胡黄连提取物对缺血再灌注肾损伤的保护作用及其机制的研究

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1、第一军医大学博士学位论文胡黄连提取物对缺血再灌注肾损伤的保护作用及其机制的研究姓名：杨永红申请学位级别：博士专业：内科学（肾脏病）指导教师：张训;侯凡凡20060525、博士学位论文胡黄连提取物对缺血再灌注肾损伤的保护作用及其机制的研究博士研究生：杨永红指导教师：张训教授侯凡凡教授摘要研究背景急性肾功能衰竭(越碾)是临床常见的急危重症，由于出血、严重创伤、休克、肾脏移植等造成的急性缺血及再灌注性肾损伤是其主要病因。尽管重症监护和血液净化等医疗技术的应用，提供了治疗急性肾功能衰竭的先进手段，使患者的预后有了一定的改善，但近年来AFR死亡率仍居高不下，进一步提高防治水平仍是当前研

2、究的重点。急性缺血再灌注引起急性肾小管坏死发生机制较为复杂，相关因素比较多。近年来研究认为，氧自由基、某些炎性介质如肿瘤坏死因子a(TNF—a)和白介素1(IL-1)等、粘附分子如细胞间粘附分子1(ICAM．1)和血管细胞粘附分子1(VCAM．1)等、炎性细胞浸润等均与缺血再灌注肾损伤密切相关，尤其是氧自由基的作用备受关注。在缺血再灌注过程中，再灌注组织通过激活黄瞟呤氧化酶途径、NADPH氧化酶途径及其它途径产生大量氧自由基。氧自由基不仅可以直接损伤再灌注组织细胞，还可以通过过氧化作用产生更多的具有活性氧作用的代谢产物即氧化应激，放大氧自由基的损伤作用。同时代谢产物能激活细胞

3、外液中潜在的化学趋化因子、粘附分子，如TNF-a、IL-1、MCP．1、ICAM．1等，使多种炎性细胞更多地在再灌注组织粘附聚集，受损的组织细胞通过代谢性激活，又使炎性细胞释放其它的氧化酶造成组织进一步损伤，造成炎症反应，从而形成恶性循环。因此，抑制和清除缺血再灌注过程中氧自由基的生成，减摘要轻炎症反应是防治急性缺血再灌注肾损伤的有效途径。以往一直认为，激活黄嘌呤氧化酶途径所产生的氧自由基是缺血再灌注过程中氧自由基的主要来源。然而近年来发现，单纯使用黄嘌呤氧化酶抑制剂并不能特别有效地降低缺血再灌注损伤的发生，尤其是存在明显的不同种属或组织的差异性。与此同时人们发现，在缺血再灌

4、注过程的中晚期都可以伴随大量吞噬细胞(包括中性粒细胞、单核巨噬细胞和嗜酸性粒细胞等)在再灌注组织局部浸润，并且吞噬细胞浸润程度与病变程度相一致。吞噬细胞膜表面有大量的NADPH氧化酶，NADPH氧化酶激活后可以通过氧爆发(呼吸爆发)产生大量氧自由基，从而造成再灌注组织损伤，在使用相应的NADPH氧化酶抑制剂后可以抑制氧自由基的生成和降低再灌注组织损伤程度。因此现在NADPH氧化酶在缺血再灌注损伤中的作用及其抑制剂的保护作用备受关注。我们在以往的实验研究中发现，某种中药的提取物(胡黄连提取物)中富含一种NADPH氧化酶的抑制剂apocynin(夹竹桃麻素)及其它可能的抗氧化剂，

5、apocynin可以特异性抑制NADPH氧化酶，从而抑制吞噬细胞的氧爆发，减轻氧化应激对组织细胞造成的损伤，目前apocynin活性研究已经引起国外学者的广泛关注。国外已经有研究证明，胡黄连提取物对肝缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，可以降低缺血再灌注肝组织MDA和ILl的水平，减少肝细胞的凋亡和坏死。胡黄连提取物可以提高出血性休克大鼠动物模型抗休克能力，降低多器官衰竭的发生率。也有动物实验证明胡黄连提取物可以减轻中性粒细胞在缺血再灌注心肌细胞的浸润，降低再灌注心肌细胞的氧化应激水平，提高缺血再灌注后心肌细胞的生存能力，减小心肌坏死面积。有实验通过内皮细胞缺氧复氧模型体外模拟

6、缺血再灌注损伤，发现apocynin可以抑制缺氧复氧内皮细胞E选择素、ICAM．1和VCAM一1的表达上调，明显降低细胞凋亡的水平。国外研究认为，这些保护机制可能主要与胡黄连提取物可以保护细胞内抗氧化酶的活性、清除氧自由基、抑制氧化应激反应、提高机体的抗氧化能力以及抑制炎症反应有关。借鉴以上实验结果我们可以设想，是否胡黄连提取物也可以在肾缺II博士学位论文血再灌注过程中起到同样或相似的保护作用。因此本实验研究旨在观察胡黄连提取物对缺血再灌注肾损伤的可能保护作用，并对上述作用的机制进行探讨。研究方法我们利用急性缺血再灌注肾损伤大鼠模型和缺氧复氧肾小管上皮细胞(HK2)损伤模型，

7、采用如下方法观察胡黄连提取物对急性缺血再灌注肾损伤的保护作用：一、制各急性缺血再灌注肾损伤动物模型和缺氧复氧肾小管上皮细胞模型。1．动物模型：选取健康雄性200～2509SD大鼠，3％戊巴比妥钠(30mg／kg)麻醉，取腹正中切口进腹，切除右肾，分离左肾动静脉，无创动脉夹夹闭左肾动脉60min后打开动脉夹，再灌注72h。2．细胞模型：取第3-4代HK2细胞，调节细胞浓度为1×106／m1，种入6孔培养板，在37QC、95％02、5％C02环境中培养12h，然后换无糖Hank’S液，将培养板置于持续95％