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大豆胚尖遗传转化体系的优化及MYB转录因子转基因大豆的鉴定OptimizationofSoybeanEmbryonicTipGeneticTransformationSystemandIdentificationofMYBTranscriptionFactorTransgenicSoybeans作者姓名：滕巍专业名称：作物遗传育种指导教师：王庆钰教授学位类别：农学硕士答辩日期：2015年06月03日 本研究由转基因重大专项——优质功能型转基因大豆新品种培育（2014ZX08004-003）；国家自然科学基金——大豆MYB转录因子基因对大豆异黄酮合成调控的研究(31371641）资助Projectsupportedby-NationalGMOscultivatenewvarietiessub-questio-nsoftechnologymajorprojects:Thequalityfunctionalnewvarietiesofgen-eticallymodifiedsoybeansnurtured“highisoflavonenewvarietiesofgenetic-allymodifiedsoybeannurtured(2014ZX08004-003);TheNationalNaturalScienceFoundationofChinaThestudyofthemolecularregulationmechanismonsoybeanisoflavonesbyMYB(v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog)transcriptionfactor(31371641). 中文摘要大豆胚尖遗传转化体系的优化及MYB转录因子转基因大豆的鉴定大豆（Glycinemax(L.)Merr）是我国重要的粮食作物，是多种生物活性物质的主要来源，如异黄酮等。大豆异黄酮属于一类次生代谢产物，有助于人类的健康。MYB（v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog）类转录因子是功能最多的一类转录因子，参与调控大豆异黄酮合成途径，在植物的类黄酮代谢中发挥着重要作用。因此为提高大豆异黄酮含量需要建立一个高效的大豆遗传转化体系，同时利用转基因技术达到此目的。由于再生频率低，重复性差等问题普遍存在于大豆的遗传转化中，如何提高转化效率一直是植物转基因技术中急需解决的难点之一。本文主要以大豆品种吉林35做为受体材料，从共培养阶段添加的激素浓度、激素活化方式、生根阶段的激素选择、激素浓度等方面优化农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化体系。结果显示，在转化体系中，重悬液和共培养培养基中添加100umol/L的乙酰丁香酮（AS），OD600为0.6-0.8的重悬菌液冰浴1h，生根阶段添加1.1mg/L的吲哚-3-乙酸（IAA），可使转化率提高到25.30%，并且于25d左右可获得可移栽的抗性植株，对比之前的体系转化率明显提高，并在一定程度上缩短了培养周期，说明优化的遗传转化体系是可行的。对所得到的抗性植株分别用以下方法检测：PCR检测标记基因，bar试纸条检测蛋白，Glufosinate涂抹抗性植株，Westernblot检测蛋白。并统计5个不同品种的T0代植株转化率。获得T1代转基因植株，阳性率为17.82%。培育出22个阳性T1代转化株系，16个阳性T2代转化株系以及部分T3代植株。选用高效液相色谱法对转基因T3代植株进行大豆异黄酮含量的测定，分析MYB12B2、MYB12A两种转录因子对不同大豆品种籽粒和叶片中异黄酮含量的影响。结果表明：MYB转录因子对大豆异黄酮含量有促升高作用，尤其MYB12B2调控更明显，改变量最高值为吉林35提高了2.89mg/g。关键词：大豆；胚尖；遗传转化；MYB转录因子；异黄酮I AbstractOptimizationofSoybeanEmbryonicTipGeneticTransformationSystemandIdentificationofMYBTranscriptionFactorTransgenicSoybeansAsanimportantcropinChina，Soybean(GlycineMax(l.)Merr)providesnotonlylargecookingoilandprotein,butalsoavarietyofbiologicalactivitysuchasisoflavone.Soybeanisoflavoneisakindofsecondarymetabolitesandplaysanimportantroleinhumanhealth.MYB（v-mybavianmyeloblastosisviraloncogenehomolog）factoristhemostcommontypeoffunctionaltranscriptionfactor,itisinvolvedintheregulationofsoybeanisoflavonessynthesispathway.Soinordertoimprovesoybeanisoflavonescontent,Theefficientsystemofsoybeangenetictransformationwasbuildonthebasisoftransgenictechnology.Duetothelowefficiencyontrangenetechniqueofsoybean,howtoimprovethegenetictransformationefficiencyofsoybeanhasbeenoneoftheurgentproblemsandneedtobesolved.Inthisstudy,soybeanvarietyjilinNo.35ismainlypointedasthereceptors,theoptimizationofagrobacteriummediatedgenetictransformationsystemofsoybeanembryonictipaboutthekeyfactorssuchasmayaffecttheconversionefficiency.Duringgerminationstageandco-culturetoaddtheconcentrationofhormone,hormoneactivationmethod,choiceofhormonetypeandconcentrationatrootingstage.ResultsshowsthatthesoybeangermpointedinthegenetictransformationsystemofsuspensionareASadding100umol/L,weightofOD6000.6-0.8suspendedbacteriumliquidicebathfor1h,add1.1mg/LIAArootingstage.Usingtheoptimizedsystem,thispaperaverageconversionratereached25.30%,andafter25dthetransplantwithresistancecanbeget.Itwassignificantlyenhancedcomparisontotheconversionsystembefore.Andtoacertainextent,thetrainingcycleisshortened.ItisdemonstratedthattheoptimizationsystemofgenetictransformationforjilinNo.35embryoarefeasible.Theresistanceofplantswastested.Themaindetectionmethodsare:markergenedetectionbyPCR,geneproteinbarstripdetection,DaubingresistantplantsbyGlufosinatedaub,proteindetectionbyWesternblot.FivedifferentvarietiesofT0generationplantwasget,theconversionrateoffivevarietiesrespectively.TheT1generationoftransgenicplantswastaken,thepositiverateis17.82%.22positivetransformationstrainwasdevelopedonII T1generation,16positivetransformationstrainwasdevelopedonT2generation,andsomevarietiesofpositiveT3wereget.Thehighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodwasusedtoinvestigatetestT3transgenicplantsthecontentofsoybeanisoflavone.TheisoflavonecontentwerechangedofMYB12B2,MYB12Atranscriptionfactorinseedsandbyleavesofsoybean.ResultsshowthatMYBtranscriptionfactorsofsoybeanisoflavonescontenthasimproved,MYB12B2ofisoflavonesmetabolicregulationwasmoreapparent.Themostincreasingratesisthatjilin35increased2.89mg/g.KeyWords:Soybean;Embrponictip;Genetictransformation;MYBtranscriptionfactor;IsoflavoneIII 目录第一章绪论...............................................................................................11.1植物遗传转化技术概述..................................................................11.1.1农杆菌介导的遗传转化法.......................................................11.1.2花粉管通道法............................................................................11.1.3聚乙二醇法.................................................................................21.1.4电激法........................................................................................21.1.5基因枪法....................................................................................31.2大豆遗传转化的再生系统..............................................................31.2.1丛生芽器官发生途径的再生体系...........................................41.2.2原生质体培养的再生体系.......................................................41.2.3体细胞胚胎发生的再生途径...................................................51.3影响农杆菌介导遗传转化的因素..................................................61.3.1基因型........................................................................................61.3.2受体类型....................................................................................61.3.3农杆菌菌株................................................................................71.3.4抗氧化剂....................................................................................71.3.5培养条件....................................................................................81.3.6筛选方式....................................................................................81.4MYB转录因子的研究现状.............................................................81.4.1植物MYB转录因子的主要特征及其分类............................81.4.2大豆中的MYB转录因子......................................................91.5大豆异黄酮的概述........................................................................101.5.1大豆异黄酮的分布及生物学特性.........................................101.5.2大豆异黄酮的生理功能.........................................................10I 