延迟吗啡预处理对兔缺血后肢肌的远期保护作用

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1、安徽医科大学硕士学位论文2.4.标本的处理和指标的检测切取下的中段腓肠肌标本在10%福尔马林中浸泡24小时后，清水冲洗24小时，去除剩余福尔马林溶液后，亚鹏ts-12a生物自动脱水机进行脱水，并自动石蜡包埋。依次顺序：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、无水乙醇、二甲苯、最后石蜡包埋。腊块常规切片，HE染色，镜下观察组织形态学变化；Anti-CD31检测组织2标本中微血管增生情况并计数；Masson染色，观测组织标本中梗死面积（μm）并计数。2.4.1免疫组织化学染色（SABC法）（1）常规石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗5min×3次；（2

2、）枸橼酸盐修复，中火，8min，PBS洗5min×3次；（3）3%H2O2孵育10min，PBS洗5min×3次；（4）正常山羊血清封闭，37oC，30min；（5）吸去封闭血清，不洗；（6）兔抗兔CD31抗血清抗体，37oC，2h，PBS洗5min×3次；（7）生物素标记羊抗兔IgG工作液，37oC，30min，PBS洗5min×3次；（8）复合物工作液，37oC，30min，PBS洗5min×3次；（9）DAB显色，镜检，自来水冲洗；（10）脱水、透明、封片；（11）Nikon显微镜观察并摄片。2.4.2Masson三色法（1）切片脱蜡

3、至水；（2）放入Bouin氏液4oC冰箱作用一晚，流水冲洗切片至黄色消失。（3）Weiger氏铁苏木素染5～10min；（4）流水稍洗；7安徽医科大学硕士学位论文（5）1%盐酸酒精分化；（6）流水冲洗数分钟；（7）丽春红酸性品红液染5～10min；（8）1%磷钼酸水溶液处理约5min；（9）不用水洗，直接1%亮绿复染5min；（10）1%冰醋酸处理1min；（11）脱水、透明、封片。（12）镜下观察摄片。2.4.3HE染色程序（1）组织块固定后常规石蜡包埋，4μm切片。（2）切片常规二甲苯脱腊，经过各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min、二甲

4、苯（II）5min、100%乙醇2min、95%乙醇1min、80%乙醇1min、75%乙醇1min、蒸馏水洗2min。（3）苏木精染色（预热）20min，水洗，光镜下观察细胞核着色是否均匀；（4）1%盐酸酒精分化3～4s；（4）蓝化：自来水流水冲洗1～2h；（5）0.5%伊红染色6～8s，水洗，光镜下观察细胞质着色是否均匀；（6）脱水、透明、封片；95%乙醇（I）3s、95%（II）5s、100%无水乙醇5min、石炭酸二甲苯5min、二甲苯（I）2min、二甲苯（II）2min、中性树胶封固。（7）镜下观察摄片。2.4.4计算机图像分析

5、Masson三色染色胶原被染成绿色，肌纤维呈红色。在400倍镜下观察切片中染色为蓝色或绿色区域，采用Image-ProPlus6.0生物图像软件软件测量组织切片中胶原纤维的面积。在10×40倍光镜下利用Nikon彩色数码CCD摄像头（DiagbsticCameraDXM1200F）8安徽医科大学硕士学位论文捕获各组CD31免疫组织化学染色图像，并采用Image-ProPlus6.0软件检测血管再生情况。CD31阳性染色均为棕（黄）色，均在血管内皮细胞胞质中表达，MVD计数法参照Weidner校正方法。任何被抗体染色的单个内皮细胞或细胞团，不

6、管是否形成管腔，只要与周围的微血管和其他连接组织有清楚界限，都认为是一个可计数的微血管。每一个标本先低倍镜（×10）下选3个微血管数最多的区域即“热点”，在每一个区域中计数一个高倍镜（×40）下的微血管数，取其平均值为MVD值。2.5统计学方法数据结果采用SPSS11.0统计软件经行分析。数据均用均数标准差（S）表示。三组间的均数比较采用单因素方差分析“SNK”法经行两两比较，各组间多重比较采用“LSD-t”法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。3.结果3.1缺血区新生血管密度可见传统IPC组和吗啡预处理组梗死区的CD31表达丰

7、富，标记的微血管数量明显高于生理盐水预处理组(图1)。IPC组和吗啡组的微血管MVD计数也明显较生理盐水组增多（P<0.05，表1），且IPC组的微血管MVD计数亦明显高于吗啡组（P<0.05）。表124例兔腓肠肌CD31-MVD计数（±S）组别例数CD31-MVDIPC89.92.3吗啡85.32.3生理盐水82.41.19安徽医科大学硕士学位论文注:与IPC和吗啡组比较，P<0.05.与IPC和生理盐水组比较，P<0.05.ABC图1A为传统IPC预处理后的缺血区腓肠肌；B为吗啡预处理后的缺血区腓肠肌；C为生理盐水

8、预处理后的缺血区腓肠肌可见A图CD31染色较B组明显，且C组几乎无阳性表达。3.2缺血区组织梗死面积可见传统IPC组和吗啡组胶原纤维染色浅，仅呈束状分布于肌束间；而生理盐水组胶原