河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流行病学调查及PEDV遗传进化分析

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河南农业大学专业硕士学位论文题目河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流行病学调查及PEDV遗传进化分析学位申请人姓名崔新格导师姓名王亚宾教授专业学位类别全日制兽医硕士领域兽医研究方向动物分子病原学与免疫学中国郑州2018年6月 分类号密级河南农业大学专业硕士学位论文论文题目：河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流行病学调查及PEDV遗传进化分析英文题目:EPIDEMIOLOGICALSURVEYOFSWINEDIARRHEACORONAVIRUSINSOMEAREASOFHENANPROVINCEANDANALYSISOFITSGENETICEVOLUTIONUSINGPEDV学位申请人：崔新格导师：王亚宾教授学位类别：全日制兽医硕士领域：兽医研究方向：动物分子病原学及病原学论文提交学位授予日期：日期： 河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书￣￣￣学位ｉ仑学位河南省部分地区猪腹泻类冠状病毒流｜文题目｜行病学调查及ＰＥＤＶ遗传进化分析类别学生坦部故｜学科＾３＾７７导师￥新格胃＿±姓名专业姓名Ｖｉ否如需保密，解密时间ｊＪｔ是否保密独创性声明本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。特此声明。研宂生签名：Ｉ托导师签名：東日期：年月乂曰日期：■＾曰＜〖枰月％＜学位论文使用授权及知识产权归属承诺本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版本，，并提供目录检索和阅览服务可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。本人完全了解《河南农业大学知识产权保护办法》的有关规定，在毕业发表一开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工的所有论文，第署离作业大学，试验材料、原始数据、知识产权均归名单位为河南农申报的专利等，河南农业学所有则承担相应的法律任。大，否责注：保密学位论文在解密后适用于本授权。书Ｔ：明研名：导师签名：学院领导签名｜宂生签拳：年：曰期年６月夕曰曰期月曰曰期月曰年＆义 致谢时光如白驹过隙，转眼便是毕业时节，研究生两年的求学生涯即将接近尾声。回想起两年来的点点滴滴，我思绪万千，感慨万分。本论文是在导师王亚宾教授和胡慧教授的悉心指导下完成的。两位恩师知识渊博、治学严谨、求真务实，他们严谨的治学态度、一丝不苟的敬业精神、宽广的胸襟和谦虚真诚的待人方式无不使我终生难忘。从论文选题、实验设计到论文的顺利完成，无不蕴含着导师的心血。恩师不仅教会了我做科研，更重要的是教会了我要做一个对社会有用的人。值此论文完成之际，谨向尊敬的导师致以最崇高的敬意和最衷心的感谢！衷心感谢导师组张改平院士、边传周教授、魏战勇教授、陈丽颖教授、夏平安教授、王川庆教授、张龙现教授、宁长申教授、陈红英教授、张红英教授、赵军教授、李新生教授、王荣军副教授、王学兵副教授、王彦彬副教授、王新卫副教授、还要衷心感谢张红垒老师、金钺老师在完成学习任务和课题研究中对我的指导、帮助和大力支持！感谢牧医工程学院的领导和老师！同门求学是一种缘分，感谢和我一起做试验、一起探讨问题的同门李滨洲、陈飞、李炳晓、张鸿鑫、唐磊、闫瑞杰、许瑞勤、梁青青、张云飞、高航、韩昊莹以及牧医工程学院16级全体研究生。感谢他们无私的奉献和帮助，让我每天都能处在一个温馨、和谐、积极向上的大家庭中，让我经历了一段难忘的研究生生活。感谢好友陈慧心、唐磊等在生活和试验中给予的帮助。衷心感谢师兄张留君、张利卫、韦学雷、徐朋丽，师姐靳晓慧、韩丽、赵娣、和春昊、马思续、冯延、周雍、张宇，师弟王鹏涛、袁一心、张弛、赵宇、任豪杰、李想通，师妹蒋毛勤、王芳、郭珍珍、吴秋玲、郑慧华、张艺璇等在我试验和学习过程中给予的无私帮助！。特别感谢我的父母及众多亲人几年来对我经济上的支持和精神上的理解！他们无私的奉献是我顺利完成学业的保障和继续奋斗的动力！再次感谢在我生命中出现或即将出现的人，这些都将是我生命中美好的篇章！感谢以上各位以及由于本人疏忽未提到的亲人、同学和好友！感谢所有给予我帮助的人们！ 