DB32∕T 3802-2020 南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法(江苏省)

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1、TCS65.150B51DB32ETE由巳江苏省,万标准DB32/T3802-2020南美白对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法DetectionofEnterocytozoonhepatopenaeiinLitopenaeusvannameibynestedPCR2020-05-25发布2020-06-25实施江苏省市场监督管理局发布DB32/T3802--2020目IJ1=1本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业农村厅提出井归口C本标准起草单位:江苏省海洋水产研究所。本标

2、准主要起草人:万夕和、沈辉、乔毅、史文军、王李宝、黎慧、蒋葛、成捷、范贤平。DB32/T3802--2020南美自对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应(PCR)检测方法1范围本标准规定了南美臼对虾CLitopenaeusvannameï)肝肠胞虫CEnterocytozoonhepatopenaei,EHP)巢式聚合酶链式反应Cpolymeraswchainreation,PCR)检测方法的原理、试剂材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本标准适用于南美臼对虾样品中肝肠子包虫带虫情况的高灵敏定性检测。其他环境生物和饵料生物，以

3、及非生物样品中肝肠胞虫带虫情况检测可参照此方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T25878--2010对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒CTHHNV)检测PCR法SC/T7202.2--2007斑节对虾杆状病毒诊断规程第2部分PCR检测法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1肝肠胞虫Enteroc}归zoonhepatopenaei一种感染对虾肝膜腺、肠进等器官的微由

4、于虫，可致南美白对虾生长缓慢，养殖产量严重下降。4技术原理南美臼对虾肝肠胞虫巢式聚合酶链式反应CPCR)检测方法是以样品DNA为模板，针对其胞壁蛋白基因设计两对特异性巢式寡核昔酸序列为号物，在旧种脱主L该糖昔三磷酸存在下，利用DNA聚合酶的合成作用，经过先后两步数十次变性、退火和延伸的反应循环，1史模板上介于两对引物间的DNA片段得到特异性巢式扩增，通过电泳检测扩增片段是否存在。5试剂材料5.1在分析中仅使用确认为分析纯的化学试剂。5.2实验用水为无菌蒸馆水或超纯水。5.3无水乙醇。5.4液体石蜡。5.5二氧化氯消毒剂

5、。DB32/T3802--20205.6电泳琼脂糖。5.71kbDNAMarkero5.8Tris平衡盼。5.9TaqDNA聚合酶(5U/~L)05.1010xPCR缓冲液，无Mg2+，随TaqDNA聚合酶提供05.11氧化镜溶液(25mmollL)。5.12dNTP(含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各10m日lollL的混合物)05.1320mg/mL蛋白酶Ko5.14TE缓冲液、抽提缓冲液、1x电泳缓冲液、6x载样缓冲液。5.1510mol/L乙酸错。5.16酌-二氧甲炕-异戊醇(25:24:1)。5.17

6、核酸染料。5.1870%乙醇。5.19阳性对照为己知受EHP感染的南美臼对虾样品:阴性对照为己知未受EHP感染的南美臼对虾样品:空白对照为无菌双亲水。6仪器设备所需仪器设备按照SC/T7202.2--2007中第6章的规定。所有非一次性使用的器具应经清洗，浸于新配制的有效氯3.0x10-3的二氧化氯消毒剂中5min，经无PCR产物污染的蒸馆水或超纯水充分淋洗干净后方可用于检测。7操作步骤7.1样品准备取活体!!lG17j(冻南美自对虾或其他生物样品50mg~100mg(环境沉积物样品约500mg)，放入灭菌的1.5mL

7、离心管中，jJ'ií免样品间交叉污染。7.2DNA的提取样品DNA的提取参照SC/T7202.2--200寸中7.1.3执行。7.3PCR反应体系准备7.3.1巢式第一步PCR的反应的模板为抽提的样品DNA，其反应预混物组成及反应条件见表102DB32/T3802--2020表l巢式第一步PCR反应预混物组成及反应条件25IlL休系50μL休系试剂(μU(IlU10xPCR缓冲液(元Mg2+)2.55MgCI(25mmol几)24DNA模板0.5dNTP(1OmmollL)2100ng/IlL引斗匆F1:5'-TTGC

8、AGAGTGTTGTTAAGGGTTT-3'2100ng/IlL引斗匆R1:5'-CACGATGTGTCTTTGCAATTTTC-3'2TaqDNA聚合酶(5U/μU0.250.5灭菌双蒸水16.7533.5扩增程序95'C预变性5min;95'C30s、58'C30s、68'C45s,30次循环68'C终延伸5mino4'C保温