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《无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼的免疫机制与效果研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼的免疫机制与效果研究 无乳链球菌(Strep tococcusagalactiae)又称B群链球菌(group Bstrep tococci,GBS),在自然界,也是一种重要的水产动物致病菌。鱼类无乳链球菌病的流行与暴发在许多国家均有报道,给罗非鱼养殖业带来严重的经济损失。近年来,鱼类无乳链球菌病在我国的发生率呈上升趋势,特别是位于我国南部的广东、广西和海南等地暴发严重。 目前,对于罗非鱼链球菌病的防治方法多样,其中使用疫苗免疫是最重要的方法之一。因此,我国正大力发展罗非鱼无乳链球菌病疫苗的研究,并取得一定进展。本试验利用自行
2、研制的无乳链球菌口服疫苗免疫罗非鱼,应用HE染色方法观察肠绒毛形态结构、杯状细胞以及上皮内淋巴细胞的分布和数量,探讨该疫苗的免疫机制及不同免疫剂量的免疫效果,以期为该疫苗的深入研究和推广应用积累资料。 1、材料与方法 1.1材料 试验用罗非鱼由广西水产研究所国家级罗非鱼良种场提供,体重为100g±10g,体长为15cm±2cm;无乳链球菌GX035弱毒苗由广西水产研究所鱼类病害防治实验室提供。 1.2方法 1.2.1饲养管理 罗非鱼饲养于室内水箱中(规格:70cm50cm40cm),各组水质均为脱氯自来水,全天供氧。试
3、验期间水温保持在27℃~29℃,每周换水2/3。每天饲喂2次(8:00和16:00),日投饲率为2%~3%。 1.2.2试验分组与处理 选用体重为100g±10g,体长为15cm±2cm的健康罗非鱼共125尾,随机分为5个试验组,每组25尾鱼。免疫前驯养2周。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为免疫组,分别投喂剂量为1.0106、1.0107、1.0108、1.0109CFU/mL的口服型无乳链球菌GX035弱毒苗(每100g饲料用100mL相应浓度的菌悬液拌匀后在50℃烘箱中烘干),试验Ⅴ组为空白对照组,投喂未添加疫苗的饲料,按照2.5g
4、/尾进行投喂。 1.2.3组织切片制备 免疫接种15d后,从各组中随机抽取1尾(共5尾)罗非鱼进行解剖,迅速取出前肠、中肠和后肠分别制样。前肠在胃后端至肠道的第一个弯曲之间取材,中肠在肠道的第一个弯曲至最后一个弯曲之间取材,后肠在肠道最后一个弯曲至肛门之间取材,各肠段长度约1cm。将肠段浸入pH7.2~7.4的磷酸盐缓冲液中冲洗肠道内容物,使用Bouin固定液固定各肠段后,制作石蜡切片,HE染色,显微镜观察。 1.2.4各指标的形态观察和测量 参照黄玉章等提供的方法,每段肠道选取5张染色效果较好的切片于400倍镜下对以下指标进行观察:肠绒毛、各肠段肌
5、层厚度、杯状细胞、上皮内淋巴细胞,并应用图像分析系统(Super image verson 6.0.1.2)对其进行拍照和测量。 1.2.5攻毒试验 免疫20d后,所有鱼(各组均为20尾)均按照1.67107CFU/尾的剂量腹腔注射感染无乳链球菌,记录攻毒后10d内各组鱼的死亡数,并计算相对免疫保护率(RPS)。 1.2.6数据处理 应用SPSS19.0统计软件的单因素方差分析进行生物学统计。结果用平均值±标准差表示。 P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著,P>0.05为差异不显著。 2、结果 2
6、.1罗非鱼肠绒毛长度的变化 各试验组不同肠段的肠绒毛长度均呈现前肠最长,中肠次之,后肠最短的规律。免疫组与对照组不同肠段肠绒毛长度相比,差异均不显著(P>0.05)(表1)。 2.2罗非鱼肠道肌层厚度的变化 各试验组不同肠段的肌层厚度均呈现前肠最薄,中肠次之,后肠最厚的规律。免疫组与对照组相比较,前肠肌层厚度:免疫Ⅰ组与对照组相比有增厚,但差异不显著(P>0.05),免疫Ⅱ组~Ⅳ组较对照组增加20.96%、20.09%、31.51%,差异极显著(P<0.01);中肠肌层厚度:免疫Ⅰ组与对照组相比有缩短,但差异不显著(P>0.05
7、),免疫Ⅱ组~Ⅳ组较对照组均有增加趋势,其中免疫Ⅳ组较对照组增加17.01%,差异极显著(P<0.01);后肠肌层厚度: 各免疫组较对照组均增厚,其中免疫Ⅱ组增加10.95%,差异显著(P<0.05),免疫Ⅳ组增加19.41%,差异极显著(P<0.01)(表2)。 2.3罗非鱼肠道黏膜的形态结构观察 肠黏膜层具有环形皱襞、肠绒毛和小肠腺,黏膜上皮由柱状细胞、杯状细胞和内分泌细胞等组成。400倍镜下观察,各组肠段肠黏膜都较完整,层次分明。肠绒毛排列整齐,肠黏膜上皮细胞形状规则,排列紧密,染色鲜明。各免疫组肠绒毛顶端稍有脱落,固有层中轴稍
8、有增宽(图1)。 2.4对杯状细胞分布及数量的影响
