饲料中添加益生菌对凡纳滨对虾的生长和免疫力的影响

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淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页本科毕业设计(论文)饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响EffectsofProbioticBacteriumontheGrowthPerformanceandImmunityofLitopenaeusvannamei学院：海洋生命与水产学院专业班级：水产养殖131学生姓名：张鹏学号：2013121279指导教师：毕可然（副教授博士）你们老师是教授/副教授2017年5月 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页毕业设计（论文）中文摘要 饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响摘要：为研究饲料中添加益生菌对南美白对虾生长和免疫力的影响，以初体质量为(6.95±1.20从摘要开始全文的文字和字母是新罗马字体的)g的南美白对虾为实验材料，在室内养殖箱进行3周的养殖实验和2周的副溶血弧菌人工感染实验;其中，对照组每天投喂基础饲料，实验组每日投喂在基础饲料中添加地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌/枯草芽孢杆菌(1：1)配制成的3组实验饲料，实验饲料中益生菌的终浓度为1010cfu/g。实验结果表明，添加芽孢杆菌饲料喂养的南美白对虾的生长速度明显比对照组生长速度快(P<0.05)，其中添加复合芽孢杆菌的实验组生长速度最为明显。在饲料中添加单一芽孢杆菌或复合芽孢杆菌都可以明显加强南美白对虾对副溶血弧菌的抵抗能力(P<0.05)，且复合芽孢杆菌的保护能力更强。饲料中添加芽孢杆菌可以提高南美白对虾肠道蛋白酶和淀粉酶活力，且饲料中添加复合芽孢杆菌的实验组的淀粉酶活力相比于对照组显著提高(P<0.05)。饲料中添加芽孢杆菌可以有效的降低肠道中的弧菌数(P<0.05)，南美白对酚氧化酶活力、超歧化氧化酶活力和总抗氧化能力有了明显的提升。综上所述，饲料中添加益生菌可以促进南美白对虾的生长，加强其免疫力，添加复合益生菌则有更好的效果。关键词:南美白对虾;益生菌;生长;免疫力;副溶血弧菌 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页毕业设计（论文）外文摘要EffectsofProbioticBacteriumontheGrowthPerformance andImmunityofLitopenaeusvannameiAbstract: InordertostudytheeffectsofprobioticsonthegrowthandimmunityofPenaeusvannamei,thelarvaeofP.vannamei(6.95±1.20)gwereusedasexperimentalmaterialsandculturedintheindoorcultureboxfor3weeksTheexperimentalgroupwasfedwithBacilluslicheniformis,Bacillussubtilis,Bacilluslicheniformis/Bacillussubtilis(Bacillussubtilis)inthecontrolgroup,andthecontrolgroupwasfedwithbasaldietdaily.1:1).Thefinalconcentrationofprobioticsinexperimentalfeedwas1010cfu/g.TheresultsshowedthatthegrowthrateofPenaeusvannameifedwithBacillussp.Wasfasterthanthatofthecontrolgroup(P<0.05).Thegrowthrateoftheexperimentalgroupwasthemostobvious.TheadditionofsingleBacillusorBacillussubtilistothefeedcouldsignificantlyenhancetheresistanceofP.viridetoVibrioparahaemolyticus(P<0.05),andtheprotectiveabilityofBacillussubtiliswasstronger.Theactivityofamylaseandtheactivityofamylaseinthecontrolgroupweresignificantlyhigherthanthoseinthecontrolgroup(P<0.05).TheadditionofBacillusinfeedcouldeffectivelyreducethenumberofVibriointheintestine(P<0.05).TheactivityofPhenoloxidase,theactivityofhyperbranchedoxidaseandthetotalantioxidantcapacitywereimprovedobviously.Insummary,thefeedaddedprobioticscanpromotethegrowthofPenaeusvannamei,strengthenitsimmunity,addcompoundprobioticshaveabettereffect.Keywords:Penaeusvannamei;Probiotics;Growth;Immunity;Vibrioparahaemolyticus 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页目录1.1目前国内外对虾养殖简况51.2现阶段我国对虾养殖存在的主要问题51.3益生菌62.