豆类酸奶发酵微生物的筛选与鉴定

《豆类酸奶发酵微生物的筛选与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

8豆类酸奶发酵微生物的筛选与鉴定刘芸1，刘波1*，朱育菁1，马丽娜1，刘丹莹1，张衡宇2，刘贯锋2（1.福建省农业科学院农业生物资源所，福建福州350003；2.福建农林大学，福建福州350002）摘要：从样品中筛选分离出两株豆类酸奶发酵微生物菌株CF7和CF9，其混合菌株能较好地利用豆类基质发酵形成色泽均匀、风味独特、营养合理的黑豆酸奶。利用形态学观察、生理生化方法对菌株进行分类鉴定。观察到菌株CF7，CF9均为杆状，无芽孢，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。菌株CF7的生理生化特征与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)一致，菌株CF9的生理生化特征与干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)基本一致。对菌株的16SrDNA基因进行扩增、克隆测序、分子系统发育树分析，结果表明菌株CF7为植物乳杆菌，菌株CF9为干酪乳杆菌，这与生理生化鉴定结果一致。关键词:酸豆奶；乳酸杆菌；16SrDNA；分子鉴定；植物乳杆菌；干酪乳杆菌中图分类号:S879.1文献标识码:A　　IsolationandidentificationoflacticacidbacteriastrainsforfermentationofsoybeanyoghourtLIUYun1，LIUBo1,ZHUYu-jing1,XIAORong-feng1,MALi-na1,ZHANGHeng-yu2,LIUGuang-feng2(1.AgriculturalBio-ResourcesResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China;2.FujianAgriculturalandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)Abstract:Inpresentresearch,twolacticacidbacteriastrainsCF7andCF9wereisolatedfromajogurtsample,whichhadbeenscreenedasthebacteriasourceforpreparingbeanyoghourtbeverage.Observationunderscanningandtransmissionelectronicmicroscopeshowedthatbothofthebacteriastrainswererod-shaded,Gram-negativeandcatalase-negativewithoutspore.Accordingtotheirphysiologicalandbio-chemicalproperties,CF7andCF9weresimilartothoseofLactobacillusplantarumandLactobacilluscasei,respectively.ThephylogenetictreeofCF7andCF9onthebaseoftheir16SrDNAsequenceanalysisalsoindicatedthatCF7andCF9wereLactobacillusplantarumandLactobacilluscasei,respectively.Keywords:lacticacidbacteria,16SrDNA,identification,Lactobacillusplantarum,Lactobacilluscasei大豆的蛋白质和油脂是非常优良的营养源，含有大量生理活性物质，包括有低聚糖类、磷脂、维生素类、异黄酮、大豆皂苷等，是人类理想的植物蛋白来源。我国大豆生产资源丰富，是世界上非转基因大豆的主要生产国。大豆产业是我国“十五”重点发展的产业之一，是食品与营养发展的重点领域。