1.5.3大豆异黄酮的需求现状.........................................................111.5.4大豆异黄酮的生物合成途径.................................................111.6研究的目的和意义........................................................................11第二章大豆胚尖遗传转化体系的优化................................................132.1材料.................................................................................................132.1.1供试材料..................................................................................132.1.2菌株和载体..............................................................................132.1.3激素和相关生化试剂.............................................................132.1.4仪器..........................................................................................142.1.5基础培养基..............................................................................142.1.6遗传转化过程相关培养基.....................................................142.2方法.................................................................................................142.2.1胚尖遗传转化体系的操作流程.............................................142.2.2胚尖遗传转化体系的优化.....................................................162.2.3乙酰丁香酮（AS）的浓度对抗性植株再生率的影响........172.2.4AS活化对再生率及转化率的影响........................................172.2.5IAA浓度对生根的影响..........................................................172.2.6IAA与IBA对毛状根影响的比较分析.................................172.3结果与分析....................................................................................172.3.1AS的浓度对抗性植株再生率的影响...................................182.3.2AS活化对再生率及转化率的影响........................................182.3.3IAA浓度对生根的影响..........................................................192.3.4IAA与IBA对毛状根影响的比较分析.................................202.3.5优化后的胚尖遗传转化率.....................................................212.4讨论.................................................................................................21II 2.5本章小结........................................................................................22第三章MYB转录因子的转化及转基因大豆的鉴定..........................233.1材料.................................................................................................233.1.1供试材料..................................................................................233.1.2仪器..........................................................................................233.1.3试剂..........................................................................................233.1.4检测所需相关药品配方.........................................................233.2方法.................................................................................................253.2.1MYB12A及MYB12B2的遗传转化......................................253.2.2T0代植株的PCR检测.............................................................253.2.3T1代植株的Glufosinate涂抹及PCR检测............................263.2.4T2代植株BAR试纸条检测....................................................263.2.5T2代植株Westernblot检测....................................................263.3结果与分析....................................................................................273.3.1菌液PCR.................................................................................283.3.2T0代植株的PCR检测.............................................................283.3.3T1代植株的Glufosinate涂抹.................................................293.3.4T1代植株PCR..........................................................................303.3.5T2代植株BAR试纸条检测....................................................313.3.6T2代植株Westernblot检测....................................................313.4讨论.................................................................................................313.5本章小结........................................................................................32第四章大豆异黄酮含量测定................................................................334.1材料.................................................................................................334.1.1供试材料..................................................................................33III 