材料与方法72.1实验材料72.2实验分组82.3副溶血弧菌感染实验83.实验指标与计算93.1生长指标93.2肠道消化酶活力93.3虾肠道菌群总数和弧菌总数103.4免疫指标的测定103.4.1血细胞计数103.4.2酚氧化酶（PO）活性的测定104.结果与分析124.1不同益生菌对南美白对虾生长指标的影响124.2不同益生菌对肠道消化酶活力的影响134.3不同益生菌对肠道菌群总数和弧菌总数的影响144.4不同益生菌对南美白对虾免疫指标的影响154.4.1不同益生菌对南美白对虾血细胞数量的影响154.4.2不同益生菌对南美白对虾的血清中酚氧化酶（PO）活力的影响154.4.3不同益生菌对南美白对虾血清中的溶菌酶活力的影响154.4.4不同益生菌对南美白对虾血清中的超氧化歧化酶（SOD）的影响164.4.5不同益生菌对南美白对虾血清的总抗氧化能力的影响165.讨论165.1营养及益生菌添加剂途径的对虾免疫调控175.2饲料中添加益生菌改善养殖环境175.3无抗时代的抑菌方案18结论19致谢20参考文献211.绪论51.1目前国内外对虾养殖简况51.2现阶段我国对虾养殖存在的主要问题51.3益生菌62.材料与方法72.1实验材料72.2实验分组82.3副溶血弧菌感染实验83.实验指标与计算8 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页3.1生长指标93.2肠道消化酶活力93.3虾肠道菌群总数和弧菌总数93.4免疫指标的测定104.结果与分析134.1不同益生菌对南美白对虾生长指标的影响134.2不同益生菌对肠道消化酶活力的影响134.3不同益生菌对肠道菌群总数和弧菌总数的影响144.4不同益生菌对南美白对虾免疫指标的影响155.讨论165.1营养及益生菌添加剂途径的对虾免疫调控175.2饲料中添加益生菌改善养殖环境175.3无抗时代的抑菌方案18结论18致谢19参考文献20 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页1.绪论1.1目前国内外对虾养殖简况日前，由于虾类养殖业在农业生产总值中占很大一部分，对虾类也是人类摄取蛋白的重要来源，所以很多沿海国家的对虾养殖产业正处于快速发展时期，全球对虾养殖业进入迅速发展是从1980年到1990年。1993年，由于全球爆发对虾病毒，给对虾养殖业造成了很大的损失，之后对虾的养殖发展进入了没落期[1]。此后，因为养殖品种的研究，出现了南美白对虾养殖品种，再加上养殖技术的不断先进如微生物制剂的广泛使用，促进全球对虾养殖产业逐渐的稳步的前进，对对虾养殖产量的提升有着不可忽视的存在[2]。通过相关研究可了解，中国大部分地区对虾养殖产业重点养殖的品种为南美白对虾，并且南美白对虾产量占所有虾类产量百分比每年都在逐步提升，2003年我国养殖对虾总产量达到79万吨，其中南美白对虾产量达到61万吨，占虾类养殖总量的76.7%[3]。2010年全球对虾的总产量350万吨，而我国对虾养殖产量达到134.8万吨，其中海水对虾占到73.3万吨，淡水虾的产量占到61.5万吨，我国南美白对虾的产量约占我国南美白对虾容量的80%，我国南美白对虾主要养殖产地为江苏、广东和广西等地。目前我国对虾养殖主要养殖品种除了南美白对虾（Litopenaeusvannamei）外，还有斑节对虾（Penaeusmonodon），中国对虾（Fenneropenaeuschinensis），日本对虾（Marsupenaeusjaponicus）等。在我国沿海地区也有少量养殖长毛对虾（Fenneropenaeuspenicillatus），墨吉对虾（Fenneropenaeusmerguiensis），细角对虾（Litopenaeusstylirostris），新对虾（Matapenaeussp）等在我国沿海地区也有少量养殖。1.2现阶段我国对虾养殖存在的主要问题 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页虽然我国对虾养殖产业再不停的前进与进步，但现在当下依然有不少问题等待解决。目前国内在对虾养殖中生产中缺乏一个明确的管理标准，这就造成对虾养殖户对利润的一味追求，而造成对养殖环境的严重破坏，过多的重视对虾这一养殖对象，而忽视了养殖环境，饲料投喂过剩或养殖过程中操作不当导致养殖排水中营养成分的极大超标，这些养殖废水在没有经过处理的情况下被排放到养殖环境周围的自然水域中，引起该水域氮磷含量非正常上升，这就大大增加了该水域水体富营养化的可能。除了养殖生产过程的养殖废水的肆意排放，还有很多问题需要去解决：首先是虾苗的健康活力问题，健康的虾苗关系到养殖是否能够成功，民间有一句话：好的虾苗养殖已经成功了一半，所以健康的虾苗很重要，虾苗的成活率、抗病力和生长速度与虾苗的品质有很大的关系，饵料系数的高低与虾苗的品质也有很大程度上的联系。正因为这样，好多育苗场一味地提高出苗的成活率而很大程度上使用大量的违禁药品，从而导致虾类的免疫体质受到不同程度的损伤，在育苗过程不重视幼虾生长过程所需的营养成分，因为活饵料成本比较高，所以好多育苗场为了节约成本获得更高的利润选择不投喂活饵料，这样导致在养殖后期对虾虾体容易感染病毒性疾病白斑综合症病毒(WSSV)、桃拉病毒(TSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)[4]。