将大豆与发酵工程相结合在我国已有悠久的历史。大豆制品经微生物发酵后，内含物质分解，产生了人体所需要的多种营养成份和特殊的鲜香味。更重要的是，发酵豆制品具有许多独特的生理调节功能。目前，发酵豆制品主要有豆豉、豆腐乳、酱油等，但传统发酵豆制品含盐量过高，损害了其生理活性，只能作为餐桌上的佐料，限制了其消费量[1]。因此，有必要加强对大豆发酵食品的研究。研究以大豆等豆类植物蛋白作为主要原料，经适合的微生物发酵而成的豆乳饮料，因其 8具保健功效，成为具有很大开发潜力的功能性食品。其生产中最大的难点是发酵菌种能否适应以豆浆为主的环境，它直接关系到产品的发酵风味、口感和组织状态，因此，发酵剂的筛选成为生产优质产品的首要任务。而目前国内的研究多集中于发酵型酸豆乳饮料生产工艺的探讨[2-8]，对豆类酸奶微生物发酵菌株的筛选则鲜见报道。笔者前期以豆类为基质，观察了来源于样品中的微生物菌群对其有较好的发酵效果。本研究从样品中分离筛选豆类酸奶发酵微生物菌株，在此基础上，研究了所分离的豆类酸奶发酵微生物对豆乳的发酵特性，以及菌株的形态特征，生理生化特征等生物学特性，初步判断其分类学地位。并进一步结合分子鉴定方法，对所得菌株的16SrDNA序列进行了PCR扩增、克隆和测序，对其系统发育学进行了分析。以期为新型大豆功能性食品—豆类发酵乳的开发奠定实践基础。1.材料与方法1.1供试材料菌株来源分离自市售酸奶。MC培养基：大豆蛋白胨5.0g；牛肉浸粉3.0g；酵母浸粉3.0g；葡萄糖20.0g；乳糖20.0g；碳酸钙10.0g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；1%中性红溶液5.0ml；pH6.4±0.2；121℃高压灭菌15min。改良TJA培养基：番茄汁50ml；酵母提取液5.0g；牛肉浸膏10.0g；乳糖20.0g；葡萄糖2.0g；磷酸氢二钾2.0g；吐温-801.0ml；乙酸钠5.0g；琼脂15g；蒸馏水1000ml；pH6.4±0.2；121℃高压灭菌15min。豆奶发酵基质：黑豆浆800ml；鲜牛奶200ml；白砂糖50g；乳糖20g，95℃保持30min灭菌。细菌微量生化鉴定管购自青岛海博生物技术有限公司。采用Biosopin细菌基因组DNA提取试剂盒提取核酸物质。PCR扩增试剂购自上海生工生物工程服务有限公司。其它化学试剂为国产分析纯。采用16SrDNA扩增引物采用通用引物，正向引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。引物由福州博鸿生物技术有限公司合成。1.2试验方法1.2.1豆类酸奶发酵微生物分离与纯化参照文献[9]，以无菌操作将酸奶样品用无菌水梯度稀释，取10-4、10-5，10-6共3个稀释度的混合液各0.2ml，分别均匀涂布于MC培养基的平板上，置于37℃恒温培养48h后观察菌落形态。挑取MC培养基上具有明显钙溶圈的菌落，划线分离纯化2-3次。观察菌落颜色和状态，采用革兰氏染色法，观察染色情况，并进行过氧化氢酶检测。1.2.2豆类酸奶发酵微生物菌株生物学特性的研究形态特征观察：将乳酸杆菌在改良TJA培养基上划线培养48h后，分别用透射电镜和扫描电镜观察该菌的显微结构并拍照。生理生化特征测定：参照文献[10,11]的鉴定标准，分别用纤维二糖，半乳糖，乳糖，乳糖，麦芽糖，甘露醇，甘露糖，蜜二糖，棉子糖，鼠李糖，山梨醇，蔗糖，海藻糖，七叶苷，水杨苷等细菌微量生化鉴定管进行生理生化测定。打开生化鉴定安瓿瓶，用接菌针挑取已纯化培养的同一菌落接种于安瓿瓶中，加200ul灭菌液体石蜡覆盖安瓿瓶内的培养基，于36±1℃培养箱中静置培养48h，观察生化鉴定管的颜色变化。1.2.3豆类酸奶发酵微生物菌株鉴定16SrDNA序列的PCR扩增：取1.2.1中纯化保存的培养物，采用biosopin细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR扩增的模板，利用16S引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL：10×PCRBuffer2.5μL，基因组DNA1μl，dNTP0.3μL，10uM·L-1的Primer各1μl，TaqDNA聚合酶0.3μl，ddH2O18.9μl。