................................-57-在学期间科研成绩...................................................-72-致谢...............................................................-73-个人简介...........................................................-74- 摘要中文论著摘要目的：观察氧化苦参碱（OMT）对神经病理性疼痛的镇痛作用，进一步探讨OMT的镇痛作用机制与高电压依赖性钙通道（HVDCCs）辅助亚基的相关性。材料与方法：1.采用部分结扎坐骨神经法（PSNL）建立神经病理性疼痛模型PSNL小鼠。2.利用von-Frey纤毛刺激法检测假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组的机械缩足反应痛阈值ED50，利用CatWalk步态分析比较各组小鼠的坐骨神经功能指数，明确OMT对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的镇痛作用。3.采用实时荧光定量PCR（real-timePCR）检测OMT对神经病理性疼痛PSNL小鼠的脑组织、脊髓组织及背根神经节（DRG）中HVDCCs辅助亚基α2δ1~α2δ4、β1~β4、γ1~γ4亚单位的mRNA表达的影响。4.采用蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测OMT对神经病理性疼痛PSNL小鼠的脑组织、脊髓组织及背根神经节（DRG）中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达的影响。5.利用培养背根神经节（DRG）原代细胞，使用Fluo-3AM荧光探针法检测假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组、GBP给药组、OMT+GBP给药组DRG神经细胞内钙离子浓度，考察OMT与钙通道调节剂GBP对于PSNL小鼠DRG神经细胞内钙离子浓度的影响。6.使用CatWalk步态分析仪检测假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组、加巴喷丁（GBP）给药组、OMT+GBP给药组小鼠SciaticFunctionalIndex（SFI，坐骨神经功能指数）、RegμLarityIndex（正常步序比）、Swing(s)（摆动时相）、StrideLength(cm)（步幅长度）、BodySpeed(cm/s)（身体速度）、MaxContactArea(cm2)（最大接触时间的足印面积）、PrintLength(cm（足印长度）)、PrintWidth(cm（足印宽度）)、PrintArea(cm2)（足印面积）、Stands(s)（支撑时相）、SingleStance(s)（单足触地时间）、MeanIntensity（完整足印的平均强度）、MaxContactMaxIntensity（最大接触时间的最大强度）指标的变化情况，考察OMT与钙通道调节剂GBP对神经病理性疼痛小鼠的步态参数的改善和纠正。-1- 结果：1.OMT对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的镇痛作用。与假手术Sham组比较，PSNL模型组小鼠机械缩足反应痛阈值ED50显著降低（P<0.05），坐骨神经功能指数显著下调（P<0.01）；与PSNL模型组比较，OMT给药能使PSNL小鼠机械缩足反应痛阈值ED50显著升高（P<0.05），坐骨神经功能指数明显改善（P<0.01）。2.OMT对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠HVDCCs各辅助亚基mRNA表达水平的影响与假手术Sham组比较，PSNL模型组中，HVDCCs辅助亚基α2δ1亚型的mRNA在脑、脊髓、DRG三种组织中表达水平呈显著增加（P<0.01）；α2δ2亚型的mRNA在脑、脊髓组织中表达水平呈显著增加（P<0.05），在DRG组织中表达水平显著下降（P<0.05）；α2δ3亚型的mRNA在脊髓组织中表达水平呈显著增加（P<0.05），在脑、DRG组织中表达水平显著下调（P<0.01）；α2δ4亚型的mRNA在脑组织中表达水平显著下调（P<0.05）。与PSNL模型组比较，OMT给药能使α2δ1亚型在脑、脊髓、DRG三种组织中mRNA表达水平显著下降（P<0.05）；使α2δ2亚型在脑、脊髓组织中mRNA表达水平显著下降（P<0.05）；使α2δ3亚型在脑、脊髓组织中表达水平显著下降（P<0.01）；使α2δ4亚型mRNA表达水平在脑组织显著增加（P<0.05）。辅助亚基β1-4亚型和γ1-4亚型均未受到PSNL及OMT给药影响。3.OMT对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠HVDCCs辅助亚基α2δ1亚型蛋白表达的影响与假手术Sham组比较，PSNL模型组中,HVDCCs辅助亚基α2δ1亚型蛋白表达水平在脊髓、DRG组织中显著增加（P<0.01）；与PSNL模型组比较，OMT给药能使α2δ1亚型蛋白表达水平在脊髓、DRG组织中显著降低（P<0.01）。PSNL及OMT给药均未使脑组织中的α2δ1亚型蛋白表达水平发生显著变化。4.OMT及钙通道调节剂GBP对PSNL小鼠DRG神经细胞内钙离子浓度的影响与假手术Sham组比较，PSNL模型组中DRG神经元细胞的钙离子浓度显著上调（P<0.01），而OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药处理均显著抑制PSNL小鼠DRG神经元钙离子浓度的上调（P<0.01）。5.OMT与钙通道调节剂GBP对PSNL小鼠步态参数的影响与假手术Sham组比较，PSNL小鼠的SciaticFunctionalIndex（坐骨神经功能指数）显著下调（P<0.01），结扎侧左后足衡量着地脚印的各项参数MaxContactArea(cm2)（最-2- 大接触时间的足印面积）、PrintLength(cm)（足印长度）、PrintWidth(cm)（足印宽度）、PrintArea(cm2)（足印面积）及衡量单足承重、平均压力的各项参数Stands(s)（支撑时相）、SingleStance(s)（单足触地时间）、MeanIntensity（完整足印的平均强度）、MaxContactMaxIntensity（最大接触时间的最大强度）均出现显著下调现象（P<0.01）。与PSNL模型组比较，OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药使SciaticFunctionalIndex（坐骨神经功能指数）显著上调（P<0.01），使衡量着地脚印的各项参数显著上调（P<0.01），使衡量单足承重、平均压力的参数Stands(s)（支撑时相）显著上调（P<0.01）。PSNL处理左后足及OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药均未使右后足的各项参数发生显著变化，对衡量身体协调性及平衡性的参数RegularityIndex（正常步序比）、Swing(s)（摆动时相）、StrideLength(cm)（步幅长度）、BodySpeed(cm/s)（身体速度）也没有显著影响。结论：1.氧化苦参碱能显著改善神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的痛觉超敏现象和自然步态中的坐骨神经功能指数。2.氧化苦参碱在神经病理性疼痛镇痛作用中使PSNL小鼠脑组织、脊髓组织及DRG组织中HVDCCs辅助亚基α2δ而不是β、γ亚基的mRNA的表达发生显著变化，同时，能够抑制PSNL小鼠脊髓组织及DRG组织中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白的过度表达。3.氧化苦参碱与钙通道调节剂加巴喷丁均能抑制神经病理性疼痛PSNL小鼠的DRG神经细胞内钙离子浓度升高，且联合用药无加和或补充作用。4.氧化苦参碱与钙通道调节剂加巴喷丁均能改善神经病理性疼痛PSNL小鼠的多项步态参数，且联合用药无加和或补充作用。5.氧化苦参碱可能通过影响HVDCCs辅助亚基α2δ发挥对于神经病理性疼痛的镇痛作用。关键词：氧化苦参碱；神经病理性疼痛；高电压依赖性钙离子通道；辅助亚基α2δ1-3- 英文论著摘要AbstractPurpose：Presentstudyisaimedtoobserveanalgesisofoxymatrine(OMT)againstneuropathicpainandfurthertoexplorerelativityofthemechanismunderthisOMTanalgesistotheauxiliarysubunitsofhigh-voltagedependentcalciumchannels(HVDCCs).Materialandmethod：1.Throughcarryingpartialsciaticnerveligation(PSNL)onmice,theneuropathicpainmodelwasestablished.2.Byusingvon-FreyfilamentstimulationtodetectED50ofmechanicalwithdrawingthresholdandCatwalkanalyzingsystemtocompareSciaticFunctionalIndex(SFI)amongshamoperated,PSNL,OMT-administratedmice,analgesiaofOMTagainstneuropathicpainwasconfirmedonPSNLmice.3.Throughreal-timePCRmethod,theinfluencesofOMTonthemRNAexpressionsofauxiliarysubunitα2δ1~α2δ4、β1~β4、γ1~γ4wereanalyzedinthebrain,spinalcordanddorsalrootganglia(DRG)tissuesfromneuropathicpain-modeledPSNLmice.4.UsingWestern-blottingmethod,theeffectofOMTonauxiliarysubunitα2δ1proteinexpressionwasdetectedinbrain,spinalcordandDRGtissuesfromneuropathicpainPSNLmice.5.WithFluo-3AMfluorescentprobing,theintracellularcalciumionconcentrationwasdetectedinprimaryculturedDRGneuronsfromshamoperated,PSNL,OMT,GBPandOMT+GBP-administratedmice,andtheeffectsofOMTandGBPontheintracellularcalciumionconcentrationwereanalyzed.6.UsingCatwalkanalysissystem,thechangesofSFI,RegularityIndex,Swing(s),StrideLength(cm),BodySpeed(cm/s),MaxContactArea(cm2),PrintLength(cm),PrintWidth(cm),PrintArea(cm2),Stands(s),SingleStance(s),MeanIntensityandMaxContactMaxIntensitywereanalyzedintheshamoperated,PSNL,OMT,Gabapentine(GBP)andOMT+GBP-administratedmice,thentheeffectsofOMTandGBPontheseCatWalkparameterswereanalyzed.-4- Results：1.OMTsuppressedneuropathicpaininPSNLmice.Comparingtotheshamoperatedgroup,themechanicalpawwithdrawthresholdED50wasdramaticallydecreasedinthePSNLgroupmice(P<0.05);ComparingtothePSNLgroup,themechanicalpawwithdrawthresholdED50(P<0.05)wassignificantlyincreasedandSFIwasremarkablyimproved(P<0.01)withOMTadministration.2.OMTinfluencedmRNAexpressionslevelofmultipleHVDCCsauxiliarysubunitsinneuropathicpain-modeledPSNLmice.Comparingtotheshamoperatedgroup,inthePSNLgroup,themRNAexpressionlevelofHVDCCsauxiliarysubunitα2δ1wasremarkablyincreasedinthebrain,spinalcordandDRGs(P<0.01);ThemRNAlevelofα2δ2subunitwasdramaticallyincreased(P<0.05)inthebrainandspinalcordbutdecreased(P<0.05)inDRGs;ThemRNAlevelofα2δ3subunitwasincreased(P<0.05)inthebrainandspinalcordbutdecreased(P<0.01)inDRGs;ThemRNAlevelofα2δ4subunitwasdecreasedinbrain(P<0.05).ComparingtothePSNLgroup,intheOMT-administratedgroup,themRNAexpressionlevelofα2δ1subunitwasdramaticallydecreasedinthebrain,spinalcordandDRGs(P<0.05);ThemRNAlevelofα2δ2subunitwasdecreaseinthebrainandspinalcord(P<0.05);ThemRNAlevelofα2δ3subunitwasdecreasedinthebrainandspinalcord(P<0.01);ThemRNAlevelofα2δ4subunitwasincreasedinthebrain(P<0.05).Butnoneofauxiliarysubunitsβ1-4andγ1-4wasaffectedbyeitherPSNLorOMTadministration.3.OMTinfluencedtheproteinexpressionlevelofHVDCCsauxiliarysubunitα2δ1inneuropathicpain-modeledPSNLmice.Comparingtotheshamoperatedgroup,inthePSNLgroup,theproteinlevelofα2δ1wasincreasedinthespinalcordandDRGs(P<0.01);ComparingtothePSNLgroup,intheOMT-administratedgroup,theproteinlevelofα2δ1wasdecreasedinthespinalcordandDRGs(P<0.01).Whilesttheproteinlevelofα2δ1didn’tchangeinthebraineitherinthePSNLorOMT-administratedgroup.4.Oxymatrineandgabapentineaffectedintracellularcalciumionconcentrationin-5- culturedDRGneuronsformPSNLmice.Comparingtotheshamoperatedgroup,theintracellularcalciumionconcentrationincreasedsignificantly(P<0.01)intheculturedDRGneuronsfromPSNLmice.WhilestOMT,GBPandOMT+GBPadministrationremarkablysuppressedthiselevation(P<0.01).5.OMTandcalciumchannelregulatorGBPsuppressedneuropathicpain.Comparingtotheshamoperatedgroup,inthePSNLgroup,thesciatiefunctionalindexwasdramaticallydecreased(P<0.01);AndtotheligatedleftsidehindpawinthePSNLgroup,theparameterstoestimatefootprints,suchasMaxContactArea(cm2),PrintLength(cm),PrintWidth(cm)andPrintArea(cm2),andparameterstoestimatesinglepawsupportingandpressure,suchasStands(s),SingleStance(s),MeanIntensity,MaxContactMaxIntensitywereremarkablydecreased(P<0.01).ComparingtothePSNLgroup,totheligatedleftsidehindpawintheOMT,GBPandOMT+GBP-administratedgroup,theSciaticFunctionalIndexwassignificantlyincreased(P<0.01),andtheparametersforestimatingfootprints(P<0.01)andforsinglepawsupportingandpressure(P<0.01)wereremarkablyincreased.Whilesttothenon-ligatedrightsidehindpaw,theseparametersdidn’tshowanysignificantchangesinallPSNL,OMT,GBPandOMT+GBPgroups.Similarly,noneoftheparameterstoestimatebodycoordinationandbalance,suchasRegularityIndex,Swing(s),StrideLength(cm)andBodySpeed(cm/s),wereaffectedinanytreatedgroup.Conclusion：1.OxymatrinecanimprovehyperalgesiaandtheSFIinnaturallytraveledneuropathicpainmodeledPSNLmice.2.OxymatrinecandramaticallychangethemRNAexpressionlevelsofHVDCCsauxiliarysunbunitsα2δbutnotβ、γinbrain,spinalcordandDRGsfromneuropathicpainmodeledPSNLmice.Meanwhile,oxymatrinecansuppressthePSNL-inducedelevationofHVDCCsauxiliarysubunitα2δproteinexpressioninspinalcordandDRGsfromPSNLmice.3.BothoxymatrineandcalciumchannelregulatorgabapentinecanrestraintheelevationofintracellularCa2+ionconcentrationinculturedDRGneuronsfromPSNLmice,andcombinationofoxymatrineandgabapentinedoesn’tshowsynergisticorcomplementary-6- effects.4.BothoxymatrineandcalciumchannelregulatorgabapentinecanimprovesameparametersofCatwalk,andcombinationofoxymatrineandgabapentinetreatmentdoesn’tshowsynergisticorcomplementaryeffects.5.OxymatrinemaysupressneuropathicpainthroughregulatingHVDCCsauxiliarysubunitα2δ.Keyword：Oxymatrine,neuropathicpain,Highvoltagedependentcalciumchannels,auxiliarysubunitsα2δ-7- 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称OMTOxymatrine氧化苦参碱GBPGabapentin加巴喷丁MTMatrine苦参碱SCSophocarpine槐果碱OSCOxysophocarpine氧化槐果碱DRGDorsalrootganglion背根神经节ED5050%effectivedose半数有效量PSNLPartialsciaticnerveligation部分坐骨神经结扎SCISpinalcordinjury脊髓损伤SNLSpinalnerveligation脊神经结扎VDCCsvoltage-dependentcalciumchannels电压依赖性钙通道LVDCCslowvoltage-dependentcalciumchannels低压依赖性钙离子道HVDCCshighvoltage-dependentcalciumchannels高电压依赖性钙通道PVDFPolyvinylidenefluoride聚偏二氟乙烯膜SDSSodiumdodecylsulfatesodiumsalt十二烷基硫酸钠PBSPhosphatebufferedSaline磷酸盐缓冲液Real-TimePCR实时荧光定量PCRWestern-blot蛋白质印迹ω-conotoxin-GVIAω-漏斗网蛛毒素GVIA-8- 正文氧化苦参碱抑制神经病理性疼痛作用与HVDCCs辅助亚基相关性的研究前言疼痛是当机体内外受到较强刺激时所产生的一种不愉快的情感体验，属于一种临床常见症状[1-2]。根据疼痛反应持续时间的长短，可将其分为急性疼痛和慢性疼痛，急性疼痛是指持续时间较短的疼痛反应，一般不会超过三个月，手术、创伤及各种内科外科急症（急性胰腺炎、急性阑尾炎、肾绞痛、胆绞痛、心梗、骨折、外伤等）都可能引起急性疼痛反应，当机体的损伤恢复后急性疼痛症状即可有所减轻[1-2]。慢性疼痛是指疼痛反应的持续时间大于三个月，而且随着时间的推移这种疼痛反应也会出现增强现象，慢性疼痛的疼痛反应可能是轻微的、可能是剧烈的、可能是间歇的、也可能是持续不断的，极大地降低了患者的工作效率和生活质量。神经病理性疼痛（Neuropathicpain,NP）是慢性疼痛的一种。国际疼痛研究协会2011年将神经病理性疼痛定义为由躯体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛。常见的神经病理性疼痛主要包括疱疹后神经痛、三叉神经痛、糖尿病性神经痛、幻肢痛等。神经病理性疼痛患者一般会出现自发性疼痛、诱发性疼痛（痛觉过敏、痛觉超敏）、异常性疼痛、同时伴随着烧灼感及麻木感等生理症状[3-4]，往往还会出现抑郁及焦虑等精神症状[5-6]。我国目前至少有1600万神经病理性疼痛患者，这些患者中有将近一半的人在经过治疗后仅能达到30%的缓解程度，相当数量的患者即使经过长时间的治疗依旧不能完全治愈，并且这种疼痛现象有可能会伴随他们的终生[7]。但神经病理性疼痛的发病机制极其复杂，涉及了多种通路、多种受体、多种递质，使疼痛医学工作者和研究者面临着严峻挑战。因此探讨研究神经病理性疼痛发病机制，研发针对性强的特效治疗药物也是当前神经病理性疼痛研究的重要任务。钙离子通道和钠离子通道的作用在近年来的神经病理性疼痛研究中备受瞩目。英国国家卫生与临床优化研究所(NICE,NationalInstituteforHealthandClinicalExcellence)在2013年发表的《2013NICECG173成人神经病理性疼痛药物管理指南》中推荐具有调节钙通道功能作用的普瑞巴林为一线的抗神经病理性疼痛的药物，更突显了钙离子通道在神经病理性疼痛中的重要作用。-9- 钙通道可通过调节细胞内钙离子浓度[Ca2+]i对肌肉收缩、激素分泌、基因表达、神经递质的释放、突触效能的改善等生理过程产生至关重要的作用。电压依赖性钙离子通道（voltage-dependentcalciumchannels，VDCCs）可以分为高电压依赖性钙离子通道（highvoltage-dependentcalciumchannels，HVDCCs）与低电压依赖性钙离子通道（lowvoltage-dependentcalciumchannels，LVDCCs）。HVDCCs的活化膜电压为-30mV左右[8]，根据成孔亚基α1的不同将其分为Cav1家族和Cav2家族，Cav1家族包括Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3、Cav1.4，统称为L-型HVDCCs，Cav2家族包括Cav2.1（P/Q-型HVDCCs）、Cav2.2（N-型HVDCCs）、Cav2.3（R-型HVDCCs）[9-11]。LVDCCs的活化膜电压为-60mV左右[8]，主要包括Cav3家族（Cav3.1、Cav3.2、Cav3.3），即为T-型VDCCs[9-11]。其中HVDCCs在神经病理性疼痛的发病机制研究中被发现作用突出，并且作为神经病理性疼痛的治疗靶点，在神经病理性疼痛的治疗过程中也发挥了显著作用[12-13]。研究发现，L-型HVDCCs阻断剂硝苯地平能够通过阻断L-typeCa2+channel/NFAT/TRPM8通路而逆转奥沙利铂所造成的冷痛觉过敏现象[14]。在脊髓背角特定位置敲除Cav1.2能抑制神经病理性疼痛所造成的机械超敏反应及背角神经元的过度兴奋现象，鞘内注射抗Cav1.2siRNA也得出相同结论[15]。P/Q-型HVDCCs突变的小鼠对伤害性热刺激、机械刺激及化学刺激表现出较低的敏感性，引起较低的痛觉反应，说明P/Q-型HVDCCs能起到感受伤害的作用[16]。N-型HVDCCs在突触传递过程中发挥了关键的作用，该通道基因缺陷小鼠的神经病理性疼痛症状明显缓解，N-型钙通道在神经病理性疼痛发展中呈现不可或缺的作用[17]，更有阻断药Ziconotide在临床的应用进一步强调了调控N-型钙通道状态在神经病理性疼痛中的重要作用[18]。R-型HVDCCs阻断剂SNX-482能够抑制脊神经结扎（spinalnerveligation，SNL）所造成的神经病理性疼痛现象[19]。以上研究表明HVDCCs在神经病理性疼痛的治疗及发展过程中起着不可或缺的作用。HVDCCs主要由成孔亚基α[20-21]1以及辅助亚基α2δ、β、γ组成的蛋白复合体。以往[22-23]，近几年才发现其辅助亚基α的研究主要集中在成孔亚基α1上2δ对钙通道的调节在[24]，但对β及γ亚单位的研究尚少。α疼痛传导过程中也具有关键作用2δ是由α2亚基与[25]，αδ亚基通过二硫键结合在一起的蛋白复合体2亚单位可以增强HVDCCs的钙电流，[26-27]。αδ亚单位可以改变HVDCCs的电压依赖性2δ亚基主要分为四种亚型，分别为α2δ1（Cacna2d1）、α[28-30]2δ2（Cacna2d2）、α2δ3（Cacna2d3）、α2δ4（Cacna2d4）。β亚基主要分为四种亚型，分别为β1（Cacnb1）、β2（Cacnb2）、β3（Cacnb3）、β4（Cacnb4）[28-30]。γ亚基主要分为八种亚型，分别为γ1（Cacng1）、γ2（Cacng2）、γ3（Cacng3）、-10- γ[28-30]4（Cacng4）、γ5（Cacng5）、γ6（Cacng6）、γ7（Cacng7）、γ8（Cacng8）。研究发现，α2δ1缺失的小鼠脑组织和脊髓突触体中Cav2.2水平下调，其背根神经节（DorsalRootGanglia，DRG）神经元钙电流密度也较低[31]。临床用于疼痛治疗的加巴喷丁（Gabapentin）、普瑞巴林（Pregabalin）等药物可通过与高电压依赖性钙通道的辅助亚基α[32-34]，使得HVDCCs的辅助亚基在2δ1、α2δ2结合而发挥治疗神经病理性疼痛的作用疼痛治疗研究中的意义更加突出。苦参为豆科槐属植物苦参的干燥根，又称为苦骨、地骨、地参、牛参、川参、凤凰爪、野槐根、山槐根[35]。性苦、寒。归心、肝、胃、大肠、膀胱经。具有利尿，杀虫，清热燥湿的功能，主要用于便血，热痢，湿疹，黄疸尿闭，阴肿阴痒，赤白带下，皮肤瘙痒，疥癣麻风，滴虫性阴道炎等[35-36]。苦参生物碱是苦参的主要有效成分，主要包括苦参碱(matrine，MT)、氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)、槐果碱(sophocarpine，SC)、氧化槐果碱（oxysophocarpine，OSC）、槐胺碱(sophoramine)、槐定碱(sophoridine)、槐醇碱（sophoranol）及苦豆碱（aloperine）等[37-38]。临床应用中发现复方苦参注射液用于抗癌辅助治疗时对轻中度癌性疼痛具有较好的镇痛效果[39-40]，对于带状疱疹引起的神经性疼痛也有很好的治疗作用[41-43]。目前苦参生物碱的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化槐果碱等有效成分对于镇痛作用已有实验研究和综述报道[38]。文献报导氧化苦参碱不仅可抑制由部分坐骨神经结扎、冰醋酸刺激、物理热刺激所造成的小鼠疼痛反应[44-46]，还对带状疱疹后神经痛的患者有显著疗效[41-43]。本研究的前期基础也证明了氧化苦参碱的镇痛作用[46-49]，特别是对神经病理性疼痛有较深刻的研究，发现氧化苦参碱能通过影响部分组织HVDCCs成孔亚基α1的蛋白及mRNA表达，发挥影响神经细胞内钙离子浓度和抑制神经病理性疼痛及影响神经递质释放的作用[47-48]。但期间氧化苦参碱的镇痛作用是否像普瑞巴林和加巴喷丁一样影响HVDCCs辅助亚基，以及氧化苦参碱是否对HVDCCs各辅助亚基的影响呈现一致性尚有待进一步研究。因此，本研究基于前期的氧化苦参碱镇痛作用研究[46-49]，利用部分坐骨神经结扎（partialsciaticnerveligation，PSNL）造成的神经病理性疼痛小鼠模型，分别从痛觉超敏和步态分析等方面研究氧化苦参碱对神经病理性疼痛模型小鼠行为模式的改变，分析该过程中氧化苦参碱镇痛作用与HVDCCs中各辅助亚基的相关性，探讨氧化苦参碱对其中α2δ辅助亚基的特别影响，进一步明确在氧化苦参碱的神经病理性疼痛镇痛作用中HVDCCs辅助亚基α2δ的特殊地位，为氧化苦参碱的镇痛作用机制研究提供新的科学数-11- 据。-12- 材料与方法1实验材料1.1药品①氧化苦参碱（纯度为99.01%，批号：150416，成都普菲德生物技术有限公司）。氧化苦参碱的给药剂量为150mg/kg体质量[46,49]。