白斑综合症病毒(WSSV)现在已经是制约我国南美白对虾养殖产业迅速发展的关键性影响之一。自1993年发现该病毒开始至今，全球水产研究者对它开展了大量的调查实验，但至今依然没有取得有任何突破性的进步，到现在也没有研发出任何有效可行的方案来预防白斑综合症病毒的爆发和控制该病毒的发散。第二因为养殖水质问题，工业废水、农业废水以及生活废水造成我国很多自然水体污染严重，仅仅就2010年中国就有760多亿m3的各种污水排流到自然水体中。被污水污染的水体通过多次的交叉污染，最后致使虾类疾病交叉互相传播，导致虾病大面积的爆发。其次，我国的饲料生产水平不及国外饲料生产水平，而且我国的饲料产品安全没有一个系统的行业标准，营养组成不科学，从而致使虾类的营养跟不上、生长速率过慢，因此很多开口饵料都是从国外进口的。1.3益生菌1.3.1益生菌的概念益生菌又名“微生物制剂”、“活性微生物”等，主要产品有光和细菌、乳酸杆菌、枯草杆菌、双歧杆菌、假单胞菌、酵母菌、粪球菌等。其中光和细菌是我国养殖早期最常用的益生菌，在这么多年的实践与探索中，益生菌的使用已经被普遍接受，并且成为一种普遍的养殖方式存在[5]。这几年来，在养殖产业上出现品种繁杂、功能多样的微生物制剂，有一些是国外引进的，还有一部分是我国自主研制的，使用效果也大同所异，在对虾养殖中使用Epicin来改善养殖水体环境[27]，很多益生菌在净化池底有机物上也都取得了明显的效果[6]，比如有机污染降解菌等等。益生菌作为外源细菌进入生物体，作用机理就好像直接吃进活的细菌，就好像投喂一些“好细菌”来遏制“坏细菌”；将水体中的氨氮等有机物质来作为益生菌的营养元，从而降低水中的氨氮浓度；养殖生产过程中一些有机污染物通过生物降解的方法来转变为二氧化碳、无机盐等无机物质；改善机体的新陈代谢，增强机体的对外界的刺激能力[7]；益生菌可以抑制有害菌在肠道内的繁殖，减少毒素的产生，从而促进肠道蠕动，提高肠道机能，增强肠道对营养的吸收，可以使养殖动物快速的生长[8]。水产养殖生产过程中，饵料的残留和动物的粪便在时间的催化下产生大量的有机污染物，使养殖水体的污染越来越严重，导致生态环境严重失衡[9] 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页。益生菌具有繁衍能力强、可以快速的适应生存环境、而且作用效果显著，与物理处理、化学处理等方法相比较，益生菌无需复杂的处理过程、这样可以节约大量的劳动力和经济投入、而且没有毒性残留，所以可以在养殖水环境调控过程中广泛推广。我国的水产养殖面积和产量均位列在世界的前沿，所以应该保持健康的养殖方式，益生菌应该广泛推广使用[10]。1.3.2益生菌在水产养殖中的调水作用水产养殖规模化的迅速发展可以带来巨大的利润和效益，但也引起了一系列的问题。在规模化的养殖环境里造成了严重的水体污染。有关研究显示，在养殖过程中对饵料的不完全利用，造成大量的残饵、粪便等碳氢化合物在养殖水体中的长时间累积，在厌氧细菌的催化下产生大量的毒性物质，对养殖动物造成不可挽救的伤害[11]，造成养殖水体的环境毁灭性破坏。另一方面，养殖水质问题，工业废水、农业废水以及生活废水造成我国很多自然水体污染严重。现在养殖环境的规模化，造成病毒种类的繁多复杂且传播迅速，造成养殖动物发病数增多，给养殖户带来了严重的经济损失。据相关资料显示，我国这几年养殖发生严重病害且发生病害的面积很大，占到总体养殖面积的五分之一，每年损失的产量多于146万吨[12]。近年来全国的养殖面积不断扩大，规模化的养殖方式的大面积使用，造成水体严重的富营养化。养殖过程中对饵料的用量没有准确的用量，造成饵料的残余，再加上养殖动物的粪便、尸体的有机物共存在一个养殖环境中，因为这几天养殖规模的不断扩大和养殖年限的增加，造成水体的自我恢复能力不断下降，使得养殖水体中的一些有毒物质的含量严重超标[13]，造成养殖水体的质量下降，水产病害发病频率升高，而造成这一系列问题发生的主要根源就是有机物污染、氨氮、亚硝态氮等在养殖水体中的长时间沉积。目前，国内尝试用益生菌对养殖污染的水体进行生态修复掀起了养殖领域对水处理的一片热潮，挑选培养针对净水作用和制剂生产性能优良的优势的芽孢杆菌或其他的组合是制作有效微生态净水产品的成败[11]。2.材料与方法2.1实验材料实验对虾：2017年4月3日在连云港市赣榆区青口镇对虾养殖场购买的南美白对虾用于此次试验用的虾，大小为300头，体质量(1.65±0．05)g。将买的虾暂养在有效体积大约为25升的3升的玻璃缸中。养殖期间每天换水1次，换水量为1/4-1/3，逐日投喂饲料3次，水的温温度保持在(23±2)℃，持续充气。益生菌：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(菌含量不小于1010CFU/g，绿百多生物有限公司生产)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(菌含量不小于1010CFU/g，绿百多生物有限公司生产)，常温保藏，用于拌料。副溶血弧菌：攻毒用副溶血弧菌，直接从实验室获得。活化菌种后使用2216E（1000mlNSS溶液中加入酵母膏1g，蛋白胨5g，磷酸铁0.1g，琼脂20g， 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页PH7.6-7.8）液体培养基来激活培养，用离心法收集培养菌体，再用PBS缓冲液稀释备用，用于人工感染实验。