PCR扩增程序：94℃变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，72℃延伸10min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，用凝胶图像分析系统观察并保存。PCR产物的克隆、测序及序列对比分析：将扩增成功的PCR 8产物送交福州博鸿生物技术有限公司克隆、测序。将测序结果通过国际互联网GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，采用Blast软件进行序列同源性比较，从而初步判断16SrDNA基因的鉴定结果。同时下载有关种的公认标准序列数据。用ClustalW软件进行比对后进行手工校正，并采用软件DNAMAN分析绘制系统发育树。1.2.4豆类酸奶发酵微生物菌株对黑豆的发酵特性将以上鉴定的2种乳酸杆菌，进行豆类发酵试验。分别接入改良TJA液体培养基活化，然后2菌株按等比例接入豆奶发酵基质，接种总量为3%，静置于36℃隔水式恒温培养箱中发酵12~14h。观察豆乳的色泽，气味以及品尝口味等，并测定其水分、蔗糖、还原糖、蛋白质、粗纤维、组灰分、淀粉、氨基酸的含量。2.结果与分析2.1豆类酸奶发酵微生物分离与纯化分离纯化所得两株豆类酸奶发酵微生物CF7和CF9在MC培养基上形态特征相似，均有明显的溶钙圈，菌落小，白色或粉红色，近圆形，微隆起，湿润，边缘整齐。菌株CF7运动性，能生长于底部，并垂直生长于培养基中部。普通光学显微镜下，菌株形态均为杆状，无芽孢，革兰氏染色反应呈阳性，过氧化氢酶反应均呈阴性，参照文献[9]，可初步确定为乳酸菌。2.2豆类酸奶发酵微生物菌株形态特征电镜观察结果表明，菌株CF7为圆端直杆菌，宽度约0.61~0.77μm，长度约1.26~2.16μm，单个，成对或成短链，缺乏鞭毛。菌株CF9呈短或长杆状，，宽度约0.62~0.93μm，长度约1.39~2.31μm，两端呈方形，且倾向于成长链状，无鞭毛。AB图1透射电镜下菌株CF7的菌落形态(A，B)Fig.1MorphologyofstrainCF7undertransmissionelectronicmicroscopesAB图2透射电镜下菌株CF9的菌落形态(A，B)Fig.4MorphologyofstrainCF9undertransmissionelectronicmicroscopes 8AB图3扫描电镜下菌株CF7的菌落形态(A，B)Fig.3MorphologyofstrainCF7underscanningelectronicscopesAB图4扫描电镜下菌株CF9的菌落形态(A，B)Fig.4MorphologyofstrainCF9underscanningelectronicscopes2.3豆类酸奶发酵微生物生理生化特征菌株CF7，CF9的生理生化鉴定结果见表3。由表3可知，菌株CF7能发酵麦芽糖、七叶苷、山梨醇、棉子糖、甘露糖、水杨苷、纤维二糖、蔗糖、蜜二糖、木糖、乳糖、甘露醇、半乳糖、海藻糖，无法发酵鼠李糖，其生理生化特征与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)一致。菌株CF9能发酵麦芽糖、七叶苷、山梨醇、甘露糖、水杨苷、纤维二糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露醇、半乳糖、海藻糖，无法发酵鼠李糖，棉子糖和蜜二糖，其生理生化特征与干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)基本一致，仅发酵木糖的反应不同[11,12]。因此，初步确定菌株CF7为植物乳杆菌，菌株CF9为干酪乳杆菌。表3菌株CF9细菌微量生化鉴定管测定Table3MicrobiochemicalreactionsofbacteriastrainCF9生化鉴定管CF7鉴定结果CF9鉴定结果鼠李糖--麦芽糖++七叶苷++山梨醇++棉子糖+-甘露糖++水杨苷++纤维二糖++蔗糖++蜜二糖+- 8木糖++乳糖++甘露醇++半乳糖++海藻糖++注：“+”表示阳性反应；“-”表示阴性反应(“+”positive,“-”negative)2.4豆类酸奶发酵微生物菌株鉴定采用引物对菌株CF7和CF9的16SrRNA-PCR的扩增产物进行克隆测序。