乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前x基因的分子流行病学意义论文

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1、乙型肝炎病毒相关性原发性肝癌患者前X基因的分子流行病学意义论文【摘要】目的：了解前X基因在HBV相关HCC患者中的流行病学分布、前X基因和HBV基因型与HCC的临床关系.方法：患有乙肝的肝细胞肝癌患者（HCC）35例，采用型特异性引物巢式聚合酶链反应进行基因分型.同时对明确基因分型的肝癌患者，扩增前X区，TA克隆到PMD18T载体后进行单克隆测序，分析前X区在肝癌患者的表达情况，对前X区和基因型及相关病情进行研究.结果：HCC患者35例中B基因型1例，C基因型24例，B/C混合基因型8例.freele,ORF）即前S/S区、前C/C区

2、、P区和X区，分别编码7种性质不同的蛋白如HBcAg，HBeAg，HBsAg等.有研究表明，X区编码的HBxAg与肝细胞肝癌（HCC）的形成密切相关［1］.研究证实，在XORF的上游还存在一个新的ORF即前XORF［2］，而关于其的功能研究尚不多见，是否具有类似功能尚不确定，我们对前XORF功能进行初步探讨.1对象和方法1.1对象200401/200412HBVDNA阳性的HCC患者35例.所有患者均经B超、CT和核磁共振（MRI）或血管造影等临床诊断为乙肝相关性肝癌，采用蛋白酶K、酚氯仿异戊醇法提取血清HBVDNA.乙肝标志物(HBV

3、M：HBsAg，AntiHBs，HBeAg，AntiHBe，AntiHBc）的测定均采用ELISA法检测，试剂由华美生物工程有限公司提供.生化指标（ALT）由我院全自动生化检测仪常规测定.1.2方法通过比对不同HBV基因型序列以及参考Natio［3］等设计的6种主要基因型的分析方法，设计了共同的外引物P1,P2，进行PCR扩增，并以扩增产物为模板进行基因型特异性内引物扩增.基因型特异性内引物扩增分为A，B两组，其中A组包括共有的上游引物P3,PA（基因型A特异性下游引物）,PB（基因型B特异性下游引物），PC(基因型C特异性下游引物），B组

4、包括上游引物P4以及基因型D,E,F的特异性下游引物PD,PE,PF，同时行PCR扩增.取第2轮PCR扩增产物5μL经过20g/L琼脂糖凝胶电泳后判断HBV基因型，根据电泳结果判断HBV基因型.以35例HCC患者中明确HBV基因分型的33例患者HBVDNA溶液为模板，根据前X上游引物Px1,下游引物为Px2，扩增前X区［4］.Px1下游第3133nt处为前X区起始密码子ATG，Px2上游3032nt处为X区起始密码子ATG，扩增的靶区域全长231nt，其中前X区全长为168nt.将PCR产物回收并连接至PMD18T载体，将连接好的重组

5、体转入感受态细胞，经氨苄青霉素（Amp）和Xgal蓝白斑法初步筛选阳性菌落，进一步提取质粒采用PCR法鉴定.对经过鉴定的成功导入前X基因的菌落送测序.统计学处理：所有数据应用SPSS13.0统计软件分析，不同组间率的比较采用χ2检验，均数比较采用t检验.P0.05表示有统计学意义.2结果2.1HBV基因型应用该基因型分型方法，A组PCR产物电泳时A基因型为68bp，B基因型为281bp，C基因型为122bp（图1）;B组电泳时D基因型为119bp，E基因型为167bp，F基因型为67bp.本组的35例患者中，B基因型1例，C基因型24例，B/C

6、混合基因型8例，未定型者2例，未见其他基因型.2.2前X基因PCR扩增扩增的靶区域全长231bp，成功构建出PMD18T前X载体后，以PMD18T载体上游引物M13和Px1为上游引物、Px2为共有的下游引物同时行PCR扩增，可得到308bp和231bp的片断，说明克隆成功.2.3前X基因序列分析经鉴定成功导入重组体的菌落，随机共选取93株送测序.前XORF全长168bp，位于测序片断的第31位至第198位，根据其测序结果推定核苷酸序列如下：ATGGGGCTTGGCTATTGGCCATCGCCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGC

7、TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCGAAACTTATCGGAACCGACAACTCTGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCC；在这93个克隆中有65个克隆在第31~33bp处为ATG，而该位点即为前X基因的起始位点，是成功编码前X多肽的关键所在，占所测核苷酸序列的69.9%.而经过进一步分析发现，在前X基因全长168bp中未发现终止密码子的出现，导致其余28个单克隆不能编码前X多肽的原因在于该位点出现了A→C替换突变，使其不能

8、正常编码.2.4前X多肽在HCC中的分布来自同一例患者的不同单克隆中，只要有一个单克隆可以编码前X多肽，就认为该患者可