4.1.2仪器..........................................................................................334.1.3试剂与耗材..............................................................................334.2方法.................................................................................................334.2.1色谱条件..................................................................................334.2.2标准品的配置..........................................................................344.2.3标准曲线的绘制......................................................................344.2.4样品的制备..............................................................................344.2.5样品的测定..............................................................................344.3结果与分析....................................................................................344.3.1流动相的选择..........................................................................354.3.2大豆异黄酮标准曲线的绘制.................................................354.3.3相同基因的不同品种异黄酮含量分析.................................364.3.4相同品种的不同基因异黄酮含量分析.................................404.4讨论.................................................................................................404.5本章小结........................................................................................41结论...................................................................................................42参考文献...................................................................................................43作者简介...................................................................................................50致谢...................................................................................................51IV 第一章绪论1.1植物遗传转化技术概述随着植物转基因技术发展以及转基因作物种植面积不断扩大，通过基因工程等方法培育理想性状的新品种大豆也取得了一定的成果。目前，可以应用在遗传转化过程中的转基因方法主要有：农杆菌介导法，花粉管通道法，基因枪法，电[1]激法和聚乙二醇等。应用最普遍的仍然是农杆菌介导法。1.1.1农杆菌介导的遗传转化法农杆菌是一种普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌，这种细菌能在自然状况[2]下大量的感染大多数双子叶植物的伤口，并诱导其产生发状根和冠瘿瘤。目前应用在农杆菌介导法中的主要是根癌农杆菌及发根农杆菌。二者细胞中分别含有[3]Ti质粒，Ri质粒。质粒作用的机制包括4个区域：转移到受体基因组的T-DNA[4~6]区，与其转移相关的Vir基因区，Con基因区以及Ori基因区。在农杆菌侵染植物伤口并进入细胞后，植物伤口所分泌的乙酰丁香酮将作为信号因子诱导Vir基因表达，将农杆菌附着在细胞上。不过这阶段只是停留在细胞间隙当中，T-DNA进一步的加工，剪切和复制后，进入到植物细胞中并整合到植物基因组上，稳定表达。农杆菌介导法的基本步骤：首先构建含有目的基因的载体，将其导入农杆菌菌种中并活化；其次对靶组织进行选择及处理，利用农杆菌侵染，组织筛选，分化及植株的再生；最后将再生植株以及后代进行分子检测和目的性状鉴定。该遗传转化方法技术操作简单，可靠性高，经济成本低，而且外源基因通常是单拷贝[7]插入到植物基因组，转化率比较高且可以转化的基因片段较大，重排现象比较少，遗传稳定性比较好，是大规模转化的最佳方法。1.1.2花粉管通道法花粉管通道法主要是利用植株授粉后开花、受精期间所形成花粉管通道，将含有目的基因的DNA片段溶液注射到此部位，使外源的DNA通过珠心通道进入到胚囊，转化到未完全发育法胚胎细胞，从而利用天然的种胚系统得到转基因[8][9]种子，观察植株后代的变异，筛选出转基因植株。此方法是由周光宇等建立1 [10]的，并培育出一些抗病，抗虫的转基因新品种。徐香玲等利用此方法也把外源DNA转入到大豆中，并观察其性状，均表现出变异特性，获得转基因阳性植株。花粉管通道法的优点是操作十分简单且不用组织培养过程即可将目的基因导入到植株中，不需要标记基因，对受体植株种类无要求，转化速度比较快，所需周期较短，不会带入多余的载体骨架到植物中，环境安全性好。但是此方法大豆的遗传转化效率比较低，重复性差。花粉管通道法受到自然条件，环境条件，以及受体植株花期等限制，因此必须对所选用受体植物开花受精时间充分了解，而且后代筛选难度大。因此，花粉管通道法在大豆遗传转化方面的实际应用并不[11]广泛。1.1.3聚乙二醇法聚乙二醇（PEG）法是利用细胞融合剂PEG、磷酸钙、多聚-L-鸟核苷酸及高pH，使细胞膜与膜之间，外源基因与细胞膜间建立分子桥，促进接触和粘连[1]进而诱导外源基因进入原生质体，整合到受体基因组中。黄健秋等用此方法将GUS基因转入大豆的原生质体中，检测到了该基因的稳定表达，并研究了该方法中影响转化效率的一些因素。试验表明，PEG通过引起膜的表面电荷紊乱，干扰了细胞识别，从而使细胞融合及外源基因进入原生质体中。聚乙二醇法优点是设备简单，操作方便。利用了原生质体本身的特性导入外源基因，对细胞伤害比较小。所选用受体植株种类不受限制，易于转化体的筛选。但聚乙二醇法转化效率较低，且分离原生质体以及植株的再生都比较耗费时间。后代的变异也比较大，受基因型的影响，导致其应用受到限制。1.1.4电激法电激法利用了植物原生质体可以整合和表达外源DNA的特点，在一定的高压脉冲的作用下，使原生质体细胞膜的透性发生变化，产生一些可逆性的空隙，外源DNA通过细胞膜上的孔隙直接进入细胞，大部分DNA可被细胞内的降解[12]酶降解，小部分整合入植物核基因组当中，此方法获得的转化植株可稳定遗传。电场强度，处理时间，细胞种类和溶解性质等决定了可逆空隙的数量及大小。[13]Christou等通过此方法，选用了3个不同基因型的大豆品种进行试验，确定了[14]电激转化法的条件，并获得具有卡那霉素抗性的转基因再生植株。Dhir等通过电激转化法也得到了相同抗性的再生植株。2 电激转化法的优点在于操作简单，可以一次性转化原生质体数量较多，但需要具备原生质体制备，培养以及原生质体再生的系统。1.1.5基因枪法基因枪转化法也叫微弹轰击法，原理是通过物理介导将外源基因导入到受体细胞，组织，器官以及原生质体中，进而整合到植物基因组中。该方法借助低压气体加速，用包裹有目的基因的金属颗粒或者其他惰性的金属颗粒对目标组织细胞进行轰击，微粒可穿过细胞壁、细胞膜。基因枪法广泛应用于对农杆菌不敏感的植物转化中。利用此方法对大豆种子进行遗传转化，转化率大约为2%，且外[15][16]源基因在后代植株中均有少量表达。1990年，GordonKamm等和Fromm[17]等报道通过此遗传转化方法，成功将外源基因转入了玉米基因组中，并得到可[18]育的再生植株，Christou等也分别利用此方法将水稻种胚和愈伤组织做为外植[19]体，获得转基因水稻株系；1991年Finer等用基因枪法对大豆的体细胞胚进行了遗传转化，成功获得阳性植株。此后，基因枪法得到了迅速的发展。基因枪法的优点是可直接将外源基因导入完整植物细胞内，避免了原生质体分离和再生的问题。对所用外植体的基因型没有依赖。具有较高的遗传转化率。可以转移DNA片段以及多拷贝的重组DNA。但耗资较大，所转移的基因片段比较小，外源基因随机整合，不利于在植物中稳定表达。随机整合位点无法固定，外源基因拷贝数增加均会导致后代产生突变，且突变率较高，容易发生基因重组，基因沉默，外源基因丢失等现象，在转化过程中对植物细胞有损伤，容易出现嵌合体，重复性差且转化率低。1.2大豆遗传转化的再生系统大豆的组织培养开始于上个世纪60年代，到80年代才开始取得了一些突破性进展。再生体系是遗传转化过程中极为重要的组成部分，其建立及优化是解决遗传转化率低，试验周期长以及嵌合体等问题的主要途径。目前，应用于大豆遗传转化研究中的再生系统主要有三种，包括丛生芽器官发生途径的再生体系、体细胞胚胎发生途径的再生体系和原生质体的再生体系。其中丛生芽器官发生途径的再生体系和体细胞胚胎发生途径的再生体系在实践中应用广泛，发展也比较成熟。3 1.2.1丛生芽器官发生途径的再生体系[20]早在1988年由Meurer等提出了大豆丛生芽器官发生途径，选用大豆子叶节作为受体材料，在含有高浓度的苄氨基腺嘌呤（BA）培养基上诱导丛生芽，[21][22]并获得了高频率的再生植株。王萍等、袁鹰等利用子叶节作为受体材料也[23]成功获得再生植株。刘海坤等利用胚尖作为受体材料获得再生植株，并且发现[24]在同样条件下，胚尖作为外植体的再生率远远高于子叶节。程林梅等利用大豆[25]的上、下胚轴等部位作为转化的外植体，并且获得了大豆再生植株。王升吉等将不同基因型的大豆胚轴、子叶、子叶节、顶芽以及叶等分别作为转化的外植体，通过丛生芽器官发生途径的再生体系，成功获得了再生植株，并且对此再生体系的各个阶段所添加的激素作了优化。国内外对丛生芽器官发生途径的再生体系的研究主要集中在组织培养过程中各阶段所用的培养基、在培养基中添加的激素类型和浓度、不同的基因型等因素对体系再生率的影响。研究表明：丛生芽器官发生途径的再生体系多以MS和B5培养基为主；在培养基中添加的激素主要有赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、6-BA和萘乙酸(NAA)等；不同的激素浓度，所得到的外植体芽诱导率也不相同，大部分低浓度的激素对外植体丛生芽分化有着促进作用，而高浓度的激素就会对丛生芽的分化出现抑制作用；大豆的不同基因型芽诱导率有很大差别，因此，选用再生率相对高的基因型、合适的培养基、激素以及激素浓度对大豆丛生芽器官发生途径的再生体系十分重要。丛生芽器官发生途径的再生体系周期短、过程简单，外植体容易获得，不受季节限制，无需经过脱分化过程，再生频率比较高，培养相对容易。但丛生芽大多数起源于多细胞，因此易出现嵌合体，导致后代纯化及筛选比较困难。目前应用于该再生体系的外植体有很多种，包括子叶节、胚尖、未成熟子叶、无菌苗茎尖、上胚轴、初生叶节、下胚轴和真叶等，其中最常用的有子叶节、胚尖、下胚轴。1.2.2原生质体培养的再生体系对比外植体培养再生途径，原生质体培养的再生体系易于摄取外源遗传物质，可以避免嵌合体出现，这是其他再生体系不能达到的。[26]1985年，Newell等通过原生质体培养的途径成功获得再生植株后，卫志[27]明等从6种大豆的未成熟子叶中分离得到了原生质体并获得愈伤组织诱导成4 [28][29]苗，得到再生植株。罗希明等，Dhir等相继通过原生质体培养的再生途径[30]得到了再生植株。肖文言等利用大豆幼胚分离出原生质体，经培育获得再生植株。一系列的研究表明，通过原生质体的分离培养能够获得再生植株，为大豆的遗传转化提供了新的方法。我国对大豆原生质体培养研究起步较晚，但进展迅速，已经有很多学者通过自己的研究得到了再生植株。结果表明，细胞分化能力受到基因型的影响，因此需要筛选到使用此方法的最佳基因型。在MS培养基中添加适量的玉米素对于植株的形成有很大帮助。该再生体系获得外源遗传物质相对于其他方法比较便捷，可以更好的解决嵌合体现象。但原生质体的培养掌握起来比较困难，再生率低，遗传背景影响大，再生植株多出现变异，重复性较差，转化率较低，受基因型的限制，相关的转化方法效果并不理想，所以通过此方法获得大量再生植株有一定困难。1.2.3体细胞胚胎发生的再生途径体细胞胚胎发生的再生途径是利用液体悬浮培养法，诱导大豆胚型细胞团不断增殖，形成具有发育成完整植株潜力的体细胞胚，再对体细胞胚培养从而获得完整的再生植株。此方法可为大豆的转化提供大量外植体材料，同时在筛选过程中能够与筛选剂充分接触，使得只增殖转化部位的细胞，大大的提高了筛选效力。对比丛生芽器官发生途径，最主要优势就是体细胞胚是单细胞起源，可有效避免嵌合体现象。目前常用大豆未成熟胚、子叶和下胚轴作为外植体进行研究实验。[31][32]Beversdorf等首次进行了体细胞胚胎的实验。1983年，Christianson等研究大豆品种和培养基种类以及添加的激素对体细胞胚胎发生途径的影响，获得大豆再生植株，这是首次通过体细胞胚胎发生途径得到的再生植株；之后，Lazzeri[33][34]等和Ranch等在此基础上，分别利用未成熟胚和子叶作为外植体并成功获[35]得再生植株。Finer等报道了关于体细胞胚胎悬浮培养的技术，并通过一系列的研究表明该体系效果较好，之后又对体细胞胚胎的发生途径进行了一系列的改进，胚性细胞团作为外植体材料，显著提高了转化率及筛选效率。随后，有研究人员利用球形期的体细胞胚给予伤害处理后作为外植体进行转化，结果显示转化率高达8.0%，利用发育晚期的子叶胚不利于抗性体细胞胚的诱导，转化率为0%。