目录摘要...................................................................................................................................................1文献综述...........................................................................................................................................31猪δ冠状病毒(PDCoV)的研究进展............................................................................................31.1猪δ冠状病毒的病原学研究................................................................................................31.2猪δ冠状病毒流行病学研究................................................................................................42猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究进展......................................................................................42.1猪流行性腹泻病毒的病原学研究........................................................................................42.2猪流行性腹泻病毒流行病学研究........................................................................................63猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的研究进展..................................................................................63.1猪传染性胃肠炎的病原学研究............................................................................................63.2猪传染性胃肠炎的流行病学研究........................................................................................74PDCoV、PEDV和TGEV的诊断技术研究...............................................................................74.1免疫荧光法(IF)......................................................................................................................74.2酶联免疫吸附试验(ELISA)...................................................................................................84.3免疫组织化学(IHC)...............................................................................................................84.4环介导等温扩增技术(LAMP)...............................................................................................84.5PCR检测技术........................................................................................................................8引言.................................................................................................................................................10试验一河南省部分地区猪群腹泻类冠状病毒的流行病学调查...............................................111材料与方法.................................................................................................................................112结果与分析.................................................................................................................................153结论与讨论..................................................................................................................................21试验二PEDVS基因遗传进化分析............................................................................................231材料与方法.................................................................................................................................232结果与分析.................................................................................................................................263结论与讨论..................................................................................................................................32试验三PEDVORF3、N、M基因遗传进化分析......................................................................33 1材料与方法.................................................................................................................................332结果与分析.................................................................................................................................353结论与讨论..................................................................................................................................51全文总结.........................................................................................................................................53参考文献.........................................................................................................................................54ABSTRACT....................................................................................................................................58 中文摘要目前调查研究表明，猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪δ冠状病毒(PDCoV)是导致猪病毒性腹泻的常见病原，它们都可使不同生长阶段猪群发生急性水样腹泻、呕吐，严重时脱水致死，尤其在哺乳仔猪中有较高的感染率。