测得的片段大小分别为1528bp和1531bp。在GenBank上的登录号分别为HQ318714和HQ318715。将2株菌的基因序列输入GenBank数据库，采用BLAST软件进行相似性分析。结果显示，在菌株CF7基因序列相似性高于99%的序列中，大部分为植物乳杆菌的16SrDNA基因序列，其中与Lactobacillusplantarum(登录号为AB104855)的16SrDNA的基因序列相似性达100%。与菌株CF9基因序列相似性高于99%的序列中，大部分为干酪乳杆菌的16SrRNA基因序列，其中与LactobacilluscaseistrainTJ6(登录号为FJ476122)的16SrDNA的基因序列相似性达100%。进一步下载数据库中邻近属或种同源性的16S序列与其对位排列后，利用DNAMAN软件以NeighborJoin法构建系统发育树。根据16SrDNA序列同源性构建系统发育树，可以判断微生物物种之间同源性的远近，如果微生物的16SrDNA序列同源性小于98%，认为属于不同种；同源性小于95%，认为属于不同属[13,14]。从系统发育树中可以看出，菌株CF7与其它三株Lactobacillusplantarum(植物乳杆菌)的序列以100%的置信度聚在一支上，亲缘关系最接近，结合它们之间的同源性高达99%以上，可确定分离的菌株CF7为Lactobacillusplantarum（图8）。菌株CF9与Lactobacilluscasei（干酪乳杆菌）以100%的置信度聚在一支上，亲缘关系最接近，结合它们之间的同源性高达99%以上，可确定分离的菌株CF9为Lactobacilluscasei（图9）。图8　菌株CF7基于16S序列构建的分子系统发育树Fig.8Phyogenetictreebasedon16SsequencesandconstructedusingtheNeighbor-joiningmethodforstrainCF7 8图9　菌株CF9基于16S序列构建的分子系统发育树Fig.9Phyogenetictreebasedon16SsequencesandconstructedusingtheNeighbor-joiningmethodforstrainCF92.5豆类酸奶发酵微生物菌株对黑豆的发酵特性用豆类酸奶发酵菌株CF7，CF9所发酵出的黑豆酸奶色泽均匀一致，呈枣红色，无分层，具有黑豆香，滑爽可口，酸甜适中，pH值为4.28。黑豆酸奶的一般营养成分见表1。由表1可知，黑豆酸奶为高蛋白、低脂肪的营养食品。蛋白质营养价值的优劣是以其必需氨基酸的组成为衡量指标。表2分析了黑豆酸奶中氨基酸的组成，数据表明，黑豆酸奶中的必需氨基酸种类齐全，含量较高，占氨基酸总量比例的42.55%，其中亮氨酸和赖氨酸的含量很高，分别占氨基酸总量的9.26%和8.22%。配比符合FAO／WHO氨基酸模式的要求[10]，所发酵的黑豆酸奶蛋白质适宜人体生理作用需要，营养合理。表1黑豆酸奶中一般营养成分样品名称水分(%)蔗糖(g/100g)还原糖(g/100g)蛋白质(g/100g)粗纤维(%)粗灰分(g/100g)淀粉(%)黑豆酸奶87.73.91.71.620.10.291.6表2各种氨基酸占总氨基酸的百分比(%)测试项目黑豆酸奶测试项目黑豆酸奶苏氨酸4.54天门冬氨酸10.66胱+蛋氨酸0.46+0.94丝氨酸6.05缬草氨酸5.63谷氨酸19.83异亮氨酸4.57甘氨酸3.39亮氨酸9.26丙氨酸4.32酪+苯丙氨酸3.24+5.69组氨酸2.96赖氨酸8.22精氨酸4.86色氨酸-脯氨酸5.38必需氨基酸合计42.55非必需基酸合计57.453.讨论目前国内外食品界对植物性蛋白研究具有浓厚的兴趣。特别是对大豆蛋白的研究，在大豆营养价值的利用和大豆原料深加工方面，都有重要意义。