fgfr3单链抗体和fgfr3单链抗体—鱼精蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能研究

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1、摘要FGFR3单链抗体和FGFR3单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及功能研究成纤维细胞生长因子受体3（fibroblastgrowthfactorreceptor3,FGFR3）是FGFR家族的一员，与成纤维细胞因子特异性结合后，在细胞的增殖分化过程中发挥重要的调节作用。近年来，越来越多文献报道FGFR3的突变或过表达与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系。因此，FGFR3作为一个潜在的治疗肿瘤的靶点受到越来越多的关注，并且已经有靶向FGFR3的药物被成功研制并进入二期临床实验。本课题中，我们设计了两种蛋白：抗FGFR3的单链抗体（singlecha

2、infragmentvariable，ScFv）和ScFv与截短型鱼精蛋白（truncatedprotamine，tp）的融合蛋白ScFv-tp。希望达到以下两个目的：一、ScFv特异性结合FGFR3，并发挥生物学作用，拮抗FGFR3的磷酸化；二、融合蛋白ScFv-tp中，ScFv能够特异性的结合FGFR3，是“定位装置”，tp在中性条件下带正电，能与带负电的核酸结合，是“携带装置”，用ScFv-tp将有生物学功能的siRNA（“杀伤装置”）靶向运送至FGFR3+肿瘤细胞内，从而通过RNAi机制沉默相关基因，为FGFR3+肿瘤的靶向治疗提供一种有效的方法。

3、通过PCR扩增将ScFv与小泛素修饰复合物（Smallubiquitin-relatedmodifierProteins，Sumo）分子伴侣连接，构建表达载体pET-20b-Sumo-ScFv，并在大肠杆菌内表达。经Ni柱亲和层析纯化、Sumo酶切和再纯化，获得抗FGFR3的单链抗体ScFv，蛋白纯度达到90%以上，产量可达到约4mg每升菌液。细胞实验结果表明ScFv能够特异性结合FGFR3，并抑制FGF9对FGFR3的磷酸化作用。利用相同方法构建融合蛋白ScFv-tp的表达载体pET-20b-Sumo-ScFv-tp，但获得的融合蛋白ScFv-tp结合了

4、过多菌体本身破碎时释放的基因组DNA，影响后续实验中siRNA的携带。为避免融合蛋白结合菌体DNA，我们采用了包涵体表达的策略。首先将Sumo去掉，构建了融合蛋白ScFv-tp的表达载体pET-20b-ScFv-tp，并在大肠杆菌中以包涵体形式表达。通过包涵体洗涤与变复性纯化蛋白，并获得重折叠的可溶性蛋白。蛋白纯度达到90%以上，产量可达到约10mg每升菌液。凝胶阻滞实验结果表明，所得的ScFv-tp不带有菌体DNA，而能够结合siRNA，且此种结合作用有饱和性。流式细胞术检测和免疫荧光检测证实ScFv-tp能够将siRNA运送至IFGFR3+细胞K562

5、和RT-112内，而不能运送至FGFR3-细胞THP-1内。RT-PCR和WesternBlot实验结果表明通过ScFv-tp递送入RT-112细胞的siRNA在细胞内产生了明显的RNAi效应，干扰了乳腺癌扩增基因-1（amplifiedinbreastcancer1，AIB1）的表达，使细胞中AIB1基因的mRNA和蛋白表达量明显减低。综上所述，本研究首先在大肠杆菌中可溶性表达并获得了靶向FGFR3的单链抗体ScFv，且ScFv特异性结合FGFR3后能够明显抑制FGF9诱导的FGFR3的磷酸化作用；其次通过包涵体变复性的方法获得了FGFR3的单链抗体Sc

6、Fv与截短的鱼精蛋白tp的融合蛋白ScFv-tp，该融合蛋白不仅能够结合siRNA，而且能够靶向性地将其运送至FGFR3+细胞内，并有效地发挥RNAi效应将相关基因AIB1沉默。关键词：成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3），单链抗体（ScFv），小分子干扰RNA（siRNA），重组融合蛋白质，原核表达，蛋白纯化IIAbstractExpression,purificationandbiologicalfunctionalanalysesofsingle-chainFvagainsthumanFGFR3anditsfusionproteincontaini

7、ngtruncatedprotamineFibroblastgrowthfactorreceptor3(FGFR3)isamemberoffibroblastgrowthfactorreceptors(FGFRs)family,whichplaysasignificantroleinCellgrowth,differentiationandotherbiologicalprocessafterbindingtoitsligands,fibroblastgrowthfactors.Recently,emergingresearcheshavereported

8、thecloseassociationbetweenFGFR3ac