由于这三种病原在临床症状中难以区分，因而对猪病毒性腹泻疑似病例进行病原检测尤为重要。为探究猪病毒性腹泻在河南省地区的流行情况，本研究拟对河南省部分地区的猪群腹泻冠状病毒（PDCoV、TGEV和PEDV）的感染情况进行调查，并对其中的25份PEDV阳性病料进行了ORF3、N、M基因的扩增及序列测定，还对其中18株PEDV阳性病料S基因进行了扩增及序列测定，并且与经典毒株CV777及国内外流行毒株基因序列进行了遗传进化分析。1.河南省部分地区猪群腹泻类冠状病毒的流行病学调查对来自河南省部分地区猪场的2017年至2018年期间采集的255份腹泻病料进行RT-PCR检测，以分析PDCoV、PEDV和TGEV在河南地区猪群中的流行情况。结果显示255份腹泻病料中，PEDV阳性病料达115份，占45.10%，TGEV阳性病料有68份，阳性率占26.67%，PDCoV阳性病料有47份，阳性率是18.43%，表明在河南省多数猪场存在TGEV、PEDV和新发的PDCoV的流行。而且，三种腹泻类冠状病毒也存在着不同的混合感染情况，其中，PEDV和PDCoV混合感染率为14.12%，PEDV和TGEV混合感染率为5.49%，PDCoV和TGEV混合感染率为2.35%，PEDV、PDCoV和TGEV三种病原混合感染阳性率为1.96%。在采集腹泻病料的不同地区冠状病毒感染阳性率也不相同，其中，安阳、鹤壁、新乡、漯河、三门峡、信阳地区送检的腹泻病料中腹泻冠状病毒感染的阳性率最高达100%；而在感染冠状病毒的种类上，鹤壁、洛阳、三门峡、郑州地区只检测到PEDV的感染；从整体来看，PEDV在河南地区的感染较为严重，并且分散的区域相对较多。在不同时段上冠状病毒的阳性率也不相同，其中一月份检出率最高，PEDV在一月份高达96.43%，PDCoV在一月份检出率最高达82.14%，而7-8月份PDCoV、TGEV和PEDV均未检测到。另外，冠状病毒对不同阶段的猪感染也不相同，PDCoV主要感染哺乳仔猪，阳性率高达48.19%，其次是保育猪7.14%，但是母猪的感染率仅有2.59%；而PEDV在哺乳仔猪、保育猪和母猪的阳性率分别为75.90%、35.71%和27.59%，，显示PDCoV和PEDV在哺乳仔猪阶段感染最为严重。而对免疫和未免疫猪场感染率分析发现，未免疫的猪场感染PDCoV、PEDV和TGEV的阳性率虽较高，分别为20.88%、54.40%和34.07%。但免疫猪场感染PEDV和TGEV的阳性率也分别达到了21.92%和8.22%。该结果为河南省猪腹泻类冠状病毒感染的防控提供了流行病学信息。2.PEDVS基因遗传进化分析根据对河南省猪腹泻类冠状病毒感染情况调查结果，选取有代表性的地区、不同时间、不同猪场的PEDV阳性病料，扩增S基因全长，测序后进行S基因的遗传进化分析。本试验共检测了18株S基因的全长序列，片段大小约为4150bp，其基因序列之间的核苷酸及推1 导氨基酸同源性分别为95.3~100%和95.2~100%；与经典毒株CV777之间的核苷酸及氨基酸同源性为93.8~95.8%和93.2~96.3%。对S基因序列的遗传进化分析结果显示，本研究的大部分毒株与往年的国内流行毒株、两个韩国毒株和三个美国毒株都处于同一分支，而CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSYX-G37/2018、CH-PDSLS-3L/2018、CH-zmd-G9/2017和三株日本毒株（MYZ-1/JPN/2013、KCH-2-JPN-2014和OKY-1-JPN-2014）同属于一个分支，说明本研究中的这六株与日本毒株的亲缘关系较近。3.PEDVORF3、N、M基因遗传进化分析另外也对25个PEDV河南株进行了ORF3、N、M基因的遗传进化分析。发现PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的，均为强毒株；与经典毒株CV777之间核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。其推导的氨基酸序列与CV777相比结果显示，有3个毒株（CH-ZK-G14/2017、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018）在第80位发生点突变，即第80位由V变F，在第182位有9个（CH-ZMDO-G9/2017、CH-ZMDO-G10/2017、CH-PDS25LSO-2L/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-LH-1/2017）毒株发生突变，即由Q变H；ORF3基因碱基序列的遗传进化树显示，本研究中大多数株毒株均与中国其他地区的毒株、往年河南地区的流行株、美国毒株、韩国毒株、日本毒株同属于一个分支。