PCR及反应条件的优化课件.ppt

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1、1.目的DNA片段质粒TA载体5.连接重组质粒目的DNA6.转化无质粒的E.Coli死亡有质粒的E.Coli存活含抗生素培养基中生长2.PCR2-3min平板筛选实验课安排质粒提取7.酶切实验报告要求最后2学时进行实验课考试(20分)开卷,但不许抄袭其它同学试卷。内容为两个实验：实验目的、主要步骤（简答）、－－－（3分）结果（画图）、结果分析、－－－（4分）有关实验的问答题（注意听讲）－－－（3分）4.收卷时签名。实验一、基因组DNA的提取、电泳第一部分：肝组织制备及蛋白酶K消化第二部分：酚氯仿抽提及乙醇沉淀第三部分：DNA琼脂糖凝胶电泳预期结果12345Marker总DNA如果是Sm

2、ear带，说明所提基因组DNA的断裂现象严重。思考题：1.实验中所用到的各试剂的作用是什么?氯仿,乙醇,EDTA2.DNA提取过程中应注意什么？凝胶成像系统：凝胶成像系统：实验二、PCR扩增特定基因片断实验背景基本原理PCR操作引物设计注意事项PCR的应用一．实验背景Thepolymerasechainreaction(PCR)isinventedbyK.Mullisin1985.ThistechniqueisusedtoamplifyasequenceofDNAinvitrobysimulatingthereplicationprocedureofnaturalDNAinvivo.P

3、CRenableustounlimitedlyamplifyDNAfragments.TheNobelPrizeinChemistry1993二．PCR基本原理3’5’3’5’PCR3’5’5’3’5’5’targetsequence在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。pre-denaturation95℃for5min;Denaturation:95℃for30~60sAnnealing:37~68℃for30~60sextension:72℃for30s~2min72℃extensionfor10min3

4、0cycles反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension）DNA模板1l10PCRbuffer（含MgCl2）5ldNTPs(10mmol/L)1l5’引物(10mol/L)1l3’引物(10mol/L)1l去离子水（补足反应体系）40lTaqDNApol.(2U/l)1l轻弹管底混合（用离心机甩一下）注意：最后加入Taq酶。三．PCR操作50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：PCR仪设定的反应条件：94oC45SDNA变性55oC45SDNA复性72oC1min产物链延伸25-30个循环后72oC

5、10min一般地，基因片段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行PCR：介绍：PCR仪如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进行PCR；如果下面加热的PCR仪，加入2滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。仪内发生的反应PCR变性退火延伸55PCR产物的积累规律在PCR反应中，DNA扩增过程遵循酶的催化动力学原理。反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样

6、品中模板的拷贝数、PCR扩增效率、DNA聚合酶种类和活性、以及非特异产物的竞争等因素。到达平台期前，TaqDNA聚合酶一般要进行25次以上PCR循环。多数情况下，平台期在PCR反应中不可避免。PCR产物的积累规律示意图PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。PCR反应中有两条引物，即5′引物和3′引物。（四）、PCR引物的设计引物设计的基本原则引物的设计实例(＊)PCR引物设计的基本原则1、引物的方向永远是5→3引物长度一般为15-40个核苷酸。过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。2、引物中的碱基

7、尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。引物中G+C的含量在45-55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物长度要确保值不低于54°C。3、引物内部不应存在互补序列，以避免折叠成发夹结构，尤其引物末端应无回文结构。按经验，引物自身存在的连续互补序列，一般不达到4bp。4、引物间不应存在互补序列。尤其3’端，以免形成引物二聚体。PrimersThatFormHairpins•Apr