实验基础饲料：由南通巴大饲料有限公司生产的宝鼎牌南美白对虾配合饲料作为本次实验的基础饲料，饲料各指标见表1表1:基础饲料各项指标Tab.1:Compositionofthebasedieting/100gdrydiet原料Ingredients配比Quota原料Ingredients配比Quota鱼粉Fishmeal34豆粕Soybeanmeal13花生粕Peanutmeal9鱿鱼膏Squidcream4低筋面粉Low-glutenflour24次粉Timesthepowder4磷脂油Phospholipidoil1海鱼油Seafishoil1.5虾壳蜕壳素Shrimpshells0.1对虾多矿Shrimpmine0.5对虾多维Shrimpmultidimensional0.2胆碱Choline0.3诱食剂Attractant0.1抗氧化剂Antioxidants0.05磷酸酯Phosphate0.05磷酸二氢钙Calciumdihydrogenphosphate0.5实验饲料：以基础饲料为对照组。在基础饲料中分别添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(菌含量不小于1010CFU/g，绿百多生物有限公司生产)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(菌含量不小于1010CFU/g，绿百多生物有限公司生产)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(质量比为1∶1)，在1kg饲料中添加1g益生菌，配制菌含量不得低于107CFU/g的3种实验饲料。2.2实验分组将南美白对虾分为3组实验组和一组对照组，每组投放100尾虾，实验组投喂三个不同益生菌的试验饲料，对照组投喂不添加任何益生菌的基本饲料。在实验养殖期间，各组南美白对虾每天投喂3-4次，每日投喂饲料的质量约为对虾体质量的10%左右(具体根据池底饵料残余情况调节每次的投喂量)，所有的组别按照一开始实验暂时养的条件进行参考。2.3副溶血弧菌感染实验在养殖生长的第四周开始，从各实验组中挑选出健康，活力强，没有任何病症，个体大小相近的的50尾对虾分别重新放到一样的养殖环境的四个玻璃缸中进行副溶血弧菌人工感染实验，将副溶血弧菌溶液20ml 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页分别放到四个池中并搅拌均匀，感染实验开始后，不再换水，封闭水循环系统。各组依旧分别继续投喂对应的实验饲料或基础饲料，感染实验期间需要及时捞出每个池的死亡的对虾，并及时记录每个池死亡的数量和感染后死亡的时间，2周后结束感染实验。3.实验指标与计算3.1生长指标实验起始和实验结束时分别对各玻璃缸虾进行记数、称质量。饲料常规成分分析参照AOAC的方法[14]。相对增重率率：指增重和初体重的比值，是衡量生长状况的一个常用指标，特定增重率越大表示每天的体重增长越快，常用于实验中衡量生长指标。相对增重率的计算公式如下：RW=（Wb-Wa)/Wa×100%饵料系数：饵料用量和养殖品种的增重量的比值，表示饵料的营养效果。饵料效率的计算公式如下：FER=(Wb-Wa)/Wc×100%Wb、Wa分别表示平均终体质量(g)、平均初体质量(g)；T表示饲养时间(d)；Wc表示实验期间投入饲料量(g)3.2肠道消化酶活力养殖实验结束后，在每个玻璃池中随机取出10只南美白对虾，用牙签在虾头和虾身的连接处向下数第三个关节处穿过虾身（虾头和虾身的连接算第一个关节）轻轻向外挑出虾肠道，去除肠道里的粪便，用蒸馏水冲洗后放在干净的培养皿中用滤纸吸干，称出每组的质量，捣碎后分别移入电动匀浆器内匀浆（冰水混合），在4℃下离心30min(10000r/min)，移取上清液备用（需要一天内分析完毕）。蛋白酶活性测定采用福林-酚试剂，，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈现蓝色反应，利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活性[15]，在测酶活力前；先用福林-酚与已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出蓝色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线[16]，然后将蛋白酶与底物反应的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，以每mg酶蛋白在40℃的条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位。淀粉酶活性测定采用碘-淀粉比色法，淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小[17]，就提就是以每mg酶蛋白在37℃与淀粉反应30min，以水解10mg淀粉定为1个酶活性单位。 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页3.3虾肠道菌群总数和弧菌总数感染后的第14天测定虾肠道和粪便的弧菌及细菌总数。从每个池中随机取10尾虾，在无菌的环境下将10尾南美白对虾解剖，取出肠道，分离肠道和粪便，分别置于无菌玻璃匀浆器，分别加入5ml无菌的生理盐水后匀浆，然后取出匀浆液再进行20倍稀释，然后分别取0.1ml的稀释液均匀的涂抹在2216E和TCBS培养基，然后将培养皿放到28℃的恒温箱恒温培养2天，两天后统计菌落数，分别记录虾肠道的菌总数和弧菌的数量。2216E培养基的制作取蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.01g，琼脂20g，加热溶解于1000ml的蒸馏水中，加入5%的氢氧化钠溶液调节PH7.6-7.8，121℃高压灭菌15分钟，待冷却至50℃倾倒到无菌的培养皿中，冷却凝固后放入到恒温箱备用。