海蜇酶解多肽制备及其抗肿瘤活性研究论文

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1、海蜇酶解多肽制备及其抗肿瘤活性研究论文龙吟杨永芳甄茹陈鹏申林严容芳丁国芳【摘要】目的研究海蜇活性肽制备与抗肿瘤活性。方法海蜇先经正交试验确定最佳酶解条件，然后将酶解物离心得到海蜇活性肽粗品。粗品经超滤、SephadexG-15凝胶层析、冷冻干燥纯化得到海蜇抗肿瘤活性肽，通过MTT法及AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞测定了其对肿瘤细胞体外增值的影响。结果碱性蛋白酶在温度为55℃，料液比为1:2，加酶量为1000U/g，时间为4h的酶解条件下对海蜇进行酶解，酶解液中的氨基氮含量为41.3mg/100ml。从海蜇中分离纯化得到活性肽，MTT法表明：其对肿瘤细胞的增殖有较强抑制

2、作用.freeloractivitypeptidefromjellyfish(Rhopilemaesculentum).Methods:First,theorthogonalexperimentjellyfish.Then,crudeproductatographyandantitumoractivitypeptideethodanddouble-labeledfloetryAnnexinV-FITC/PIinedtheantitumoractivityofpeptide.ResultsUsingalkalineproteaseatatemperatureof55℃,eamounto

3、f1000U/g,hydrolysistimeejellyfish,andthehydrolyzateaminonitrogencontentedintheproductis41.3mg/100ml.Purifiedfromthejellyfishinavarietyofactivepeptides,MTTmethodshoorcellproliferationetryinducedapoptosisofthetumorcellsandapoptosisinadose-dependent.ConclusionThepeptidefromjellyfishhydrolysatecoul

4、dsignificantlyrestraintumorcellsmultiplicationandinducetumorcellsapoptosis.【Keyeanti-tumoractivityactivepeptides海蜇(Rhopilemaesculentum)俗称“鮓鱼”，隶属于腔肠动物门(Coelentera)、钵水母纲(Scyphozoa)、根口水母目(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)，海蜇属(Rhopilema)的无缘膜动物。海蜇的蛋白占其干重的50％，其氨基酸成分种类繁多，必须氨基酸含量丰富。海蜇等海洋生物为了适应高盐、高压、

5、低温、缺氧等极端的海洋生活环境，其蛋白质的氨基酸组成与序列都与陆地生物蛋白有很大的不同，在种类和数量上也远远超过陆地蛋白资源。在种类繁多的海洋生物蛋白氨基酸序列中，潜在着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特异的蛋白酶水解，就能释放出有活性的肽段。抗肿瘤肽是一种具有抗肿瘤效果的生物活性肽（biologicallyactivepeptides,简称BAPP）。目前已从海绵、海鞘、海兔、海藻、海苔虫、鲨鱼、珊瑚以及海洋微生物中分离出2万余种天然产物,其中不少化合物显示出明显的抗肿瘤活性,.freela3111型CO2培养箱购自美国Thermo公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司；酶标仪

6、购自美国Bio-Rad公司。2实验方法2.1蛋白酶及酶解条件的确定2.1.1水解酶选取将海蜇分别用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各自的酶解条件下对海蜇进行酶解，酶解条件见表1。水解一定时间后，加热至90～100℃灭酶15min，然后将水解液以6000r/min离心25min取上清液。测定氨基氮含量，选取最佳酶。表1酶的适宜作用条件2.1.2氨基氮含量测定氨基氮含量的测定采用甲醛滴定法5，取5.0ml酶解液，定容至100ml，取20ml酶解液稀释液置于烧杯中，加水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准液滴定至pH为8.2。加入10ml甲醛溶液混匀，再用0.05m

7、ol/L氢氧化钠溶液继续滴定至pH为9.2，记下消耗氢氧化钠标准液的毫升数，同时取水80ml做试剂空白试验。按下列公式计算氨基氮(ANN)含量：X：为样品中氨基氮的含量（g/100ml）；V1：为测定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液（ml）；V2：为试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（ml）；V：为样品液取用量（ml）；C：为氢氧化钠标准液的浓度（mol/L）；0.014为氮的毫摩尔质量（g/mmol）。2.1.3单酶水解条件的优化以酶