我国大豆资源丰富，畜牧业较 8落后，利用我国的资源优势，以植物性原料代替动物乳，予以适合的微生物进行发酵，研发豆类酸奶饮料，不仅可以缓解我国乳制品不足的现状，还能改善大豆食品行业附加值低、精深加工不足、产品结构单一等一系列问题。而豆类酸奶产品研发的关健是筛选出适应以植物类基质为主要环境的发酵剂。本研究以黑豆为主要发酵基质，筛选分离出2株豆类酸奶发酵微生物菌株，菌株编号分别为CF7，CF9。经菌株生物学特性的研究，16SrDNA序列同源性和系统发育树分析，确定菌株CF7为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，菌株CF9为干酪乳杆菌Lactobacilluscasei。目前国内酸豆奶发酵微生物多为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合发酵剂[7,15-18]。而保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌这两种菌经不住胃酸和胆汁的杀伤作用，不能在肠内定植，存活率仅0.065%~0.01%，其有益作用受到极大限制[19]。此外，还有用植物乳杆菌与嗜热链球菌作为混合发酵剂[6]，双歧杆菌作为发酵剂的报道[8]。但双歧杆菌是厌氧菌，操作要求严格，不利于工业化生产。目前尚末见有关植物乳杆菌和干酪乳杆菌混合菌株发酵酸豆奶的报道。乳酸菌大体上可分为两大类，一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。植物乳杆菌属植物性乳酸菌，多分离自发酵的植物、青贮料、酸泡菜、腌菜等[11]。植物环境的营养成份种类与浓度和动物环境不同，其微生物种群也随之不同。植物性乳酸菌可利用葡萄糖、果糖、蔗糖等，对氨基酸、维生素的需求也较低，而多数动物性乳酸菌只能利用乳糖。植物乳杆菌还能直接将淀粉分解生成乳酸[20]。目前，植物乳杆菌相关发酵饮料，如欧美的含燕麦蔷薇果饮料[21]，日本的“蔬菜的战士”在市场上有着良好的发展态势。因此，植物乳杆菌相对于动物性乳酸菌更适合应用于以豆类为主的发酵基质。干酪乳杆菌多分离自牛奶和干酪、乳制品和奶厂环境，人的口腔和肠道内含物、粪便，青贮饲料等[11]，属动物源乳杆菌。目前主要用作干酪生产，属三大益生菌之一。干酪乳杆菌发酵的凝乳风味柔和，质地均匀光滑，更适合东方人的口味。研究表明，干酪乳杆菌能够利用大豆糖源和大豆脂肪酸，其凝乳的能力可与葡萄糖酸内酯媲美，引起大豆牛奶质感及风味的变化[22]。韩璞等[23]选用嗜酸乳杆菌，瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等8种乳酸菌进行豆乳发酵，筛选得到干酪乳杆菌05-20为最优菌株，其生长繁殖力最强，发酵活力最高。以豆类和牛奶作为发酵基质，以植物乳杆菌和干酪乳杆菌这两种动植物源乳酸菌作为混合发酵剂，更能协同有效地利用豆乳中的动植物蛋白。其发酵出的酸豆奶不仅风味独特，营养丰富，而且植物乳杆菌和干酪乳杆菌能够耐受胃酸、胆碱，可在肠道内大量存活，起着调节肠内菌群平衡、增强人体免疫力的作用[24,25]。并且，植物乳杆菌发酵豆乳或牛乳时，可降解乳中蛋白质产生抑制血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)的短肽物质[26]，对血压调节起着重要作用。同时，以植物乳杆菌作为发酵剂，还可作为生物防腐剂抑制病原微生物的生长[27]，延长商品保质期。因此，所筛选的植物乳杆菌和干酪乳杆菌是豆类酸奶的优良发酵微生物，在大豆发酵型饮料的研制中具有广阔的应用前景。参考文献[1]龚淑俐，邓放明，张忠刚，等.微生物在发酵豆制品生产中的应用[J]。农产品加工，2006(3)：41-45.[2]崔蕊静，高海生，李凤英，等.无腥大豆加工酸豆奶工艺条件的研究[J].中国粮油学报，2004,19(4)：46-49.[3]杨慧，卓勇贤，郑仁兵，等.黑豆双歧酸奶的研制[J].食品科技，2004，12：62-64.[4]孙园，牟光庆，孙成行.黑米与黑豆混合发酵酸奶的研究[J].中国乳品工业，2006，34(8)：40-42.[6]刘爱萍，阿尚武，苗颖，等.绿豆酸奶发酵工艺的研究[J].食品科学，2007，28(2)：108-111.[7]邢建华，侯巧芝，李锟，等.