TCBS培养基的制作取酵母粉5g，蛋白胨10g，硫代硫酸钠10g，枸缘酸钠10g，牛胆粉5g，牛胆酸钠3g，蔗糖20g，氯化钠10g，柠檬酸铁1g，麝香草芬兰0.04g，琼脂15g煮沸溶解于1000ml的蒸馏水中，冷却至60℃时，倾倒于无菌培养皿，冷却凝固后放入恒温箱36摄氏度左右备用。3.4免疫指标的测定实验结束后，24h内每组都不投喂任何食物，饥饿处理后，从每个玻璃池中随机取出5尾南美白对虾，用1mL无菌注射器，在南美白对虾头部的心脏部抽血，将每组抽的血分别放到无菌量筒中，测出每组的血淋巴容积，然后按照血液与抗凝剂按照1：2的比例混合，混合后静置12小时，然后在4℃下3000r/min进行10分钟的离心，然后分离上层血清，封闭置于-80℃超低温冰箱储藏待用。3.4.1血细胞计数利用血球计数板在光学显微镜400倍下直接计数,计算出每毫升血淋巴中的血细胞数目。3.4.2酚氧化酶（PO）活性的测定酚氧化酶(PO)活力的测定是用L-dopa作为底物,参照改进的Ashida[7]方法进行试验,具体步骤如下：取浓度为0.1mol/L的磷酸钾盐缓冲液（PH6.0）300微升于96孔的酶标板中，再取出浓度为0.01mol/L的L-dopa10微升于酶标板中，最后取出10微升的血清于此前加的缓冲液混合L-dopa的酶标板中25℃下混合均匀，然后将酶标板放到多通道分光-荧光光度计中，将温度设定为28℃，其吸收波长设置为490nm，测定血清酶动力的光密度值，测量期间2分钟测一次，测定10次。以490nm波长的光下测得的吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作实验结果图，1 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页个酶的活力单位以本次实验条件下光密度值每分钟增加0.001作为标准。为方便实验测得结果，本次实验在相同测定条件下可以直接采用酶活力单位来表示酶的活性。3.4.3血清溶菌酶活性的测定3.4.3.1：实验原理：溶菌酶的测定原理是利用溶菌酶对细菌的溶菌作用，用对溶菌酶比较敏感的菌株悬液作为底物，酶的活性测定依靠酶作用菌液光密度减少值来确定[18]。3.4.3.2：标准曲线用0.1ml不同浓度的酶标准溶液于4支小试管中，在37℃水浴中加热5分钟，然后再向每支试管中加入2ml同样37℃预热的菌液，然后摇晃使其混合均匀，此时立刻记录实验起始的时间，2min后滴加一滴（体积约为0.05ml）浓度为5mol/L的KOH用来停止此次反应。立刻将反应溶液倒入比色皿中，用波长为640nm来测定其光密度值结果记作D0。其余3支试管重复以上操作，分别记为D1，D2，D3，然后以光密度值作为纵坐标，溶菌酶浓度作为横坐标制作标准曲线图。3.4.3.3：血清溶菌酶活性测定血清溶菌酶第一步测定方法与制作标准曲线的测定方法一样，取0.1ml的血清溶液于小试管中，在37℃水浴中加热5分钟，然后再向试管中加入2ml同样37℃预热的菌液，然后摇晃使其混合均匀，此时立刻记录实验起始的时间，2min后滴加一滴（体积约为0.05ml）浓度为5mol/L的KOH用来停止此次反应。立刻将反应溶液倒入比色皿中，用波长为640nm来测定其光密度值结果记作D4.血清溶菌酶第二步测定方法是另取0.1ml的血清溶液，然后滴入一滴（体积约为0.05ml）浓度为5mol/L的KOH摇晃使其混合均匀，在37℃水浴中加热5分钟，再同样加入2ml、37℃预热的菌液，在同样的实验条件下2分钟后记录其光密度值D5，所以光密度减少值为（D4-D5）。3.4.4血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化力的测定血清中超氧化歧化酶（SOD）活性和总抗氧化力的测定可以直接用试剂盒（南京建成生物工程研究所生产）测得。3.4.4.1超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（羟胺法）操作方法：试剂对照管测定管试剂一（ml）1.01.0样品（ml）0.01.0蒸馏水（ml）1.00.0试剂二（ml）0.10.1试剂三（ml）0.10.1试剂四（ml）0.10.1 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页用旋涡混匀器充分混匀，置37℃恒温水浴40分钟显色剂（ml）2.02.0混合均匀，室温放置10分钟，于波长550nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，比色。计算公式：血清中超氧化物歧化酶（SOD）活力计算：（U/ml）SOD=3.4.4.2总抗氧化能力的测定：操作方法：试剂对照管测定管试剂一（ml）1.01.0样品（ml）0.01.0试剂二（ml）2.02.0试剂三应用液（ml）0.50.5旋涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟试剂四（ml）0.10.1样品（ml）1.00.0旋涡混匀器充分混匀，放置10min，蒸馏水调零，1cm光径，520nm处测各管吸光度。计算公式：血清中总抗氧化能力（T-AOC）的计算：3.5数据处理和统计分析实验结果用平均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS19．0分析软件对数据进单因素方差(One-WayANOVE)分析，Duncan氏法进行多重比较，处理间(P＜0．05)则认为差异显著。4.