实验十一 精子顶体完整率的测定

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1、实验十一精子顶体完整率的测定一.实验特点实验类型：综合型实验实验类别：专业基础课计划学时：2学时每组人数：1人二．实验目的要求要求学生掌握精子顶体完整率测定的原理和方法。三．实验原理精子顶体异常率指精液中顶体异常的精子数占精子总数的百分率。精子顶体能释放蛋白质分解酶，所以在受精的过程中起着重要的作用，顶体的完整与否和受胎率有着密切的关系。精子经固定和姬姆萨染色后，顶体是否正常在1000倍光镜下均能观察到。顶体异常，一般表现为顶体膨胀、缺损、部分脱落、全部脱落等情况，其发生原因，可能与精子生成过程和副性腺分泌物性状不良有关

2、，尤其是离体精子遭受低温打击和冷冻伤害等因素所造成的。因此精子顶体异常率是评定液态或冷冻精液品质检查的重要指标之一。如果顶体异常率显著增加，例如牛超过14%以上，猪超过4.3%以上，就会直接影响受胎率。四．实验材料设备1.器材：载玻片、三角烧杯、玻璃漏斗、细玻璃棒、滴管、100ml容量瓶、25ml量筒、5ml、10ml刻度细管、生物显微镜（带油镜）、计数器、扭力天平、镊子、平皿、玻璃研皿、洗染架。2.药品：姬姆萨染料、甘油（A.R）、碳酸镁（A.R）、甲醇（G.R）、NaH2P03·2H2O（A.R）、NaHP03·H2

3、0（A.R）、氯化钠（A.R）、二甲苯、香柏油、蒸馏水、中性树脂等。五．实验步骤0.载玻片的清洗载玻片用时必须清洁，否则会影响涂片染色效果。1.涂片冷冻精液解冻后，用细滴管吸一滴精液，滴在载玻片的一端，用薄盖片推片，要求推得薄，而且均匀。2.风干自然风干，5分钟左右。3.固定风干后的涂片，平放在染色架上，用滴管吸取固定液（24h前配好6.8%重铬酸钾液，临用时以8份6.8%重铬酸钾液和2份福尔马林液混合），使固定液由载玻片的一端，缓缓流动，直至铺满整个载玻片，静止15分钟。5.水洗静止15分钟后，用镊子夹住片子的一端将固

4、定液弃去（残液倒入废液缸），在蒸馏水中冲洗3次凉干。6.染片每张片子需用2ml染液（染液的配制：姬姆萨原液20%，缓冲液30%，蒸馏水50%）。用滴管吸取染液，滴在涂片上，使整个染片铺满染液，染色90分钟。（该染液现用现配，配好即用）。1.洗片90分钟后，将涂片上的染液倒入残液缸内，用镊子夹住染片，用装有蒸馏水的洗瓶，缓缓冲洗，直至流水不变兰色，凉干待检。然后树脂封装制成标本，8.镜检置于高倍显微镜下（1000倍以上）或相差显微镜下观察。观察200个以上精子中顶体异常数，计算出精子顶体异常率。六．实验结果在油镜下数一百个

5、精子，计算正常的或变态的精子占精子的百分数。正常顶体：整个精子外形正常，轮廓清晰，顶体形态正常，各层膜清晰可见。疏松顶体：精子外形正常，轮廓清晰，顶体形态正常，但电子密度下降，属正常精子顶体半脱：顶体开始脱落，但顶体内膜的某些部分仍和核膜连接着。顶体微胀：精子顶外形基本正常，顶体轻度膨胀，顶体层疏松，但尚均匀，电子密度下降。顶体膨胀：顶体严重膨胀，表面凹凸不平，膜和顶体层都相当疏松。顶体全脱：顶体全部脱落，只剩下光秃的头部，核膜（有时有顶体内膜）一般清晰可见。七．注意事项凡已稀释过的精液（含有卵黄、甘油的），必须将样品在

6、含有2%甲醛的柠檬酸盐中固定，涂片后在37℃下干燥，才能有利染色着色和观察清晰。此外要求冷冻精液解冻后，应以37℃中孵育3h为准，进行制片观测。各种家畜正常精液中精子顶体异常率，如果顶体异常率显著增加，牛超过14%以上，猪超过4.3%以上，就会直接影响受胎率。