间皮素抗原靶向的嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:间皮素抗原靶向的嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究英文论文题目：TheStudyofChimericAntigenReceptorTCellsTargetingMesothelinforTheTreatmentofPancreaticAdenocarcinoma学科专业：生物学学生姓名：何江川指导教师：钱其军教授论文编号：201520201013完成日期：2018年04月17日浙江理工大学硕士学位论文间皮素抗原靶向的

2、嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究间皮素抗原靶向的嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究摘要胰腺癌是目前治疗效果最差的消化道恶性肿瘤之一。其恶性程度极高，发现时一般都已经发展至中晚期，这也就导致了胰腺癌患者治疗病程很短且预后效果不佳。近30年来，医疗技术虽然有了长足的进步，但是在胰腺癌的治疗上却始终举步维艰，患者的5年总生存率也一直维持在5%以下。目前，临床上治疗胰腺癌的主要方法包括手术治疗、放疗、和化疗。其中，手术治疗仍旧是唯一可以治愈未发生转移患者的手段。而对于80%以上中晚期发生转移的胰腺癌患者，放、化疗或者多药联合疗法也就成

3、了最主要的选择。因此寻找一种新的方法来延长患者生存期显得尤为迫切。近几年，备受人关注的嵌合抗原受体T细胞（即CART）技术为肿瘤的免疫治疗打开了一扇新的大门。在血液性肿瘤中，CART技术取得了非常喜人的成绩，尤其是CD19-CART在治疗B细胞淋巴白血病方面效果卓著。相比较而言，CART细胞治疗在实体瘤方面还没有达到血液肿瘤的高度，究其原因主要与实体瘤的异质性、肿瘤抑制性微环境以及CART细胞较差的肿瘤浸润能力等有关。本课题借助piggyBac转座子依赖的质粒电转技术，构建了靶向间皮素（MSLN）抗原RegionIII的第二代C

4、ART细胞，并测试了其在治疗间皮素阳性胰腺癌细胞的效果：（1）将mesoCAR基因构建到包含piggyBac转座酶的载体质粒中，获得重组pNB338B-MESO质粒。通过电转的方法获得mesoCART细胞，并用重组间皮素（rMSLN）抗原和CD28抗体给与特异性活化和富集。Westernblot和RT-PCR在蛋白和基因水平证明转染成功并能表达出mesoCAR蛋白。流式检测结果证明，平均阳性细胞比率可以达到60%以上；（2）检测活化之后的mesoCART细胞的活化表型（CD25,CD69,CD137,和CD107α），结果显示这

5、四个指标的水平均高于CD3抗体活化的controlT细胞。同时，mesoCART细胞的平均增殖能力也明显高于controlT细胞。此外，用rMSLN抗原刺激mesoCART细胞可以检测到高水平的细胞因子分泌；（3）筛选出MSLN高表达的ASPC1和相对低表达PANC1两种胰腺癌细胞株，用实时无标记细胞分析仪检测mesoCART细胞对胰腺癌细胞的杀伤效果。I浙江理工大学硕士学位论文间皮素抗原靶向的嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究结果显示，mesoCART对间皮素阳性的胰腺癌细胞的杀伤具有抗原表达量的依赖性，而这种依赖性也体现在杀

6、伤之后Th1类细胞因子的水平上。体外肿瘤球模型结果证明，mesoCART细胞对MSLN高表达的ASPC1杀伤效果更突出，因此选择ASPC1细胞构建小鼠移植瘤模型；（4）构建好ASPC1-Luc细胞系，皮下移植到NSG小鼠成瘤，成瘤后用mesoCART和controlT细胞分别治疗。结果显示，mesoCART组小鼠肿瘤在第17天就出现了消退，到第21天所有小鼠肿瘤完全消退。分析治疗后血液中细胞因子水平，其中mesoCART组IFN-γ水平显著高于对照组。分析脾脏中记忆T细胞情况，同样可以看出mesoCART能分化成更多效应和中心记

7、忆T。H&E分析小鼠重要脏器，发现各组小鼠脏器组织特性无差异，说明mesoCART对小鼠正常器官无明显毒性，在一定程度证明了mesoCART细胞治疗的安全性。本文首先构建了靶向间皮素抗原RegionIII的CART细胞，通过优化手段获得了较高的阳性率，并且具有出色的体外增殖、杀伤和分泌高水平细胞因子的能力。在体内也展现出了出色的抑制肿瘤生长的能力，同时对机体没有产生明显毒副作用。我们的实验为mesoCART治疗胰腺癌的临床转化上提供了前期数据。关键词：胰腺癌、间皮素、CAR、piggyBacII浙江理工大学硕士学位论文间皮素抗原

8、靶向的嵌合抗原受体T细胞治疗胰腺癌的研究TheStudyofChimericAntigenReceptorTCellsTargetingMesothelinforTheTreatmentofPancreaticAdenocarcinomaAbstractPanc