研究中的PEDV毒株N基因之间的核苷酸与推导氨基酸同源性分别为96.2~100%和93.8~99.8%；与经典毒株CV777核苷酸与推导氨基酸的同源性分别为94.7~95.8%、93.2~96.8%。进化树分析发现本研究的大部分毒株与河南地区往年毒株CHHNAY2015、CHHNLH2015、CHHNZZ47-2016的亲缘关系较近。25株河南地区毒株M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.1~100%和95.6~99.6%；与经典毒株CV777之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为97.7~98.2%和95.6~98.7%。推导的氨基酸比对结果发现有4处发生氨基酸的改变，在第17位处有6个（CH-AY-1/2017、CH-HB-13/2017、CH-JY2/2017、CH-JY3/2017、CH-NY-1、CH-NY-7）发生E突变为Q；在第46位处，除了CH-ZKFG-374、CH-ZKFG-377、CH-ZKLYM-370和CH-ZKLY-373外，其他21株发生V-A；在第196位，CH-XYBsq-G29和CH-XYBSQ-G30发生G-S；而在第218位（除了CH-XYBsq-G29和CH-XYBSQ-G30）发生了A突变为S。遗传进化树显示本研究的河南地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支，表明猪场爆发猪流行性腹泻与免疫疫苗后依旧难以控制的原因可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。关键词：分子流行病学；PDCoV；PEDV；RT-PCR；遗传进化分析2 文献综述猪病毒性腹泻病是猪场中比较常见的传染性疾病之一，尤其以新生仔发生猪腹泻最为多见，该病对我国养猪业发展有着严重的制约[1-2]。据最新的病毒学分类报告可知，冠状病毒属成员可分为四个群：α、β、γ和δ，ɑ群和β群冠状病毒都是主要感染哺乳动物的病毒，ɑ群冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪呼吸道冠状病毒（PRCV）和人冠状病毒（HCoV229E）等，β群冠状病毒包括牛冠状病毒（BCV）、小鼠肝炎病毒（MHV）和人的严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）等，而γ冠状病毒感染禽类，包括火鸡蓝冠病病毒（Bluecombvirusofturkey）和传染性支气管炎病毒（IBV），δ冠状病毒是冠状病毒科的新成员，最早报道是在2007年，是从检测的亚洲豹猫与中国白鼬獾群中发现的，猪δ冠状病毒首次发现是在2012年的香港猪群中，美国第一株猪δ冠状病毒分离是在2014年，而我国第一株猪δ冠状病毒是在2016年[3]。导致我国仔猪腹泻的病毒有很多种，其中冠状病毒主要包括新发的猪δ冠状病毒（PorcineDeltacoronavirus,PDCoV）、猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus,PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（PorcineTransmissibleGastroenteritisVirusofswine,TGEV），PDCoV、PEDV和TGEV对不同类别（比如日龄、品种和性别）的猪都有感染，对哺乳仔猪的危害相对严重[4]。PEDV、TGEV和PDCoV感染猪群导致的临床症状极难区分，再加上常有混合感染的影响，所以在临床诊断和病理剖检上容易发生混淆。1猪δ冠状病毒(PDCoV)的研究进展1.1猪δ冠状病毒的病原学研究PDCoV（PorcineDeltacoronavirus,PDCoV），单股正链RNA病毒，有囊膜且基因组结构与PEDV很相似，其全长约为25.4kb，这其中复制酶ORF1ab约占18kb，是目前已知冠状病毒家族中基因组长度最小的病毒，PDCoV具有5´端帽子结构和3´端Poly（A）尾巴的结构，共编码4种结构蛋白和4种非结构蛋白[4]。研究结果发现PDCoVHKU15和麻雀冠状病毒(sparrowcoronavirus,SpCoVHKU17)差异性不大，表明新型冠状病毒从禽类传递到猪群发生时间比较短，且在传播过程中，可能是发生在3′端的非结构蛋白基因NS7a与NS7b的缺失的原因，这与SARS-CoV从麝香猫传播到人类的过程中发生ORF8缺失29nt是十分相似的[12]。目前为止，PDCoV结构蛋白的具体作用还有待进一步探讨。