饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响及作用机理

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河北大学硕士学位论文饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响及作用机理姓名：裴素蕊申请学位级别：硕士专业：水生生物学指导教师：管越强20090601 摘要‘本文从雨生红球藻中提取虾青素，高效液相色谱法测定虾青素的含量后添加到凡纳滨对虾的基础饲料中。分别从虾青素对生长、存活和抗氧化能力的影响，对抗氨氮胁迫能力的影响和光保护作用三个方面研究饲料中添加虾青素对凡纳滨对虾的影响，并探讨其作用机理。实验中虾青素分别以0、20、40、60、80、100mg／kg的浓度添加到凡纳滨对虾的饲料中投喂7周，研究虾青素对凡纳滨对虾生长、存活和抗氧化能力的影响。结果显示，虾青素可提高凡纳滨对虾的存活率和特定生长率(SGR)，其中添加量80mg／kg组最高，80mg／kg组SGR和对照组间差异显著妒12眺曲可显著提高斑节对虾增重、存活和抗WSSV感染的能力，降低饲料系数。谭北平等【711研究了葡聚糖对凡纳滨对虾生长、免疫保护力及非特异性免疫指标的影响，实验结果表明，葡聚糖能够显著的提高凡纳滨对虾的生长、酚氧化酶活性及吞噬活性、血细胞总数等免疫指标。肽聚糖(PG)存在于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁中，在革兰氏阳性菌中含量很高，是由N．乙酰葡萄糖胺与N一乙酰胞壁酸形成的二糖，通过肽链相互交叉构成的聚合物。Matsuo等【硎报道，肽聚糖能够增强虹鳟(Oncorhynchusmykiss)抵抗鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和孤立肠球菌(Enterococcusseriolicida)的能力，但是肽聚糖增强虹鳟抵抗细菌感染的能力是暂时的，在28d时表现出对细菌的防御能力，而在56d时则没有防御作用。肽聚糖对对虾血淋巴中的抗菌、溶菌、酚氧化酶和超氧化物岐化酶等具有不同程8 第l章绪论度的诱导作用【731，能够增强对虾血细胞的噬菌作用及对WSSV的抵抗能力【741。饲料中添加适量的肽聚糖能够显著的提高同本囊对虾与儿纳滨对虾血清酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶等非特异性免疫指标[75,76】。脂多糖(LPS)是从革兰氏阴性菌的细胞壁中提取出来的，它是细胞的内毒素，是调节哺乳动物免疫功能最为有效的一种多糖。LPS由三个重要的亚单位组成：分别为O一特异性侧链、核内区域以及最内部的类脂A。LPS内毒素在增强动物的免疫机制中发挥重要作用，LPS在鱼类如大西洋鲑中己经应用成功。LPS能够刺激对虾的细胞防御功能，如噬菌作用、黑色素沉着、包裹和凝结作用等，这种刺激还能被血浆识别蛋白增强。海藻多糖是海藻中主要组成部分，主要为海藻中的高分子碳水化合物。目前能进行工业化生产的海藻多糖主要有褐藻胶、琼胶、卡拉胶、红藻胶等。虫草多糖是冬虫夏草中重要的生理活性成份。江晓路等【771将从北虫草(CD毋c叩豳mililaris)d?提取的真菌多糖体腔注射到中国明对虾中，注射48h后，中国明对虾血细胞的吞噬率提高11．4％，噬菌指数提高39．7％，血清的溶血能力、溶菌能力与对照组相比有显著升高，一直维持到96h仍具较高水平，对虾血清凝集红细胞活性也有所增加。昌鸣先等【78】将虫草多糖添加到同本沼虾(Macrobrachiumnipponensis)的饲料中，结果除个别情况外，虫草多糖组的吞噬百分比和吞噬指数、抗菌活力、溶菌活力均高于对照组，证明投喂虫草多糖能够显著增强日本沼虾的免疫防御能力。刘恒等【791利用由海藻中提取的与微生物多糖有类似结构和性质的免疫多糖作为饲料添加剂，投喂凡纳滨对虾，对虾的抗病能力和免疫活性都有不同程度的提高。刘树清等【80,811利用海藻多糖与北虫草多糖作为免疫激活剂，对中国明对虾和日本囊对虾进行腹腔注射，结果表明这两种多糖能促进对虾机体非特异性免疫机能的增强，提高溶菌酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶等体液因子的活性。