小麦与叶锈菌互作体系中TaHIR2基因克隆及其特性分析.pdf

《小麦与叶锈菌互作体系中TaHIR2基因克隆及其特性分析.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、分类号：S垒箜：121：垒一密级：公珏单位代码：!鲤墨鱼学号：2QQ墨QZZ小麦与叶锈菌互作体系中TaHIR2基因克隆及其特性分析CloningandanalysisofTaHIR2duringtheinteractionDetWeenw11eatannFuccmtamnelnal●-'一●●．●●学位申请人：指导教师：学科专业：学位类别：授予单位：答辩日期：陈佳平于秀梅副教授刘大群教授生物化学与分子生物学理学硕士河北农业大学二。一一年五月二十九日签字R期：山1＼年易月1日签字日期：勿，，年∥月，日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：摘要‘过敏性反

2、应(HypersensitiveResponse，HR)是植物抗病机制中最常见的一种抗病表现形式。过敏性诱导反应蛋白是参与植物HR过程的一类蛋白。目前在小麦上尚未见勋删的报道。为明确TaHIR2及其所编码蛋白在小麦中的存在状况及其与小麦抗叶锈病性的关系，本研究以受叶锈菌侵染的小麦抗叶锈病近等基因系TcLrl5为材料，利用PCR技术克隆获得小麦过敏性诱导反应蛋白2(TaHIR2)的cDNA及基因组DNA序列；利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术对小麦与叶锈菌亲和及非亲和互作过程中TaHIR2的表达模式进行了分析；通过构建原核表达载体对该基因进行原核表达，产生的蛋白用

3、于制备抗体，利用Western杂交技术对小麦中该基因所编码蛋白的表达情况进行检测；构建了含有TaHIR2基因的重组质粒，通过基因枪介导法分别对小麦品种Tchl5和Thatcher的成熟胚性愈伤组织进行了转化。主要内容包括以下几个方面：1．小麦TaHIR2基因克隆及序列分析。以小麦抗叶锈病近等基因系TcLrl5和非亲和叶锈菌株05．19．43②为材料，以接菌24h、48h和72h小麦叶片总RNA的等量混合物为模板，通过RT-PCR技术获得小麦TaHIR2的cDNA序列。同时以TcLrl5的基因组DNA为模板，通过PCR技术获得TaHIR2的DNA序列。2．小麦TaHIR

4、2时空表达模式分析。以接种非亲和叶锈菌05．19—43②和亲和叶锈菌05．5．137③的小麦TcLrl5叶片为材料，应用qRT-PCR技术检测接种不同毒力叶锈菌后小麦叶片中TaHIR2的时间表达模式。结果表明TaHIR2受叶锈菌诱导18h时表达量均上升，在接种36h时达到最大，然后下降。但在非亲和组合中，24h和36h的表达量要明显高于亲和组合。以小麦TcLrl5的幼根、幼茎、幼叶和种子为材料，应用qRT-PCR技术检测而艘在这几种组织中的表达量差异。结果表明TaHIR2在小麦幼叶中的表达量最大。3．TaHIR2蛋白在叶锈菌侵染不同时间点的小麦叶片中表达模式分析。将T

5、aHIR2基因的编码区插入到表达载体pET-30(+)中，获得原核表达载体TaHIR2．pET-30a，重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。对阳性菌株的蛋白表达条件进行优化，确定l盯G的最佳诱导浓度为0．3mM，最佳诱导时间为7h。表达的融合蛋白分子量为37kDa左右，该蛋白存在于包涵体中。用Ni2+-His亲和层析柱对蛋白进行纯化后，经SDS．PAGE电泳检测呈现单一条带。纯化的蛋白用于免疫兔子，制备抗体，当效价达到1：76800时，利用Western杂交检测抗体质量，并对小麦中TaHIR2蛋白的表达情况进行检测。杂交结果表明，在小麦中确实存在TaHIR

6、2蛋白。对叶锈菌侵染不同时问点的小麦叶片中TaHIR2蛋白的表达模式进行分析。结果表明在非亲和组合中，TaHIR2蛋白的表达量在检测的时间进程中平稳增长，60h时达到最大，而在亲和组合中，蛋白的表达量在96h时达到最大。4．TaHIR2基因植物高效表达载体构建及再生小麦幼苗获得。将TaHIR2基因的编码区定向插入到载体pAHC．25中，获得重组质粒TaHIR2．pAHC．25，利用基因枪介导法将该重组载体转化小麦品种TcLrl5和Thatcher的成熟胚性愈伤组织，经分化筛选后得再生的小麦幼苗。。本研究在克隆获得小麦TaHIR2cDNA及基因组DNA序列基础上，利用实

7、时定、Western杂交及转基因等技术对TaHIR2基因进行系统研究，研究结果一方面丰了小麦的基冈资源，另一方面对于揭示该基因在小麦中的功能，同时为阐明HR的生机制提供新的实验支持。键词：小麦；过敏性诱导反应蛋白2；基因克隆；基因鉴定；转基因CloningandanalysisofTaHIR2duringtheinteractionbetweenwheatandPucciniatriticinaAuthor：ChertJia—pingMajor：BiochemistryandMolecularBiologySupervisors：YuXiu—meiL