称取0.075g氧化苦参碱溶于5mL生理盐水中，配成浓度为15mg/mL的氧化苦参碱，小鼠腹腔注射剂量为0.1mL/10g体质量。②加巴喷丁（纯度为98%，批号：C10008079，Macklin）。加巴喷丁的给药剂量为100mg/kg体质量[50-51]。称取0.05g加巴喷丁溶于5mL生理盐水中，配成浓度为10mg/mL的加巴喷丁，小鼠腹腔注射剂量为0.1mL/10g体质量。1.2试剂氯仿（批号：T20110309）国药集团化学试剂有限公司氯化钠（批号：20150306）国药集团化学试剂有限公司碳酸氢钠（批号：20151221）国药集团化学试剂有限公司葡萄糖（批号：F20070625）国药集团化学试剂有限公司氯化钙（批号：F2006119）国药集团化学试剂有限公司氯化镁（批号：20150308）国药集团化学试剂有限公司氯化钾（批号：20151121）国药集团化学试剂有限公司醋酸（批号：20151020）国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钠（批号：20151230）国药集团化学试剂有限公司乙二胺四乙酸（批号：20151125）国药集团化学试剂有限公司乙醚（批号：20140218）天津市天河化学试剂厂生理盐水（批号：12082104）沈阳志鹰制药厂乙醇（批号：20141224）天津市富宇精细化工有限公司小鼠抗β-actin抗体（批号：TA-09）北京中杉金桥生物技术有限公司Cacna2d1抗体（批号：A0312）SantaCruzBiotechnologyTween-20（批号：16G005100）北京鼎国昌盛生物技术有限公司胶原酶（Collagenase）（批号：DH070）北京鼎国昌盛生物技术有限公司β-巯基乙醇（批号：DH195-1）北京鼎国昌盛生物技术有限公司BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：65B00150）北京鼎国昌盛生物技术有限公司四甲基二乙胺（TEMED）（批号：DH338-1）北京鼎国昌盛生物技术有限公司-13- Tris（批号：43200602257）GenviewHEPES（批号：1A010540）GenviewPen/Strep（批号：6102601011100）GenviewD-Hank’s（批号：61017010110）GenviewGlycine（批号：57090103300）Genview预染蛋白marker（批号：00156179）ThermoscientificDMSO（批号：D5879）Sigma丙烯酰胺（批号：BCBG4320V）Sigma十二烷基磺酸钠（批号：L-5750）Sigma多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）（批号：070k5002）Sigma亮抑蛋白酶肽（Leupeptin）（批号：195C135）AmrescoFluo-3AM（批号：6F0221）BiotiumDME（批号：SH30023.01）HyClone钙离子载体（Ionomycin）（批号：S1672）碧云天生物技术研究所过硫酸铵（批号：ST005）碧云天生物技术研究所ECL发光液（批号：P0018）碧云天生物技术研究所SDS（批号：151-21-3）北京博奥拓达科技有限公司Bis（批号：0172）北京博奥拓达科技有限公司Acrylamide（批号：BCBG4320V）北京博奥拓达科技有限公司氯化锰（批号：20141011）北京博奥拓达科技有限公司胰蛋白酶抑制剂（Aprotinin）上海楷洋生物技术有限公司胎牛血清（批号：11011-8611）浙江天杭生物科技股份有限公司中性蛋白酶（批号：Z8030）北京索莱宝科技有限公司RNAisoPlus（批号：A8201-1）TaKaRaSYBRPremixExTaqTM（批号：AK6004）TaKaRaPrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNATaKaRaEraserPerfectRealtime）试剂盒（批号：AK3102）辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG北京鼎国昌盛生物技术有限公司-14- （批号：IH-0031）PCR引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。表1引物序列基因序列引物长度（bp）GAPDH[52]上游5´-TAGACAAAATGGTGAAGGTCGG-3126下游5´-AGTTGAGGTCAATGAAGGGGT-3Cacna2d1[53]上游5´-GCAGCCCAGATACCGAAAAG-3´195下游5´-TCGTTGCAGATCTGGGTTCT-3´Cacna2d2上游5´-TACCCATCAGGACCAACCTC-3´127下游5´-GTTTGACAGCACCAGGAACC-3´Cacna2d3上游5´-ACAGACCCTGGAACCTTGTG-3´122下游5´-GGATTTGCTGGATGACGAAG-3´Cacna2d4上游5´-GCTCAACTGGGTTCTTCAGG-3´126下游5´-CGATGTCTTTGGGAGATGTG-3´Cacnb1[54]上游5´-TGTCACCTGACTTGCTGGAG-3´179下游5´-GCCCAAGGACTTCCTACACA-3´Cacnb2[54]上游5´-GTGGATAGGACGGCTGGTTA-3´173下游5´-TGGAACTGGGCACTATGTCA-3´Cacnb3[54]上游5´-ACTGTGGTCCCAAGGTTCTG-3´200下游5´-TTAGAGGGGCATCCATTCTG-3´Cacnb4[54]上游5´-GCAAGAGTAGGAACCGCTTG-3´167下游5´-GCAGCCTCAAAGCCTATGTC-3´Cacng1上游5´-CGTATGATTGACAGCGAGGA-3´121下游5´-GGGAGAAGAGCAGGAGGAAC-3´Cacng2[21]上游5´-CAGAAGTCGGTTGGGTGTTT-3´376下游5´-AGGATCACACTCAGGATCGG-3´Cacng3[21]上游5´-ATCCTCAGCGTCACTCTGCT-3´390下游5´-GCGAGAACTTGACCGTCTTC-3´Cacng4[21]上游5´-AGGATCTACAGCCGCAAGAA-3´362下游5´-GACCTTGAACTGGACCTGGA-3´-15- 1.3动物C57BL/6小鼠，体重为20±2g，雌雄兼用，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号SCXK（辽）2015-0001。所有动物实验均按照辽宁中医药大学实验动物管理条例施行，确保实验动物都能够饲养在室内温度为18-24℃，相对湿度为40%-60%，通风良好，12小时光照，12小时黑暗，洁净而又舒适的环境中。同时要给予小鼠充足的饲料和水。制备神经病理性疼痛模型前使动物适应环境2天。1.4仪器设备实时荧光定量PCR仪（型号：7500realtime）AppliedBiosystems梯度PCR仪（型号：Veriti96Well）；AppliedBiosystems台式高速冷冻离心机（型号：ST16R）Thermo超微量紫外分光光度计（型号：NANODROP2000）Thermo微量移液枪Thermo高压灭菌锅（型号：SQ810c）YamatoPH计（型号：868）Thermo电热恒温鼓风干燥箱（型号：DHG-9140A）上海精宏实验设备有限公司电子天平（型号：BSA2235-CW）赛多利斯科学仪器有限公司电泳设备一套（型号：MiniP-4型）凯元公司（CAVOY）全自动酶标仪伯乐生命医学产品有限公司全自动雪花制冰机（型号：FMB50）上海比朗仪器制造有限公司迷你离心机（型号：LX-200）海门市其林贝尔仪器低速离心机（型号：TDL-40B）上海安亭科学仪器厂脱色摇床（型号：WD-9405A）；沃德生物医学仪器公司塑料薄膜封口机（型号：SG-200）上海凯鸣电子机械有限公司理发器（型号：JW-3012）奉化市巨星电器有限公司连续变倍体视显微镜（型号：SZ61）Olympus冷光源（型号：LG-PS2-5）OlympusCatWalkXT10.5动物步态采集分析系统Noldus公司von-Frey纤毛笔NorthCoastMedicalInc-16- 光扫描共聚焦扫描显微镜（型号：LeicaTcsSp5）Leica超声波清洗机（型号：SB-5200D）；宁波新芝生物科技股份有限公司水浴恒温振荡器（型号：SHA-B）金坛市荣华仪器制造有限公司恒温磁力搅拌器（型号：78-HW-1）；江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司2实验方法2.1神经病理性疼痛模型小鼠的制备方法参照SeltzerZ[55]等人的部分结扎坐骨神经法（PartialSciaticNerveLigation，PSNL）建立神经病理性疼痛模型PSNL小鼠。先将C57BL/6小鼠放入含有乙醚的玻璃罐内麻醉，然后将小鼠的四肢用胶布俯卧固定于手术台上，弯头剪刀将小鼠双侧后腿的毛剔除，手术刀在股骨中部纵向切割形成切口，直头剪子分离股二头肌，弯头镊子寻找坐骨神经，暴露坐骨神经后，滴加少量生理盐水，防止坐骨神经变干而断裂，最后使用带1/2弧度反向切头的细针带5.0的硅处理线牢固结扎于神经背端的1/2～2/3处，使坐骨神经复位后，闭合肌肉，缝合皮肤。PSNL模型组、氧化苦参碱（OMT）给药组、加巴喷丁（Gabapentin，GBP）给药组小鼠均采用此方法结扎坐骨神经，假手术Sham组与模型组的处理方法相同，仅暴露坐骨神经而不实施结扎。2.2给药剂量及给药方法参照姜静[46]等人的前期研究氧化苦参碱的有效浓度为25mg/kg~200mg/kg，且氧化苦参碱的给药剂量为150mg/kg体质量对小鼠部分坐骨神经结扎的神经病理性疼痛具有较好的抑制效果，因此本实验中OMT给药组小鼠按照0.1mL/10g体质量腹腔注射浓度为15mg/mL的氧化苦参碱。参照文献[50-51]，加巴喷丁的给药剂量为100mg/kg，所以GBP给药组小鼠按照0.1mL/10g体质量腹腔注射浓度为10mg/mL的加巴喷丁。假手术Sham组和PSNL模型组腹腔注射等剂量的生理盐水作对照。2.3Up-and-down方法测定机械缩足反应痛阈值ED50采用随机数字表方法将30只C57BL/6小鼠随机分成假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组，每组10只小鼠。结扎坐骨神经后第7天将各组小鼠放入底部为（0.5×0.5）cm2的钢丝网的透明有机玻璃笼子中，在使用von-Frey纤毛笔刺激小鼠后足底前需要让小鼠在笼子中安静1h，以确保小鼠的缩足反应为正常生理反应。参考Dixon[56]等人的方-17- 法，待小鼠已处于一种安静状态时，最首先使用接近正常小鼠机械缩足反应刺激剂量ED50的0.6g的von-Frey纤毛笔刺激小鼠后足底部中间位置，若小鼠出现抬起后足的阳性反应时，记为×，再次刺激足底时选用小一号von-Frey纤毛笔，若小鼠出现没有抬起后足的阴性反应，记为○，再次刺激足底时选用大一号von-Frey纤毛笔，根据记录下来的×和○，查表求出常数k值，并根据公式（ED50=0.2237k+lastforce）计算机械缩足反应痛阈值的ED50。OMT给药组、假手术Sham组和PSNL模型组都需在给药和生理盐水45分钟后刺激后足底。同时需要注意两次刺激后足底的时间间隔不能少于15秒，以防止上一次的刺激对下一次造成影响[57]。2.4实时荧光定量PCR（real-timePCR）检测HVDCCs辅助亚基mRNA表达2.4.1实验分组、给药剂量及取材方法15只体重为20±2g的C57BL/6小鼠采用随机数字表的方法分为假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组，每组5只，分笼饲养。参照实验方法2.1进行造模，手术后第7天，OMT给药组小鼠按照0.1mL/10g体质量腹腔注射浓度为15mg/mL的氧化苦参碱，其余的两组小鼠注射等计量的生理盐水，三组小鼠均在给药1小时后，于冰上提取小鼠的脑组织、脊髓组织及背根神经节（Dorsalrootganglion，DRG）而后放入液氮中，随后转入-80℃冰箱中保存备用。2.4.2实时荧光定量PCR法（real-timePCR）实时荧光定量PCR法（real-timePCR）主要分为以下四个步骤：（1）总RNA的提取：每100mg组织加入1mL的RNAisoPlus，冰中在预冷玻璃匀浆器中研碎裂解，收集液体，离心5min（条件为4℃，13500rpm）。取上清液，加入1/5体积氯仿，剧烈摇动15s，室温静置5min，离心15min（条件同上）。取无色上清液，加入等体积异丙醇，轻轻震荡15s，静置10min，离心10min（条件同上）。沉淀中加入1mL的冰冷75%乙醇轻轻上下震荡清洗沉淀，离心5min（同上），待乙醇挥发后，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀。使用超微量紫外分光光度计测定总RNA浓度。（2）基因组DNA去除反应：用DEPC水稀释RNA成200ng/μL。利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒在冰上配制反应液T1（见表2），使用梯度PCR仪恒温42℃保持2min进行基因组DNA去除反应。（3）RT反应：利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒在冰上配制反应液T2（见表3），将已去除基因组DNA的RNA在梯度PCR仪内反转录成cDNA。反转录条件为：37℃，15min；85℃，5s。（4）PCR反应：利用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒、SYBRPremixExTaqTM以-18- 及引物在冰上配制反应液T3（见表4），将T3与相应cDNA的混合液放入实时荧光定量PCR仪内，进行PCR反应。实时荧光定量PCR仪条件：①95℃，2min；②95℃，30s；③60℃，30s，共40循环。检测结果使用MxPro软件进行分析，用2-ΔΔCt法计算各HVDCCs辅助亚基的mRNA表达变化比值。表2基因组DNA去除反应液T1的配制处方试剂1×RNaseFreedH2O2.0μL5×gDNAEraserBuffer2.0μLgDNAEraser1.0μL注：由上而下的顺序加入试剂，每次轻弹混匀并离心3次。表3RT反应液T2的配制处方试剂1×RNaseFreedH2O4.0μL5×PrimerScriptBuffer24.0μLRTPrimerMix1.0μLPrimerScriptRTEnzymeMixI1.0μL注：由上而下的顺序加入试剂，每次轻弹混匀并离心3次。表4PCR反应液T3的配制处方试剂1×RNaseFreedH2O9.5μL引物0.5μL引物0.5μLSYBRPremixExTaqII12.5μL注：由上而下的顺序加入试剂。-19- 实时荧光定量PCR流程图：研磨组织，收集液体↓4℃，13500rpm，离心5min取上清液，加入1/5体积氯仿，剧烈摇动15s，室温静置5min↓4℃，13500rpm，离心15min取无色上清液，加入等体积异丙醇，轻轻震荡15s，静置10min↓4℃，13500rpm，离心10min75%的冰冷乙醇清洗RNA沉淀↓4℃，13500rpm，离心5min适量DEPC水溶解RNA沉淀，测定总RNA浓度↓用DEPC水稀释RNA成200ng/μL↓去除基因组DNA已去除DNA的RNA↓反转录cDNA↓扩增2-ΔΔCt法计算2.5蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达2.5.1脑、脊髓及背根神经节（DRG）组织的膜蛋白的提取玻璃匀浆器上端标明分组，放入冰里预冷半个小时。