但大部分研究人员提取的多糖成分都比较复杂，究竟是那种物质起作用还不是很清楚，多糖作用的机理也也需要进行深入研究。1．4．1．2维生素类维生素类作为虾类免疫增强剂的研究很多，涉及的主要有VA、Vc和VE。在饲料中添加VA可以促进性腺发育和性激素的形成，维护骨骼的正常生长和修补，保护上皮组织的健全和完善、促进结蒂组织中粘多糖的合成、维护细胞膜和细胞器的结构完整。Vc是对虾生长发育和维持正常生理功能所不可缺少的营养物质，具有提高对虾抗应激能力9 河，化人’Z碑。≯硕十沦文和抗病力的能力【82,83】。VE的主要功能为抗氧化，保护脂溶性细胞膜和不饱和脂肪酸彳i被氧化，在饲料中适量添加，可促进吞噬细胞的生成，增强吞噬活力，提高血清中酚氧化酶活性【841。各种维生素在不同虾类中最适添加量不同，添加过量往往会引发不良反应甚至中毒死亡。1．4．1．3中草药制剂中草药作为我国的传统药物，主要功能有营养、增强免疫、抗应激、维生素样、激素样、双向调节和抗生素样等多方面的作用。其突出的优点是：毒副作用小，不易造成有害残留，从而可以长期添加使用。中草药作为水产动物用饲料添加剂，具有促进机体生长，改善肉类品质，增强机体预防疾病能力等作用。陈孝煊【85】等用大黄和黄连的水煎液与饲料混合成药饵后分别投喂克氏原螫虾和红螯螯虫-F(Cheraxquadricarinatus)结果表明大黄和黄连均能增强克氏原螯虾和红螯螯虾血细胞的活性。李义等【86】将黄蔑，党参，大黄，板篮根等十余味中草药粉碎，生筛后制成复方添加剂按一定比例添加于基础饲料中进行投喂，然后用嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)作为病原进行感染，结果表明，罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergif)血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力均显著提高。罗日祥【8‘7】用2种中药制剂分别以口服和注射的形式对中国明对虾进行实验，发现l号中药制剂能激发中国明对虾免疫系统的功能，诱导血凝素活力、溶菌活力升高，可显著提高机体的非特异性体液免疫能力。叶均安【88】将丁香、金银花等中药粉碎后按比例喷洒于对虾颗粒饲料上进行投喂，结果显示：投喂中药饲料后，对虾酚氧化酶活力和溶菌活力显著提高。1．4．1．4复合疫苗对虾疫苗研究获得的成果比较少，比较成功的只有对虾弧菌疫苗。Sung等和Song等曾对弧菌疫苗进行过报道，口服后可使凡纳滨对虾产量提高8％．10％，死亡率减少[89,90l。陶保华等【911用弧菌疫苗分别以浸泡、口服、注射等方式免疫斑节对虾和同本囊对虾，发现对虾的免疫保护率随疫苗浓度的增加而升高，酚氧化酶活力也升高，这表明弧菌疫苗可以提高虾的成活率和抗感染能力。丁烯等【嘲提纯、处理了七种大分子物质对中国明对虾进行免疫，并根据其结果筛选出几种物质制成复合疫苗。结果除小牛血清白蛋白外，其余6种物质的SOD活力和溶菌活力均明显提高(SOD活力最高峰224．1units，溶菌活力最高峰0．112units)。说明复合疫苗具有提高SOD活力和溶菌活力的作用，可10 第1奇绪论增强中幽明对虾的防御能力。复合疫苗对SOD活力的提高，优于各单一成分的免疫，说明复合疫苗的效果比较好，具有更好的发展前景。1．4．2免疫增强剂的使用方法免疫增强剂的使用方法主要有：注射法、口服法及浸泡法。在生产中以口服法最为实用。注射法虽然效果比较明显，但劳动强度大，在生产上不方便。浸泡法在鱼用疫苗的免疫接种中使用的比较普遍，优点是对鱼类造成的应激性小而且可以同时处理较多的鱼体，但是在浸泡过程中，物质是通过鳃和其他器官进入体内的，吸收量很少，持续的时间较短，效果不十分理想。免疫增强剂在虾类上的应用，则主要是通过口服的方式。这种方法不会对虾类造成伤害，且适用于各个生长阶段的个体。因此在加工饲料过程中如何保持免疫增强剂的活性成分，以及在虾体内如何能够更大程度的吸收免疫增强剂，便成为免疫增强剂应用研究的一个重要的方面。1．4．