结果与分析4.1不同益生菌对南美白对虾生长指标的影响基础饲料，基础饲料中饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(质量比为1∶1)对南美白对虾的生长指标参见表2表2南美白对虾增重、增重率、饵料系数和成活率Tab2:Weightgain,baitcoefficientandsurvivalrateofPenaeusvannamei实验组Testgroup初体（g）Earlyweight末体重（g）Bodyweight增重（g）Weightgain增重率Weightgainrate饵料效率Baitefficiency成活率Survivalrate对照组1.65±0.052.88±0.021.23±0.02a74.55%a0.73a85%地衣芽孢杆菌1.65±0.053.03±0.081.38±0.08ab83.64%ab0.68a80%枯草芽孢杆菌1.65±0.053.05±0.051.40±0.05ab84.85%ab0.70a78%地+枯（1:1）1.65±0.053.17±0.071.52±0.07abc92.12%abc0.83ab87%注：相同列数据的右上角不同的上标字母代表有显著差异(P<0.05)Note：Valuesinthesamecolumnwithoutacommonsuperscriptaresignificantlydifferent(P<0.05)由上表可以明显的看出：饲料中添加益生菌均可以提高南美白对虾的生长速度（P＜0.05），其中饲料中单一添加地衣芽孢杆菌的南美白对虾生长速度与饲料中单一添加枯草芽孢杆菌的生长速度差异不明显（P＞0.05），但与添加复合芽孢杆菌的生长速度有显著的差异（P＜0.05）。饲料中单一地添加枯草芽孢杆菌或者地衣芽孢杆菌对饵料效率的影响与对照组的饵料效率差异并不显著，但是添加复合芽孢杆菌的实验组的饵料效率与对照组有显著的提高（P＜0.05）。实验的成活率在78%-87%之前，由于实验的南美白对虾的数量有限，并不能得出有效的结论。4.2不同益生菌对肠道消化酶活力的影响基础饲料，基础饲料中饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(质量比为1∶1)对南美白对虾的肠道消化酶活力参见表3表3：不同益生菌对南美白对虾肠道蛋白酶和淀粉酶活力的影响Tab3:EffectsofdifferentprobioticsonintestinalproteaseandamylaseactivityinPenaeusvannamei 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页实验组Testgroup蛋白酶Protease淀粉酶Amylase对照组18.8±0.58a4.34±1.13a地衣芽孢杆菌23.61±1.08ab8.28±0.89ab枯草芽孢杆菌23.35±0.99ab7.89±1.34ab地衣＋枯草（1:1）23.93±0.76ab8.73±0.64b注：相同列数据的右上角不同的上标字母代表有显著差异(P<0.05)Note：Valuesinthesamecolumnwithoutacommonsuperscriptaresignificantlydifferent(P<0.05)由上表可以明显的看出，饲料中添加益生菌均可以提高南美白对虾肠道中的蛋白酶和淀粉酶的活性（P＜0.05），但是饲料中添加地衣芽孢杆菌的实验组、添加枯草芽孢杆菌的实验组和添加复合芽孢杆菌的实验组之间对南美白对虾肠道蛋白酶的活力差异并不明显（P＞0.05）。单一的添加枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌之间对南美白对虾肠道淀粉酶活力没有明显差异的影响（P＞0.05），但是添加复合芽孢杆菌相比于添加单一的芽孢杆菌可以更好的提高南美白对虾肠道淀粉酶的活性（P＜0.05）。4.3不同益生菌对肠道菌群总数和弧菌总数的影响基础饲料，基础饲料中饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(质量比为1∶1)对南美白对虾的肠道菌群总数和弧菌总数的影响参见表4表4：不同益生菌对南美白对虾肠道菌群总数和弧菌总数的影响Tab4:EffectsofdifferentprobioticsonthetotalnumberofintestinalmicrofloraandthetotalnumberofVibrioinPenaeusvannamei实验组Testgroup菌群总数Totalnumberofflora弧菌总数TotalnumberofVibrio对照组4.0×107a1.29×107a地衣芽孢杆菌1.17×107b7.08×105b枯草芽孢杆菌2.95×107ab4.68×106地衣＋枯草（1:1）5.89×106bc6.69×105b注：相同列数据的右上角不同的上标字母代表有显著差异(P<0.05)Note：Valuesinthesamecolumnwithoutacommonsuperscriptaresignificantlydifferent(P<0.05)由上表可以明显的看出，饲料中添加益生菌均可以降低南美白对虾肠道中的细菌总数（P＜0.05），但是添加复合芽孢杆菌比单一添加地衣芽孢杆菌或者枯草芽孢杆菌可以更有效的降低南美白对虾肠道中的细菌总数（P＜0.05 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页）。饲料中添加益生菌也均可以降低南美白对虾肠道中的弧菌数量（P＜0.05），其中添加枯草芽孢杆菌最为明显（P＜0.05），但是添加地衣芽孢杆菌和复合芽孢杆菌相比，两者没有显著的区别（P＞0.05）。