资源描述：
《人肺上皮细胞蛋白酶激活论文.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、人肺上皮细胞蛋白酶激活论文【摘要目的摘要:蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）广泛分布在多种组织细胞上，但4种PARs在肺上皮细胞的表达情况尚不清楚.我们用A549细胞探究PARs在肺上皮细胞的表达.方法摘要:采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）、流式细胞仪和免疫荧光细胞染色分析技术分析肺上皮细胞系A549细胞PARs的表达情况.结果摘要:4种PARs在肺上皮细胞上均有不同程度的表达.结论摘要:肺上皮细胞同时表达PAR1~44种受体，这为进一步探究PARs在肺上皮细胞的功能奠定了基础.【蛋白酶
2、激活受体；肺上皮细胞；RTPCR；流式细胞术；免疫荧光细胞染色0引言蛋白酶激活受体（proteaseactivatedreceptors,PARs）属G蛋白耦联受体家族，目前共发现4个成员摘要：PAR1，PAR2，PAR3，PAR4.蛋白酶可以酶切PAR的N末端，暴露含有系锁配体的新的N末端，可自我激活PAR功能［1］.探究显示，PARs分布在多种组织细胞上，包括血小板、白细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞、消化道上皮细胞等.PAR被激活后，可介导跨膜信号转导从而参和凝血、炎症、变态反应等生理和病理过程的发生［2］.许
3、多组织上皮表达的PARs可能在不同的病理过程中起功能，虽然一些组织的PARs的分布已有探究，但4种PARs在肺上皮的表达情况和功能还不是十分清楚.因此，我们利用培养的人肺癌上皮细胞系A549细胞探索四种PARs在肺上皮细胞上的表达特征.1材料和方法1.1材料5学海无涯人肺癌上皮细胞系A549细胞购自中国科学院上海细胞探究所,青、链霉素、非酶性细胞分离液购于Sigma公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司，TRIZOLReagent购自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,购自TAKARA公司，S
4、YBRGreenI核酸凝胶染料购自BMA公司,PCRMarkers购自Biolabs公司.PE标记的小鼠抗人PAR1和PAR2mAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗体及相应的同型对照均购自SantaCruz公司.FITC标记的羊抗兔IgG二抗购自BDPharmingen公司.PCR仪PTC200购自MJResearch公司，激光扫描共聚焦显微镜系统购自日本Nikon公司，FACSCalibur流式细胞仪购自BectonDickinson公司.1.2方法1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞接种于50mL培养瓶内，用DME
5、M完全培养液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃,50mL/LCO2培养箱中培养.1.2.2RTPCR收集培养的A549细胞，用TRIZOLReagent提取细胞总RNA，具体操作步骤按试剂说明进行.RNA经10g/L琼脂糖电泳后，按TAKARARTPCRkit说明进行cDNA合成.逆转录的条件为摘要：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特异性引物均由上海博亚生物技术有限公司合成.βactin（F）5′AGG
6、GGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCCTGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCAC
7、CTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR扩增条件为摘要：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35个循环,72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4扩增的目的片段分别为500,461,403和401bp；βactin的扩增片段为202bp.PCR扩增片段经测序验证.1.2.3流式细胞术分析待培养细胞
8、生长至70%~80%时，用非酶性细胞分离液悬浮细胞，10g/LBSA/PBS洗2次，调整细胞密度为5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室温固定10min,按说明书分别加入1∶20PE标记的抗P