冰上配制组织匀浆缓冲液（见表5），将组织平铺到玻璃匀浆器内管底部，尽量铺的薄一些，向玻璃匀浆器内加入适量匀浆缓冲液，研磨组织，切记研磨过程中切勿快速提起玻璃匀浆器内管，防止因空气泡沫而使蛋白样品降解。将玻璃匀浆器内液体转移至1.5mLEP管中，4℃，1700rpm，离心10min。上清液转移至1.5mLEP管中，4℃，13500rpm，离心10min，得到的沉淀即为膜蛋白。冰上配制蛋白样品混悬缓冲液（见表6），根据沉淀的量加入适量的蛋白样品混悬缓冲液悬浮沉淀[58-59]。为避免蛋白降解，将悬浮好的膜蛋白分装好后放入-80℃冰箱中备用。-20- 表5组织匀浆缓冲液的配制处方试剂最终工作液原始储备液稀释倍数体积浓度浓度/1000μL去离子水---861μLHEPES/KOH（PH=7.5）20mM200mM10100μLEDTA/Tris（PH=7.5）2mM500mM2504μLAprotinin200U/mL10000U/mL5020μLPMSF1mM100mM10010μLLeupeptin20μg/mL4mg/mL2005μL注：由上而下顺序加入试剂，Aprotinin、PMSF、Leupeptin需在研磨前临时添加混匀。表6蛋白样品混悬缓冲液缓冲液的配制处方试剂最终工作液原始储备液稀释倍数体积浓度浓度/1000μL去离子水---711μLHEPES/KOH（PH=7.5）50mM200mM4250μLEDTA/Tris（PH=7.5）2mM500mM2504μLAprotinin200U/mL10000U/mL5020μLPMSF1mM100mM10010μLLeupeptin20μg/mL4mg/mL2005μL注：由上而下顺序加入试剂。2.5.2BCA法测定蛋白浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定实验方法2.5.1中提取的膜蛋白浓度。根据需要测定的膜蛋白样品数量，向96孔板的3倍数量孔中每孔加9μL去离子水，而后各孔加入1μL需要测定的相应的膜蛋白样品，即每个样品测定三个复孔浓度。再准备梯度浓度标准蛋白，即向同一96孔板的未使用孔中分别加入0μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL、10μL的去离子水，蛋白标准品将体积补至10μL，每个标准蛋白浓度同样需要三个复孔，加样顺序也是先加去离子水后加蛋白标准品。再将已新鲜配制好的BCA工作液（BCA蛋白浓度测定试剂盒中的A液与B液以50:1的体积比即可配成BCA工作液），向每个孔中都加入200μL。用保鲜膜将96孔板包好放入37℃的水浴恒温振荡器中温育半小时。放至室温后，使用全自动酶标仪在波长为562nm时测定吸光度（OD值），根据蛋白标-21- 准品的OD值绘制标准曲线，需保证线性相关系数R2≥0.999，代入样品的OD值，计算膜蛋白浓度。2.5.3配制8%的聚丙烯酰胺分离胶和3%的聚丙烯酰胺浓缩胶将装胶的模具安装好，用去离子水验漏，验好后用滤纸条将玻璃片内的水去除干净。配制8%的聚丙烯酰胺分离胶（处方见表7），快速混匀后，用1mL的移液枪加至距离模具玻璃片顶端1cm处停止，加胶过程需注意避免双玻璃板与分离胶间及分离胶内气泡产生，再缓慢加入75%的乙醇将分离胶顶端压平，室温静置45分钟左右，可发现分离胶与乙醇之间出现明显的分界线时说明分离胶已经完全凝固。弃掉胶上层的乙醇，用滤纸条将剩余乙醇吸干净，在分离胶上配制浓缩胶。3%的聚丙烯酰胺浓缩胶配制处方见表8，快速混匀后，用1mL的移液枪迅速加入玻璃板中加到溢出为止，将样品梳缓慢水平地插入浓缩胶中，配制过程中同样需避免气泡产生。3%的聚丙烯酰胺浓缩胶室温静置30分钟左右即可凝固。水平匀速地拔出样品梳，用去离子水将样品孔内的气泡冲出。表78%分离胶的配制处方（总体积V=10mL）试剂最终工作液原始储备液稀释倍数体积/10mL浓度浓度去离子水---5.925mLAcrylamide/Bis8%30%3.752.67mLTris/HCl（pH=8.8）0.375M3M81.25mLSDS0.1%10%100100μL（混匀）APS（现用现配）0.05%10%20050μL（混匀）TEMED0.05%100%20005μL（混匀）注：由上而下顺序加入试剂并混匀。表83%浓缩胶的配制处方（总体积V=10mL）试剂最终工作液原始储备液稀释倍数体积/10mL浓度浓度去离子水---7.54mLAcrylamide/Bis3%30%101mLTris/HCl（pH=6.8）0.125M1M81.25mLSDS0.1%10%100100μL（混匀）-22- APS（现用现配）0.1%10%100100μL（混匀）TEMED0.1%100%100010μL（混匀）注：由上而下顺序加入试剂并混匀。2.5.4膜蛋白的处理方法根据BCA法测定的蛋白浓度，计算膜蛋白各样品的上样量，每张胶中各样品孔的蛋白上样量相同。每孔脑组织的蛋白上样量为50μg，脊髓组织的蛋白上样量为50μg，DRG组织的蛋白上样量为40μg。在分离胶和浓缩胶凝固的过程中将膜蛋白样品SDS化处理好。每个样品孔的上样体积为25μL，首先向1.5mLEP管加入对应体积的去离子水，然后加入1/5体积的5×SDSBuffer，再加入对应体积的膜蛋白样品或预染蛋白marker，用涡旋振荡器混匀，最后加入1/20体积的β-巯基乙醇，再用涡旋振荡器混匀，用迷你离心机将全部液体离心至1.5mLEP管底部，用封口膜将开口处封住，放入蛋白漂中，于100℃沸水中煮5分钟，冷却至室温，用涡旋振荡器再次混匀并离心备用。2.5.5电泳及转膜液的配制及PVDF膜处理电泳液配制处方：0.025mol/LTris，0.192mol/LGlycine，0.1%SDS（可提前配制）。转膜缓冲液配制处方：0.025mol/LTris，0.192mol/LGlycine，10%MeOH（需要现用现配，配好后用保鲜膜封好放入冰箱，使用时越凉越好）PVDF膜处理：用甲醇处理PVDF膜20s，立刻浸入转膜缓冲液中并平衡20min以上，之后方在转膜中使用。2.5.6电泳、转膜、封闭、孵育一抗和二抗、洗膜、ECL发光、曝光玻璃板凝胶三明治放置入电泳槽内，把部分电泳液沿容器侧壁小心倒入电泳槽，电泳液液面高度没过分离胶，尽量不产生气泡，若此时在分离胶的最下端有气泡须将气泡赶出，再继续加入电泳液至没过浓缩胶顶端，排除样品孔处的气泡后，用200μL移液枪垂直匀速缓慢地将处理好的膜蛋白加入浓缩胶样品孔中，避免加样时产生气泡。接通电源，设定电泳电压为80V，待含溴酚蓝的蛋白样品经浓缩胶压缩进入分离胶时，重新设定电压为100V继续电泳。待目的蛋白得到充分分离时停止通电，结束电泳。将玻璃板从浓缩胶一面起开，切去浓缩胶和多余部分的分离胶，将留有目的蛋白的分离胶放入转膜液中平衡10min，采用湿转法转膜，按照海绵、滤纸、分离胶、PDVF膜、滤纸、海绵的顺序放置（由负极到正极），排除任何夹层间的所有气泡，用夹板夹紧后放入装有冷转膜缓冲液的转膜槽中，接通电源，转膜条件为：电压100V，持续时间90min。由于转膜过程中会释放出大量的热，需将转膜槽放入冰中于恒温磁力搅拌器-23- 上进行转膜。转膜过程结束后，拆包，将蛋白印迹好的PDVF膜切成与胶一样大小，做好记号，取该PVDF膜以TBS快洗5min，将膜上的胶和转膜液洗掉之后，浸入TBS溶解的5%的牛奶缓慢摇动封闭1h，将膜放入杂交袋中，进行一抗孵育（Cacna2d1抗体，浓度为1:1000），4℃过夜。TBS/T快洗一抗孵育后的PDVF膜30min，每5min换液一次，进行二抗孵育（辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，浓度为1:2000），室温缓慢摇动1h，再用TBS/T快洗PDVF膜30min，每5min换液一次，TBS快洗5min，防止Tween-20对曝光产生影响。在暗室中，将保鲜膜铺到压片暗匣里面，用镊子夹起PDVF膜的一角并用纸巾吸掉多余的TBS，蛋白样品面朝上放于保鲜膜上，将ECL发光试剂盒中的A液500μL与B液500μL等体积混合成ECL发光液，将ECL发光液均匀地加到PDVF膜上，盖上保鲜膜，避免PVDF面与保鲜膜间产生气泡，再盖上暗匣盖子，室温孵育1min，进行发光反应。打开暗匣，将X光片置于包有保鲜膜的PVDF膜上，盖上暗匣盖子，根据观察到的目的条带发光强度决定曝光时间，蛋白表达越强曝光时间越短。取出X光片，放入显影液中3min，再放入定影液中3min，最后用蒸馏水冲干净后室温晾干即可。以上操作均须避光进行。2.5.7条带灰度分析扫描晾干后的X光片，目的蛋白α2δ1和内参蛋白β-actin的条带灰度值用ImageJ2x软件分析，重复实验3次。计算目的蛋白α2δ1与内参蛋白β-actin条带的灰度值比值，计量资料用X±S表示，组间差异采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。蛋白免疫印迹法（Western-blot）操作顺序流程图：配制8%的聚丙烯酰胺分离胶和3%的聚丙烯酰胺浓缩胶↓蛋白上样↓电泳（①电压：80V，时间：40min；②电压：100V，时间：50min）↓湿转法转膜（电压：100V，时间：90min）↓-24- 5%的牛奶缓慢封闭1h，室温↓一抗孵育，4℃过夜↓TBS/T快洗PDVF膜30min↓二抗孵育，室温缓慢摇动1h↓TBS/T快洗PDVF膜30min，TBS快洗5min↓ECL发光、曝光2.6Fluo-3AM荧光探针法测定DRG神经元内钙离子浓度2.6.1DRG神经元的培养参照文献[47,60-61]，于细胞培养的前一天使用浓度为100μg/mL的多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）包被激光共聚焦皿，使其带上正电荷，使用前用高压过的去离子水将激光共聚焦皿清洗两遍晾干备用。冰上提取C57/BL6小鼠的背根神经节（DRG），放入冷的无Ca2+、Mg2+的D-Hank’s试剂中，每个神经节之间的神经丝都需去除。于安全柜中将尽量多的弃掉D-Hank’s，加入适量预先配制好的消化酶（胶原酶5mg/mL，中性蛋白酶2mg/mL等体积混合），消化15分钟左右，每隔5分钟用1mL的枪吹打一次，使DRG消化完全，加入7-10mL的培养液（17%胎牛血清，0.347%葡萄糖，100μg/mL链霉素，100unit/mL青霉素于DME/F-12）终止消化反应，静置2-3分钟，将上清液转移至15mL离心管中，低速离心机1000rpm，离心6min，弃去上清，加入4mL培养液清洗沉淀两次，离心条件同上。加入适量的培养液悬浮细胞后播种至激光共聚焦皿中，放入5%二氧化碳、37°C培养箱中静置1小时，将皿中液体及未贴壁细胞吸出，加入2mL的培养液于5%二氧化碳、37°C培养箱中培养5-7天。2.6.2Fluo-3AM荧光探针测定DRG神经元内钙离子浓度在显微镜下观察激光共聚焦皿中的DRG神经元细胞，选取已经长出神经丝的DRG神经元进行钙离子浓度测定。OMT给药组、GBP给药组、OMT+GBP给药组于测定前分别以OMT（100μg/mL）[61]、GBP（1mM）[62]、OMT+GBP处理PSNL小鼠DRG神经元1小时后再进行测定。将培养皿中的培养液弃掉，以PBS清洗两遍。避光加入浓度为-25- 2.5μmol/L的Fluo-3-AM荧光探针的D-Hank’s混合液，然后用锡纸将激光共聚焦皿包好后放入二氧化碳培养箱中孵育45分钟。孵育结束后用PBS洗掉多余染料，加入1mL的含2+和0.1%葡萄糖的台氏液（CaCl2%Ca21.8mmol/L、NaCl143mmol/L、HEPES5mmol/L、NaH2PO40.3mmol/L、MgCl20.5mmol/L，使用前再加入葡萄糖），激光共聚焦扫描显微镜测定DRG神经元的荧光强度F值。再加入终浓度为5μmol/L的钙离子载体（Ionomycin），测定DRG神经元的荧光强度Fmax。最后加入终浓度为2mmol/L的MnCl2，测定DRG神经元的荧光强度Fmin。实验重复8次。根据测定出的F、Fmax、Fmin及如下公式计算细胞内Ca2+浓度[63]。整个过程要点在于对细胞实施的所有动作均需轻柔，以不使细胞脱落为宜。2+][Cai=Kd×[(F－Fmin)/(Fmax－F)]，Kd（450nM，37℃）为解离常数。DRG神经元钙离子浓度测定流程图：多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）包被激光共聚焦皿↓冰上提取背根神经节（DRG）↓消化15分钟↓清洗沉淀两次（1000rpm，6min）↓播种于激光共聚焦皿↓培养5-7天↓PBS清洗2次↓Fluo-3AM孵育45min↓PBS清洗2次↓加入含2%Ca2+和0.1%葡萄糖的台氏液，测定荧光强度F-26- ↓加入终浓度为5μmol/L的钙离子载体（Ionomycin），测定荧光强度Fmax↓加入终浓度为2mmol/L的MnCl2，测定荧光强度Fmin↓计算细胞内Ca2+浓度2.7CatWalk步态分析仪检测C57/BL6小鼠自然步态2.7.1Catwalk步态分析操作系统实验原理CatWalk步态分析操作系统是定量分析啮齿类动物模型脚步和步态的完整系统。系统的核心设备是一个封闭的走道，动物可以在不受外界干扰的条件下从走道的一端走至另一端。由于走道是透明的玻璃板，且有荧光灯照射，使其呈现绿色光亮，当动物的四脚接触到玻璃板时就会形成折射，这种现象就是脚印光亮折射，利用脚印光亮折射技术可以捕获动物的真实动态的脚印，也可探测四脚压力差异，测量动物体重在四脚的分配情况。目前，Catwalk步态分析操作系统可用于评估神经性疼痛、脊髓损伤、末梢神经损伤、帕金森症、运动失调、创伤性脑损伤、关节炎及中风等。2.7.2动物分组及PSNL神经病理性疼痛造模75只体重30±5g、发育正常、健康的雌性C57/BL6小鼠随机分为假手术Sham组、PSNL模型组、OMT给药组、GBP给药组、OMT+GBP给药组，每组15只，分笼饲养。造模时仅将小鼠左侧坐骨神经部分结扎，以便左右对照以及坐骨神经功能指数（SciaticFunctionalIndex，SFI）的计算。选用体重30±5g的雌性C57/BL6小鼠是因为体重大的小鼠的脚印较清晰，有利于数据采集；另外，雄性小鼠的生殖器则会产生信号噪点，影响数据的采集记录，因此本实验采用体重较大的雌性小鼠。2.7.3CatWalk步态分析仪实验程序及参数设置使用CatWalk步态分析仪进行步态分析实验时应在暗室中进行，这样有利于小鼠足印的记录。开始使用CatWalk步态分析仪前，要对一些实验参数进行设置。首先设置走道，将CatWalk步态分析仪上的C57/BL6小鼠走道挡板拧至最小，以防止小鼠在走路过程中转身。打开CatWalkXT软件，新建一个实验，在DefineWalkway处设置走道的长度及宽度，在CalibrateWalkway处进行摄像头校准，调整摄像头光圈，使校准纸张上字迹清楚，同时将屏幕上的长方形长宽与校准纸张长宽设成相同大小。走道设置的关键是要保证小鼠在这段走道中能有3~4次连续的脚印信息。然后进行实验设置，在Experiment-27- Settings处设置小鼠的分组信息、时间点、要求的合格次数为设为3、在走道中停留的最短时间设为0.5s、最长时间设为5s、平均速度差异不能超过60%。记录脚印的过程中，应先获取背景以抵消背景噪音，再开始录制。可通过点击AdjusttheGreenIntensityThreshold观察脚印清晰度，若脚印不够清晰，可重新校准摄像头，若脚印亮度太低可调节GreenWalkwayLight提高亮度。同一批实验，只需进行一次实验设置即可。2.7.4CatWalk自然步态训练及步态数据采集、分析在所有的实验参数设置好后，对C57/BL6小鼠进行训练，先将小鼠放入走道尽头的暗盒中1~2分钟，让小鼠提前适应环境，然后将C57/BL6小鼠放入走道的开始处，让小鼠从走道的起始处走到暗盒内，刚开始训练的小鼠由于对走道比较陌生，可能不愿意在里面一次性自然走完整个路程，可通过用风筒吹、食物诱惑等方法使小鼠完成训练任务。