3免疫增强剂使用剂量对免疫效果的影响确定添加免疫增强剂的剂量和时间是免疫增强剂有效应用的重要前提。研究结果表明：免疫增强剂的免疫作用并不是直接依赖于剂量，高剂量有时不仅不会增强免疫效果，反而会抑制免疫反应。Mulero等【93】在用左旋咪唑对乌颊鱼(印以Maurata)吞噬细胞进行激活的体外实验中，10～．103ng／ml的左旋咪唑未能提高其吞噬细胞的吞噬活性，而101与103ng／ml两种浓度的左旋咪唑，在48h显著抑制了巨噬细胞活性氧中间产物的产量。在我们的实验中也出现了同样的结果，饲料中添加80mg，kg虾青素对凡纳滨对虾的生长存活和抗氧化能力的促进作用均要高于100mg／kg组。1．5虾青素作为免疫增强剂的研究进展1．5．1虾青素虾青素是一种红色的类胡萝卜素，属于非营养型免疫增强剂。化学名为3，3’．二羟基．4，4’二酮．p，3'-胡萝卜素，分子式为C40H5204，为萜烯类不饱和化合物，分子结构中有两个D．紫罗兰酮环，共11个共轭双键【舛1。虾青素可根据立体异构体、几何异构体分为多种形式，如图1．2。虾青素根据酯化与否及酯化程度分为单体虾青素、虾青素单酯和虾青素双酯。在细胞中单体虾青素不稳定，多以虾青素酯的形式存在。从虾青素的来源来看，分为人工合成和天然来源两类，天然来源主要有水产品加工的废弃物、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)、雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)和转基11 河北人学理学硕tj论文因工程菌四类【94,95】。由于雨生红球藻和红发夫酵母中虾青素含量高，且较易进行批量培养，使之成为研究的热点，同时也是天然虾青素的主要来源。本实验中虾青素即来源于雨生红球藻。u3露。31露图1．2虾青素结构式Fig1．2Structuralformulaofastaxanthin1．5．2虾青素的作用1．5．2．1虾青素对甲壳动物生长、存活和着色的影响虾青素对甲壳动物存活率和生长率的影响，各位学者的研究结果不完全一致。Yamada[96]的研究结果表明，若在日常饲料中添加100mg／kgl撒T青素，对虾存活率可达91％，而对照组仅为57％。金征宇等【97】通过开展天然虾青素的喂食实验指出，以虾青素作为饲料添Dil齐U可使罗氏沼虾的存活率增加21．66％左右。Pan等【981研究虾青素的喂食、养殖水体条件对斑节对虾的着色、生长及存活率的影响时指出，喂食虾青素可以促进其生长、提高存活率。但H邳az等【99】研究发现，饲料中添加虾青素对红螯螯虾的生长和存活没有影响。Chien等【啪1的研究表明，虾青素对于日本囊对虾的生长影响不显著。饲料中添加适量虾青素具有显著的着色效果。甲壳动物虾青素是虾体色素中最主要的类胡萝卜素，它与蛋白质一起形成蓝色的虾青素蛋白，使许多甲壳动物呈现出深青蓝体色。多数甲壳动物的机体自身无法从头合成虾青素，因此在饲料中添加能起至Ull,充色素、增加着色效果的作用。Menasveta等【1011研究发现若养殖对虾的饲料中缺乏虾青素，会导致对虾呈现不健康的体色。给缺乏虾青素的对虾连续投喂4周含50mg／kg虾青素的饲料，可使其体色恢复为正常的深青蓝色，而对照组仍呈现病态的颜色，并且前者在煮熟后呈鲜艳的红色而后者则呈苍白的黄色。Yamada／96】报道，D．胡萝卜素、角黄素和12 第1章绪论虾青素等3种类胡萝卜素以100mg／kg的浓度侧喂同本囊对虾时，虾青素在对虾组织中积累量最高，达至J]16．5mg／kg，分别比角黄素和p．胡萝b素高23％年U43％，证明虾青素是着色效果最好的类胡萝b素。1．5．2．2虾青素对甲壳动物抗环境胁迫能力的影响虾青素可提高甲壳动物的抗环境胁迫能力。环境胁迫条件下对虾机体产生大量活性氧，导致氧化胁迫，而虾青素可清除这些活性氧，从而增加机体对环境胁迫的适应能力。台湾学者Chien等[65,100】曾就对虾在饲料中添加虾青素后对温度、盐度、溶解氧和氨氮胁迫的适应能力方面进行了系列报道，当环境发生温度突变、盐度突变、较长时间缺氧或氨氮浓度较高时，添加虾青素实验组的存活率都显著高于对照组，说明对虾摄食虾青素后可提高对环境胁迫的适应能力。饲料中添加虾青素的斑节对虾在经受低氧胁迫(DO