4.4不同益生菌对南美白对虾免疫指标的影响基础饲料，基础饲料中饲料中添加地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌+枯草芽孢杆菌(质量比为1∶1)对南美白对虾的血细胞数、溶菌酶和酚氧化酶的影响参见表5，对南美白对虾的超氧化歧化酶和总抗氧化能力的影响参见表6表5：不同益生菌对南美白对虾血细胞数、酚氧化酶和溶菌酶的影响Tab5:EffectsofDifferentProbioticsonBloodCellCount,PhenoloxidaseandLysozymeinPenaeusvannamei实验组Testgroup血细胞数（107cell/ml）Numberofbloodcells酚氧化酶(U/ml)Phenoloxidase溶菌酶(U/ml)Lysozyme对照组1.57±0.12a6.3±0.5a16.75±0.71a地衣芽孢杆菌1.76±0.11a13.3±1.5b20.00±1.73b枯草芽孢杆菌1.68±0.15a13.9±1.7b21.75±3.47b地衣+枯草（1:1）2.18±0.12b17.4±0.8bc28.45±2.37bc注：相同列数据的右上角不同的上标字母代表有显著差异(P<0.05)Note：Valuesinthesamecolumnwithoutacommonsuperscriptaresignificantlydifferent(P<0.05)4.4.1不同益生菌对南美白对虾血细胞数量的影响由表5可以明显的看出，饲料中添加单一的枯草芽孢杆菌的实验组或者单一的地衣芽孢杆菌实验组相比于基础饲料的对照组，南美白对虾的血细胞数量没有明显的提高（P＞0.05），但是添加复合芽孢杆菌的实验组的南美白对虾的血细胞数量相比于其他三组有明显的提高（P＜0.05）。4.4.2不同益生菌对南美白对虾的血清中酚氧化酶（PO）活力的影响由表5中可以看出，饲料中添加益生菌均可以提高南美白对虾的血清中酚氧化酶的活性（P＜0.05），其中单一的添加枯草芽孢杆菌和单一的添加枯草芽孢杆菌相比，两者对南美白对虾血清中的酚氧化酶活性的没有显著的差别（P＞0.05），但是添加复合芽孢杆菌的实验组中南美白对虾血清中的酚氧化酶活性明显大于其他几组（P＜0.05）。4.4.3不同益生菌对南美白对虾血清中的溶菌酶活力的影响由表5中可以明显的看出，饲料中不管添加何种益生菌均可以提高南美白对虾血清中的溶菌酶的活性（P＜0.05 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页），其中单一的添加枯草芽孢杆菌和单一的添加枯草芽孢杆菌相比，两者对南美白对虾血清中的溶菌酶活性的没有显著的差异（P＞0.05），但是添加复合芽孢杆菌的实验组中南美白对虾血清中的溶菌酶的活性相比于单一的添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的实验有明显的提高（P＜0.05）。表6：不同益生菌对南美白对虾超氧化歧化酶和总抗氧化能力的的影响Tab6:EffectsofdifferentprobioticsonsuperoxidedismutaseandtotalantioxidantcapacityofPenaeusvannamei实验组Testgroup超氧化歧化酶(U/ml)Superoxidedismutase总抗氧化能力(U/ml)Totalantioxidantcapacity对照组271.45±1.33a5.66±0.32a地衣芽孢杆菌294.65±3.45b7.87±0.07b枯草芽孢杆菌287.26±7.45b12.57±0.48bc地衣+枯草（1:1）288.34±7.05b11.36±1.88bc注：相同列数据的右上角不同的上标字母代表有显著差异(P<0.05)Note：Valuesinthesamecolumnwithoutacommonsuperscriptaresignificantlydifferent(P<0.05)4.4.4不同益生菌对南美白对虾血清中的超氧化歧化酶（SOD）的影响由表6中可以明显的看出，饲料中添加益生菌均可以提高南美白对虾血清中的超氧化歧化酶（SOD）活性，但是单一的添加枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的实验组与添加复合芽孢杆菌的实验组相比，三者对南美白对虾血清中的超氧化歧化酶（SOD）没有明显的区分（P＞0.05）。4.4.5不同益生菌对南美白对虾血清的总抗氧化能力的影响由表6中可以看出，饲料中添加益生菌均可以提高南美白对虾血清中的总抗氧化能力（P＜0.05）。其中添加枯草芽孢杆菌和添加复合芽孢杆菌的两组实验组之间差异不显著（P＞0.05），但是相比于单一的添加地衣芽孢杆菌的实验组有明显的提高(P＜0.05）。5.讨论在全球的对虾养殖领域中对由于病毒性疾病以及早期死亡综合症对对虾养殖造成严重的损失的研究都是水产研究界的一个困扰。这些年以来，相关研究学者在对虾的致病源以及提高对虾免疫力等方面取得突破性进展[19]。在此，一些研究学者根据以往这些的研究成果开发出了有效阻止对虾病害的发生的方法以及提高对虾对外源刺激物的应激能力的技术措施。从养殖动物的元素需求和抗病力方面来说，在养殖动物的饲料中添加微生物制剂的措施，可以增强对虾对各种理化刺激因素的应激能力，提高南美白对虾生长速度，增加经济收益。因为有了这些研究成果，才能保证对虾养殖 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页生产的安全以及对虾养殖行业的可持续的发展。