病毒的培养与增殖.doc

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1、病毒的培养与增殖一、病毒的培养病毒必须在活细胞中方能进行生命活动，因此早期对病毒生物学特性的研究主要通过动物接种（鼠、兔、犬、牛、猴等）以培养病毒。冃前动物接种仅限于研究病毒或毒株的致病性或为确切诊断某种病毒为病原体。个别病莓（如流感病莓）必须在鸡胚中进行分离培养。受精鸡胚的羊一、病毒的培养病毒必须在活细胞中方能进行生命活动，因此早期对病毒生物学特性的研究主耍通过动物接种（鼠、兔、犬、牛、猴等）以培养病毒。冃前动物接种仅限于研究病毒或毒株的致病性或为确切诊断某种病毒为病原体。个别病毒（如流感病毒）必须在鸡胚屮进行分离培养。受精鸡胚的羊膜腔和尿囊腔均可用以分离流感病毒。在

2、病壽学的发展史中，利用体外培养的动物组织、胚胎或细胞，分离或培养病毒是突破性的成就。我国病毒学家黃桢祥在30年代研究马脑炎病壽时，发现在体外培养的组织块中加入病毒后，培养液的pH与无病毒的对照培养液有显著差别，提出了利用体外组织培养病毒。在此基础上，Enders在非神经组织培养中成功地培养了脊髓灰质炎病毒，并进一步研制出脊髓灰质炎疫苗。Enders在诺贝尔奖金获得者的报告屮还提到了黄桢祥的T作。由于组织培养及以后发展的单层或悬浮细胞培养技术具有便于纯化病毒、可直接观察细胞变化（包括细胞出现病变或转化）可对病毒的复制过程进行基础性研究、、可进行空斑纯化病毒克隆以及可滴定病

3、壽伤量等优点，至今细胞培养仍是分离病毒及了解病毒生物学特性和病毒疫苗生产的主耍工具。例如当今为消灭小儿麻痹症所应用的脊髄灰质炎病毒疫苗就是用细胞培养法所生产与制备的。培养病毒所用的细胞有原代细胞、传代细胞及双倍体细胞等不同种类。原代细胞培养是指自动物或人（来口猝死、疾病或因治疗而流产胎儿的材料）组织直接用蛋白酶消化所获得的细胞，经培养后可贴管壁生长或悬浮生长（如淋巴细胞）。原代细胞对病毒的易感性高，主要作为自标本中分离病毒的工具。传代细胞分为二倍体细胞株和传代细胞系。可连续传代的细胞系或來自肿瘤组织（如HeLa细胞）或来自发生自发转化的原代细胞系（如中国地鼠卵巢细胞系，

4、CHO）c这些细胞系的染色体为多倍体，与正常细胞不同。二倍体细胞则为在体外连续50-60代后仍保持其二倍染色体数冃的细胞。经再连续传代，则二倍体细胞逐渐衰老而死亡。这种细胞株多数用人胚肺组织建立，既可用于分离病毒，也是人用疫苗生产屮首选的细胞株。在用真核表达基因工程产品时则常用CHO细胞。由于建立了细胞培养系统才能开展对病毒复制的研究。病毒的复制过程常伴有一定的形态学与生化的变化，最早观察病毒的复制是从细胞发生形态变化入手。溶细胞型病莓感染细胞后，可出现细胞团缩、裂解和细胞肿大以及数个细胞融合成多核巨细胞或细胞聚集成葡萄串等。将病壽原液作10倍系列稀習后,可对病毒的量进

5、彳亍滴定。常用表达的方式为TCID50（50%tissuecultureinfectivedose），即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变（cytopathiceffect,CPE）的病毒量。例如在判定减毒活疫苗的质量时，常需用所含病毒量作为重要标准。此外还可利用在细胞培养的表面覆盖一层半固体物质的方法，使细胞病变形成空斑，用來纯化毒株。二、病莓的增殖病毒体在细胞外是处于静止状态，基本上与无生命的物质相似，当病毒进入活细胞后便发挥其生物活性。由于病毒缺少完整的酶系统，不具有合成自身成份的原料和能量，也没有核糖体，因此决定了它的专性寄生性，必须侵入易感的宿主细胞，依

6、靠宿主细胞的酶系统、原料和能量复制病毒的核酸，借助宿主细胞的核糖体翻译病毒的蛋白质。病毒这种增殖的方式叫做“复制(Replication)o病毒复制的过程分为吸附、穿入、脱売、生物合成及装配解放五个步骤，乂称复制周期(Replicationcycle)o(一)、吸附吸附(Adsorption)是指病毒附着于敏感细胞的表而，它是感染的起始期。特异性吸附是非常重耍的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。脊髓灰质炎病毒的细胞表面受体是免疫球蛋白超家族,在非灵长类细胞上没有发现此受体，而猴肾细胞、

7、Hela细胞和人二倍体纤维母细胞上有它的受体，故脊髓来质炎病毒能感染人体鼻、咽、肠和脊髓前角细胞，引起脊髓灰质炎(小儿麻痹)。水磨石病毒的细胞表而受体是含唾液酸(N■乙酰神经氨酸)的糖蛋白，它与流感病毒表而的血凝素剌突(受体连结蛋白)有特殊的亲和力，如用神经氨酸酶破坏该受体，则流感病毒不再吸附这种细胞。此外，HIV受体为CD4；鼻病毒的受体为细胞粘附分子・1(1CAM-1)；EB病毒的受体为补体受体・2(CR-2)o病壽吸附也受离子强度、pH、温度等环境条件的影响。研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意