[36][37~38]Komatsuda等，Parrott等，分别研究了外植体、基因型、取材时期、培养条件和侵染方式等影响因素，研究结果从总体上来看，在MS基础培养基中添加高浓度的激素2，4-D效果最佳。但体细胞胚胎的组织培养过程十分复杂，周5 期比较长，且再生率比较低，此外还会产生突变等现象，发育成正常植株有一定难度，体细胞胚经多次继代容易造成胚性丧失，再生植株变异或不结实等现象，[39]所以此体系还需进一步的改良。1.3影响农杆菌介导遗传转化的因素双子叶植物大豆作为农杆菌的天然宿主，却有着难以转化这一现象。转化率低,重复性差,且不能达到大豆转基因规模化的需要。转化效率低有主要有两个原[40]因:一是由于T-DNA不能高效到达植物细胞中，二是分化再生植株困难。农杆菌介导大豆遗传转化系统受到很多因素的影响。主要因素有基因型、外植体、农杆菌菌株、Vir基因的诱导、筛选剂、抗氧化剂和培养条件等。通过对这些因素的深入研究,有利于提高转化体系的稳定性和转化率，从而实现对转化体系的[41]优化。1.3.1基因型农杆菌介导的遗传转化，是农杆菌和受体材料之间的相互作用。农杆菌的侵染能力受大豆基因型影响，大豆的不同品种间，同一品种的不同受体间对农杆菌的敏感性以及筛选压力的承受能力都存在很大差异。因此所选用的受体材料必须对农杆菌敏感并有良好的再生能力。基因型对转化效率的影响主要反映在对农杆菌的敏感程度以及再生能力上。[42]Owens等研究了24个栽培型大豆品种及3个野生型大豆品种，实验结果表明不同的基因型出芽率不同，对农杆菌的敏感程度也不相同。实验筛选出4个易感基因型，其中黑农3的出芽率较高且对农杆菌敏感，被认作为最适合大豆[43]遗传转化的基因型。李茂福等以大豆的子叶节作为受体材料，研究了3个大豆品种与农杆菌相互作用过程中的影响因素，实验结果表明，基因型之间存在着极显著差异，其中垦农18对农杆菌的敏感性弱于合丰35。大量研究表明，大豆不[43]同基因型品种的诱芽率、再生率、筛选压力及转化率都存在明显差异。因此，建立高效的大豆遗传转化体系以选择合适的基因型为前提，其他影响因素都应建立在所选大豆为易感基因型的基础上。1.3.2受体类型农杆菌介导遗传转化的关键是受体类型，受体类型和农杆菌的互作关系十分复杂，主要表现在侵染后的再生情况存在差异。同一植物外植体类型不同所适合选用的遗传转化方法也不同，对农杆菌的易感性存在差异。转化方法与受体材料6 相匹配才能提高遗传转化体系的转化效率。目前常用的受体体系主要有丛生芽器官，原生质体和体细胞胚胎。每种体系都有各种的优点。其中丛生芽器官的受体体系具有周期短、过程简单、外植体容易获得、不受季节限制、不经过脱分化过程、再生频率比较高、培养相对容易；原生质体体系易于摄取外源遗传物质，可以避免嵌合体出现的优点，这是其他体系不能达到的。体细胞胚是单细胞起源，不同于丛生芽器官发生途径，可有效避免嵌合体的现象，因此也常作为最有潜力的解决嵌合体现象的再生体系。这三种方法应用最广泛且研究最深入的就是丛生芽器官。在遗传转化过程中，受体类型与农杆菌之间相互作用机制不同。因此，选用合适的受体能够有效的提高再生率以及转化率。1.3.3农杆菌菌株农杆菌菌株类型也是转化率的一个重要影响因素，菌株的类型影响着其转化能力，不同的菌株对大豆遗传转化能力存在差异。常用的菌株主要有LBA4404、EHA101、EHA105、KYRT1、GV3101和A136。其中超毒力菌株EHA101，EHA105[44]和LBA4404被广泛应用。王凤敏等在大豆的转化过程中选用EHA101、LBA4404和EHA105三种菌株，结果发现EHA101的侵染能力最强，其次是EHA105，然后是LBA4404。Dang等比较了LBA4404、EHA105和KYRT1等菌株的转化率，发现KYRT1的转化率最高，菌株EHA105略低，然后是LBA4404。选择适合的农杆菌菌株，才能使转化能力达到最佳的状态。1.3.4抗氧化剂由于大豆中含有较多的多酚氧化酶，导致大豆在农杆菌侵染后会出现褐化和坏死等现象。农杆菌介导转化过程的实质是病原菌感染受体组织的过程。受体材料伤口处会出现大量的酚类化合物，在有氧条件下又被氧化成醌类物质。醌经过非酶促反应产生有色物质导致组织褐化甚至扩散到培养基中，细胞内其他的酶活[45]性也将受到抑制，影响细胞正常代谢，严重会导致细胞死亡。褐化的产生还有可能对T-DNA进入受体细胞造成阻碍，影响转化效率。抗氧化剂是一类能捕获并中和自由基,从而消除其对植物伤害的一类物质。有研究显示，在培养基中添加抗氧化剂能够减轻受体材料在侵染后发生的酶促反应，进而减少褐化现象，提高转化率。常用的抗氧化剂主要有L-半胱氨酸、AgNO3、抗坏血酸、二硫苏糖醇、聚乙烯吡咯烷酮等。在大豆的遗传转化过7 程添加L-半胱氨酸和AgNO3可以明显抑制褐化现象。抗氧化剂的添加能够提高出芽率以及再生和转化效果。1.3.5培养条件农杆菌介导的遗传转化还受培养条件的影响，例如：培养过程中添加的激素及浓度，培养基的pH，抗生素的添加及浓度，共培养的时长，光照强度，温度，湿度等。选用合适的培养条件有利于提高出芽率、再生率以及转化率。不同时期受体的生长情况，需要的营养，光照强度以及温湿度都有差异，因此在不同时期要根据受体材料自身的生长情况选择培养条件。此外，组织培养过程对外界条件要求比较精细。因此，要提高转化效率，就要综合考虑这些外界因素，从而建立起一个高效的大豆遗传转体系。1.3.6筛选方式大豆遗传转化过程中，筛选是获得转基因植株的关键步骤。一个好的筛选方案可以使转基因材料获得更好的生长环境，减少嵌合体的产生，并可以降低后期检测的工作量，省时省力。因此筛选方式对于整个遗传转化过程十分重要。应用于大豆遗传转化过程中的筛选剂主要有卡那霉素、潮霉素、甘露糖、草丁膦、草甘膦等，而随着大家对转基因生物安全性的关注，除草剂类型的筛选剂[46]已成为大豆转化中首选的筛选剂。草丁膦是除草剂的一种，属于有机磷类除草剂，是灭生性除草剂。草丁膦的靶标酶是植物界中一个重要的的解毒酶。此酶的活性被抑制就会造成植物氮代谢途径失调，细胞内氮含量过高而导致植株死亡。用草丁膦作为筛选剂，不仅效率高，价格便宜，且污染小，可以大面积使用。1.4MYB转录因子的研究现状转录因子又称反式作用因子，是一类模块化的蛋白，转录水平的调控主要发[47]生在基因表达的初期阶段。通过与启动子结合来调控下游基因的表达。在其结构方面，主要有几个独立的功能域组成。这些区域决定了转录因子所具有的功能[48]以及特有的性质。1.4.1植物MYB转录因子的主要特征及其分类MYB类转录因子的结构域大约由51-52个氨基酸组成的一个肽段，其中含有保守的氨基酸残基以及间隔序列。这些氨基酸被3个保守的色氨酸残基均匀[49]隔开，有时也会被其他类氨基酸代替，起到一个疏水核心的作用。每个MYB结构域可以通过特定的折叠方式，构建出所需要的空间结构，在目标DNA大沟8 [50]处，从而起到对目的基因的一个调节作用。根据MYB蛋白中MYB结构域的组成数量，植物MYB转录因子可分为三类：单一MYB结构域蛋白(R1/R2)，一类重要的端粒结合蛋白，这类蛋白对于植物的生物钟的改变以及细胞组织的形[51~53]态发生都起着重要调控作用；2RR3这类蛋白参与了植物生长发育的整个过程，参与次生代谢，在细胞分化方面也起到一定调控作用，并能够抵御外界的各种胁迫，在很多方面起着调控作用；R1R2R3这类蛋白在动物以及真菌中有高[54~55]度同源性蛋白，主要参与细胞分化及细胞周期的控制。目前，在拟南芥中[56]还发现存在少量的4RMYB转录因子。1.4.2大豆中的MYB转录因子由于大豆的重要食用和经济价值，越来越多的研究人员致力于大豆基因水平上的研究。然而，就目前的研究情况可以发现，从大豆中获取的并已进入深入研究的MYB转录因子基因资源对比其他作物相差甚远，这对于其充分利用发挥更大的作用设置了很大的障碍。MYB作为很大的转录因子家族，已经获得的MYB类基因数量十分有限。在对比其在大豆中所获得的156个相关基因可以发现，其中的48个基因具有全[57]长开放阅读框。其中有43个基因盐胁迫、干旱、冷处理和ABA中的一种或者更多胁迫具有应答响应。在拟南芥中过表达MYB76、MYB92和MYB177后，[58]在植物高盐和低温处理方面都表现出有一定的抵御能力。杨文杰等分离并鉴定了四个R2R3类MYB转录因子，在烟草中转MYBJ6基因，对其类黄酮代谢途径中多个关键酶的表达量进行分析发现，其中大部分关键酶的表达量均有不同程度的上调，同时使烟草中的总异黄酮的含量有了明显的提高；与野生型的植株对比分析，转基因植株对干旱、高盐和紫外辐射的抵抗能力也有一定程度的增强；相反MYBZ2和MYBJ7两个基因却能够抑制多数该代谢途径中基因的表达，导致转基因烟草中总黄酮含量减少。发现不同的基因对于类黄酮代谢途径的调节作[59][60]用并不相同，且调控能力也有所差异。李晓薇等从大豆吉林32品种中克隆了MYB12A和MYB12B2两个基因，通过在拟南芥中进行实验，研究表明，所克隆出的两个基因均对类黄酮合成途径中的大部分关键酶表达具有调控作用，并提高其表达量。同时半定量结果显示，在紫外辐射、高盐胁迫下两基因的表达量有所增加，并且随着处理时间的延长，表达量也成逐步上升的趋势。并对转基因拟9 南芥的抗性进行分析，结果显示，MYB12A和MYB12B2两个基因均可不同程度使拟南芥对盐胁迫及紫外辐射的耐受力提高。1.5大豆异黄酮的概述1.5.1大豆异黄酮的分布及生物学特性大豆异黄酮是大豆的主要活性成分，可以从大豆中提取，并具有异黄酮类化[61]合物的典型结构。主要分为游离型和结合型。大豆异黄酮主要来自与大豆及大[62]部分豆制品，在普通品种的大豆中含量都比较低，在自然界中分布十分局限，[63~64]只存在极少数植物中，大豆中含量相对较高。大豆异黄酮的含量在不同时[65]期不同部位都不相同，成熟的种子中含量最高，其次是花，茎中的含量较少。大豆异黄酮的纯制品多为无色晶体，且具有苦涩味道，易溶于醇类，脂类，[66]酮类，稀碱水等极性溶剂。不同状态的大豆异黄酮易溶的溶剂并不相同。糖苷[67]态大豆异黄酮还具有热不稳定性，可向葡萄糖苷异黄酮转化。1.5.2大豆异黄酮的生理功能大豆异黄酮自发现以来，在医药和保健食品等领域引起了极大反响，其在生[68]理和药理方面的功能引起各个不同领域方面的工作者广泛关注。1.5.2.1抗肿瘤功能[69]大豆异黄酮是植物界抗癌的首选物质，对人类有着极为重要的功效。有研[70]究表明，大豆异黄酮在减少结肠癌，前列腺癌及乳腺癌等的发病率有很大作用。可以确定为天然的最佳抗癌物质。其可通过抑制与癌症相关的酶的活性来预防疾[71]病。服用该类物质也可以预防动脉硬化。异黄酮可以直接抑制细胞增殖相关的酶的活性，抑制癌细胞变化，增强细胞免疫力及抗氧化作用，还可以利用细胞毒[72~73]杀癌细胞，进而达到抗肿瘤的做用。1.5.2.2心脑血管疾病的预防异黄酮类物质能够有效的预防心脑血管疾病，通过将身体内脂质类自由基分[74]解，进而使人体内的氧化级联反应得到抑制，从而起到了抗氧化作用。异黄酮中所含的染料木素能够使血管舒张，显著降低人体内低密度脂蛋白的浓度。还可以削弱脂质氧化程度，消除活性氧分子，促进抗氧化酶合成，增强促血管舒张药品的药效，进而增加血流量。有研究表明，大豆异黄酮中的染料木素能够通过人体内的磷酸化酪氨酸激酶来阻断血小板源性生长因子的生成，使其不能聚集在血[75]管上，达到预防粥样硬化效果。10 1.5.2.3防治骨质疏松骨质疏松是由于骨骼中的钙质溶出，使其失去原有的致密性而变得疏松。随着年龄增长，人体内的雌性激素分泌下降，骨骼也在各种激素的作用下不断代谢，[76]失去平衡，钙流失加剧。异黄酮做为类雌性激素，不仅具有雌性激素的功能，还可以通过促进钙盐积累增加骨质密度。该作用机制可能与异黄酮的固有结构类[77]雌二醇的结构有关。Poter等发现大豆异黄酮能明显提高骨矿物质密度及含量。利用大豆异黄酮替代荷尔蒙，发现其可治疗由于雌性激素缺失所导致的骨质[78]疏松。1.5.3大豆异黄酮的需求现状目前，在很多国家大豆异黄酮已经被广为人知，已成为了新型的保健食品，种类多达十余种。全球的年销售额已经超过4亿美元。国际大豆计划，美国大豆协会等都致力于大豆异黄酮的研究和生产。数据显示世界对大豆异黄酮的年需求量已经超过了1500吨，而大豆异黄酮的实际年产量不足需求量的三分之一，仅在预防妇女更年期综合征这一领域，已经供不应求。因而，在目前的种植面积下，[79]进行外源基因导入提高大豆异黄酮含量很有必要且具有很大的市场潜力。1.5.4大豆异黄酮的生物合成途径大豆异黄酮是大豆非常重要的次生代谢产物，由植物界普遍存在的三大次级代谢途径之一苯丙烷类代谢途径产生。其中很多关键酶，限速酶以及转录因子都[80]起到了主导作用。苯丙烷类代谢途径主要有两条支路，一条是类黄酮类和花青素代谢途径，另一条支路是水杨酸，木质素和可溶性酚类的代谢途径。在产生异黄酮过程中由多种关键酶和MYB，MYC转录因子协调调控。因此，通过基因工程等手段修饰转录因子和关键酶是解决异黄酮产量的重要途径之一。1.6研究的目的和意义大豆异黄酮主要存在于大豆中，对人类健康有十分重要的影响。