走道透明玻璃板须保持清洁以免产生折射光信号噪音影响脚印清晰记录和数据采集。每只小鼠每天训练3次，一共训练7天，经过训练的小鼠基本上都能独立自主匀速完整地通过走道，并留有清晰脚印，有个别经过训练依旧不能独立通过完整走道的小鼠可在此时淘汰。使用合格小鼠进行PSNL造模，之后继续使小鼠每天在走道内进行训练，采集造模后第7天小鼠的脚印数据进行数据分析。采集数据须保证C57/BL6小鼠是在无人为干扰的情况下，匀速地通过走道，而且记录下来的数据是有3~4个连续续的脚印，每只小鼠要有至少三次的合格记录。给药45分钟后进行数据采集，其中假手术Sham组及PSNL模型组腹腔注射等剂量的生理盐水。实验数据录制结束后，利用CatWalkXT10软件将C57/BL6小鼠的左、右、前、后足印分别标记，按照统一标准在MeasureFootprints上测量获取TS（远趾端开口距）、PL（足印长度），将采集到的脚印参数数据以excel表格的形式导出进行统计分析。所选取的统计分析参数包括：（1）衡量PSNL小鼠坐骨神经功能恢复情况的指标：①SciaticFunctionalIndex（SFI，坐骨神经功能指数，计算公式：SFI=118.9×（TSE-TSN）/TSN-51.2×（PLE-PLN）/PLN-7.5，TS是远趾端开口距，PL是足印长度，E指的是手术侧即为左后足，N指正常对侧后足即为右后足)。坐骨神经功能指数能反映处理因素对小鼠坐骨神经功能的影响。（2）衡量PSNL小鼠身体协调性、平衡性的指标：①RegμLarityIndex（正常步序比，即正常步序中四足着地次数与行走过程中四足着地的总次数的比值，能直接反映小鼠步序正常与否及步序协调性）；②Swing(s)（摆动时相，行走过程中左右摆动的时间）；③StrideLength(cm)（步幅长度，同一只脚的连续两个脚印之间的距离）；④Body-28- Speed(cm/s)（身体速度）。这些参数能够评估小鼠身体协调性、平衡性的变化情况。（3）衡量PSNL小鼠着地足印变化的指标：①MaxContactArea(cm2)（最大接触时间的足印面积）；②PrintLength(cm)（足印长度）；③PrintWidth(cm)（足印宽度）；④PrintArea(cm2)（足印面积）。小鼠前后左右四足的这些参数变化能够分别反映小鼠各足在着地时的脚印变化情况。（4）衡量PSNL小鼠四足承重及平均压力的指标：①Stands(s)（支撑时相，行走过程中支撑身体的时间）；②SingleStance(s)（单足触地时间，行走过程中仅一只脚触地的时间）；③MeanIntensity（完整足印的平均强度）；④MaxContactMaxIntensity（最大接触时间的最大强度），小鼠前后左右四足的这些参数变化能够分别反映小鼠四足承重、平均压力的变化情况。3数据统计分析使用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料用X±S表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。实验结果1氧化苦参碱对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的镇痛作用1.1氧化苦参碱对PSNL小鼠痛觉超敏的抑制作用PSNL术后小鼠饮食会有所减少，体重略微减轻，并未出现自噬现象。结扎侧后足-29- 呈现拳状保护状态，行走时会出现跛行。术后第七天手术侧后足底受到von-Frey纤毛刺激时迅速出现躲避、抬足、甩腿或反掌伸展等典型的痛觉超敏反应。Up-and-down方法测定手术侧后足的机械缩足反应痛阈值ED50评估小鼠的痛觉超敏反应。表9、图1中的实验结果表明：与假手术Sham组比较，PSNL模型组小鼠结扎侧后足的机械缩足反应痛阈值ED50显著降低（P<0.05）；与PSNL模型组比较，PSNL小鼠腹腔注射OMT（150mg/kg）处理后，结扎侧后足的机械缩足反应痛阈值ED50明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。因此与前期研究结果[46,49]相似，说明PSNL手术使小鼠对von-Frey纤维丝刺激产生了痛觉超敏，而给予OMT则缓解了这种痛觉超敏，证明了OMT能够抑制部分坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛。表9小鼠手术侧后足机械性缩足反应痛阈值ED50（g）比较（n=10，X±S）组别n机械性缩足反应痛阈值ED50（g）Sham101.4±0.2PSNL100.9±0.1*△OMT+PSNL101.3±0.1注：PSNL为部分坐骨神经结扎术术后7天，OMT+PSNL组为PSNL术后7天小鼠腹腔注射150mg/kg氧*△化苦参碱，以下同。与假手术Sham组比较，P<0.05；与PSNL模型组比较，P<0.05。*△注：与假手术Sham组比较，P<0.05；与PSNL模型组比较，P<0.05。图1机械缩足反应痛阈值ED50(g)1.2氧化苦参碱对PSNL小鼠坐骨神经功能指数的改善以Catwalk步态分析系统分析小鼠步态，观察氧化苦参碱对神经病理性疼痛疼痛小鼠自然步态的影响，分析对坐骨神经功能指数的改善作用。表10、图2中数据表明，与假手术Sham组比较，PSNL模型组的SciaticFunctionalIndex（坐骨神经功能指数）显著-30- 下调（P<0.01）；与PSNL模型组比较，OMT给药能使SciaticFunctionalIndex显著上调（P<0.01）。SciaticFunctionalIndex是步态分析中用来衡量PSNL小鼠坐骨神经功能的重要指标，它的显著上调说明神经病理性疼痛行为得到明显改善。所以通过表9和表10的数据都说明OMT对神经病理性疼痛具有明显的镇痛作用。表10PSNL小鼠坐骨神经功能指数比较（n=15，X±S）组别nSciaticFunctionalIndexSham10-10.6±6.7PSNL10-107.5±11.9**△△OMT+PSNL10-79.5±10.9**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。图2SciaticFunctionalIndex2氧化苦参碱对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠HVDCCs各辅助亚基mRNA表达水平的影响2.1氧化苦参碱对PSNL小鼠脑组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达的影响如表11所示。与假手术Sham组比较，PSNL模型组，脑组织中α2δ1、α2δ2的mRNA水平明显升高，α2δ3、α2δ4的mRNA水平明显降低（P<0.05）。与PSNL模型组比较，OMT给药组中，α2δ1、α2δ2、α2δ3及γ1的mRNA水平明显降低，α2δ4的mRNA水平明显升高（P<0.05），β、γ辅助亚基各亚型的mRNA表达水平均无明显变化。提示PSNL神经病理性疼痛使小鼠脑组织中α2δ辅助亚基mRNA水平发生显著变化，而对β、γ辅助亚基的mRNA表达无影响。氧化苦参碱逆转了脑组织中PSNL神经病理性疼痛对α2δ1、α2δ2和α2δ4的作用，对β、γ辅助亚基无影响。-31- 表11脑组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达水平比较（n=5，X±S）基因名ShamPSNLOMT+PSNL**△α2δ1(Cacna2d1)0.979±0.0521.645±0.1440.987±0.238*△α2δ2(Cacna2d2)1.002±0.0401.263±0.0810.998±0.002**△△α2δ3(Cacna2d3)1.000±0.0210.859±0.0030.629±0.013*△α2δ4(Cacna2d4)1.001±0.0330.718±0.0120.879±0.018β1(Cacnb1)1.004±0.0401.012±0.0300.972±0.054β2(Cacnb2)1.000±0.0061.010±0.0781.012±0.073β3(Cacnb3)1.008±0.0501.107±0.1351.001±0.089β4(Cacnb4)1.005±0.0310.997±0.1220.951±0.082△γ1(Cacng1)1.002±0.0411.037±0.0790.753±0.041γ2(Cacng2)0.978±0.0491.003±0.1560.976±0.046γ3(Cacng3)0.985±0.0300.966±0.0290.972±0.063γ4(Cacng4)1.013±0.0700.995±0.0211.002±0.038***△△△注：与假手术Sham组比较，P<0.05，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.05，P<0.01。2.2氧化苦参碱对PSNL小鼠脊髓组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达的影响如表12所示。与假手术Sham组比较，PSNL模型组，脊髓组织中α2δ1、α2δ2、α2δ3、γ1及γ4的mRNA水平均明显升高（P<0.05）。与PSNL模型组比较，OMT给药组中，α2δ1、α2δ2、α2δ3的mRNA水平均明显降低（P<0.05），β、γ辅助亚基各亚型的mRNA表达水平均无明显变化。提示PSNL神经病理性疼痛使小鼠脊髓组织中α2δ辅助亚基mRNA水平发生显著变化，而对β、γ辅助亚基的mRNA表达无影响。氧化苦参碱逆转了脊髓组织中PSNL神经病理性疼痛对α2δ1、α2δ2和α2δ3的作用，对β、γ辅助亚基无影响。表12脊髓组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达水平比较（n=5，X±S）基因名ShamPSNLOMT+PSNL△△α2δ1(Cacna2d1)0.997±0.0121.350±0.083**0.994±0.016△α2δ2(Cacna2d2)1.001±0.0161.310±0.101*1.002±0.024-32- △△α2δ3(Cacna2d3)1.003±0.0291.209±0.061*1.004±0.070α2δ4(Cacna2d4)1.003±0.0300.989±0.2931.012±0.332β1(Cacnb1)0.949±0.0370.948±0.0490.957±0.037β2(Cacnb2)0.972±0.0241.033±0.0460.964±0.022β3(Cacnb3)0.972±0.0231.023±0.1641.037±0.102β4(Cacnb4)0.972±0.0251.012±0.0780.986±0.078γ1(Cacng1)1.001±0.0201.554±0.089**1.354±0.186γ2(Cacng2)1.033±0.0271.137±0.0491.011±0.072γ3(Cacng3)1.007±0.0390.956±0.1390.995±0.083γ4(Cacng4)1.038±0.0331.388±0.069**1.347±0.216***△△△注：与假手术Sham组比较，P<0.05，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.05，P<0.01。2.3氧化苦参碱对PSNL小鼠DRG组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达的影响如表13所示。与假手术Sham组比较，PSNL模型组，DRG组织中α2δ1的mRNA水平明显升高，α2δ2、α2δ3的mRNA水平明显降低（P<0.05）。与PSNL模型组比较，OMT给药组中，α2δ1的mRNA水平明显降低（P<0.05），β、γ辅助亚基各亚型的mRNA表达水平均无明显变化。提示PSNL神经病理性疼痛使小鼠DRG组织中α2δ辅助亚基mRNA水平发生显著变化，而对β、γ辅助亚基的mRNA表达无影响。氧化苦参碱逆转了DRG组织中PSNL神经病理性疼痛对α2δ1的作用，对β、γ辅助亚基无影响。α2δ4和γ3在DRG中没有表达。表13DRG组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达水平比较（n=5，X±S）基因名ShamPSNLOMT+PSNL**△△α2δ1(Cacna2d1)0.991±0.0061.105±0.0040.992±0.003α*2δ2(Cacna2d2)1.002±0.0280.768±0.0810.811±0.134α**0.777±0.0062δ3(Cacna2d3)1.000±0.0130.781±0.032α2δ4(Cacna2d4)———β1(Cacnb1)0.979±0.0251.085±0.2280.988±0.105β2(Cacnb2)1.001±0.0131.089±0.1930.999±0.043β3(Cacnb3)1.012±0.0131.094±0.0231.021±0.152β4(Cacnb4)1.013±0.0480.994±0.1191.044±0.096-33- γ1(Cacng1)1.022±0.0761.102±0.2331.019±0.054γ2(Cacng2)1.001±0.0271.029±0.2760.996±0.108γ3(Cacng3)———γ4(Cacng4)1.043±0.1071.036±0.0701.053±0.060***△△注：与假手术Sham组比较，P<0.05，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。综合以上HVDCCs各辅助亚基mRNA表达检测实验结果，发现辅助亚基α2δ1亚型的mRNA在脑、脊髓、DRG三种组织中，PSNL的神经病理性疼痛使其表达水平呈显著增加，而OMT给药处理使其表达水平下调至正常水平；辅助亚基α2δ2亚型的mRNA在脑、脊髓组织中，PSNL的神经病理性疼痛使其表达水平呈显著增加，而OMT给药处理使其表达水平下调至正常水平；辅助亚基α2δ3亚型的mRNA在脊髓而不是脑和DRG组织中，PSNL的神经病理性疼痛使其表达水平呈显著增加，而OMT给药处理使其表达水平下调至正常水平；辅助亚基α2δ4亚型的mRNA表达在PSNL及OMT处理后，在脑组织中均呈现下降趋势；辅助亚基β1-4亚型和γ1-4亚型均未受到PSNL及OMT给药影响。因此，提示HVDCCs辅助亚基α2δ，特别是α2δ1亚型与神经病理性疼痛及OMT的镇痛作用密切相关，而β亚型和γ亚型则未呈现此相关性。3氧化苦参碱对神经病理性疼痛模型PSNL小鼠HVDCCs辅助亚基α2δ1亚型蛋白表达的影响3.1氧化苦参碱对PSNL小鼠脑组织中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达的影响如图3所示，在脑组织中，与假手术Sham组比较，PSNL模型组中的α2δ1蛋白未发生明显地改变；与PSNL模型组比较，OMT给药组中的α2δ1蛋白也未发生明显地改变。图3小鼠脑组织中α2δ1亚型蛋白表达变化3.2氧化苦参碱对PSNL小鼠脊髓组织中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达的影响如图4所示，在脊髓组织中，与假手术Sham组比较，PSNL模型组中的α2δ1蛋白显著上调，差异有统计学意义（P<0.01）；OMT给药处理抑制了这种α2δ1蛋白增加，并且与-34- PSNL模型组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。图4小鼠脊髓组织中α2δ1亚型蛋白表达变化**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。