叶锈菌与tclr19小麦互作体系中2个病程相关蛋白基因的克隆及分析

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1、河北农业大学硕士学位论文叶锈菌与TcLr19小麦互作体系中2个病程相关蛋白基因的克隆及分析姓名：王珅申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：王海燕；刘大群20120526摘要植物病程相关蛋白(Pathogenesis．relatedproteins，PRs)是指植物在病理或病理相关环境下诱导产生的一类蛋白，在多种植物中已有报道。为了深入研究小麦抗叶锈病机制，本研究利用RT-PCR和RACE技术，从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLrl9中获得病程相关蛋白1基因(TcLrl9PRl)和B．1，3．葡聚糖酶基因(勉rJ，9G胁)的cDNA全长；并利用实时荧光

2、定量PCR技术对小麦与叶锈菌亲和及非亲和组合中TcLrl9PRl和TcLrl9Glu基因的表达模式进行了分析；同时构建了含有TcLrl9PRl、TcLrl9Glu基因的重组载体，通过基因枪介导法分别对小麦感病材料离体叶片和幼嫩胚性愈伤组织进行了转化。主要内容包括以下几个方面：1．以小麦抗叶锈病近等基因系TcLrl9和叶锈菌菌株07．10-421．3为材料，以接菌后各时间点的小麦叶片总RNA的等量混合物为模板，利用RT-PCR和RACE技术获得TcLrl9PRJ和TcLrl9Glu的cDNA全长。2．以接种叶锈菌的TcLrl9和Thatcher叶片为材料，应用半定量PCR

3、和qRT-PCR技术检测亲和与非亲和组合中TcLrl9PRl和TcLrl9Glu的表达模式。结果表明，TcLrl9PRI在非亲和组合中接种12h表达量达到最大，然后有所下降，但整体水平高于亲和组合。TcLrl9Glu在非亲和组合中12h表达水平开始明显上调，在36h表达量达到最大，但各时间点表达量均高于未接菌对照及亲和组合。3．以TcLrl9小麦基因组DNA为模板，通过PCR技术获得TcLrl9PRl的DNA序列。Southern杂交验证说明TeLrl9PRl在小麦基因组中为低拷贝。并利用“中国春”缺体．四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上。4．为了研究B．1，3．

4、葡聚糖酶在小麦抗叶锈病中的作用，接种叶锈菌后检测TcLrl9与Thatcher中葡聚糖酶活性。结果显示，感病亲本Thatcher接菌后O一144h之间葡聚糖酶活性缓慢升高，在144h达到最大，整体变化不明显。抗病材料TcLrl9接菌48h范围内p。l，3．葡聚糖酶活性水平明显升高，48h达到高峰，整体表达水平比Thatcher高。5．将TcLrl9PRl和TcLrl9Glu基因分别定向插入到单子叶表达载体pAHC25中，获得重组质粒pAHC—TcLrl9PRl和pAHC．TcLrl9Glu。利用瞬间表达技术分析TcLrl9PRl和TcLrl9Glu基因与抗叶锈相关性，结

5、果显示勉r』妒足J和尼LrJ9G觑基因的导入在一定程度上抑制叶锈菌菌丝的生长。6．基因枪介导法将重组质粒pAHC—TcLrl9PRl和pAHC．TcLrl9Glu转化感病材料郑州5389小麦的幼嫩胚性愈伤组织，经分化筛选后获得再生小麦植株。关键词：小麦；病程相关蛋白；基因克隆；基因表达分析；瞬间表达；转基因Cloningandanalysisoftwopathogenesis-relatedproteingenesfromTcLrl9inthedefenseresponsestoPucciniatrldclnaAuthor：WangShenMajor：PlantPath

6、ologySupervisors：AssociateprofessorWangHaiyanProfessorLiuDaqunAbstraetPlantpathogenesis—relatedproteins(PRs)aretheproteinsinducedbythepathogenorenvironmentconditionofpathologywhichhavebeenreportedaboutmanyplants．Theobjectiveofthisresearchwastodeeplyunderstandthemechanismofwheatresistance

7、toleafrustpathogen．RT—PCRandRACEwascombinedtoisolatethefulllengtheDNAsequenceof死L厂，9P尺1and尼Lrl9Glufromthenear-isogeniclineTcL订9inducedbyPucciniatriticina．Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)WaSusedtodetecttheexpressionprofilesofTcLrl9PRlandTcLrl9Gluinthecompatibleandincompat