大多数MYB转录因子对植物类黄酮代谢具有调控作用，其中MYB12B2对其调控作用显著，不需要其他类转录因子辅助。将该类转录因子导入大豆中提高大豆异黄酮含量还是很有必要的，但目前对于MYB基因资源利用比较少。同时，大豆的遗传转化[81~83]一直被认作为植物基因工程领域难点之一。大豆再生体系的再生率较低、重复性差、基因型依赖强，只有克服再生体系中的难点，才能在真正意义上提高11 大豆的遗传转化效率。大豆组织培养过程中，以胚尖为外植体的丛生芽器官发生途径的再生体系因胚尖具有完整的顶端分生组织与根尖分生组织，分生能力极强，共培养阶段能够抑制农杆菌的生长，减少褐化现象的发生；形成再生植株周期短；由于具有完整的胚根和胚轴，有利于营养物质和激素的运输；重复性，转化率相对较高，被广泛应用。但由于农杆菌介导的遗传转化受很多因素影响，遗传转化效率还有待于提高。而且在遗传转化过程中，转基因植物的安全性评价，外源基因插入位点及拷贝数的影响，嵌合体现象出现频繁，因此对再生植株的鉴定，选择准确、便捷、经济的检测方法已成为关键环节。本研究通过对大豆胚尖的再生体系中影响转化效率以及周期的因素进行优化，获得了高效的大豆胚尖遗传转化体系，并在此遗传转化体系的基础上，研究农杆菌介导大豆异黄酮相关转录因子MYB12A，MYB12B2的遗传转化，并对所获得的后代植株利用PCR技术，Bar试纸条，Glufosinate涂抹，Westernblot等方法进行检测，以期得到更加高效的农杆菌介导大豆胚尖的遗传转化体系，并培育出高异黄酮含量的转基因大豆品种。12 第二章大豆胚尖遗传转化体系的优化2.1材料2.1.1供试材料本试验所选的大豆供试材料主要为吉林35，该材料由吉林大学农学部植物科学学院植物种质资源与利用研究室提供。2.1.2菌株和载体试验中所涉及到的菌株主要为本实验室提供的农杆菌菌株EHA105，所涉及到的植物表达载体为本实验室构建的重组植物表达载体pCB35SR1R2-GFP-MYB12A和pCB35SR1R2-GFP-MYB12B2以及载体pCAMBIA1301。2.1.3激素和相关生化试剂试验中所需的激素以及相关生化试剂见表2.1表2.1转化相关试剂和激素Table2.1ReagentandHormoneofthetransformation试剂名称制造商琼脂（Ager）北京鼎国琼脂糖（Phytagel）Sigma2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）北京鼎国乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）北京鼎国三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）北京鼎国蔗糖（Sucrose）北京鼎国乙酰丁香酮（AS）Sigma6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）SigmaSigma吲哚乙酸（IAA)Sigma吲哚-3-丁酸（IBA）Sigma表面活性剂（SilwetL-77）Sigma利福平（Rif）Sigma头孢噻肟（Cef）Sigma草丁膦(Basta)Sigma2,4-二氯苯氧乙酸丁酯(2,4-D)Sigma溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸（X-Gluc）Sigma13 4-甲基伞形酮（4-MU）Sigma4-甲基伞形酮-β-葡糖苷酸（4-MUG）SigmaSigma十二烷基氨酸钠（SDS）金泰化玻无水乙醇（MSDS)2.1.4仪器（1）Sigma3K15高速冷冻离心机；（2）WMK-02温度控制器（3）SPX-250B-Z生化培养箱（4）ZHWY-2102C恒温培养振荡器（5）SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（6）T6新世纪紫外可见分光光度计；（7）SANYOMLS-3750灭菌锅；（8）人工气候箱（9）F-4600型荧光分光光度计；（10）SARTORIUSBSA系列天平2.1.5基础培养基大豆胚尖外植体在组织培养过程中，所使用的基础培养基为MSB培养基，[84]各母液配方请参考文献。2.1.6遗传转化过程相关培养基大豆胚尖外植体在组织培养过程中，各个阶段所需营养不同,其中各类培养[84]基配方请参考文献。2.2方法2.2.1胚尖遗传转化体系的操作流程（1）准备农杆菌固体培养基，农杆菌液体培养基，萌发培养基，共培养培养基，重悬液，无菌水，75%酒精；（2）侵染所需单菌落的制备：取原菌液，用烧好的接种环在固体已添加50mg/LKm、50mg/LRif的YEP固体培养基上划线，28℃培养2～3d，当农杆菌单菌落长到合适大小后，放在4℃冰箱保存备用；（3）侵染所需菌液的制备：挑取提前制备好的农杆菌平板上的单菌落，加入到3mL液体已添加50mg/LKm、50mg/Lrif的YEP液体培养基中，28℃，14 振荡培养，约24h，而后从中吸取适量菌液加入到已添加50mg/LKm、50mg/Lrif的YEP液体中，28℃，振荡培养，约10h；（4）选取种皮完好，大小均匀，饱满，色泽好，无损坏，无虫害，无斑点的成熟豆子；（5）用自来水冲洗干净后，向种子中添加75%的酒精，消毒35s；（6）将酒精倒掉，无菌水清洗；（7）将种子倒入装有灭菌后的萌发培养基的培养瓶中，封好，28℃，黑暗，浸泡大约16h；（8）在超净工作台中，切去萌发后的大豆籽粒的原叶及两片子叶，得到胚尖外植体；（9）侵染液的制备：将含菌液的YEP室温离心，5000rpm/min，离心10min，收集沉淀，加入重悬液，调整OD600至0.6～0.8；（10）将切好的外植体放置于侵染液中，封好，真空抽滤15min;（11）滤纸吸干外植体表面的菌液，平接于铺有无菌滤纸的共培养培养基上，25[84]℃，黑暗，共培养3~5d；（12）共培养后，接种在含有筛选剂的诱芽培养基中，16h/8h光照黑暗交替，25℃培养；（13）每隔2周更换一次培养基；（14）待抗性芽长到一定长度，切取抗性芽并接于生根培养基中，16h/8h光照黑暗交替，25℃进行生根培养；（15）大约20d后，将生根状态良好，根系发达的抗性苗炼苗，根据长势决定炼苗时间，期间保持水分；（16）炼苗后，将再生苗从培养基中小心取出，洗净根部，移栽至花盆中，放在光照培养室中培养，16h/8h光照黑暗交替，25℃培养。农杆菌介导大豆胚尖转化的完整操作流程如图2.1所示。15 图2.1大豆吉林35胚尖遗传转化流程图Fig2.1TheprocedureofembryonictiptransformationofJilin35A：萌发；B：共培养；C：诱芽；D：抽茎；E：生根；F：炼苗;G：开花；H：结荚2.2.2胚尖遗传转化体系的优化本实验室已建立完整的大豆吉林35胚尖再生体系，利用此体系作三次重复实验，每次切取100个胚尖外植体，均能够得到超过80株再生植株，证明再生率比较高，说明本实验室大豆吉林35的胚尖再生体系良好，胚尖出芽及再生方面都没有问题，因此如果想提高胚尖遗传转化体系的转化率，快速获得转基因植株及其后代，优化此体系的关键就在于各个阶段的各类激素，例如浓度、搭配方式、时间、添加方式等方面，本实验基于优化好的大豆品种吉林35胚尖再生体系，研究可能影响转化率以及生长周期时间的关键因素，从萌发阶段，侵染环节，16 共培养阶段，生根阶段这几个环节研究其对转化率以及生长周期的影响，通过对这一系列关键因素的优化，期望得到高效快速的大豆吉林35胚尖遗传转化体系。2.2.3乙酰丁香酮（AS）的浓度对抗性植株再生率的影响大豆胚尖遗传转化体系侵染环节中，在共培养中添加不同浓度的AS，浓度设定为50umol/L，100umol/L，150umol/L，同时做一个空白对照，每个处理选用50个胚尖外植体三天后，进入诱芽、抽茎、生根、炼苗和移栽等阶段，进行记录，统计不同浓度的AS对抗性植株的再生率所产生的影响。2.2.4AS活化对再生率及转化率的影响经过AS浓度的筛选，选择出大豆胚尖遗传转化体系中最适合大豆胚尖外植体出芽的浓度，在未加菌液的重悬液中添加该浓度的AS，选用冰浴对乙酰丁香酮进行活化。并做空白对照。活化时间为1h。每个处理选用80个外植体，3次重复，而后加入菌液，OD600=0.6～0.8并加入外植体，侵染15min，转入共培养培养基，三天后转入诱芽培养基进行后续的培养。对抗性植株数量进行统计并对其进行PCR检查，得到不同转化率，确定冰浴活化AS是否有利于转化率的提高。2.2.5IAA浓度对生根的影响2.2.5.1IAA浓度对生根的影响在生根阶段，需在生根培养基中添加粗生根激素。选取IAA并设置五个不同浓度，比较其对抗性芽生根的影响。浓度分别设定为0.3mg/L，0.6mg/L，0.9mg/L，1.2mg/L,1.5mg/L，并设置空白对照。每个处理选30个长势大致相同的抗性芽，并作三次重复实验。统计相同时间段生根情况。2.2.5.2对IAA最适浓度的细化进一步将IAA浓度细化到0.9mg/L、1.0mg/L、1.1mg/L、1.2mg/L这4个梯度处理，每个处理选择30个长势大致相同的抗性芽，3次重复，统计相同时间段生根情况。2.2.6IAA与IBA对毛状根影响的比较分析通过上一步实验，确定了合适的促生根的IAA浓度。在生根培养基中添加最佳浓度的IAA与IBA。每个处理选取长势相同的抗性芽30株，重复三次。记录相同时间不同处理的生根情况。17 2.3结果与分析2.3.1AS的浓度对抗性植株再生率的影响大豆胚尖遗传转化体系共培养阶段中，在共培养培养基中添加不同浓度的AS，浓度设定为50umol/L，100umol/L，150umol/L，同时做一个空白对照,每个处理选用50个胚尖外植体，3次重复，统计不同浓度的AS对抗性植株的再生率所产生的影响。结果如表2.5所示，当乙酰丁香酮浓度为100uml/L时，抗性植株再生率最高。再生率=（抗性植株数÷侵染外植体数）×100%表2.5不同浓度乙酰丁香酮（AS)对再生率的影响Table2.5EffectsofdifferentASconcentrationsforregenerationrateAS浓度外植体数抗性植株数再生率(%)平均再生率(%)ConcentrationsofNo.ofexplantsNo.ofresistantTheregenerationAveragerateofAS(umol/L)plantsrate(%)regeneration(%)052713.4610.974748.5156610.715053916.9818.6242819.04501020.00100602135.0035.40421638.10592033.89150501122.0022.30521325.0046919.572.3.2AS活化对再生率及转化率的影响经过AS浓度的筛选，选择出大豆胚尖遗传转化体系中最适合大豆胚尖外植体出芽的浓度，在未加菌液的重悬液中添加该浓度的AS，选用冰浴对乙酰丁香酮进行活化，并做空白对照。活化时间为1h。每个处理选用80个外植体，3次重复，而后加入菌液，OD600=0.6-0.8并加入外植体，侵染15min，转入共培养培养基，三天后转入诱芽培养基进行后续的培养。对抗性植株数量进行统计并对其进行PCR检查，是否有Bar基因条带得到不同转化率，结果表明：AS经过冰浴活化对再生率及转化率均有一定程度提高。如表2.6所示。转化率通过对抗性植株Bar基因PCR检测进行统计18 转化率=（检测呈阳性植株÷侵染外植体数）×100%表2.6活化乙酰丁香酮（AS)对再生率及转化率的影响Table2.6EffectsofdifferentASconcentrationsforregenerationrateandconversionrateAS处理外植体数抗性植株数检测阳性植株平均再生率平均转生率ConcentrationsofNo.ofNo.ofresistantNo.ofpositiveAveragerateofAveragerateofAS(umol/L)explantsplantsplantsregenerationregeneration(%)(%)室温60211335.4019.2542168592010冰浴58331659.0325.119758227243192.3.3IAA浓度对生根的影响2.3.3.1IAA浓度对生根的影响在生根阶段，需在生根培养基中添加粗生根激素。选取IAA并设置五个不同浓度，比较对抗性芽生根的影响。浓度分别设定为0.3mg/L，0.6mg/L，0.9mg/L，1.2mg/L，1.5mg/L，并设置空白对照。每个处理选30个长势大致相同的抗性芽，并作3次重复实验。统计相同时间的生根情况。发现在IAA浓度选取为0.9mg/L和1.2mg/L时，生根状况良好。结果如图2.2所示。