降胆固醇实验方法

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1、降胆固醇乳酸菌的筛选、鉴定及降解机制的研究浙江工商大学汪晓辉一、降胆固醇培养基的制备根据Razin等[48]提供的方法制备胆固醇胶束，作为高胆固醇培养液中的胆固醇源。准确称取220mg卵磷脂和100mg胆固醇于具塞试管，加入三氯甲烷溶剂5mL，超声波振荡溶解。氮气流吹干溶剂，加入10mL无菌水。试管放入冰浴，通氮气条件下超声波(130w,20kHz)处理15min，停止5min保持温度平衡，循环三次；所得的溶液于4℃，10000r/min离心20min，所得的上清液即为卵磷脂-胆固醇胶束溶液。4℃保存，当天使用，作为胆固醇源添加于M

2、RS培养基中，用于以下的实验。二、邻苯二甲醛法测定胆固醇含量[49]取1mL样品，加入3mL95%乙醇和2mL50%(w/v)氢氧化钾，旋涡振荡。于60℃下恒温水浴10min冷却后加入5mL正己烷。旋涡振荡萃取1-2min,加入2mL蒸馏水，振荡均匀，静置分层，取2mL上层正己烷，60℃水浴氮气吹干，加入4mL0.5mg/mL(w/v)邻苯二甲醛溶液(用冰醋酸定容)和2mL浓硫酸，显色反应20min，于553nm处测定吸光度值。三、胆固醇标准曲线的测定准确称取0.1g胆固醇粉末，正己烷定容1mg/mL的溶液。然后分别取0.02,0.

3、04,0.06,0.08,0.1,0.12,0.14mL到比色管中，60℃水浴氮气吹干后，加入4mL0.5mg/mL邻苯二甲醛溶液和2mL浓硫酸，显色反应20min，在553nm处测定吸光度值，以胆固醇含量为横轴，吸光度值为纵轴作标准曲线。四、降胆固醇乳酸菌的体外筛选将乳酸菌接种于MRS液体培养基，37℃静置培养I2h转接3次活化后，按2%(v/v)接种量接种于5mL降胆固醇筛选培养基中，摇匀后立即取样1mL,4000r/min离心5min，取上清液用邻苯二甲醛比色法测定胆固醇含量。接种后的发酵液37℃静置培养48h后用同样方法测定

4、上清中胆固醇含量，做多组平行求平均值。胆固醇的降解率：V=（B-A）/B×100%式中:A为各实验菌株发酵后的培养液553nm处的吸光度值。B为空白对照553nm处的吸光度值。降胆固醇益生菌的研究黑龙江大学徐晶雪一、胆固醇标准曲线的制作精确称取的胆固醇100mg，溶于无水乙醇中，并定容至100mL，再精确移取此胆固醇溶液10mL，加入无水乙醇定容至100mL，即为胆固醇标准液，吸取胆固醇标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，10，1.2，1.4，1.6，1.8mL，于试管中。在各管中加入无水乙醇使总体积达2mL，再沿管壁缓慢

5、加入2mL硫酸铁铵显色剂，加完以后再充分振摇混匀，促进呈色。将各试管室温放置30min后于分光光度计560nm波长读取各管吸光度值(A)，并绘制标准曲线。二、供试菌液的制备(1)供试菌液的活化培养将斜面保存的菌株接种至MRS液体培养基中，30℃恒温培养16-18h，取菌悬液1mL转接至装有50mLMRS液体培养基的250mL三角瓶中30℃静置培养16-18h。(2)菌悬液的制备将菌液4000r/min离心15min用已灭菌的生理盐水洗涤菌体沉淀三遍并悬浮于等体积的无菌生理盐水中。三、MRS-CHOL(高胆固醇MRS培养基)的制备精确

6、称取胆固醇0.5g，用少量无水乙醇溶解并定容至50mL，终浓度10.0mg/mL，用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤除菌后，按照1%的量加入到已灭菌的MRS液体培养基中，使MRS液体培养基中胆固醇终浓度为0.1mg/mL。四、菌株体外降胆固醇能力的测定将菌株菌悬液分别以1%和5%的接种量接种于MRS-CHOL培养基中，37℃恒温培养（低速振荡培养60-80r/min）48h和72h后分别测各菌株胆固醇降解能力。菌株胆固醇降解能力的测定：取菌株液体培养物以及未接菌的MRS-CHOL培养基，摇匀后吸取0.2mL于装有4.8mL无水乙醇的

7、离心管中，混匀；室温放置10min；4000r/min离心5min；取上清液2mL于试管中，缓缓加入2mL硫酸铁铵工作液，立即摇匀，空白样为2mL无水乙醇加入2mL硫酸铁铵工作液，室温放置30min于560nm下测各个样品的吸收值，并计算胆固醇的降解率。胆固醇降解率=(胆固醇总量-上清中胆固醇的量)/胆固醇总量