3.3氧化苦参碱对PSNL小鼠DRG组织中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达的影响如图5所示，在DRG组织中，与假手术Sham组比较，PSNL模型组中的α2δ1蛋白显著上调，差异有统计学意义（P<0.05）；OMT给药处理抑制了这种α2δ1蛋白增加，并且与PSNL模型组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。图5小鼠DRG组织中α2δ1亚型蛋白表达变化**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。综合以上HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白表达检测实验结果，发现神经病理性疼痛及OMT的镇痛作用与调控脊髓组织及DRG组织中α2δ1蛋白表达有关，而未影响脑组织中的α2δ1蛋白表达，提示α2δ1蛋白表达变化在神经病理性疼痛和OMT镇痛中有重要意义。4氧化苦参碱及钙通道调节剂加巴喷丁对PSNL小鼠DRG神经细胞内Ca2+浓度的影响Fluo-3AM是一种能够穿过细胞膜的荧光染料，进入细胞后能被细胞内的酯酶剪切而生成，Fluo-3可与Ca2+结合产生荧光。钙离子载体能使细胞外的钙离子流入细胞内，是荧光强度快速增强。加入Mn2+后，可与Ca2+竞争与Fluo-3相结合，由于Mn2+具有更高的结合能力，而是荧光快速熄灭。表14、图6中的钙离子浓度是根据测定的荧光强度F、Fmax、Fmin所计算的。观察实验数据可以发现，与假手术Sham组比较，PSNL模-35- 型组中DRG神经元细胞的钙离子浓度显著上调（P<0.01），而OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药处理均使PSNL小鼠DRG神经元钙离子浓度显著下调（P<0.01），同时还可以发现三种给药方法得出钙离子浓度之间并没有显著性差异，说明OMT对DRG神经元内钙离子浓度的影响与GBP类似。表14DRG神经元内钙离子浓度变化情况（X±S）2+]组别[Cai（nM）Sham328.627±79.326PSNL577.927±83.616**△△OMT+PSNL322.253±57.988△△GBP+PSNL349.565±46.674△△OMT+GBP+PSNL331.027±89.431**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。图6DRG神经元细胞内钙离子浓度变化情况比较**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。5氧化苦参碱与钙通道调节剂加巴喷丁对PSNL小鼠步态分析参数的影响5.1氧化苦参碱与加巴喷丁对PSNL小鼠坐骨神经功能指数的影响如表15、图7所示，与假手术Sham组比较，PSNL模型组中，SciaticFunctionalIndex（坐骨神经功能指数）显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药均使PSNL小鼠的坐骨神经功能指数显著上调，差异有统计学意义（P<0.01），其中OMT、GBP分别给药使坐骨神经功能指数上调的结果相似，没有显著性差异，OMT+GBP的联合给药也未见显著加和或补充作用。而PSNL处理、OMT-36- 给药、GBP给药、OMT+GBP给药均未使RegularityIndex（正常步序比）发生明显变化（表15、图8）。说明部分坐骨神经结扎能够使小鼠的坐骨神经功能发生显著改变，而对小鼠的正常步序没有影响；OMT和GBP给药也未影响小鼠正常步序，但对坐骨神经功能指数有相似的显著性的调节作用。表15坐骨神经功能指数及正常步序比变化情况（n=15，X±S）组别SciaticFunctionalIndexRegularityIndex（%）Sham-10.586±6.65983.489±10.319PSNL-107.485±11.962**81.674±11.578△△OMT+PSNL-79.585±10.93081.091±9.636△△GBP+PSNL-84.946±11.75680.846±11.134△△OMT+GBP+PSNL-83.602±12.03282.346±8.678**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。图7SciaticFunctionalIndex**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。-37- 图8RegularityIndex（%）5.2氧化苦参碱与加巴喷丁对PSNL小鼠协调性平衡性的影响如表16、图9、图10、图11所示，通过左右自身对照，发现PSNL处理左后足、OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药均未使C57/BL6小鼠的左、右后足的Swing(s)（摆动时相）、StrideLength(cm)（步幅长度）、BodySpeed(cm/s)（身体速度）发生明显变化。说明部分坐骨神经结扎造成的神经病理性疼痛和氧化苦参碱以及加巴喷丁对其镇痛作用对小鼠行进中的协调性、平衡性均无影响。表16衡量协调性、平衡性的CatWalk步态分析指标变化情况（n=15，X±S）组别Swing(s)StrideBodyLength(cm)Speed(cm/s)结Sham0.096±0.0186.184±1.37932.086±1.723扎侧PSNL0.097±0.0325.926±1.16331.286±1.645左OMT+PSNL0.098±0.0066.043±1.59930.317±3.721后足GBP+PSNL0.099±0.0086.157±1.50430.639±2.985OMT+GBP+PSNL0.099±0.0226.187±0.93131.264±2.068未Sham0.102±0.0256.542±1.93932.532±1.775结扎PSNL0.098±0.0176.067±1.48431.163±1.498侧OMT+PSNL0.105±0.0136.854±1.87131.353±2.014右后GBP+PSNL0.101±0.0156.608±1.55530.865±1.649足OMT+GBP+PSNL0.095±0.0116.548±2.11632.877±1.831-38- 结扎侧左后足未结扎侧右后足图9PSNL小鼠后足Swing(s)结扎侧左后足未结扎侧右后足图10PSNL小鼠后足StrideLength(cm)结扎侧左后足未结扎侧右后足图11PSNL小鼠后足BodySpeed(cm/s)-39- 5.3氧化苦参碱与加巴喷丁对PSNL小鼠脚印参数的影响如表17、图12、图13、图14、图15所示，发现在PSNL组小鼠的结扎侧左后足，与假手术Sham组比较，MaxContactArea(cm2)（最大接触时间的足印面积）、PrintLength(cm)（足印长度）、PrintWidth(cm)（足印宽度）、PrintArea(cm2)（足印面积）等脚印参数指标均显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；与PSNL模型组比较，OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药处理则使以上脚印参数指标均显著上调，差异有统计学意义（P<0.01），其中OMT与GBP分别给药作用结果相似而无显著差异，OMT+GBP联合给药未呈现加和作用。对于未结扎右后足而言，各给药处理未使各项脚印参数指标发生显著变化。说明部分坐骨神经结扎手术能够改变结扎侧左后足着地时的各项脚印参数指标，而OMT、GBP给药分别能相似的显著扭转部分坐骨神经结扎所造成的着地脚印参数改变，并且OMT+GBP联合给药没有加和或补充作用。表17衡量着地足印的CatWalk步态分析指标变化情况（n=15，X±S）组别MaxContactPrintLengthPrintWidthPrintAreaArea(cm2)(cm)(cm)(cm2)结Sham0.237±0.0870.921±0.0430.744±0.0230.304±0.016扎PSNL0.037±0.018**0.518±0.033**0.341±0.021**0.059±0.041**侧左△△△△△△△△OMT+PSNL0.088±0.0330.868±0.0450.641±0.0570.229±0.056后△△△△△△△△GBP+PSNL0.081±0.0370.904±0.0810.614±0.0920.266±0.059足△△△△△△△△OMT+GBP+PSNL0.079±0.0260.905±0.0880.598±0.0230.236±0.035未Sham0.240±0.0390.985±0.0490.766±0.0690.336±0.041结PSNL0.248±0.0430.997±0.0380.784±0.0730.342±0.053-40- 扎OMT+PSNL0.243±0.0460.921±0.0820.784±0.0600.336±0.038侧GBP+PSNL0.235±0.0450.932±0.0630.779±0.0580.343±0.044右后OMT+GBP+PSNL0.242±0.0640.935±0.0340.776±0.0590.337±0.052足**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。结扎侧左后足未结扎侧右后足图12PSNL小鼠后足MaxContactArea(cm2)**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。结扎侧左后足未结扎侧右后足图13PSNL小鼠后足PrintLength(cm)**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。-41- 结扎侧左后足未结扎侧右后足图14PSNL小鼠后足PrintWidth(cm)**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。结扎侧左后足未结扎侧右后足图15PSNL小鼠后足PrintArea(cm2)**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。5.4氧化苦参碱与加巴喷丁对PSNL小鼠单足承重和平均压力的影响如表18、图16、图17、图18、图19所示，发现在结扎侧左后足，与假手术Sham-42- 组比较，PSNL模型组的Stands(s)（支撑时相）、SingleStance(s)（单足触地时间）、MeanIntensity（完整足印的平均强度）、MaxContactMaxIntensity（最大接触时间的最大强度）反映单足承重和平均压力的参数指标均显著下调，差异有统计学意义（P<0.01）；与PSNL模型组比较，OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药处理均使Stands(s)（支撑时相）显著上调（P<0.01），且结果相似，而对SingleStance(s)（单足触地时间）、MeanIntensity（完整足印的平均强度）、MaxContactMaxIntensity（最大接触时间的最大强度）没有影响。在未结扎的右后足，PSNL处理左后足、OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药处理均未使以上右后足的单足承重、平均压力的步态指标发生显著变化。说明左后足的部分坐骨神经结扎手术使左后足的单足承重、平均压力发生明显变化，OMT给药、GBP给药能显著改善结扎侧左后足的Stands(s)（支撑时相）且作用相似，OMT+GBP联合给药未能呈现加和或补充作用。表18衡量四足承重、平均压力CatWalk步态分析指标变化情况（n=15，X±S）组别Stands(s)SingleStance(s)MeanIntensityMaxContactMaxIntensity结Sham0.107±0.0390.087±0.02229.983±4.40181.154±9.947扎PSNL0.038±0.018**0.033±0.019**13.026±2.728**21.666±7.475**侧左△△OMT+PSNL0.068±0.0270.036±0.01513.306±1.97120.451±5.749后△△GBP+PSNL0.071±0.0190.037±0.00913.951±2.77122.245±5.751足△△OMT+GBP+0.062±0.0210.038±0.00712.734±1.53721.795±5.628PSNL未Sham0.101±0.0200.096±0.01430.771±1.91883.503±8.222结PSNL0.102±0.0190.098±0.01529.085±2.87383.589±8.701扎侧OMT+PSNL0.108±0.0330.091±0.01530.287±3.35882.415±7.019右GBP+PSNL0.104±0.0160.094±0.01529.806±2.87183.901±6.064后足OMT+GBP+0.100±0.0170.097±0.01329.594±2.87983.607±8.778PSNL**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。-43- 结扎侧左后足未结扎侧右后足图16PSNL小鼠后足Stands(s)**△△注：与假手术Sham组比较，P<0.01；与PSNL模型组比较，P<0.01。结扎侧左后足未结扎侧右后足图17PSNL小鼠后足SingleStance(s)注：与假手术Sham组比较，**P<0.01。-44- 结扎侧左后足未结扎侧右后足图18PSNL小鼠后足MeanIntensity（Pa）注：与假手术Sham组比较，**P<0.01。结扎侧左后足未结扎侧右后足图19PSNL小鼠后足MaxContactMaxIntensity(Pa)注：与假手术Sham组比较，**P<0.01。以上实验结果说明，部分坐骨神经结扎术不影响神经病理性疼痛小鼠行进的协调性和平衡性，但PSNL处理左后足使小鼠的坐骨神经功能指数、手术侧单足着地脚印参数、单足承重、平均压力等步态分析参数指标出现显著下调现象，而OMT给药、GBP给药、OMT+GBP给药均能显著改善这种下调现象，并且OMT与GBP的作用结果相似，-45- OMT+GBP联合给药没有加和或补充作用。讨论慢性疼痛严重干扰着人们的生活和工作质量。神经病理性疼痛作为慢性疼痛的一种，通常与电压依赖性钙离子通道[12]及钠离子通道相关[64]。大量研究都表明高电压依赖性钙离子通道作为神经病理性疼痛的治疗靶点，在其治疗过程中发挥了至关重要的作用[13]。研究发现，电压依赖性钙离子通道的辅助亚基可以调节成孔亚基α1的运输功能和生物物理特性[65]。基因突变研究实验证明，在电压依赖性钙离子通道Cav1和Cav2的成熟早期过程中，辅助亚基α2δ与β均可与成孔亚基α1相结合，并使α1亚基在通道蛋白成熟早期聚集在细胞核周围。同时证明，α2δ亚基是成孔亚基α1向细胞膜聚集并具有阳离子通透功能的关键，这一作用是通过它的VonWillebrandfactor-A（VWA）domain中的metal-ion-dependentadhesionsite（MIDAS）实现的[66]。α2δ亚基作为伴侣蛋白可使HVDCCs通道蛋白在突触大量聚集的同时，还可配置突触部位的VDCCs使其具有促进胞裂外排的作用，加强突触对内流钙离子的利用，提高其促进递质释放的效率[67]。研究还发现增加α[67]2δ和β亚基的表达能够加强P/Q型钙离子通道在突触的积聚作用。β亚基能够加强电压依赖性钙离子通道功能性表达，从而影响Cav1家族和Cav2家族的生-46- 物物理特性[29]。