图2.2不同浓度IAA对再生根的影响Fig2.2EffectsofdifferentIAAconcentrationsonrootgrowth19 ABCDEF分别代表IAA浓度为0mg/L0.3mg/L,0.6mg/L,0.9mg/L1.2mg/L1.5mg/LABCDEFrepresenttheIAAconcentrationof0mg/,L0.3mg/L,0.6mg/L,0.9mg/L,1.2mg/L,1.5mg/L2.3.3.2对IAA最适浓度的细化进一步将IAA浓度细化到0.9mg/L、1.0mg/L、1.1mg/L、1.2mg/L这4个梯度处理，每个处理选择30个长势大致相同的抗性芽，3次重复，统计相同时间段生根情况。得到最适合浓度为1.1mg/L。结果如表2.7所示。表2.7不同浓度IAA对再生根影响Table2.7EffectsofdifferentIAAconcentrationsonrootgrowthIAA浓度生根时间平均根系数No.of再生根质量QualityConcentrationsofRootoftimeaveragerootsofrootsIAA(mg/L)0.986.3±0.5++1.087.0±0.7++1.187.3±0.5+++1.276.8±0.3++平均根系数：平均数±标准差Theaveragecoefficientofroot:X±SD2.3.4IAA与IBA对毛状根影响的比较分析通过上一步实验，确定了合适的促生根的IAA浓度。在生根培养基中添加最佳浓度的IAA与IBA。每个处理选取长势相同的抗性芽30株，重复3次。记录相同时间不同处理的生根情况，结果发现在生根培养基中添加适当浓度的IAA在生根时间上比在生根培养基中添加适当浓度的IBA的生根时间短，在相同时间生根培养基中添加IAA生根状况比生根培养基中添加IBA生根状况好。添加IAA的生根培养基基本上在25d时就可以使抗性芽根系达到了可以移栽的程度，而生根培养基中添加IBA的植株则需要32d左右才可以达到移栽程度。但随着时间的增加IBA的毛状根质量比IAA的毛状根质量好，IAA的毛状根多而细，IBA的毛状根相对粗壮。相比较吸水能力更强。不过对于建立一个高效快速的配间遗传转化体系，IAA在时间上比IBA更有优势。而且对移栽后植株的生长状况发现，二者无明显区别，因此选择在生根培养基中添加促生根激素IAA更有20 利于节省时间。因此在此遗传转化体系生根阶段选择添加1.1mg/L的IAA。如图2.3。图2.3IAA与IBA对再生根影响比较分析Fig2.3ThecomparativeanalysisofIAAandIBAeffectsonroots2.3.5优化后的胚尖遗传转化率选用大豆吉林35的胚尖外植体，采用本论文中所优化后的大豆胚尖遗传转化体系，进行侵染转化，共设置了3次重复，每次选用80个外植体。待移栽成活后，提取叶片DNA进行PCR检测。统计有目的条带检测成阳性的植株数，计算T0代的再生效率以及转化效率，结果如表2.8所示，平均转化率达到25.30%，比优化前的大豆胚尖遗传转化体系的转化率13.47%有明显提高，证明本论文中优化措施对于吉林35胚尖遗传转化体系有正向影响。表2.8大豆胚尖遗传转化体系的转化率Table2.8Theefficiencyofgenetictransformationofsoybeanembryotip外植体抗性植株数PCR阳性植转化率（%）平均转化率（%）优化前平均转化率数No.ofresistant株数TransformatAverageof（%）No.ofplantsNo.ofPCRionTransformationAverageofexplantpositiveplantsefficiencyefficiency（%）Transformations（%）efficiency（%）72431926.3976441823.6825.3013.4797582525.7821 2.4讨论乙酰丁香酮，是双子叶植株细胞壁形成的前体，在植物遗传转化中发挥着重要作用。已有实验证明AS等创伤诱导分子激活的是vir区基因的活化以及高效表达，同时是农杆菌Ti质粒转移至宿主细胞所必需的，并能够提高其转化效率[85]。Stachel等已经证明，当农杆菌与受伤的活着活跃生长的植物组织或细胞共同培养时，vir基因就会高效表达，而且此过程是受到植物细胞分泌的可扩散的[86]因子所诱导，即为AS。AS在促进转化率方面，不同植物种类已经相同植物种类的不同部位，其促进作用不完全相同。这与其浓度，基因型以及农杆菌菌株的致毒力的强弱都有关，而且植株个体的差异也会带来影响，因此对于不同植株，基因型以及不同的时间和部位所需最适浓度结果都不同。2.5本章小结（1）AS的浓度对抗性植株的再生率影响实验结果表明：在共培养培养基中添加100umol/L的AS抗性植株再生率最高；（2）选用冰浴的方式对AS活化1h，再生率有一定程度提高，而转化率有明显程度的提高；（3）IAA浓度对生根的影响实验中，发现1.1mg/L的IAA最能促进再生根的生长；（4）在生根阶段添加最适浓度的IAA以及IBA的研究表明，在生根培养基中添加最适浓度的IAA更能缩短生根所需时间。22 第三章MYB转录因子的转化及转基因大豆的鉴定3.1材料3.1.1供试材料表达载体为本章提到的本实验室已有的重组植物表达载体pCB35SR1R2-GFP-MYB12A和pCB35SR1R2-GFP-MYB12B2,实验所用的植株材料为前一章所得到的转化再生植株，一共包含五个品种，分别是吉林35，绥小粒豆，吉林小粒豆，威廉姆斯82和肯鉴35。3.1.2仪器（1）SARTORIUSBSA分析天平；TM（2）S1000ThermalCycler梯度PCR仪；（3）BG-subMINI水平电泳仪；（4）BG-gdsAUTO凝胶成像分析系统；（5）HWS24型电热恒温水浴锅；（6）Sigma3K15高速冷冻离心机；（7）分子杂交炉；（8）超声波清洗器；（9）移液器（10）高通量粉碎（11）脱色摇床3.1.3试剂CTABLE（北京鼎国）；EDTA（北京鼎国）；Tris-Hcl（北京鼎国）；Nacl（北京鼎国）；柠檬酸钠（北京鼎国）；浓盐酸（北京鼎国）；Glufosinate（Sigma）；DIGHighPrimeDNA标记及杂交检测试剂盒I（罗氏）。3.1.4检测所需相关药品配方Westernblot检测T2代转基因植株在，所使用的凝胶配方见表3.123 表3.1凝胶配方Table3.1FormulationoftheGel名称用量10%separationGel5ml30%甲叉双丙烯酰胺1.667ml1.5molTris1.25ml10%SDS0.05mlddH2O2.017ml10%AP0.05mlTEMED0.005ml4%stackingGel2ml30%甲叉双丙烯酰胺0.266ml0.5ml0.5molTris0.02ml10%SDS1.22mlddH2O0.015ml10%AP0.0015mlTEMED1000ml10×runningbuffer30gTris144gGlycine100ml10%SDS900mlddH2O1000ml10×Transferbuffer30gTris144gGlycine900mlddH2O1000mlStrippingbuffer15gGlycine9.5mlHCl50ml4×samplebuffer25.2gGlycerol0.02gbromophenolblue4gSDS20ml1MTris3.1gDTT30mlddH2O10×PBS80gNaCl2gKH2PO42gKCl24 Na2HPO4.12H2O28.3gddH2O3.2方法3.2.1MYB12A及MYB12B2的遗传转化使用实验室已有的基因MYB12A，MYB12B2两种，选用大豆品种为:吉林35，吉林小粒豆，绥小粒豆，威廉姆斯82，垦鉴35。选用农杆菌介导遗传转化方式，其中吉林35选用胚尖作为外植体,吉林小粒豆，绥小粒豆，威廉姆斯82，垦鉴35选用子叶节作为外植体，这两种基因的转化植株。3.2.1.1基因引物GmMYB12A-F:5′-ATGGAGAGAAGTAGTGAAGAG-3′；GmMYB12A-R:5′-TCAGAACAAGTCATCATCACC-3′；GmMYB12B-F：5′-ATGGAGAGGAGTTTATCAGG-3′；GmMYB12B-R：5′-TCACGACAAGTCATGATCAG-3′。3.2.2T0代植株的PCR检测再生植株移栽成活后，选取植株上新鲜幼嫩的叶片，用CTAB法提取再生植株的DNA，根据pCB35SR1R2-GFP载体上的标记基因序列设计引物，以提取叶片总DNA为模板，PCR扩增目的条带。3.2.2.1CTAB法提取叶片DNA（1）取新鲜叶片放入1.5ml离心管中，在液氮中速冻，然后用高通量破碎仪研磨成粉末；（2）研磨好后迅速加入0.6ml已经加入2%的巯基乙醇的CTAB提取缓冲液（65℃预热），充分混匀，65℃水浴1h，期间轻轻翻转2~3次；（3）室温放凉，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25：24：1），翻转至充分混匀，静止10min；12,000rpm，离心10min，室温；（4）将上清液小心吸出，移至新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇（24：1），翻转至充分混匀，静止10min，12,000rpm，离心10min，室温；（5）重复步骤4；（6）将上清液小心吸出，移至新的离心管中，加入1ml乙醇（-20℃预冷），翻转几下，可清晰观察到白色絮状物，-80℃，30min，或者-20℃1h；（7）12,000rpm，离心10min；25 （8）用冰的70%乙醇清洗两次后，倒尽乙醇，吹干；（9）用30ulddH2O回溶，放入-20℃或4℃保存。表3.2CTAB提取缓冲液Table3.2CTABextractionsolution名称用量/100mlCTAB2g0.5MEDTA（pH=8.0）4ml1MTris-Hcl（pH=8.0）10ml8.19gNacl3.2.2.2引物设计Bar1：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’（60℃退火）’Bar2：5-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’3.2.3T1代植株的Glufosinate涂抹及PCR检测将T0代阳性的植株种子按单株收获并标记好，以便查询。做好标记的种子烘干后种到装有大田土：草炭：蛭石=1：1：1的花盆中，并将相同种品种的大豆种子种植于相同条件下，涂抹合适浓度的Glufosinate在植株的第二片三出复叶上，5d后观察叶片变化。同时，选取抗性植株的鲜嫩叶片提取DNA，进行PCR检测。方法与3.4.2.1相同。3.2.3.1不同品种大豆Glufosinate的筛选浓度随机选取吉林35、吉林小粒豆、绥小粒豆、肯鉴35、威廉姆斯82等5个品种的相同年份的野生型种子，种在花盆中并培养在光照培养箱内，每个品种选15粒，每三粒涂抹同一浓度。待野生型植株第二个三处复叶长出后涂抹不同浓度的Glufosinate,浓度分别设定为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L等五个梯度。3d后观察叶片变化。进一步细化Glufosinate的筛选浓度，浓度分别设定为115mg/L、125mg/L、135mg/L，依旧是每三株做一个重复，5d后观察叶片变化。3.2.4T2代植株BAR试纸条检测［93］取新鲜的叶片进行BAR试纸条检测，具体使用方法见参考文献。3.2.5T2代植株Westernblot检测（1）蛋白的制备：经BAR试纸条检测成阳性的T2带植株，选取鲜嫩的叶片大约0.1g，加入液氮，研磨至粉末。加入等体积的4×samplebuffer，12000rpm离26 心，3min.沸水浴6-8min。迅速置于冰上，冷却后4℃离心，12000rpm，10-15min。小心吸取上清液。4℃保存备用，若长时间不用，可放置-20℃保存；（2）凝胶制备：将干净且干燥的玻璃板正对齐安置在制胶架上。灌胶，到绿线下边缘。用1ml移液器快速往复加无水乙醇，以排除气泡并能够压平胶，约凝15min。倒掉乙醇并晾干。加入浓缩胶至溢出，以此排除气泡，方法亦是用1ml移液器快速往复加。插入梳子，补充一定量的浓缩胶填充空隙。约凝15min。也可将玻璃板从制脚架上拿出，用保鲜袋封好，4℃保存备用。（3）点样：在电泳槽中加入1×runningbuffer，外槽根据所需胶板数量添加1×runningbuffer，内槽装满。快速垂直拔下梳子，贴壁垂直点样；（4）SDS-PAGE凝胶电泳：浓缩胶选用80V电压，待样品进入分离胶后，观察marker是否跑开以调整电压。分离胶选用130V电压，根据蛋白大小选择电泳时间；（5）取胶：小心撬起小玻璃板，让胶尽量保留在大玻璃板上。切除浓缩胶及多余部分。将胶小心放入1×transferbuffer中；（6）转膜：准备好滤纸8块和硝酸纤维素膜1块，切制与胶大小相同。在滤纸上标记好日期及样品号。将硝酸纤维素膜和胶放置于1×transferbuffer中6min，滤纸在另装有1×transferbuffer的容器中湿润。