通过对其他同属的冠状病毒研究可知，PEDV的S蛋白在病毒与细胞受体结合后，在通过膜融合侵入宿主细胞的过程中发挥着极其重要的生物学作用[5-6]。有研究显示，S蛋白属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，S蛋白在蛋白酶的作用下通常裂解为S1及S2两个亚基，S1亚基主要识别受体，S2亚基主要融合病毒和宿主[7]。PDCoVN蛋白具有的免疫原性很强，猪被感染PDCoV后，N蛋白在不同毒株中的保守性相对较高，针对N蛋白有抗体产生时间早、抗体水平高等特点，因此N蛋白在血清学诊3 断方法中被作为首选，主要在核仁区域聚集[8-9]。PK-PDCoV-N与普通的PK细胞相比较，结果显示43个蛋白质斑点发生了变化，其中10个发生的变化比较大[10]。1.2猪δ冠状病毒流行病学研究近几年中国仔猪出现大规模的腹泻症状并有较高的死亡率，其中PDCoV、TGEV和PEDV都是导致肠道疾病的重要病原。PDCoV的特点为发病地区广，发病率与死亡率都较高，对各年龄段的猪群感染率都较高[11]。最初报道PDCoV是Woo等[12]在2012年香港的猪群中发现的，在169份猪粪便样品中检测到PDCoV阳性率为10%。2014年1-2月期间，美国仔猪腹泻严重爆发，研究人员在爱荷华州等地区腹泻的猪场中，检测到猪δ冠状病毒，而这些猪场的猪流行性腹泻病毒都没有检测到，说明PDCoV的致病性很强，通过全基因组序列比对结果，发现与2012年在香港检出的两株猪δ冠状病毒（HUK15-44和HUK15-155）同源性高达99%[13]。Hu等[14]在PDCoV的分离与纯化中，发现PDCoV可以在LLC-PK细胞和ST细胞中增殖。Dong等[15]在2013-2014年间采集我国湖北、广东、江苏、安徽和河南等省份的规模化养猪场粪便样品258份，其阳性率为14.3%，这是在中国猪场第一次发现。陈建飞等[3]对黑龙江省某猪场的PDCoV阳性样品处理，接种在LLC-PK细胞上并连续传代培养，最终我国首株命名为NH株的PDCoV被成功分离，在M基因的遗传进化分析中，NH株与韩国、中国、美国的PDCoV亲源关系相对较近。学者Song等[16]采用自已建立的巢式PCR方法对2012-2015年在江西采集的猪粪便或肠道样本356份进行检测，其阳性率为33.71%，发生PDCoV与PEDV混合感染的阳性率为58.33%。因此，关于该新型猪δ冠状病毒的流行病学、免疫学和致病机理等方面将迎来人们更多的挑战与关注。2猪流行性腹泻病毒(PEDV)的研究进展2.1猪流行性腹泻病毒的病原学研究2.1.1猪流行性腹泻病毒基因组结构PEDV属于尼多病毒目（Nidovirales)，冠状病毒科（Coronaviridae），冠状病毒属（Coronavirus）的一种单链RNA病毒，具备与冠状病毒科别的成员相似的病毒粒子形态[33]。PEDV的基因组全长约28kb，包括5ˊ非编码区（UTR）、3ˊUTR以及7个开放阅读框（ORF），这7个ORF编码3个非结构蛋白（复制酶1a、复制酶1b和ORF3）和4个结构蛋白（刺突蛋白S、小膜蛋白E、膜蛋白M、核衣壳蛋白N），其中ORF1a和ORF1b编码的RNA聚合酶复制蛋白从5ˊ端起约占2/3的区域，剩余部分依次是S蛋白、ORF3蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白[17]。在编码结构蛋白的基因中，M基因和N基因属于保守序列，检测引物一般都是针对M基因和N基因设计的[18]。张红垒等[19]运用M基因和N基因设计了特异性引物，对陕西发生猪流行性腹泻疫情猪场进行检测，其结果序列同源性分别达到96.3%～99.9%、95.2%～99.5%。4 2.1.2猪流行性腹泻病毒主要编码蛋白及其功能（1）ORF3蛋白及其功能ORF3基因位于S基因和sM基因之间116-784个核苷酸处，ORF3非结构蛋白编码224个氨基酸[20]。大部分的PEDV强毒株及经典毒株的ORF3基因长675bp，而一些致弱毒株或者是一些疫苗株的ORF3基因会发生部分碱基缺失，导致ORF3基因只有276bp，能编码91aa，有研究显示ORF3基因缺失会影响病毒的释放和降低病毒的毒力，但是病毒在体外培养的过程中ORF3作用不大[21]。ORF3基因是鉴别毒株强弱的一个重要的蛋白基因，中科院发表PEDVORF3蛋白最新研究成果，成功建立了巢式PCR的方法用于鉴别PEDV疫苗株和野毒株的[22]。Park等[23]通过对PEDV弱毒株和野毒株的ORF3基因序列分析，发现ORF3基因发生51个碱基缺失，其氨基酸的缺失17个，该基因的缺失可成为病毒弱化的标志，故ORF3基因也可以用于研究猪流行性腹泻的分子流行病学。（2）S蛋白及其功能S基因是构成病毒粒子表面的纤突，因此被称为纤突蛋白，其氨基酸约含有1383个，分子质量约180kD～220kD。