β亚基还能通过有丝分裂原激活蛋白激酶信号通路调节N型电压依赖性钙离子通道的功能[68]。γ亚基也可以通过抑制N型电压依赖性钙离子通道电流来调节该[22]。因此，HVDCCs的辅助亚基α通道的生物物理特性2δ、β、γ对高电压钙离子通道功能的调节具有重要意义。吕晓强、吴世星[47-48]等人发现氧化苦参碱能通过抑制神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的脑组织、脊髓组织及DRG组织中的多种类型的高电压依赖性钙通道成孔亚基α1的mRNA及蛋白的异常表达而达到缓解疼痛的效果。既然氧化苦参碱的镇痛作用与高电压依赖性钙离子通道成孔亚基α1具有高度的相关性，其辅助亚基α2δ、β、γ又对高电压钙离子通道功能的调节具有重要意义，我们有兴趣探讨氧化苦参碱的镇痛作用机制与高电压依赖性钙通道辅助亚基是否相关。研究发现，高电压依赖性钙通道辅助亚基α2δ1在神经病理性疼痛动物模型中的DRG[69]、脊髓背角[70]均出现上调现象，α神经元2δ1亚基的过度表达研究从另一方面证明α2δ1亚基有活化感觉神经元的VDCCs及延长和加强痛觉超敏的作用[71]。在大鼠脊髓T9损伤模型中发现脊髓组织中的高电压依赖性钙通道辅助亚基α2δ1蛋白显著上调，鞘内注射加巴喷丁和Cavα2δ1的脱氧核苷酸可显著抑制该蛋白上调从而逆转脊髓损伤所造成的神[72]，表明了α经病理性疼痛2δ1亚基在神经病理性疼痛的发展过程中起到了举足轻重的作用。因此本实验采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）对神经病理性疼痛PSNL小鼠的HVDCCs辅助亚基α2δ各亚型的mRNA表达量影响的考察，证实了辅助亚基α2δ1在脊髓、DRG中的上调变化，这与文献报道相一致[69-70]。同时，在此基础上，我们将研究范围纵向延伸至痛觉整合的脑组织，发现神经病理性疼痛小鼠脑组织中的α2δ1亚基的mRNA表达也呈上调趋势，说明在疼痛传导整合通路中α2δ1亚基表达呈一致性变化，突出了辅助亚基α2δ中α2δ1亚型对于神经病理性疼痛治疗研究的重要地位。同时，我们将研究范围横向扩大至β、γ多种辅助亚基，探讨了神经病理性疼痛对α2δ外的多种辅助亚基及各亚型的mRNA表达影响，结果表明神经病理性疼痛对β、γ辅助亚基各亚型的影响在脑组织、脊髓组织和DRG组织中未呈一致性变化或没有影响，提示β、γ辅助亚基在神经病理性疼痛中的作用尚不似α2δ1般显著。氧化苦参碱已被证实在小鼠神经病理性疼痛模型中具有镇痛作用，并且与VDCCs有关[47-48]。本研究考察了氧化苦参碱在脑组织、脊髓组织和背根神经节组织中对α2δ、β、γ辅助亚基各亚型的mRNA表达量的影响，结果发现氧化苦参碱翻转了神经病理性疼痛造成的各组织中α2δ1-47- 的mRNA变化，而对其他辅助亚基的影响与疼痛不相关或影响较小。相似结果在本实验的PSNL小鼠脊髓组织及DRG组织中的α2δ1蛋白表达中得到认同。PSNL使该组织中的α2δ1蛋白表达出现显著上调现象，而腹腔注射氧化苦参碱后，α2δ1蛋白明显下调，神经病理性疼痛现象得到缓解。因此，提示氧化苦参碱的镇痛作用机制可能与其影响α2δ1表达有关。加巴喷丁作为钙通道调节剂能够结合高电压依赖性钙通道辅助亚基α2δ而发挥神经病理性疼痛的镇痛作用[32]。因此，本研究进一步通过比较氧化苦参碱和钙调节剂加巴喷丁对神经病理性疼痛PSNL小鼠的细胞内钙离子浓度和步态分析参数的影响，探讨氧化苦参碱和加巴喷丁的作用相似性。利用培养PSNL小鼠的DRG神经元细胞，检测氧化苦参碱、加巴喷丁及两药联合用药对细胞内钙离子浓度的影响，发现氧化苦参碱对DRG神经元细胞内钙离子浓度的影响与加巴喷丁相同，并且两药联合用药并未呈现加和或补充的作用。提示氧化苦参碱对钙通道内流功能的影响与加巴喷丁具有相似性。使用CatWalk步态分析仪得到的步态分析参数结果表明，PSNL使得神经病理性疼痛模型小鼠的坐骨神经功能指数、结扎侧左后足的单足着地脚印参数、单足承重、平均压力的各项参数指标均呈现一致下调现象，而氧化苦参碱、加巴喷丁单独给药及两药联合用药使得以上指标得到显著逆转改善。进一步提示氧化苦参碱的镇痛作用机制可能与加巴喷丁相似，因此推测氧化苦参碱的镇痛作用机制可能与钙通道辅助亚基α2δ1相关。然而氧化苦参碱的神经病理性疼痛镇痛作用与辅助亚基α2δ1特异相关性，尚有待进一步研究。-48- 结论1.氧化苦参碱能显著改善神经病理性疼痛模型PSNL小鼠的痛觉超敏现象和自然步态中的坐骨神经功能指数。2.氧化苦参碱在神经病理性疼痛镇痛作用中使PSNL小鼠脑组织、脊髓组织及DRG组织中HVDCCs辅助亚基α2δ而不是β、γ亚基的mRNA的表达发生显著变化，同时，能够抑制PSNL小鼠脊髓组织及DRG组织中HVDCCs辅助亚基α2δ1蛋白的过度表达。3.氧化苦参碱与钙通道调节剂加巴喷丁均能抑制神经病理性疼痛PSNL小鼠的DRG神经细胞内钙离子浓度升高，且联合用药无加和或补充作用。4.氧化苦参碱与钙通道调节剂加巴喷丁均能改善神经病理性疼痛PSNL小鼠的多项步态参数，且联合用药无加和或补充作用。5.氧化苦参碱可能通过影响HVDCCs辅助亚基α2δ发挥对于神经病理性疼痛的镇痛作用。-49- 本研究创新性的自我评价本研究初步探讨了氧化苦参碱对神经病理性疼痛的镇痛作用机制与HVDCCs辅助亚基的相关性。本研究首次检测了氧化苦参碱在神经病理性疼痛的镇痛作用中对PSNL小鼠脑组织、脊髓组织及DRG组织中HVDCCs各辅助亚基mRNA表达的影响，发现氧化苦参碱对辅助亚基α2δ1而不是β、γ亚基的mRNA表达的影响最为明显，继而发现氧化苦参碱能显著改善脊髓组织及DRG组织中α2δ1蛋白的异常表达。本研究首次利用CatWalk步态分析仪检测氧化苦参碱对神经病理性疼痛小鼠自然步态参数的影响，并发现氧化苦参碱与加巴喷丁处理同时且相似程度对神经病理性疼痛小鼠的多项步态参数具有改善作用。-50- 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综述神经病理性疼痛的机制及治疗药物研究进展摘要：神经病理性疼痛作为慢性疼痛的一种，其发病机制十分复杂。现作为临床常见疾病，严重影响了患者的工作效率以及生活质量。然而目前的医疗水平对神经病理性疼痛的治疗效果并不是十分令人满意。归结其治疗效果不佳的主要原因体现在对发病机制的诊断不明确，有效的治疗药物不完备。本文主要从异位放电、电压依赖性钠离子通道、电压依赖性钙离子通道、N-甲基-D-天冬氨酸受体、炎症因子、胶质细胞、中枢敏化、中枢去抑制等几个方面对神经病理性疼痛的发病机制进行总结综述，并对临床上神经病理性疼痛的常用的治疗药物进行介绍，旨在为临床医疗及科研工作者提供较全面的信息。关键词：神经病理性疼痛，发病机制，治疗药物ResearchprogressonthemechanismsandtherapeuticdrugsofneuropathicpainAbstract:Neuropathicpainisakindofchronicpain,ofwhichthepathogenesisisverycomplex.Asacommonclinicaldisease,neuropathicpainseriouslyaffectsthepatient'sworkefficiencyandqualityoflife.However,thecurrentmedicaltreatmentofneuropathicpainisnotverysatisfying.Themainreasonforitspoortherapeuticeffectisthedifficultytodiagnosethepathogenesisofneuropathicpainandthentogeteffectivetherapeuticdrugs.Thisarticle-57- mainlysummarizesthepathogenesisofneuropathicpainfromthepointofectopicdischarge,voltage-dependentsodiumchannels,voltage-dependentcalciumchannels,N-methyl-D-aspartatereceptors,inflammatoryfactors,glialcells,centralsensitizationandcentraldisinhibition.Furthermore,thisarticleintroducescommonlyclinicaldrugsforneuropathicpain.WeaimtoprovidemoredetailedinformationtothephysiciansandscientistsinthetherapyandstudyofneuropathicpainKeywords:neuropathicpain；pathogenesis；therapeuticdrugs国际疼痛研究协会2011年将神经病理性疼痛（Neuropathicpain,NP）定义为由躯体感觉神经系统的损伤或疾病引起的疼痛，属慢性疼痛的一种，疼痛持续时间超过一个月或经数月数年间隔疼痛复发。神经病理性疼痛在一般人群中具有很高的患病率。研究者在英国的阿伯丁、利兹和伦敦三座城市随机选取了6000名成年人进行调查研究，结果显示慢性疼痛的发病率达52%，而其中由神经病性疼痛所引起的慢性疼痛的发病率高达8%[1]，这项调查使得神经病性疼痛的研究更加有意义。常见的神经病理性疼痛有疱疹后神经痛、三叉神经痛、糖尿病性神经痛、幻肢痛等。神经病理性疼痛患者一般会出现自发性疼痛、诱发性疼痛（痛觉过敏、痛觉超敏）、异常疼痛、烧灼感及麻木感等生理症状[2]，同时还会伴随着抑郁及焦虑等精神症状[3]，虽然这种精神症状随着疼痛的缓解也会有所缓解，但却并不会完全消除，这也令神经病理性疼痛的治疗更加困难，我们必须在设法缓解患者疼痛的同时还要兼顾患者的情绪状况。神经病理性疼痛的发病机制极为复杂，涉及了多种通路、多种受体、多种递质，令其治疗过程特别困难，只有正确的诊断其发病机制，选择正确的治疗药物与治疗方法才能减轻患者的痛苦。因此，本文结合当前神经病理性疼痛的研究发展状况、依据国内外文献报道，主要对神经病理性疼痛的发病机制及常见治疗药物进行综述，以作为今后神经病理性疼痛研究和治疗的参考。1神经病理性疼痛的发病机制神经病理性疼痛过程包括神经冲动上行传导、高级信息中枢整合和下行调控环节，涉及到异位放电、离子通道和受体变化、中枢敏化、神经递质释放和调节、炎症因子、胶质细胞等的功能调节、变化等机制。1.1异位放电与神经病理性疼痛-58- 当外周神经受到损伤后，受损部位以及背根神经节（dorsalrootganglion,DRG）神经元出现自发性持续性异位放电，这种异位放电现象将导致神经病理性疼痛的形成与发展[4]。Liu等人[5]通过大鼠L5脊神经损伤模型发现DRG神经元细胞异位放电现象与神经病理性疼痛行为存在正相关性。研究还发现大鼠L5脊神经的横断能够触发同侧背根神经节神经元轴突异位放电的急剧增加，增至原来的四到六倍，有趣的是，这种异位放电现象直到在术后16小时尚未明显显现，而是在24小时后完成的[6]。Han等人[7]在研究中也发现，神经损伤后异位放电现象会随时间的发生变化，在同一时间段内，神经性疼痛行为也会以相应类似的方式变化。因此，神经病理性疼痛与DRG神经元的异位放电具有高度的相关性，及时抑制DRG神经元异位放电现象能抑制神经病理性疼痛的发展。虽然目前对异位放电的具体机制还没有明确结论，但已有研究表明这种异位放电现象与背根神经节神经元上的电压依赖性离子通道的结构、mRNA、以及蛋白的异常表达具有高度的相关性[4,8]。1.2电压依赖性钠离子通道与神经病理性疼痛外周神经损伤后，DRG神经元中的电压依赖性钠离子（voltage-dependentsodiumchannels,VGSCs）通道的异常表达能导致受损的DRG神经元异位放电促进了神经性疼痛的发展，然而神经损伤是如何影响VGSCs却是未知的，同期的研究也发现神经损伤后，DRG神经元中的Nav1.3和Nav1.8出现了显著的上调现象[9]。Hains等人[10]通过建立了T9脊髓损伤的SD大鼠模型，发现脊髓损伤能够导致神经元过度兴奋和神经病理性疼痛，然后采用定量RT-PCR，原位杂交和免疫细胞化学等方法发现伤害性神经元中的Nav1.3显著上调，而鞘内注射Nav1.3的反义寡脱氧核苷酸能够导致上调的Nav1.3mRNA和蛋白的表达下调，同时背角神经元的兴奋降低，机械性疼痛和热痛觉过敏现象也会减轻。Lai等人[11]发现可以通过下调Nav1.8来治疗神经病理性疼痛，由于Nav1.8仅在感觉神经元中有表达，所以该通道为神经病理性疼痛的治疗提供了一个具有高度特异性和有效性的靶点。Goldberg等人[12]通过采用单倍型分析和突变检测的方法对大量先天性无痛症（Congenitalindifferencetopain,CIP）患者的基因进行研究，发现这些人都会出现Nav1.7基因缺失现象，说明Nav1.7在调节人类疼痛的过程中发挥了一定的作用。Black等人[13]通过研究发现痛性神经瘤患者的Nav1.3，Nav1.7和Nav1.8都出现了上调现象，这个发现对于人类痛性神经瘤的治疗将是一个新的起点。以上这些研究都体现电压依赖性钠离子通道能够影响神经病理性疼痛的的形成与发展。1.3电压依赖性钙离子通道与神经病理性疼痛-59- 近年来大量研究都表明了高电压依赖性钙离子通道（highvoltage-dependentcalciumchannels，HVDCCs）作为神经病理性疼痛的治疗靶点，在其治疗过程中发挥了至关重要的作用[14]。HVDCCs包括了L-型的Cav1家族的钙离子通道和N-、P/Q-、R-型的Cav2家族的钙离子通道[15-16]。吕晓强等人[17]通过实时荧光定量PCR（real-timePCR）对部分坐骨神经结扎（partialsciaticnerveligation,PSNL）所形成的神经病理性疼痛小鼠进行检测，发现脑组织中Cav1.2、Cav1.3、Cav2.1、Cav2.3的mRNA都出现显著上调现象，Cav2.2的mRNA显著降低，脊髓组织中Cav1.2、Cav1.3的mRNA也出现显著上调现象，Cav2.1、Cav2.2、Cav2.3的mRNA显著降低，说明神经病理性疼痛与高电压依赖性钙离子通道的表达变化有关。在大鼠DRG中，外周神经损伤导致Cav1.2、Cav1.3、Cav3.2、Cav3.3的基因表达下调，从而出现了自发性异位放电现象，促进了神经病理性疼痛的发展[8]。而Fossat等人[18]利用Cav1.2的基因敲除以及鞘内注射抗Cav1.2siRNAs等方法，成功抑制了神经病理性疼痛所造成的的机械超敏反应和脊髓背角神经元的兴奋性。Yamamoto等人[19]发现N-型钙通道阻断剂ω-conotoxinGVIA呈剂量依赖性的扭转大鼠慢性压迫性损伤模型（chronicconstrictioninjurymodel,CCI）所造成的热痛觉过敏反应，而P-型钙通道阻断剂ω-agatoxinIVA不能抑制这种现象，提示N-型钙通道阻断剂ω-conotoxinGVIA对某些神经病理性疼痛疼痛模型有较好的抑制效果。药理学和基因敲除研究也表明DRG神经元中N-型电压依赖性钙离子通道是伤害性感受信号传导的关键介质，是镇痛药物开发的主要靶点[20]。HVDCCs主要由成孔亚基α1以及辅助亚基α2δ、β、γ组成的蛋白复合体，钙离子将经由成孔亚基α[21-22]。目前研究的HVDCCs对神经病理性疼痛的影响主要1流入细胞内[23-25]。最近研究才发现其辅助亚基α集中在其成孔亚基α1上2δ对钙通道的调节在疼痛传导过程中也具有关键作用[26]，但对β及γ亚基的研究尚少。研究发现，神经病理性疼痛[27]、脊髓背角[28]均出现上调现象，并且α模型中α2δ1亚基在DRG神经元2δ1亚基的这种上调现象能促进神经病理性疼痛的发展和维持。Boroujerdi等人[29]通过建立脊髓T9损伤模型发现α2δ1蛋白显著上调，鞘内注射加吧喷丁和Cavα2δ1的脱氧核苷酸可显著抑制[30]通过对αα2δ1蛋白上调从而逆转脊髓损伤所造成的神经病理性疼痛。