黑豆红枣发酵饮料的研制.安徽农业科学[J]，2008，36(23)：10182-10183.[8]孔青，代志强，周伟，王艳.红豆酸奶的研制.中国酿造.，2009(2)：179-181.[9]中华人民共和国国家标准.GB/T4789.35-2008.食品卫生微生物检验食品中乳酸菌检验.[10]FAO/WHO.Energyandproteinrequirements[J].FAONutritionMeetingPeportSeries,1973:52-63.[11]BUCHANANRE，GIBBONEEN.伯杰氏细菌鉴定手册[M].中国科学科学院微生物研究所，译.第八版.北京：科学出版社，1984. 8[12]东秀株，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.[13]DevereusR,HESH,DoytleCL,etal.JBacteriol,1990,172：3609-3619.[14]FRYNK，WARWICKS，SAUNDERSNA，etal.theuseof16SribosomalRNAanalysestoinvestigatethephylogenyofthefamilylegionellaceae[J].JGenMicrobiol,1991,137:1215-1222.[15]郜宗茂.发酵绿豆奶饮料的加工工艺和营养分析[J].安徽农业技术师范学报，2001,15(2)：52-53.[16]卫雅芳，姜忠丽，毛红骞.以牛乳和大豆乳为原料混合发酵酸乳的研究[J].粮食与食品工业，2003,3,34-36.[17]吴君艳.凝固型大豆酸奶的工艺研究[J].农产品加工，2007，10：53-57.[18]郑立红，张建才，李春华，等.牛奶、大豆蛋白复合酸奶的研制[J].食品与发酵工业，34(4)：154-158.[19]CASTROHP,TEIXELRA.EvidenceofmembranedamageinLactobacillusbulariusfollowingfreezedrying[J].JAppliedMicrobiology,1997,82:87-94.[20]黄怡，王士长，刘金萍.1株植物乳杆菌生物学特性的研究[J].中国微生态学杂志，2006,18(2)：98-99.[21]JOHANSSONML.,NOBAEKS,BERGGRENA,etal.SurvivalofLactobacillusplantarumDSM9843(299V),andeffectontheshort-chainfattyacidcontentoffaecesafteringestionofarose-hipdrinkwithfermentedoats.InternationalJournalofFoodMicrobiology,1998,42(1-2):29-38.[22]AHMADN,李理，杨晓泉，等.乳酸菌培养物的生长特性及其对豆奶质构和风味的影响(英文)[J].现代食品科技，2008,24(4)：301-308.[23]韩璞，田洪涛，苑社强等.发酵大豆乳优良乳菌菌种的的筛选及其发酵性能的研究.现代食品科技，2009,25(3)：282-285.[24]CROWEJ.Thetrehalosemythrevisited:Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate[J].Cryobiology,2001,43(2):89-105.[25]DEVRIESM,VAUGHANEE,KLEEREBEZEMM,etal.Lactobacillusplantarum-survival,functionalandpotentialprobioticpropertiesinthehumanintestinaltract[J].IntDairyJ.2006,16(9):1018-1028.[26]相原浩太郎.発酵乳中に產生する降压ペプチドとその有用性[J].食品と開発，2004，39(6)：7-10.[27]王水泉，包艳，董喜梅，等.植物乳杆菌的生理功能及应用[J].中国农业科技导报，2010，12(4)：49-55.