体内药物分析实验

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1、1.HPLC法测定大鼠血浆中的山奈酚1.1目的要求1.掌握血浆样品的前处理方法。2.熟悉方法回收率和萃取回收率实验操作和评价。3.熟悉大鼠眼眶采血技术；熟悉方法学研究中其他评价内容。1.2主要实验材料与仪器山奈酚（Kaempferol）及其对照品，黄芩素（baicalein），抗坏血酸，肝素，β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）和硫酸酯酶（sulfatase），分析纯甲醇，冰醋酸、无水乙醚，色谱纯乙腈；高效液相色谱仪，氮吹装置，恒温水浴，漩涡混合器，13000r/min台式离心机，不同规格移液

2、枪（5,20,50,100,200,1000μL）和容量瓶（10，25mL），5~10mL具塞离心管若干；雄性SD大鼠（180~220g）。1.3实验原理山奈酚吸收进入体内后，多以二相代谢物葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的形式存在。由于山奈酚葡萄糖醛酸苷和硫酸酯的对照品难以获得，故采用加入硫酸酯和葡醛酸苷水解酶处理样品，使代谢物水解后测定苷元山奈酚的浓度。实验以黄芩素为内标，HPLC法测定血浆中山奈酚浓度，对建立的方法进行方法学评价。1.4实验方法1.色谱条件：C18柱（250mm×4.6mm，5μm），配保护柱，柱温

3、40℃；乙腈-0.5%冰醋酸（35:65）为流动相，流速1mL/min；检测波长370nm；进样量20μL。2.溶液配制：取山奈酚对照品约2.5mg，精密称定，置25mL量瓶中，用甲醇溶解并定容。精密吸取适量，分别用甲醇稀释成0.3、0.6、3、6、9、20和30μg/mL的标准系列溶液，置4℃冰箱保存。另取黄芩素适量，精密称定，用甲醇溶解并定量稀释至0.1mg/mL的溶液，精密吸取1.5mL置10mL量瓶中，用甲醇定容，得内标溶液，置4℃冰箱保存。3.血浆样品处理：取大鼠血浆样品120μL，加入甲醇20μL

4、、1%冰醋酸（含2mg/mL抗坏血酸）32μL、β-葡萄糖醛酸苷酶（20U/mL）和硫酸酯酶（6U/mL）的混合水溶液50μL，37℃水浴温育30min后，加入内标溶液50μL，然后加无水乙醚2mL，漩涡混合5min，于12000r/min离心5min；取上清液在氮气流下挥干，残留物用100μL甲醇复溶，12000r/min离心5min，取上清液进样分析。4.专属性考察：取空白血浆、添加山奈酚与内标的空白血浆、血浆样品，按“血浆样处理”项下方法处理，照“色谱条件”项下方法进样测定。比较所得色谱图，考察血浆内源

5、性物质是否干扰测定，药物及内标是否达到基线分离。若有必要，适当调整色谱条件，已达到专属性要求。5.标准曲线制备：精密吸取120μL大鼠空白血浆9份，分别加入20μL不同浓度的标准系列溶液，制得0.0（空白）、0.0（空白+内标）、0.05、0.1、0.5、1.5、3和5μg/mL的山奈酚血浆标准溶液（每个浓度点平行3~5份）。按“血浆样品处理”项下自“加1%冰醋酸32μL”起，同法处理后进样分析，记录峰面积。以山奈酚与内标峰面积的比值（R）对山奈酚血浆浓度（C）进行线性回归（两个空白不计入回归曲线，仅作为对干

6、扰的考察），求得回归方程（R=bC+a）和相关系数（r）。并取各浓度点实测值代入回归方程得回归值（C′）,与标示值（C）比较，计算偏差（偏差%=）和准确度（准确度=C′/C×100%）。根据上述结果确定线性范围与定量下限（LLOQ）。6.回收率和精密度试验：精密吸取120μL大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制低、中、高（0.1、1、4μg/mL）三种浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理、测定。将山奈酚与内标峰面积比值代入标准曲线，求出测得浓度。计算测得浓

7、度与加入浓度的比值，得方法回收率，并计算各浓度点的相对标准差（RSD），作为日间精密度；于不同日（至少3d）重复上述测定，计算日间精密度。7.萃取回收率试验：精密吸取120μL大鼠空白血浆，分别加入不同浓度的山奈酚标准溶液，配制0.1，1和4μg/mL浓度的山奈酚血浆样品，每浓度点平行5份，按“标准曲线制备”项下方法进行处理，记录山奈酚峰和内标峰面积，作为萃取后的测定值。另取上述低、中、高同样浓度的山奈酚甲醇液，加同样量内标溶液，混合，直接于氮气流下挥干，残留物用100μL甲醇复溶，12000r/min离心5

8、min，取同样量上清液进样分析，获得山奈酚峰和内标峰面积，作为未萃取的测定值。采用外标法计算萃取后山奈酚峰面积与相应浓度的未经萃取的山奈酚峰面积比值，得山奈酚萃取回收率；同法计算内标的萃取回收率。8.稳定性实验：精密吸取120μL大鼠空白血浆，按“回收率和精密度试验”项下方法配低、中、高浓度的山奈酚血浆样品。考察其在室温下放置24h（6，12，24h取样）、-20℃下长期冻存1个月（10，20，30