李春英等人2δ1亚基的过度表达研究发现α2δ1亚基能够活化感觉神经元的HVDCCs，还能延长和加强痛觉[31]发现α超敏行为。Patel等人2δ1缺失的的小鼠脑组织和脊髓突触体中Cav2.2水平下调，其DRG神经元钙电流密度也较低。近年来的研究还发现，α2δ1亚基能与细胞外基质蛋白血小板反应蛋白发生相互作用，这种作用会影响HVDCCs的运输功能和加巴喷丁类-60- 药物的作用效果[32]。这表明α2δ1亚基不仅能与Cavα1发生相互作用，还能与其他蛋白发生相互作用进而影响电压门控钙离子通道的功能，因此α2δ1亚基与其他蛋白发生相互作用对神经病理性疼痛的影响或将成为又一研究热点。1.4N-甲基-D-天冬氨酸受体与神经病理性疼痛N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体属于亲离子型谷氨酸受体，属于中枢神经系统兴奋性神经递质受体，主要由NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A、NR3B中的四个亚基组成，研究发现NMDA受体能影响神经病理性疼痛的形成和发展，其拮抗剂能明显减轻神经病理性疼痛行为[33]。DaSilva等人[34]发现NMDA受体NR1亚基的表达增加能够导致痛觉过敏现象，同时增强了机体对外界伤害性刺激的反应性，而降低NR1亚基的表达不仅能产生镇痛作用，还能减弱机体对外界伤害性刺激的反应性。Guo等人[35]发现在大鼠炎症模型中，NMDA受体NR2B亚基的酪氨酸磷酸化能促进炎症和疼痛的维持和发展。Wilson等人[36]对神经病理性疼痛大鼠模型进行了脊髓NMDA受体拮抗剂预先给药处理，与未预先给药的大鼠模型相比，两者通过蛋白免疫印迹法（Western-blot）和免疫组化方法都检测出NMDA受体NR2B亚基表达增加，给药脊髓NMDA受体拮抗剂后，能够减弱模型大鼠的NR2B异常表达，同时减弱了神经病理性疼痛大鼠的热痛觉过敏和冷异常性疼痛，但预先给药的模型大鼠对脊髓NMDA受体拮抗剂要更加敏感。Tan等人[37]发现鞘内注射NMDA受体NR2B亚基siRNA不仅能够显著下调NR2B亚基的mRNA及蛋白的表达，还显著改善了福尔马林所造成的大鼠疼痛反应。以上研究说明NMDA受体拮抗剂对神经病理性疼痛具有较好的抑制作用，而且与阿片类传统镇痛药物相比，NMDA受体拮抗剂具有较少的不良反应与成瘾性，因此目前NMDA受体在神经病理性疼痛研究中也处于焦点位置。1.5炎症因子与神经病理性疼痛神经受损后机体会出现炎症反应，5-羟色胺、缓激肽、组胺、白细胞介素（interleukin,IL）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）、神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）等炎症因子趁机大量释放，从而促进神经病理性疼痛的发展[38]。Schafers等人[39]应用大鼠L5、L6脊神经结扎模型（spinalnerveligationmodel,SNL），发现TNF受体1（TNFR1）和TNF受体2（TNFR2）不仅在受损的L5、L6的DRG神经元中显著上调，在相邻的未受损的L4的DRG神经元也表现为一致的上调现象，损伤和相邻未损伤DRG神经元中TNFR的上调对于TNF效应的增强是必要的，这种增强效应最终导致了神经病理性疼痛行为。Cunha等人[40]发现大鼠单个后足注射炎症因子TNF-α、IL-1β、-61- IL-6、IL-8都能导致痛觉过敏，而且这种痛觉过敏也会出现在未注射的后足，说明了注射的炎症因子能够全身分布，导致痛觉过敏现象。以上的研究说明炎症因子在神经病理性疼痛的发展过程中发挥至关重要的作用，及时地抑制炎症因子的释放能显著改善神经病理性疼痛。1.6胶质细胞与神经病理性疼痛星形胶质细胞和小胶质细胞是一类具有免疫和防御功能中枢神经细胞，主要分布于脊髓和大脑，神经损伤后，胶质细胞会被激活，释放TNF-α、IL-6等炎症因子，促进神经病理性疼痛的发展[38]。金小高等人[41]发现在大鼠CCI模型、SNL模型、保留性脊神经损伤模型（sparednerveinjurymodel,SNI）等神经病理性疼痛模型中，位于脊髓背角Ⅰ层和Ⅱ层的星形胶质细胞和Ⅰ~Ⅰ层的小胶质细胞都出现了明显活化现象。李大鹏等人[42]通过腹腔注射长春新碱建立了大鼠神经病理性疼痛模型，采用免疫组化的方法检测出位于脊髓灰质及脑导水管周围灰质中的星形胶质细胞和小胶质细胞的激活状态都明显提高了。Tsuda等人[43]发现脊髓小胶质细胞的激活能够导致糖尿病大鼠触觉异常性疼痛，而抑制脊髓小胶质细胞的活性能显著减轻这种触觉异常性疼痛现象。Watkins等人[44]发现皮下注射福尔马林可导致大鼠产生快速的痛觉过敏现象，这种痛觉过敏现象涉及脑-脊髓途径，鞘内注射胶质代谢抑制剂氟柠檬酸或具有破坏胶质产物作用的人重组白细胞介素-1受体拮抗剂和神经生长因子抗体都可阻断福尔马林诱导的大鼠痛觉过敏现象。几十年以来对神经病理性疼痛的的研究虽然还不能明确知道损伤或炎症之后是如何维持和增强疼痛状态的，但神经病理性疼痛状态下，胶质细胞的激活是明确的，明确损伤和炎症是如何激活胶质细胞将为神经病理性疼的治疗提供新的方法[45]。1.7中枢敏化与神经病理性疼痛有害刺激、神经损伤及炎症反应都能导致脊髓背角中突触效能的持久增强，使机体对外界伤害性刺激的反应放大，这种现象就是中枢敏化，ΜLtenius等人[46]通过采用免疫组织化学和Western-blot的实验方法对PSNL大鼠检测后发现增强NMDA受体NR1亚基的磷酸化程度能够导致中枢敏化现象，促进神经病理性疼痛的发展。Sarah等人[47]发现NMDA受体和脑源性神经营养因子（BrainDerivedNeurotrophicFactor,BDNF）都参与了中枢敏化和脊髓突触可塑性，接下来的研究表明BDNF能够调节NR1的磷酸化程度影响脊髓突触活动，进而影响中枢敏化现象，影响神经病理性疼痛。Gao等人[48]通过对L5脊神经结扎大鼠的研究也发现NMDA受体NR1亚基的磷酸化能够促进中枢敏化，维持和发展神经病理性疼痛行为。以上研究表明通过抑制中枢敏化来治疗神经病理性疼-62- 痛时，要同时考虑NMDA受体NR1亚基对中枢敏化的影响。1.8中枢去抑制与神经病理性疼痛正常状况下，机体的中枢抑制作用主要是通过脊髓中间神经元和脑干下行通路并通过抑制性神经递质脑啡肽、甘氨酸、γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺（5-HT）、肾上腺素能来实现的[49-51]。神经损伤后，中枢抑制作用会被抑制，脊髓背角神经元兴奋性增强，导致神经病理性疼痛的形成[49]。Moore等人[52]通过对SNI大鼠和CCI大鼠脊髓切片进行检查，发现在这两种神经病理性疼痛大鼠模型中GABA水平都明显下调，GABA抑制机制在脊髓背角浅表也有明显的减弱现象。Linderoth等人[53]通过给CCI大鼠鞘内注射GABAB受体激动剂巴氯芬和拮抗剂CGP55845，发现注射GABAB受体激动剂巴氯芬的CCI大鼠痛觉过敏现象显著下调，而注射GABAB受体拮抗剂CGP55845的CCI[54]发现GABA大鼠痛觉过敏现象明显增强。Patel等人B受体激动剂CGP35023能够显著抑制PSNL大鼠的机械痛觉过敏。因此，提示中枢抑制性神经递质GABA在神经病理性疼痛的调节中有重要的抑制作用。神经病理性疼痛产生与中枢抑制性神经递质GABA功能降低相关，其GABA功能水平提高能够明显缓解神经病理性疼痛现象。2神经病理性疼痛的治疗药物2.1麻醉性镇痛药麻醉性镇痛药具有强大的镇痛效果，但因其具有成瘾性，临床使用过程中受到了很多限制。临床常用的麻醉性镇痛药物包括曲马多、羟考酮、芬太尼、吗啡、美沙酮等。Gimbel等人[55]随机选取了159名中至重度糖尿病性神经痛患者，经过六周的给药试验发现羟考酮能够有效地缓解糖尿病性神经痛患者的疼痛行为。姜宏卫等人[56]发现曲马多对经过传统药物治疗后效果不佳的糖尿病性神经痛患者也有显著疗效。问卷调查结果发现美沙酮能够有效改善神经病理性疼痛患者的疼痛状况、睡眠质量及生活质量，但在治疗过程中往往伴随着嗜睡、恶心、呕吐及便秘等不良反应，使其应用过程中受到了极大限制[57]。近年的研究发现阿片类药物曲马多对神经病理性疼痛的治疗有一定的效果[58]，但以往的研究发现阿片类药物吗啡能够诱发痛觉过敏现象，不利于神经病理性疼痛的治疗[59]。正因如此多的限制和不良反应，麻醉性镇痛药并未作为一线治疗药物用于治疗神经病理性疼痛。2.2抗癫痫药目前临床常用的治疗神经病理性疼痛的抗癫痫药主要包括加巴喷丁、普瑞巴林、苯-63- 妥英钠、唑尼沙胺、卡马西平、拉莫三嗪、托吡酯、丙戊酸钠等[60-61]。加巴喷丁（Gabapentin）及普瑞巴林（Pregabalin）属于二代抗癫痫药物。抗癫痫药治疗神经病理性疼痛的机制主要包括：加强抑制性神经递质GABA的作用，减少Ca2+和Na+流入神经元内，阻断NMDA受体以降低兴奋性递质谷氨酸的作用[60]。Boyce等人[62]发现拉莫三嗪对大鼠异常性疼痛具有良好的治疗效果。Jose[63]等人随机选取53名神经病理性疼痛患者进行双盲实验，分别给予不同剂量的拉莫三嗪、阿米替林及安慰剂，对疼痛的缓解程度及不良反应发生情况进行评估，结果发现拉莫三嗪和阿米替林对疼痛的缓解程度相当，但拉莫三嗪引起的不良反应人数较少，仅占所有不良反应人数的四分之一，而且当拉莫三嗪剂量为25mg，每日两次对神经病理性疼痛具有较好的治疗效果，不良反应发生率也较低。研究还发现奥卡西平及卡马西平对带状疱疹后神经痛、糖尿病性神经痛具有较好的治疗效果，托吡酯及丙戊酸钠可用于预防和治疗急性偏头疼[64]。加巴喷丁（Gabapentin）及普瑞巴林（Pregabalin）属二代抗癫痫药物，为3-取代GABA类似物。近年来的研究发现加巴喷丁和普瑞巴林可通过与高电压依赖性钙通道的辅助亚基α[65-67]。蔡捷等人[68]采用鞘内注2δ1、α2δ2结合而发挥治疗神经病理性疼痛作用射的给药方法，给予SNI大鼠100mg/d的普瑞巴林，结果发现，与生理盐水比较，普瑞巴林能够产生显著的镇痛作用，而且对SNI大鼠的运动功能也没有任何不良影响。Shahid等人[69]发现CCI大鼠局部应用加巴喷丁凝胶不仅能有效缓解机械痛觉过敏及冷异常性疼痛，还能减少相对于腹腔注射造成的副作用。李慧珍等人[70]将80名神经病理性疼痛患者随机分成加巴喷丁给药组和卡马西平给药组，结果发现加巴喷丁的镇痛效果优于卡马西平，不良反应也较少。因此，普瑞巴林和加巴喷丁通过与HVDCCs辅助亚基α2δ结合调控钙离子通道功能而产生抑制神经病理性疼痛，是加强GABA功能之外的神经病理性疼痛镇痛作用机制。目前，加巴喷丁、普瑞巴林已优于其他任何一类药物，成为临床上神经病理性疼痛治疗的一线首选药物。2.3抗抑郁药研究发现，神经病理性疼痛患者往往伴随着抑郁及焦虑情绪，所以抗抑郁药最开始仅仅作为一种辅助用药来治疗神经病理性疼痛，而后期的临床治疗发现抗抑郁药不仅可以改善患者的情绪，还能够有效缓解神经病理性疼痛行为[60-61]。临床常用的治疗神经病理性疼痛抗抑郁药主要包括三环类抗抑郁药（TCAs）、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs）、5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRIs），TCAs的代表药包括丙咪嗪、去甲替林、多虑平、阿米替林，SSRIs的代表药包括帕罗西汀、西酞普兰、氟西-64- 汀、舍曲林，SNRIs的代表药包括文法拉辛、度洛西汀[60-61]。抗抑郁药治疗神经病理性疼痛的主要机制是通过抑制中枢神经系统下行防感受伤害通路中释放的去甲肾上腺素和5-羟色胺的再摄取，也可以阻断钙离子通道、钠离子通道、NMDA受体及腺苷从而抑制神经元的兴奋性[60-61]。黄东祥等人[71]通过使用阿米替林治疗84例带状疱疹后神经痛患者，结果显示有效率高达93%，但一般伴随着口干、困倦等轻微的、可耐受的不良反应。Zarei等人[72]分别采用预防性给药和术后给药两种给药方法检测帕罗西汀对CCI大鼠的作用，结果发现两种给药方法在术后第14天检测都能显著改善机械性异常疼痛和热痛觉过敏现象。Hajhashemi等人[73]应用CCI大鼠检测了文法拉辛对神经损伤所造成的神经病理性疼痛的作用，结果发现在术后第7天、14天、21天急性腹腔注射文法拉辛不能改善大鼠机械性异常疼痛，仅能够改善热痛觉过敏现象，但若是术后第1天开始给药，给至第14天，机械性异常疼痛和热痛觉过敏现象都能得到显著改善，这说明术后立即给予文法拉辛足够的时间能抑制神经病理性疼痛的发展，同时也发现了文法拉辛的作用机制与α2肾上腺素受体有关。神经病协会联盟2010年对于糖尿病痛性神经病、带状疱疹后神经痛、中枢性疼痛等神经病理性疼痛治疗药物推荐中，已将度罗西汀、文法拉辛、三环类抗抑郁药等与加巴喷丁和普瑞巴林一起作为临床的一线推荐药物。2.4其他药物随着神经病理性疼痛的发病率的不断提高，使研究者对其治疗药物的研究也越来越深入。Meier等人[74]研究发现钠通道拮抗剂5%利多卡因贴剂能在使用后8小时内显著减轻患者的持续性疼痛和异常性疼痛，并且该贴剂在使用7天内对外周神经性疼痛综合征（PNPS）表现出了良好的治疗效果。Tung等人[75]发现NMDA受体拮抗剂氯胺酮静脉注射可以用于治疗各种疼痛综合征，包括中枢神经性疼痛、缺血性疼痛和局部疼痛综合征。Cruccu等人[76]发现8%辣椒素贴剂对外周性神经痛具有较好的镇痛效果，起效较快，副作用较少，患者的满意度也较高。神经病理性疼痛的发病机制并不是独立的，而是相互联系的。DRG神经元上电压依赖性钠离子通道、电压依赖性钙离子通道的mRNA及蛋白的异常表达都能导致异位放电现象。增强NMDA受体NR1亚基的磷酸化程度能够促进中枢敏化现象。胶质细胞激活后能释放一些炎症因子。因此，在探讨神经病理性疼痛的发病机制的同时，也应关注发病机制之间的相互关系，以求更合理更精准使用和开发神经病理性疼痛治疗药物。-65- 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在学期间科研成绩[1]徐榕雪,杨丽,吴世星,王鑫蕊.氧化苦参碱对高电压依赖性钙通道辅助亚基的影响[J].中药药理与临床,2016,32(3):49-53.-72- 致谢时光荏苒，三年的药理学研究随着今天的毕业也将告别校园的萌芽阶段，转而进入实践应用。此时此刻，我激动万分，感慨良多，在过去三年中，我通过自己的努力，老师的指导和师兄、师姐、师妹的支持与帮助，不断积累、沉淀，深感自己收获颇丰。在这个过程中，我首先要特别感谢我的导师杨丽教授，从选题、构思、资料搜集、实验环境的建立，杨老师都倾注了大量的心血和汗水，多次为我提出宝贵的意见。杨老师渊博的专业知识、精益求精的工作作风、诲人不倦的高尚师德、严以律己宽以待人的崇高风范、朴实无华平易近人的人格魅力都深深感动着我，潜移默化的影响着我的实验态度和生活习惯，让我终身受益。我还要特别感谢我的父母，父母从经济上给予我无私的支持。他们无私的爱，是我坚持前进的动力，他们的理解和鼓励，陪伴着我一路前行。最后，我要特别感谢我的师姐吕晓强，师哥吴世星和师妹王鑫蕊，他们都曾在我遇到困难的时候帮助过我。感谢在实验室里共同成长、共同进步的所有身影，在实验室里的点点滴滴都将会是以后工作和生活的美好回忆。感谢国家自然科学基金（青年科学基金）项目（N0.81102901）、留学回国人员科研启动基金（教外司留[2012]940号）、辽宁省自然科学基金（N0.201102151）资助。最后，向在百忙中抽出时间对本文进行评审并提出宝贵意见的各位专家表示衷心地感谢!-73- 个人简介基本情况：姓名：徐榕雪性别：女年龄：28岁名族：满族籍贯：辽宁省本溪满族自治县爱好：排球，羽毛球专业：药理学教育及工作经历：1．2014.9-2017.6辽宁中医药大学药理学研究生2．2012.9-2014.6本溪市金山医院从事临床药师工作3．2008.9-2012.6辽宁中医药大学药学本科-74-