不同产地山药rdna its区序列的比较论文

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1、不同产地山药rDNAITS区序列的比较论文【关键词】山药；,,ITS区序列；,,聚合酶链反应摘要：目的分析怀山药与其它产地山药的rDNAITS区序列的差异，为山药的基源鉴定和品质评价提供分子依据。方法采用PCR扩增纯化后直接测序的方法测定不同产地山药的rDNA基因ITS核苷酸序列并作序列同源性分析。结果8种产地山药的ITS1片段长度均为165bp，ITS2片段长度均为158~160bp,5.8S片段长度为均为159bp。8种不同产地的山药ITS1和ITS2区分别有6个和9个碱基变异。结论利用ITS区序列的差异

2、鉴别不同产区的山药提供了依据。关键词：山药；ITS区序列；聚合酶链反应parisonofRibosomalDNAITSSequenceofRhizomaDioscoreaeinDifferentGeographicalRegionsAbstract：ObjectiveTodistinguishDioscoreaeuoppositaThunb.fromdifferentgeographicalregionsbyparingRibosomalDNAITSsequence.MethodsDirectPCRseque

3、ncingologyofrDNAITSsequence.ResultsEightDioscoreaeoppositaThunb.differentgeographicalregionsbyPCRtechnology.SequenceanalysisshodifferentgeographicalregionsaccordingtothevariationoftheITSsequences.KeyaDioscoreae为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的块茎，属多年生缠绕草本植物。是

4、我国最大众化的传统保健食品之一，除了少数热带地区外，几乎各地都有栽培，可分山地生、平地生、也有野生的。山药集中产于河南、陕西、山东等地区；在诸多品种中，以河南的“怀山药”最负盛名.freelatK)和核糖体非编码转录区(ITS)基因［2］高等植物核糖体DNA(rDNA)的每个重复单位从5'端开始,包括外转录间隔区(externaltranscribedspacer,简称ETS)、18S基因、第一内转录间隔区(internaltranscribedspacer1，简称ITS1)、5.8S基因、第二内转录间隔区(

5、ITS2)和26S基因,重复单位之间为基因间隔区(intergenicsoacer，简称IGS)称为非编码区(non-transcribedspacer,NTS)。rDNA的编码区序列(18S、5.8S和26S基因)选择压大，属高度保守区。非编码区序列(如IGS，NTS)是高变区,.freelix（dATPdCTPdGTPdTTP每种2.5mmol/L）0.3μl，0.25μmol/L引物2μl，1UTaqDNA聚合酶0.5μl及10×Taq缓冲液5μl，置于PCR仪，按下述参数进行1个PCR循环：94℃，3

6、min。然后按下述参数进行35个PCR循环：94℃，1min；60℃，1min；72℃，2min。最后按下述参数进行1个PCR循环：72℃，5min。取PCR反应液3μl于1.5%琼脂糖凝胶上用1×TBE电泳缓冲液于电泳仪中电泳，EB染色，UV灯光下照相。DNA长度与2kbDNAmarker分子标记物(TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司)比较。取目标产物条带用胶回收纯化试剂盒（北京天为时代科技有限公司）进行纯化。1.5测序PCR纯化产物直接用于测序循环反应。测序引物为通用引物1p。采用双脱氧末端终止法按T

7、hermoSequenase循环测序试剂盒(AmershamLifeScience公司)实验指南进行测序。测序反应每管反应体积为5.0μl，内含3.0μl纯化的PCR产物，0.2μl测序引物(10μmol/L)，1.8μldNTP混合试剂，循环测序反应条件：95℃，5min，1个循环。95℃，30s；55℃，30s；72℃1min，40个循环。测序反应结束后加3μl测序终止缓冲液，离心混匀。取1μl测序反应液上样于4%聚丙酰胺-7mmol/L尿素凝胶电泳板于测序仪进行测序。1.6序列数据分析用CLUSTAL×

8、(1.83)软件对8个品种山药ITS序列进行对位排列，然后手工校正，去除18s和26s端得到ITS1-5.8S-ITS2片段长度为482bp。得到的序列用phylip3.6软件进行系统发生分析。并以最大简约法(MaximumParsimony(MP)method)构建系统分支树。2结果提取的总DNA经测定其浓度在120~150ng/mg之间，经引物扩增后可得到700bp左右的清晰条带（见图1~3）。