从实际应用的角度出发，饲料中添加益生菌可以从以下三个方面来提高对虾对各种刺激因素的应激能力：首先是通过对虾对各元素需求的平衡或外源刺激提高对虾对各种理化刺激因素的应激能力，其次是减少水中刺激性物质对对虾免疫的刺激，最后是利用对水体内外的环境调节抑制病原生物的产生和减少对对虾感染的可能。5.1营养及益生菌添加剂途径的对虾免疫调控除了营养元素的准确均衡配置之外，更多的研究焦点聚集在对虾的应激调节上益生菌所起的作用。益生菌是一类能刺激白细胞活性从而提高动物抗病毒、细菌或其他病原能力的微生态制剂。对于节肢动物门，起作用的主要方面是提高酚氧化酶和与其相关的元素的生命力[20]。特别要强调的是，益生菌不是添加的越多效果会越好，相关研究均表明，益生菌的使用效果与其添加的用量并名优很准确的线性关系。在益生菌制剂的使用方面，首先益生菌准确的搭配使用相当关键，其次，准确的添加量也很关键。所有的搭配方法以及使用剂量都要在养殖动物上经过大量的实验数据分析才能过证明它对养殖动物的效果。但在剂量稍微超出“安全”剂量时则会产生某些信号分子降低动物食欲甚至抑制动物生长的现象[26]。其次，在饲料中直接添加益生菌，养殖动物广泛存在着“应激疲倦”，就是在一直投喂添加益生菌的饲料的实验组，对虾的应激反应提升后会缓慢的降到其之前状态[28]。所以，在养殖动物有了应激疲倦之后，通过何种办法对养殖动物的免疫系统的再次恢复是每一个研究学者不可忽视的存在。5.2饲料中添加益生菌改善养殖环境相比于陆地上动物的生活环境而言，对虾生活在水中，，因为水的流动性，使得水中的有机物质被清除干净存在一定的难度。尤其是在当今养殖水环境严重超负荷运载下，对虾池的水进行大量进排放的情况下，对虾对新的水环境的应激容易造成对虾虾病的发生。所以，在饲料中添加益生菌来提高对虾的摄食率，从而降低水中的残饵和粪便，减少了对养殖水体的污染的威胁，从而保证对虾健康快速的生长，带来更高的经济效益。相比较鱼类的吞食的摄食方法，对虾等甲壳动物的摄食方法是抱食，摄食速度相比很慢，所以造成饲料在水中溶解严重，想要解决这一问题，无非就是要缩短对虾的摄食过程，只有在消化得快吃的快的情况下才能解决这个问题，所以提高对虾对饲料的消化速度是解决这一问题的最根本手段。除此之外，相关研究表明，饲料生产过程中的生产工艺上对原料进行超微粉碎可以有效加快对虾对饲料的消化速度，因为饲料营养的更完全吸收从而减少了粪便中的营养物质对水环境的影响。 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页5.3无抗时代的抑菌方案对虾是无脊椎动物，没有特异性免疫系统。因此，除了提高对虾先天免疫系统以提高其自身抗病能力之外，通过技术手段减少病原的繁殖和滋生也是减少对虾疾病发生的重要课题。目前，副溶血弧菌等病原导致的EMS等疾病是影响对虾养殖成功的重要原因[23-25]。相关研究表明，虾病发生的主要特点都是从一开始的肠道感染发展而来，所以可以推测，虾病的病原体都是通过虾的口腔来进入到下的身体中的。所以，饲料中添加益生菌来维持虾肠道中的优势菌落的比例从而减少弧菌等病原体的繁殖生长并降低弧菌对虾的感染威胁。在后抗生素时代，饲料中通过添加具有抑制细菌活性的物质或者添加其他有益益生菌，抑制肠道中弧菌以及其他有害菌的生存以及形成优势的菌落，从而起到保持肠道健康的作用[22]。很多益生菌的生物学研究已经表明具有抑制有害细菌的生长甚至杀死有害益生菌的作用，因此，这些益生菌的生物学意义还具有提高水产动物对外界理化因素的刺激的应激能力。因此，挑选出合适的益生菌和合理的添加益生菌的量以及益生菌之间的合理搭配称为现在研究学者在研究饲料中添加益生菌的主要研究方向。但是，益生菌之间以及益生菌与其他微生物制剂以及其他细菌之间是否存在矛盾，以及不同益生菌之间添加的合理搭配，都是学者应该重点研究的方向，也是现在所面临解决的问题[29]。 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页结论从本实验中我们可以得出这样的结论，饲料中添加益生菌可可以使肠道消化酶活力有显著的提升，保持南美白对虾肠道菌相处于一种动态平衡的状态，大大提高对虾对外源或内源抗原的抵抗能力，同时可以增强对虾对各种理化刺激因素的应激能力，提高南美白对虾生长速度，增加经济收益。另外实验中可以看出，单一益生菌添加后所显示出来的效果不如复合益生菌显示的效果明显。这对于一些饲料厂家在生产南美白对虾饲料中添加益生菌的有着非常重要的理论依据。但是，由于养殖环境的差异性，益生菌在不同环境下所表现出来的效果有待进一步研究。 淮海工学院二〇一七届本科毕业设计（论文）第23页共23页致谢时间过得很快，眨眼间四年紧迫而又充盈的大学生生活即将拉下帷幕。在这四年的大学生活中，我得到了很多良师益友的关心和帮助。在学位论文的最后，我要向所有论文实验期间给予我支持、帮助和激励的人表示我最衷心的感谢。首先，我要感谢我的指导老师毕可然教授对我的督促。从论文的选题、构思、编写到最后的结稿，毕可然教授对我都是耐心的指导和悉心的帮助，使我的毕业论文能够顺利的完成。毕可然教授对工作的认真态度、对学术的刻苦专研和严谨的作风，都是值得我用一生去学习。其次，感谢海洋生命与水产学院的全体领导和老师，因为他们的悉心教导，我学到了专业的知识，使我的专业技能有了进一步的提升。同时，也感谢和我一起完成实验的同学李席席同学、谢益同学以及软件指导同学郑志刚同学、朱丹阳同学对我的帮助和支持。最后，由衷感谢我的家人一直的包容与无私的关怀默默地支持我完成了人生中的学习，感激他们这二十三年的养育和教导，因为他们一直以来生活上的关怀和精神上的支持使我有了战胜困难的信心！因为有你们，所以感到快乐！毕业的钟声即将敲响，我们即将离开学校走上社会去工作，去生活，我会一直铭记所有在学习和生活中给予我帮助的人，谢谢你们！ 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