孙东波等[24]将猪流行性腹泻病毒S基因划分为S1区(1~789aa)和S2区(790~1383aa)。有研究表明，S蛋白可使体内培养过程中的毒力减弱，也参与病毒体外培养[25]。S蛋白不仅可以诱导机体产生中和抗体，而且对PEDV的再次感染发挥着很强的预防作用，S蛋白是重要的靶蛋白之一[26]。（3）M蛋白及其功能M蛋白为病毒的囊膜蛋白，由681个核苷酸构成，可编码226个氨基酸。该蛋白的分子量为27ku-32ku，是一种跨膜糖蛋白。M蛋白没有信号肽，其包含两个RNA结合结构域，分别位于病毒外面的氨基末端结构域和病毒内部的羧基结构域，且保守性相对较高[27]。M基因编码的M蛋白是由3个跨膜区域构成跨膜蛋白的，是穿膜的糖蛋白在装配病毒粒子和病毒的出芽有着不可或缺的作用[28-29]。（4）N蛋白及其功能N基因全长大约为1326bp，N蛋白是已知结构的磷酸化蛋白唯一，它可以与病毒基因组RNA相结合，相互缠绕形成病毒核衣壳蛋白[28]。相对于PEDV的其它结构蛋白，N蛋白所占比例大且能在感染猪群体内发现大量抗N蛋白抗体，因此，N蛋白也常被作为PEDV早期诊断的靶蛋白[29]。（5）E蛋白及其功能E基因全长约231bp，在PEDV的结构基因中是最小，在同群的冠状病毒中E基因具有较高的同源性且PEDVE基因序列高度保守，E蛋白在病毒的包膜和病毒粒子的形成过程中具有十分重要作用[30]。刘春艳等[31]设计了一对针对PEDVE基因的特异性引物，能够稳定的扩增E基因，可用于PCR方法诊断PED。2.2猪流行性腹泻病毒流行病学研究1971年，猪流行性腹泻首次发现是在英国育肥猪猪场[32]。1978年，分离到PEDV并确5 认分类为套式病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属的一种冠状病毒[33]。在1973年，PED第一次发生在我国上海地区的某些猪场，随后在山东、吉林、河北、江西、湖南、广东等地也检测到了该病毒[34]。但是自2010年以来，PEDV由经典毒株（CV777）在日本、中国、韩国及大部分亚洲国家开始出现变异毒株，造成新生仔猪的致死率高达100%[35]。PEDV仅能感染猪，粪-口传播是PEDV主要的传播途径，感染不同日龄，但对新生仔猪造成的病死率最大[36]。PED一年四季均都可能发生，而春冬季节较为多发，夏、秋季节也偶有发生，PEDV可感染各种品种的猪群，包括野猪也可感染，处于潜伏期的猪群或发病猪群均可成为本病传播者[37]。Puranaveja等[38]对8个省份的33份样本进行RT-PCR检测及测序发现，在该国所流行的毒株与中国2004年的JS-2004-2毒株的核苷酸序列同源性为96.5%~99.7%。郑逢梅等[39]对华中地区的12株PEDV毒株进行S基因、M基因和ORF3基因的序列分析，结果显示，11株PEDVS基因发现有6个碱基的缺失与15个碱基的插入，这些变化甚至导致基因氨基酸的突变；M基因和ORF3基因的毒株变化与最近几年中国、越南和韩国等周边国家所流行的毒株大致相同，这样的变化提示着PEDV在免疫压力以及选择压力下华中地区的PEDV流行株存在着多样性的变异趋势。至今，PEDV在我国许多省份的规模化养殖场流行并呈上升趋势。在河南省各规模化养猪场同样普遍存在，导致新生哺乳仔猪大量死亡，现已经成为严重危害养猪业的重大疫情之一。3猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的研究进展3.1猪传染性胃肠炎的病原学研究TGEV长度约为28kb，基因组是一个不分段、正义单链RNA，基因组5’端具有帽子与3’端具有poly(A)尾的结构[40]。病毒基因组包括7个开放阅读框，即ORF1~ORF7，4个结构蛋白包括核衣壳蛋白N，膜结合蛋白M，刺突蛋白S和小膜蛋白E，基因组含有两个较大的开放性阅读框(ORF1a和ORF1b)，基因组结构顺序为：5’-1a-1b-S-3a-3b-sM-M-N-7-3’，ORF3由ORF3a和ORF3b构成，基因7的1个ORF编码病毒的非结构蛋白[41]。TGE病毒粒子的形状圆形或椭圆形，—端通过棒状结构错定于囊膜表面，另一端呈球形分布于病毒囊膜表面[42]。（1）纤突蛋白S(Spike)S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒中最大的结构蛋白，其由1447个氨基酸构成，有研究显示，S蛋白有4个抗原位点（A、B、C、D），其中C位点则有些差异，而A、B和D位点在各变异株之间表现高度保守性[43]。Britton等[44]将S基因重组到痘病毒基因组中，并成功获得表达，用重组病毒对小鼠进行免疫后，可检测到TGEV的中和抗体，用该蛋白制备的单克隆抗体具有良好的反应性。