罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究.pdf

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1、第43卷第12期2013年12月中国海洋大学学报PERIODICALOFOCEANUNIVERSITYOFCHINA43(12)：030～035Dec．2013罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究+王蓓L2，u，简纪常2，u，蔡双虎2⋯，黄郁葱2⋯，汤菊芬2”，吴灶和3’4”(1．中国海洋大学水产学院，山东青岛266003；2．广东海洋大学水产学院，广东湛江524025；3．广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东湛江524025；4．仲恺农业工程学院，广东广州510225)摘要：为研究罗非鱼源无乳链球菌重组DNA疫苗对鱼体的免疫保

2、护作用，将Sip基因克隆至真核表达载体pcDNAa．1(+)构建重组质粒pcDNA-Sip，并以肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)。免疫后第7、28天取样，采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip在各个组织(包括肌肉、脾脏、头肾、鳃及肝脏)中的表达情况；分别于免疫后第7、14、21、28天采集血清，使用ELISA方法检测抗体效价；免疫28d后进行攻毒实验，计算疫苗的免疫保护率。结果表明，重组质粒pcDNA-Sip可以在上述各组织中被检测到；免疫21d后抗体效价出现峰值达1：5120；免疫保护率为90％。由此证实

3、，pcDNA-Sip重组质粒可以转染到罗非鱼组织细胞，并可在鱼体中持续表达，同时有较高的免疫保护率。关键词：无乳链球菌；免疫；罗非鱼；重组DNA疫苗中图法分类号：$941．42文献标志码：A文章编号：1672—5174(2013)12—030—06无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)是一种革兰氏阳性链球菌，因最先从患乳房炎的牛中分离而得名。近年来，在广东、广西、海南等省罗非鱼养殖地区暴发了一种流行病，其病症主要为体色发黑，眼球突出，鳃盖内侧发红、充血或强烈出血等。本实验室研究团队经过对濒死病鱼病灶组织分离细菌，培养并鉴定，确定引起广

4、东地区暴发的大规模流行病的病原为无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)，这与张新艳等[1]报道的情况相似。无乳链球菌因其细胞壁多糖类C物质属于Lance—field抗原结构分类中的B群，所以又称为B群链球菌(groupBStreptococcus，GBS)，根据其荚膜多糖抗原性的不同，可分为9种血清型。Giraudo等E2]用灭活的无乳链球菌作为疫苗免疫乳牛，发现各个血清型之间无交叉保护力，不能产生保护性。寻找一种能在各个血清型之间都有保护性的抗原是开发无链球菌疫苗的有效方式。Brodeur等E3]采用免疫学筛选的方法从基因库中鉴定纯

5、化出一种表面免疫相关蛋白(Surfaceim—munogenicprotein，Sip)，该蛋白可有效地保护小鼠免遭5种血清型无乳链球菌的致死感染。由于Sip具有高度的保护性，广泛存在于各血清型的无乳链球菌中，在细菌黏附和定植方面也起到重要作用，可作为无乳链球菌主要候选疫苗靶基因之一。DNA疫苗是继灭活疫苗及亚单位疫苗之后的新型第三代疫苗，因其具有良好的安全性和保护性越来越受到了广泛的关注。早在1991年Hansen等就对鲤鱼进行了鱼类DNA疫苗的研究，并取得了良好的应用效果[4]，此后科学家们在多种鱼类身上进行了尝试[5书]。本研究旨在将具有良好免疫原性

6、的Sip蛋白与DNA疫苗技术相结合，构建Sip真核表达重组质粒并作为抗原来免疫吉富罗非鱼，对其免疫效果及转染的组织分布进行探讨，旨在探究鱼用DNA疫苗在防治罗非鱼无乳链球菌病的可行性，为进一步研究提供理论基础和实践经验。1材料和方法1-1材料Streptococcusagalactiae菌株ZQ091o从广东肇庆市岗美罗非鱼场分离。大肠杆菌DH5a、表达载体pcDNA3．1(+)为本室保存，Anti—Tilapia(Oreochromisniloticus)IgMmonoclonalantibody为英国AquaticDiagnosticsLtd公司产品。

7、细菌及动物组织基因组DNA提取试剂盒购白天根生化科技(北京)有限公司，pMDl8-T载体、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶，DNAMarker、DNA胶回收试剂盒购于TAKARA公司，无内毒素质粒试剂盒(PureLinkHiPurePlasmidFilterPurificationKits)购于英韦创津公司，cDNA一链合成试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，HRP标记的羊抗鼠IgG为博士德公司产品。实验用吉富罗非鱼购于湛江国联水产开发股份有限公司，暂*基金项目：国家重点基础研究发展计划项目(2009CBll8704)；国家重点基础研究发展计划前期项

8、目(2011CBlll600)；广东省科技计划项目(2010130