HCV核心区基因的截短及其表达.doc

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1、HCV核心区基因的截短及其表达【摘要】目的高效稳定地表达HCV的核心抗原。方法设计一对特异性引物，以含HCV全长基因的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板，扩增出HCV截短的核心抗原（1－120aa）的基因，克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导HCV截短的核心抗原的表达，表达产物经过SDS-PAGE,Western-blot,ELISA等一系列鉴定试验进行了分析。结果成功地构建了HCV核心抗原高效稳定表达的重组质粒，表达产物具有高度特异性和良好的抗原活性。结论该抗原的获得为研制

2、诊断用HCV抗原奠定了基础。【关键词】HCV；核心区基因；截短；表达　TruncationandexpressionofHCVCoregene【Abstract】ObjectiveToexpressHCVCoreantigenhightlyandstably.MethodsApairsofspecificPCRprimersweredesignedandsynthesized.TruncatedHCVCoregenewasamplifiedfromtheplasmidpBRTM/HCV1-3011byPCR.The

3、genefragementwasclonedintopGEX-4T3,thentransformedtoE.coliBL21andexpressedunderinductionofIPTG.TheexpressedproductwasanalyzedbySDS-PAGE,Western-blotandindirectELISA,respectively.ResultsArecombinantplasmidpGEX-TP1.1forstableandhightexpressionwasconstructedsucce

4、ssfully.Theexpressedproductshowedhighspecificityandgoodantigenicity.ConclusionTheexpressionoftruncatedHCVCoreantigenslaidafoundationfordevelopmentofHCVdiagnostisuseantigens.【Keywords】HCV；Coregene;Truncation；expression丙型肝炎病毒（HepatitisCvirus,HCV）的核心蛋白是HCV蛋白中抗原性强

5、且保守性较好的区段，核心抗体出现时间早，大约于感染后8～12周即可检出，且持续的时间长，阳性率高，是HCV诊断必不可少的抗原之一［1］。为了研制HCV诊断用抗原，最初构建了含HCV全长核心基因（Core）的重组表达质粒，但该质粒表达不稳定。参照有关文献［2～4］，笔者将HCV6的核心基因截短，构建了重组表达质粒，该质粒能够高效稳定地表达，现将结果报告如下。1材料与方法11实验材料含HCV全长基因的质粒pBRTM/HCV1-3011由武汉大学生命科学学院叶林柏教授惠赠；pGEX-4T3购自AmershamBiosc

6、iences公司；pGEM-T载体为Promega公司产品；大肠杆菌JM109,DH5α和BL21均由武汉生物制品研究所（以下简称为武汉所）诊断用品室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶及TaqDNA聚合酶为Fermentas公司产品；凝胶回收试剂盒为QIAGENGmbH公司产品；序列分析由宝生物工程（大连）公司完成。IPTG购于Fermentas公司；GST融合蛋白纯化试剂盒为AmershamBiosciences公司产品；鼠抗HCVCore抗原和NS3抗原的两种单克隆抗体购自ViroStat公司；HRP标记的羊

7、抗鼠IgG为NovoGeneBioscience公司产品；DAB浓缩显色液为华美生物工程公司产品；ELISA所用试剂，除抗原外，均为武汉所的HCV抗体诊断试剂盒的组份；标化血清由武汉所诊断用品室根据第5代HCV-Ab国家参比品(Panel)标定的血清样品。12引物的设计与合成根据pBRTM/HCV1-3011全长基因序列，设计扩增HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因片段的特异引物。上游引物(L)：5’GACGCGTGGATCCBamHIATGAGCACGAATCCTAAACC3’下游引物(R)：5’GTCC

8、GCCGAATTCGAEcoRIACTACCCAAATTGCGCGA3’上游引物L5’端加了限制性内切酶BamHI酶切位点，下游引物R5’端加入限制性内切酶EcoRI酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。13PCR扩增以pBRTM/HCV1-3011为模板，用上述引物扩增出截短的HCVCore区基因片段，取5μl进行10%琼脂糖凝胶