谈hcv核心区基因的截短及其表达

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1、谈HCV核心区基因的截短及其表达【目的高效稳定地表达HCV的核心抗原。方法设计一对特异性引物，以含HCV全长基因的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板，扩增出HCV截短的核心抗原（1－120aa）的基因，克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导HCV截短的核心抗原的表达，表达产物经过SDS-PAGE,ethodsApairsofspecificPCRprimersplifiedfromtheplasmidpBRTM/HCV1-3011byPCR.Thegenefra

2、gementedtoE.coliBL21andexpressedunderinductionofIPTG.TheexpressedproductidpGEX-TP1.1forstableandhightexpressionentofHCVdiagnostisuseantigens.【KeyershamBiosciences公司；pGEM-T载体为Promega公司产品；大肠杆菌JM109,DH5α和BL21均由武汉生物制品探究所（以下简称为武汉所）诊断用品室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶及Ta

3、qDNA聚合酶为Fermentas公司产品；凝胶回收试剂盒为QIAGENGmbH公司产品；序列分析由宝生物工程（大连）公司完成。IPTG购于Fermentas公司；GST融合蛋白纯化试剂盒为AmershamBiosciences公司产品；鼠抗HCVCore抗原和NS3抗原的两种单克隆抗体购自ViroStat公司；HRP标记的羊抗鼠IgG为NovoGeneBioscience公司产品；DAB浓缩显色液为华美生物工程公司产品；ELISA所用试剂，除抗原外，均为武汉所的HCV抗体诊断试剂盒的组份；标化血清

4、由武汉所诊断用品室根据第5代HCV-Ab国家参比品(Panel)标定的血清样品。1?2引物的设计和合成根据pBRTM/HCV1-3011全长基因序列，设计扩增HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因片断的特异引物。上游引物(L)：5’GACGCGTGGATCCBamHIATGAGCACGAATCCTAAACC3’下游引物(R)：5’GTCCGCCGAATTCGAEcoRIACTACCCAAATTGCGCGA3’上游引物L5’端加了限制性内切酶BamHI酶切位点，下游引物R5’端加进限制性内切酶Ec

5、oRI酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1?3PCR扩增以pBRTM/HCV1-3011为模板，用上述引物扩增出截短的HCVCore区基因片断，取5μl进行1?0%琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶上切下含目的片断的凝胶，按照DNA凝胶纯化试剂盒操纵步骤纯化回收目的片断。1?4表达质粒的构建纯化的目的基因片断，经T4DNA连接酶和pGEM-T载体连接，转化感受态JM109,筛选出阳性克隆，提取质粒后，经BamHI/EcoRI双酶切反应，回收酶切产物，经T4DNA连接酶和经同样双酶

6、切的pGEX-4T3连接，转化感受态DH5α，提取质粒后，经BamHI/EcoRI双酶切鉴定，筛选出含目的基因片断的阳性克隆，并测序，再将阳性克隆的质粒转化感受态BL21。1?5融合蛋白的诱导表达将含有目的基因重组表达质粒pGEX-TP1?1的BL21菌株，接种于含100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基中，37℃培养过夜后，按1：100比例转种于新鲜2YT培养基中，继续培养至对数生长期(A600=0?5～0?7)，加IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导4～5h，取菌体用于SDS-PAGE分析。1

7、?6融合蛋白的纯化将诱导表达的菌体超声破碎后，包涵体经洗涤，8mol/L尿素溶解，稀释复性，加50％预处理的亲和层析介质GlutathioneSepharose4B,按试剂盒说明书进行纯化。1?7/HCV1-3011为模板，用引物L、R扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见扩增的产物为约400bp的DNA片断,见图1，大小和预期设计相同。2?2克隆质粒的双酶切鉴定HCV截短的(1-120aa)核心抗原（P1?1）基因克隆到载体pGEM-T上后的克隆质粒pGEM-TP1?1，经BamHI/EcoR

8、I双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳后，结果可见pGEM-TP1?1酶切产物大小约为400bp和3kbp左右的DNA片断，和预期结果相同，见图2。2?3重组表达质粒的双酶切鉴定从转化的DH5α中提取重组质粒pGEX-TP1?1，用BamHI/EcoRI双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见表达载体pGEX-4T3(约5kbp)及TP1?1(约400bp)基因两个片断，大小和预期设计的相同，见图3。2?4重组表达质粒的序列测定测序结果表明pGEX-TP1?1中目的基因除了第68位