用半干转方法转膜，在一起中从负极到正极放置顺序依次为：四层滤纸，胶，硝酸纤维素膜，四层滤纸，每一层都需用玻璃棒轻轻赶走气泡。选用恒压方式转膜，大约40min即可；（7）染色：转膜完毕后，将硝酸纤维素膜取出，放入考马斯亮蓝中染色，约1-2min。漂洗干净，观察是否有带，以确定转膜是否成功和蛋白完整度；（8）封闭：用5%的PBST配置的牛奶封闭约1h-2h，放置在脱色摇床上；（9）一抗反应：用PBST清洗1-2次，每次约10s。加入PBST配置的牛奶，根据容器选择用量，加入一抗，根据蛋白选择比例为1：500。脱色摇床上孵育1h-2h。低温孵育。孵育结束后，用PBST清洗10min，清洗3次；（10）二抗反应：加入1×PBST，根据容器大小选择用量，能使硝酸纤维素膜漂浮即可。添加2抗，根据蛋白选择比例为1:10000。脱色摇床上孵育1h，低温孵育。孵育结束后，用PBST清洗三次，每次10min；（11）显影。27 3.3结果与分析3.3.1菌液PCR选用相关引物，对实验室保存菌液活化验证，结果如图3.1所示。图A表示MYB12A，基因大小为714bp。图B表示MYB12B2，基因大小为783bp。图3.1MYB12A和MYB12B2菌液PCR电泳图Fig3.1ElectrophoresisofPCRproductsofgeneMYB12AandMYB12B23.3.2T0代植株的PCR检测检测目的基因所需的引物是根据载体的标记基因Bar基因序列设计的，目的条带约为417bp，部分检测结果如图所示，其中阴性对照为野生型大豆的叶片DNA，阳性对照为pCB35SR1R2-GFP质粒，图3.2为Bar基因的检测结果，从电泳图中能看到，检测样品扩增出来的目的条带。根据检测结果统计了T0代五个品种的转化率，最高可达25.30%，结果如表3.3所示。其中吉林35选择胚尖作为外植体材料,其余4种选择子叶节作为外植体。图3.2T0代转基因植株Bar基因检测Fig3.2DetectionofT0generationsofgeneBarM:marker；1:阳性对照；2:阴性对照；3-12:T0代样品28 表3.3各个品种T0代植株转化率Table3.3TrasformationefficiencyofdifferentT0generationtimes品种名称MYB12A平均转化率（%）MYB12B2平均转化率（%）genotypeAverageofMYB12AAverageofMYB12B2TransformationefficiencTransformationefficienc吉林3525.1225.30吉林小粒豆7.028.28绥小粒豆11.2013.45肯鉴356.217.86威廉姆斯828.539.253.3.3T1代植株的Glufosinate涂抹对5个品种的T1代植株进行Glufosinate涂抹，待植株展开第二个三出复叶后进行涂抹，用毛笔在叶片正面的半片叶子进行单方向涂抹，避免反复涂抹同一处，在涂抹的叶片上做上记号。5d后，观察叶片变化。结果如图3.3所示，部分植株叶片会出现枯萎现象，而部分植株经涂抹后并没什么变化，初步认定涂抹后未变化的植株为转基因植株且对Basta有一定的抗性。图3.3T1代叶片涂抹Fig3.3BastapaitingonT1plants’leavesA为抗性植株B为非抗性植株3.3.3.1不同品种大豆Glufosinate的筛选浓度随机选取吉林35、吉林小粒豆、绥小粒豆、垦鉴35、威廉姆斯825个品种在相同年份的野生型种子，在相同条件下培养，每个品种选15粒，每三粒涂抹统一浓度。待野生型植株第二个三处复叶长出后涂抹不同浓度的Glufosinate，浓度分别设定为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L等五个梯度。5d后观察叶片变化。统计发现不同品种对于Glufosinate耐受浓度不同。分析结29 果显示筛选吉林35选用Glufosinate为135mg/l;吉林小粒豆和绥小粒豆选用的筛选浓度为125mg/l；威廉姆斯82选用的筛选浓度为115mg/l；垦鉴35的选用的筛选浓度为120mg/l。。3.3.4T1代植株PCRT1代的全部植株提取DNA，选用引物是根据载体上Bar序列设计出的，进行PCR技术验证。结果如图3.4所示，经Glufosinate涂抹后的植株均成阳性，而叶片有变化的植株大部分不能扩增出目的条带，说明结果与Basta涂抹相吻合。因此，证明了经Glufosinate涂抹后叶片无变化的T1代植株中存在外源基因Bar基因，并且该基因表达了抗除草剂的活性，这两种检测证明了基因已经成功的转化了所用的外植体材料中，得到了T1代转基因植株。将无变化的T1代植株进行PCR检测，得到的结果进行统计，得出T1代植株的转化率。如图3.5展示，抗性植株均为阳性。图3.4T1代转化植株Bar基因检测Fig3.4DetectionofT1generationsofgeneBarM:marker；1:阳性对照；2:阴性对照；3-12:T1代样品图3.5T1代抗性植株Bar基因检测Fig3.5DetectionofgeneBaronresistanceplantsofT1generationsM:marker；1:阳性对照；12:阴性对照；3-11:T1代样品30 3.3.5T2代植株BAR试纸条检测对T2代植株进行Bar试纸条检测。图3.6A所示试纸条为野生型植株的检测结果，在进行检测后Bar试纸条会显示红色对照条带，若无此对照条带，则视为该检测的Bar试纸条无效。当组织提取液中含Bar蛋白时，试纸条就会出现两条条带，第二条即为检测条带。以野生型植株为对照，T2代植株叶片进行磨样处理，Bar试纸条检测。大部分T2代植株检测有Bar蛋白表达，如图3.6B所示。图3.6Bar基因的蛋白检测Fig3.6DetectionofBarprotein3.3.6T2代植株Westernblot检测对T2代植株经过Bar试纸条检测有双条带的植株进行Westernblot检测,能观察到明显的目的条带，对所得植株进行记录。部分检测结果如图3.7所示。图3.7T2代免疫印迹检测Fig3.7WesternBlotdetectionofT2plants3.4讨论植物的遗传转化能在短时间内获得改良性状的品种，但外源基因的稳定性表达直接影响着转基因植株的利用。外源基因插入过程中，有单位点插入，同一染色体多位点插入，不同染色体多位点插入且插入的拷贝数又有单拷贝与多拷贝之分，且外源基因的整合又是随机的，因此外源基因在转基因植物中的遗传转化是[87]很复杂的，这些因素都影响着转基因植物的稳定性，也影响着外源基因在转基因植物中的表达。因此需要采用多种方式对转基因植株的外源基因进行鉴定和遗31 传分析。检测方法主要有对抗性筛选，PCR检测标记基因，Southernblot，原位杂交，Westernblot等方法，因为PCR检测目的基因灵敏但易有DNA污染且对于多位点插入难以检测，假阳性较多。而对转基因植物中表达蛋白的检测就能很准确的确定外源基因是否整合到植物体内，因此本实验采用了较快捷的PCR检测，抗性筛选，蛋白检测等方法。由于T0代植株获取较多，且BASTA涂抹不同时期不同部位的筛选浓度不同，本实验选取的是第二个三出复叶，而T0代植株移栽时已长多个叶片且长势较弱，不适用BASTA涂抹，因此选用了较快捷的PCR检测；T1代植株相对比较多，因此采用抗性筛选和PCR检测，而抗性筛选准确度较高，可以将T1代大部分假阳性植株筛选出来，获得相对较少量的T2代植株，易于用Westernblot检测，因此不同世代的转基因植株选取不同检测方式。3.5本章小结（1）采用农杆菌介导的大豆胚尖遗传转化体系获得MYB12A及MYB12B2转基因植株；（2）经过PCR检测标记基因，获得五个不同品种的T0代转基因植株，统计两个基因的不同品种转化率。转MYB12A基因的转化率分别为吉林35：25.12%，吉林小粒豆：7.02%，绥小粒豆：11.20%，垦鉴35：6.21%，威廉姆斯82：8.53%；转MYB12B2基因的转化率分别为吉林35：:25.30%，吉林小粒豆：8.28%，绥小粒豆：13.45%，肯鉴35：7.86%，威廉姆斯82：9.25%；（3）筛选吉林35选用Basta浓度为135mg/l;吉林小粒豆和绥小粒豆选用的筛选浓度是125mg/l；威廉姆斯82选用的筛选浓度为115mg/l；垦鉴35的选用的筛选浓度为120mg/l；（4）经BASTA涂抹和PCR检测得到转基因T1代植株结果一致，获得T1代转基因植株，阳性率为17.82%，部分籽粒不饱满，未获得T2代植株；（5）对T2代植株进行Bar试纸条检测，并对其中部分植株进行Westernblot检测，结果均显示有目的条带。获得16个转化株系。32 第四章大豆异黄酮含量测定4.1材料4.1.1供试材料选用大豆品种为吉林35，吉林小粒豆，绥小粒豆，威廉姆斯82，垦鉴35等五个成熟的野生型大豆籽粒以及叶片；经检测成阳性的转MYB12B2基因的T3代吉林35，威廉姆斯82，绥小粒豆，经检测转MYB12A的T3代吉林35，吉林小粒豆，垦鉴35等品种籽粒及叶片。4.1.2仪器日本岛津公司型号为LC-20A的高效液相色谱仪，该色谱系统包括DGU-20A脱气机，紫外检测器SPD-20AV，2个LC-20AT溶剂阵列检测器，CTO-10AS柱温箱，LC-Solution工作站CBM-20A系统控制器，以及7725手动进样器。昆山市超声仪器有限公司的KQ3200DE型数控超声波清洗器；北京中兴伟业仪器有限公司购买的高速粉碎机；上海一恒科技有限公司型号为HWS24的电热恒温水浴锅；赛多利斯科学仪器有限公司的BSA124S-CW电子天平。4.1.3试剂与耗材山东禹王试剂公司的甲醇（分析纯）；美国Fiser公司的甲醇(HPLC级）；北京化工厂的乙醇（分析纯）；娃哈哈纯净水。大豆异黄酮标准品:大豆苷元(Daidein)，染料木素(Genistein)，大豆苷(Daidzin)，染料木苷(Genistin)，黄豆黄苷(Glycitin)，纯度≧98%，五种标准品均购自美国sigma公司。津腾牌溶剂微孔过滤膜（有机系）0.45um，微孔过滤膜（水系）0,45um,一次性注射器。4.2方法4.2.1色谱条件色谱柱：PhenomenexC18柱，(150mm×4.6mm，5.0um)；检测波长；254nm；柱温：35度；流动相：甲醇：水二元梯度洗脱;流速：1mL/min；进样量：20ul;分析时间：每份样品45min。根据保留时间，各个标准品峰面积定量分析，通过标准品的标准曲线计算出样品中各个异黄酮组分的含量。33 4.2.2标准品的配置分别精确称取大豆苷元，染料木素，染料木苷，大豆苷，黄豆黄苷2.5mg，用HPLC级甲醇定容至10mg，摇匀，制成各个标准品的单标母液。分别精确秤取大豆苷元2mg，染料木素2.8mg，大豆苷2mg,染料木苷1mg，黄豆黄苷1.2mg,用甲醇(HPLC)定容至10mL,摇匀配制成标准品母液。然后分别从标准品母液中吸取一定量，用甲醇(HPLC)分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍，20倍,待测。4.2.3标准曲线的绘制以峰面积(X)为纵坐标，大豆异黄酮浓度(Y)为横坐标,对各组分浓度与峰面积关系做回归方程,分别绘制五种标准品的标准曲线。4.2.4样品的制备4.2.4.1新鲜叶片迅速精确称取转MYB12B2基因的大豆品种吉林35的新鲜叶片约0.5g，加入80%的甲醇(分析纯)提取液于研钵中研磨至匀浆，定容至10mL,混匀后室温静置2.5h，用超声清洗器超声3次，每次20min。置于80℃水浴中14h，12000rpm离心30min，将上清液用一次性注射器经过0.45mm滤膜过滤得到预处理液，转入HPLC专用小瓶中封口，4℃下储存待测。4.2.4.2成熟籽粒分别将野生型吉林35，吉林小粒豆，绥小粒豆，威廉姆斯82，垦鉴35随机抽取50粒大豆种子用高速粉碎机均匀粉碎后过40目筛，准确称取0.5g粉样，加入80%的甲醇提取液定容至10mL，混匀后室温静置2.5h，用超声清洗器超声3次，每次20min。置于80℃水浴14h，12000rpm离心30min，将上清液用一次性注射器经过0.45mm滤膜过滤得到预处理液，转入HPLC专用小瓶中封口，4℃下储存待测，转基因植株成熟籽粒于研钵中研磨成粉末状，准确称取0.5g粉样后用与野生型籽粒相同的处理办法制备预处理液，4℃下保存。4.2.5样品的测定按照上述方法制备的供试样品溶液并测定，记录出峰面积以及保留时间，用外标法计算样品。本实验选用材料为吉林35，吉林小粒豆，绥小粒豆，威廉姆斯82，垦鉴35等五个成熟的野生型大豆籽粒，转MYB12B2基因和MYB12A基因的T3代品种籽粒，相关叶片。34 4.3结果与分析4.3.1流动相的选择通过对比等浓度洗脱和二元梯度洗脱的标准品母液的色谱图发现后者能够区分五个标准品的出峰时间，因此选择二元梯度洗脱。为了更好的获得分离峰，选择了四个二元梯度洗脱的程序进行对比,最终选择二元梯度程序为0~20min：甲醇比例为15~45，20~30min：甲醇比例为45~60，30~35:甲醇比例为60~80，35~40min：甲醇比例为：80~90，40~45min：甲醇比例为90~15。