survivin反义寡核苷酸诱导胃癌sgc7901细胞凋亡及对白藜芦醇的增敏作用

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1、Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌SGC7901细胞凋亡及对白藜芦醇的增敏作用【摘要】目的：观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌SGC7901细胞的增殖、凋亡及对白藜芦醇敏感性的影响.方法：人工合成survivin硫代ASODN，通过脂质体转染胃癌细胞株(SGC7901)后，用MTT法检测细胞毒作用；用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡；RTPCR、免疫组化技术检测survivinmRNA及蛋白的表达.结果：①survivinASODN抑制胃癌SGC7901细胞的增殖呈时间和剂量依赖性；②survivinASODN处理组SGC7901细胞24h后凋亡率

2、为(33.6±1.2)%，正义寡核苷酸(SODN)组为(10.7±0.8)%，两组相比，差异有显著性(P<0.05)；③survivinASODN处理组SGC7901细胞survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降.④survivinASODN和白藜芦醇联合处理组SGC7901细胞24，48，72h生长抑制率，显著高于单用survivinASODN组(P<0.05)和单用白藜芦醇组(P<0.05).结论：survivinASODN能够抑制胃癌SGC7901细胞的增殖、诱导凋亡，并能增加胃癌细胞株SGC7901对白藜芦醇的敏感性，推测可能通过下调su

3、rvivinmRNA及蛋白表达而起作用.【关键词】反义寡核苷酸白藜芦醇Survivin基因胃肿瘤细胞凋亡　　0引言　　Survivin基因是继bcl2之后发现的又一重要的凋亡抑制基因，可能是肿瘤治疗的一个分子靶点［1］.一些体外研究表明抑制survivin的表达或功能可以促进凋亡,抑制肿瘤细胞生长［2-3］,说明survivin可作为抗肿瘤基因治疗的靶点,但在体内抑制survivin是否仍能抑制肿瘤生长,目前尚属未知.我们通过脂质体(Lip)介导survivin反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides,ASODN)转染胃癌SGC7901细胞，观

4、察survivinASODN对胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡和对化疗药物白藜芦醇（resveratrol）敏感性的影响如下.　　1材料和方法　　1.1材料　　Lip试剂为Invitrogeo公司产品，Trizol试剂为BBI公司产品.RTPCR试剂盒购自上海生物工程公司，所用兔抗人survivin多克隆抗体购自美国SantaCruz公司，免疫组织化学染色试剂盒（SP即用型）,DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发公司.吖啶橙、白藜芦醇购自Sigma公司，胃癌细胞株SGC7901由兰州大学分子生物教研室提供，培养于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液，置3

5、7℃，50mL/LCO2培养箱中培养.选择对数生长期细胞进行实验.SurvivinASODN序列为5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′，正义寡脱氧核苷酸(SODN)序列为5′CAAGGAGCTGGAAGGCTGGG3′.两种寡核苷酸均经全硫代修饰、纯化.Survivin上游引物:5′GTGAATTTTTGAAACTGGACAG3′，下游引物：5′CCTTTCCTAAGACATTGCTAAG3′，扩增产物243bp；内参照βactin上游引物:5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG3′，下游引物：5′TCATGAGGTAGTCAG

6、TCAGG3′，扩增产物305bp.ASODN,SODN及引物均由上海生工合成.细胞转染按照LipofectamineTM试剂说明书进行.用无血清培养基分别溶解ASODN和SODN，将Lip与核苷酸混合于聚苯乙烯试管中，室温下静置30min后，分别设为ASODN作用组和SODN作用组.　　1.2方法　　1.2.1MTT比色法检测　　细胞毒作用实验分为对照组、Lip组、ASODN+Lip组和SODN+Lip组.寡核苷酸浓度为100，200，300，400和500nmol/L.各组均按每孔5×103细胞数接种96孔板，每组设4个复孔.分别于转染后24，48，72h测定57

7、0nm处吸光度(A570)值.细胞抑制率(%)=(1-A570处理组/A570对照组)×100%，细胞凋亡率(%)=A570处理组/A570对照组×100%.选择400nmol/L浓度进行后续实验.　　1.2.2细胞凋亡的检测　　转染24h后每孔取细胞培养液30μL滴于载玻片上，另加入10μL吖啶橙，盖上盖玻片，置于荧光显微镜下观察细胞形态并拍照.转染24h后，收集2×106个细胞，700mL/L乙醇4℃固定，PBS洗涤2次，RnaseA37℃消化1h，碘化丙啶避光孵育10min，上机检测细胞周期及凋亡细胞所占的比率.　　1.2.3Sur