小麦叶锈菌与tclr19非亲和互作est分析及tarlp19、tastkc8克隆与表达

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1、河北农业大学硕士学位论文小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作EST分析及TaRLP19、TaSTKC8克隆与表达姓名：李淑凤申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：杨文香；刘大群20120526摘要小麦是世界范围内的主要粮食作物之一。由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)弓[起的小麦叶锈病是影响小麦稳产高产的一类重要病害。该病在世界各产麦区均有发生，它的流行会造成严重的减产。培育抗病品种成为防治该病害最经济有效的方法。小麦抗叶锈病基因Lrl9来源于长穗偃麦草(Agropyronelong

2、atum)，是目前国内外具有较大应用潜力的抗叶锈病基因。本研究首先通过EST分析小麦叶锈菌与小麦TcLrl9非亲和互作的基因表达情况；继而以两个TcLrl9中特异表达的eDNA．AFLP片段为靶序列，通过eDNA末端快速扩增(RACE)技术获得其eDNA序列全长，并在接菌的TeLrl9、Thatcher叶片中进行实时荧光定量研究。主要研究结果如下：1．小麦TcLrl9非亲和cDNA文库经随机测序，共获得1512个有效ESTs，聚类拼接后得到948条非重复序plJ(Unisequences)，其中包括2

3、14个叠连群(contigs)和734个单拷贝(singlets)。Unigene基因进行同源比对及COG分析表明，651条(68．67％)非重复序列与已知功能基因同源性很高，213条(22．49％)非重复序列与未知功能基因同源，10条(1．05％)序列与小麦叶锈菌同源，74条(7．81％)非重复序列尚无同源序列。EST分析表明，该文库包括脂类、氨基酸、核苷酸、辅酶、碳水化合物、无机离子转运与代谢及光合作用相关基因等能量基础代谢基因，抗病与防御类基因，信号转导类基因，信息存储和加工类基因、转录翻译相关

4、基因及细胞骨架等。2．在功能已知的序列中，参与能量和基础代谢类中，1，5．二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶(Rubisco)，光系统II10kd多肽蛋白，叶绿素a／b结合蛋白等参与光合作用及叶绿体结构建成的基因出现的频率都较高；在抗病与防卫相关基因中，SGTl蛋白、类RPP．8蛋白、类14．3．3蛋白、HSP70／HSP90热休克蛋白、抗病防御基因PRl0蛋白、F-box蛋白、WIRlA蛋白、过氧化氢酶等基因均存在；此外，一些与(非)生物胁迫有关的基因，如过敏性反应诱导蛋白、伤诱导蛋白、胁迫反应诱导蛋白、铁

5、缺乏诱导蛋白、冷胁迫蛋白等均存在；在膜和转运类基因中，ABC转运子、H+．ATP酶类等出现频率较高；信号转导类基因包括GTP蛋白、丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、类受体蛋白激酶等。推测上述高频率基因可能参与小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库，克隆小麦抗叶锈病相关基因奠定基础。3．以本课题组前期通过eDNA．AFLP技术获得一条在TcLrl9和Thatcher与小麦叶锈菌互作时的差异表达片段19。9为靶序列，采用RACE技术在TcLrl9中获得了cDNA全长为2

6、545bp小麦抗病相关基因，并在接菌的TcLrl9中验证得到该基因。该基因包含2136bp的开放阅读框，编码711个通读的蛋白质氨基酸序列，180bp的5’非翻译区(nontranslatedregion，UTR)，243bp的3’非翻译区和31bp的多聚腺苷酸(舢尾，暂命名为TaRLPl9。TaRLPl9基因编码产物具有胞外结构域和单次跨膜区，C末端胞内域较短，不包括激酶域；胞外域含有6个富含亮氨酸基序(LRR)，每个LRR序列大概含有23～24个氨基酸，符合典型单子叶植物所具有的LRR。TM结构模

7、式。在GenBank获得的登录号为JN872563。4．以前期研究利用cDNA．AFLP技术获得的在TcLrl9和Thatcher与小麦叶锈菌互作时的差异表达片段Sr-19为靶序列，采用RACE技术在TcLrl9中获得了cDNA全长为2062bp小麦抗病相关基因，该基因包含1363bp的开放阅读框，编码450个通读的蛋白质氨基酸序列，275bp的5’非翻译区，434bp的37非翻译区和27bp的多聚腺苷酸尾，暂命名为TaSTKC8。TaSTKC8基因编码产物具有STK、MSP等保守结构域。5．应用荧光

8、定量技术对未接菌和接菌不同时间点(Oh、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、120h)的TcLrl9、Thatcher进行分析，结果表明在接菌前以及接菌后120h内，TaRLPl9、TaSTKC8基因在TcLrl9和Thatcher中均有表达，为组成型基因。TaRLPl9基因在TcLrl9接菌前后出现表达时间提前且表达量下调的现象；TaSTKC8在TcLrl9接菌前后呈表达高峰提前且大部分时间点的表达量增高的现象，由此推