4.3.2大豆异黄酮标准曲线的绘制用高效液相色谱法测定各个标准品的单标，记录出峰时间。得到出峰顺序为大豆苷，黄豆黄苷，染料木苷，染料木素，大豆苷元。各个标准品的保留时间依次为18.831min,19.804min,22.230min,29.947min,33.204min。用高效液相色谱法测定不同浓度的标准品母液（图4.1),分别以峰面积和标准品浓度为横纵坐标作回归方程，得到5种标准品的标准曲线(表4.1)。35 图4.1(A̖,B,C,D,E)分别为不同浓度的标准品母液的HPLC图谱Fig4.1HPLCchromatogramsofdifferentconsistencesubstances(A,B,C,D,E)表4.1五种大豆异黄酮标准曲线Table4.1Standardcurveoffivesoybeanisoflavones组分线性范围标准曲线2R-1ConstituentLinearrange/μg·mlStandardcurve-9大豆苷Daidzin0.625～80y=8.6×10x+0.00140.9993-9黄豆黄苷Glycitin0.625～80y=9.4×10x+0.00080.9992-8染料木素Genistein0.625～80y=1.0×10x+0.00140.9991-9染料木苷Genistin0.625～80y=7.7×10x+0.00070.9993-9大豆苷元Daidein0.625～80y=4.5×10x+0.00090.99974.3.3相同基因的不同品种异黄酮含量分析经检测为阳性的转MYB12B2基因的T3代吉林35，威廉姆斯82，绥小粒豆，经检测转MYB12A的吉林35，吉林小粒豆，垦鉴35等品种籽粒及叶片,部分样品HPLC色谱图见图4.2（A,B,C)。36 图4.2A吉林35野生型籽粒大豆异黄酮图谱B转MYB12B2基因吉林35品种籽粒异黄酮图谱C转MYB12B2基因吉林35叶片异黄酮图谱Fig4.2HPLCchromatogramsofnon-transgenicjilin35seeds(A),MYB12B2transgenticjilin35seeds(B)andleaves(C)通过对野生型品种的籽粒和转基因株系籽粒异黄酮含量比较结果显示：转MYB12A的3个T3代品种大豆异黄酮含量增加最高为吉林35，从1.81mg/g提升到3.25mg/g，提高了1.45mg/g，约1.8倍；吉林小粒豆从1.66mg/g提升到2.82mg/g，提高了1.16mg/g，约1.7倍；垦鉴35从1.50mg/g提升到2.56mg/g,提高了1.05mg/g，约1.7倍。转MYB12B2的三个T3代品种大豆异黄酮含量改变情况最高值为吉林35从1.81mg/g提升到4.79mg/g，提高了2.89mg/g，约2.6倍；绥小粒豆从1.63mg/g提升到3.26mg/g，提高了1.63mg/g，约2倍；威廉姆斯82从2.56mg/g提升到3.08mg/g，提高了0.52mg/g，约1.2倍。如表4.2，表4.3所示。其中各个转基因品种的平均值提高量分别为转MYB12A基因的吉林35提升37 量为1.01mg/g,吉小粒豆为1.31mg/g，垦鉴35为0.45mg/g；转MYB12B2基因的吉林35为1.85mg/g，绥小粒豆为1.13mg/g，威廉姆斯82为0.43mg/g。分析结果如图4.3所示。两种基因对大豆异黄酮含量提升量的比较见图4.4所示。转MYB12B2基因的各个品种大豆籽粒的大豆异黄酮含量提高程度比较分析:吉林35>绥小粒豆>威廉姆斯82。转MYB12A基因的各个品种籽粒大豆异黄酮含量提高程度比较分析：吉林35>吉林小粒豆>垦鉴35。且相关基因对于叶片中含量的改变趋势与籽粒相同。表4.2转MYB12A基因不同品种大豆异黄酮含量Table4.2ComprisionandanalysisoftheMYB12Atransgenicplants´seedsIsoflavoneContent品种大豆苷含量黄豆黄苷含量染料木苷含量大豆总异黄酮量VarietiesDC/mg.g-1GlC/mg.g-1GC/mg.g-1TISO/mg.g-1W-A0.6503050.0531951.1042091.807711.3417980.3175641.5945163.253878A1.4669870.1177561.1694192.7541631.0445020.1128551.273352.430707W-B0.5786620.0584840.958371.6596141.2489570.1810251.3913622.821348B0.8706430.0791971.069022.018860.7925750.213351.4033762.409301W-C0.6094230.0910240.8048941.5053411.0565930.1856451.3168422.55908C0.6264750.1654641.0786571.870596W代表野生型品种籽粒，A代表吉林35，B代表吉林小粒豆，C代表垦鉴3538 表4.3转MYB12B2基因不同品种大豆异黄酮含量Table4.3ComprisionandanalysisoftheMYB12B2transgenicplants´seedsIsoflavoneContent品种大豆苷含量黄豆黄苷含量染料木苷含量大豆总异黄酮量VarietiesDC/mg.g-1GlC/mg.g-1GC/mg.g-1TISO/mg.g-1W-A0.6503050.0531951.1042091.807711.8266150.3527692.6118784.791262A1.905190.1767681.4062813.4882391.2502560.2175641.4245162.892336W-D0.6462590.10552380.8759881.627711.3878560.3954851.4722013.255542D1.1394660.1996971.396532.7356930.9187180.0956521.2766852.291055W-E1.0888080.0840411.3961352.5689841.3854680.1028021.594513.08278E1.1886480.1055671.5755642.869779W代表野生型品种籽粒，A代表吉林35，D代表绥小粒豆，E代表威廉姆斯82图4.3各个品种平均值分析Fig4.3Analysisofthetransgenicplants´seedsaverageIsoflavoneContent39 图4.4转基因植株籽粒异黄酮含量对比分析Fig4.3Comprisionandanalysisofthetransgenicplants´seedsIsoflavoneContent4.3.4相同品种的不同基因异黄酮含量分析选用吉林35的野生型籽粒，转MYB12A基因和转MYB12B2基因的T3代转基因植株的成熟籽粒进行大豆异黄酮含量分析，实验中每个转基因品种做了三次复，对其平均值进行比较，讨论两基因对品种异黄酮含量影响。结果显示转MYB12A的T3代品种吉林35平均值从1.81mg/g提升到3.25mg/g，提高了1.45mg/g，约1.8倍；转MYB12B2的T3代品种吉林35平均值从1.81mg/g提升到4.79mg/g，提高了2.89mg/g，约2.6倍。如图4.5所示。1.61.41.210.80.60.40.20转MYB12A基因转MYB12B2基因图4.5吉林35转基因植株籽粒异黄酮含量对比分析Fig4.4Comprisionandanalysisofthetransgenicplants´seedsIsoflavoneContent40 4.4讨论大豆异黄酮含量受年份、地点、品种、基因型、光照̖、温度、水分及其之间相互作用的影响，因此在做本实验研究时候所选取的野生型大豆品种均与转基因材料在同一条件下种植，以确保实验结果的可靠性。所测材料均培养在人工气候室，培养条件为温度28度，湿度60%RH，CO2浓度400PPM，LED光照。所测数据值普遍偏低，分析是由于培养条件影响，相关文献上也表明种植在室外的[88]品种大豆异黄酮含量均比室内含量高，且光照对基因的表达有一定的影响，可能会导致代谢途径中各级物质的产量不同。因此，转基因植株的异黄酮含量改变数值是可信的MYB12A与MYB12B2参与了植物类黄酮代谢，能够使PAL、CHS、FLS等类黄酮合成途径的关键酶表达量增加，DRF等其它通路的酶的表达量在转MYB12B2的植株中含量下降。二者表达模式基本一致，但后者表达量较低。所以会出现各个品种异黄酮含量有所提高但转MYB12A基因植株异黄酮含量改变低于MYB12B2。同时，异黄酮含量受基因型的影响，所以不同品种的大豆相关含量不同，且各个时期不同部位酶的表达量也不相同，同样会导致在转基因植株中的改变量不完全相同，具体相关关系，还有待进一步研究。高效液相色谱仪具有分离效能高，自动化，分析速度快等一些列特点，而且该仪器使用了非破坏性检测器。所测样品进行分析够，可除去流动相且能够实现对少量样品的回收，同时该仪器也可用于样品的纯化制备。测定时所需样品量少，实用与转基因品种，且检测大豆异黄酮含量快速，准确，适合大量样本的测定分析，由于转基因后代资源有限，因此选用高效液相色谱法测量异黄酮的含量。4.5本章小结（1）各个转基因品种的平均值提高量分别为转MYB12A基因的吉林35提升量为1.01mg/g,吉小粒豆为1.31mg/g，垦鉴35为0.45mg/g；转MYB12B2基因的吉林35为1.85mg/g，绥小粒豆为1.13mg/g，威廉姆斯82为0.43mg/g。（2）对于品种吉林35通过比较转MYB12B2,MYB12A的植株籽粒以及叶片大豆异黄酮含量测定分析发现，前者比后者在大豆异黄酮含量提高程度上更多一些。41 结论1在大豆胚尖遗传转化体系中重悬液和共培养阶段添加100umol/L的AS，对OD600为0.6~0,8的重悬菌液冰浴1h，生根阶段添加1.1mg/L的IAA,采用本论文优化后的体系，平均转化率达到25.30%，并且25天左右就可获得可移栽的抗性植株，对比之前的体系转化率有明显提高，并在一定程度上缩短了培养周期。2通过PCR，bar试纸条，Glufosinate涂抹，Westernblot等方法检测抗性植株。获得五个不同品种的T0代转基因植株，统计两个基因的不同品种转化率。获得T1代转基因植株，阳性率为17.82%。培育出22个阳性T1代转化株系，16个阳性T2代转化株系以及部分T3代植株。3通过测定T3代转基因植株异黄酮含量表明MYB12B2基因对异黄酮改变量趋势吉林35>绥小粒豆>威廉姆斯82;MYB12A基因对异黄酮改变量趋势吉林35>吉林小粒豆>肯鉴35。发现MYB12A、MYB12B2对大豆异黄酮含量有一定程度的提高。MYB12B2对异黄酮代谢调控更明显。大豆异黄酮含量改变最高值为吉林35提高了2.89mg/g。42 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作者简介滕巍，女，1989年1月出生，汉族，吉林省四平市人。2012年6月毕业于吉林农业大学农学院农学专业，获得农学学士学位。2012年9月至今于吉林大学植物科学学院作物遗传育种专业攻读硕士学位，研究方向为作物分子育种。三年来主要从事大豆胚尖遗传转化体系的优化研究及转基因大豆的验证和含量鉴定。50 致谢本文在导师王庆钰教授的指导下完成，感谢恩师在实验、论文及生活中给予无微不至的关心，师恩永生难忘！导师渊博的学识、严谨认真的科研态度和宽厚善良的处世方式，使我终身受益。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成，其中倾注了大量的心血。在此，谨向我敬爱的导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢王英老师和李景文老师在实验方面给予的悉心指导以及硕士三年中给予的支持与帮助，两位老师不仅在学习与实验上指导我们，在生活上也同样关心我们。感谢吉林大学植物科学学院对我的培养。在我刚刚进入实验室，对实验几乎一无所知，对未来的生活充满迷惑的时候，感谢我的师姐陈虹地，她不仅教给我实验技术，引导我如何思考，在生活中还像姐姐一样关心我，让我的研究生生活逐步步入正轨。还要感谢与我一同迈入实验室的姬长媛和刘德泉两位硕士，感谢你们与我一路走来，相互关心，相互交流，同窗情珍重！感谢植科院703室的师姐赵明珠、何禹璇、尹智超，师兄阮文峰、张海军、苏连泰，师妹王天亮，师弟郭文云、徐扬、申梓邑对我学习和生活上的关心与照顾，感谢在我初来乍到时寝室室友张冬静、张雅琪、赵玲玲对我的关心和照顾，我会珍惜这份友谊！论文能够顺利完成，还要特别要感谢我的父母和男朋友谭伟对我生活和工作给予的关心与支持，他们的爱和期望给了我动力和自信，永远激励着我不断奋进！值此论文完成之际，向他们致以由衷的谢意！滕巍2015年6月于吉林大学51