通过一系列的实验论证和科学探索可知，TGEV的纤突蛋白S在识别靶细胞与诱导机体产生抗TGEV的中和抗体方面都起着十分重要的作用，S蛋白还6 具有使病毒蛋白进入细胞浆中达到细胞融合的作用[45-46]。（2）膜蛋白M(Membrane)M蛋白由262个氨基酸构成，其处于病毒粒子的脂质囊膜中，M蛋白决定着病毒成熟及出芽位点和病毒粒子的装配位点，在病毒粒子构建过程中起着极其重要的作用[47]。M蛋白具有可在病毒囊膜中多次跨膜的特点，这就使病毒在进行装配期间很有可能将核衣壳连接到囊膜上，据此有研究推测M蛋白对于病毒的变异也存在与一定的影响[48]。正是由于TGEV的M基因可以作为潜在靶基因，因此M蛋白也可用于基因疫苗的研发，近日有人构建了TGEV-M糖蛋白核酸疫苗，通过用减毒的沙门氏菌感染小鼠，结果表明重组感染沙门氏菌小鼠可以引起抗TGEV的特异性免疫反应[49]。（3）核蛋白N(Nucleoprotein)N基因是由382个氨基酸构成，N蛋白位于病毒粒子内部，组成病毒的核衣壳蛋白[48]。有关报道表明假如使用通过TGEVN蛋白制备得到的抗N蛋白的血清与病毒相互作用，那么病毒粒子在体外进行复制的时候，具有可抑制高达90%的基因组RNA的合成效果，进而证明了在病毒的转录和复制过程中，N蛋白起关键作用[50]。（4）小膜蛋白EE蛋白也称sM蛋白，基因组为246bp，组成了82个氨基酸，E蛋白能与M蛋白互相作用，影响病毒的复制、组装及释放，E蛋白也是有效的表面抗原，根据推测，E蛋白是TGE病毒有效复制的重要组成部分，在调节病毒粒子的装配和释放中起重要作用[51]。3.2猪传染性胃肠炎的流行病学研究猪传染性胃肠炎(TransmissibleGastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(PorcineTransmissibleGastroenteritisVirus，TGEV)引起的以呕吐、水样腹泻为主要临床特征的高度接触性肠道传染性疾病[52-53]。隐形感染TGEV的猪群或病猪在其粪便和分泌物中带有病毒，呼吸道或消化道是仔猪主要的感染途径[54]。我国台湾于1958年第一次发现猪传染性胃肠炎，国内是从1973年起进行TGEV病毒的分离工作，经过电镜观察和生物学试验，认为分离到的华毒（上海）、辽毒（江宁）、吉毒（吉林）是TGEV[55]。猪传染性胃肠炎一年四季都有发生，但是仍有显著的季节性，在早春和寒冷的冬季有较高的发病率[56]。4PDCoV、PEDV和TGEV的诊断技术研究当前用于猪病毒性腹泻病的常用实验室诊断方法主要包括传统的病毒分离与鉴定、血清学方法和分子生物学诊断技术等[57]。4.1免疫荧光法(IF)免疫荧光试验(IF)可包括直接免疫荧光法(FAT)、间接免疫荧光法(IFAT)和免疫过氧化酶技术[58]。林志雄等[59]运用传代毒建立直接免疫荧光法，对PED阳性猪血清检测发现其检出率为89.1%。病毒感染动物后，会在其体内产生特异性中和抗体，并与入侵的病毒粒子发生特异性结合，从而阻碍吸附在病毒机体的敏感细胞，进一步达到抑制病毒入侵的目的，使病7 毒降低或者失去其感染能力[60]。4.2酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA方法是一种经典且研究背景成熟的血清学检测方法，其特点具有特异性强、快速准确、简单易操作等，可用于检测血清抗体或测抗原[61]。Gerber等[62]（2015）用哺乳动物细胞表达PEDVS蛋白的S1区域（1–781aa），并且以此为抗原，建立了用于检测血清及粪便中IgA抗体的ELISA方法，为PEDV的临床诊断及免疫效果评价提供了新的手段。Thachil等[63]人在体外表达纯化猪δ冠状病毒的S1蛋白，将S1蛋白作为抗原包被ELISA板，建立了猪δ冠状病毒的间接ELISA的检测方法，敏感性可达到90.7%，特异性为94.9%。张帆帆等[64]建立了原核表达的PDCoVN蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法，并且应用建立的方法进行了大量血清学检测试验，表明我国不同地区猪群中都存在PDCoV的感染，为PDCoV的流行病学调查及防控提供了重要的依据。4.3免疫组织化学(IHC)免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）是运用抗原抗体特异性结合的原理，利用显色剂（酶、荧光素、同位素等）对标记的抗体通过化学反应显色，以确定细胞组织中抗原（多肽和蛋白质）的方法[65]。Chen等[66]将猪德尔塔冠状病毒编码的M蛋白、N蛋白和S蛋白处理后免疫家兔，利用家兔产生的高免血清作为一抗，成功建立了免疫组化（IHC）的方法用于检测猪δ冠状病毒，单克隆抗体和多克隆抗体均可以作为该方法标记抗体，在南达科他州立大学研究室已经成功获得了PDCoVN蛋白单克隆抗体，为PDCoV的进行IHC试验提供了物质基础。4.4环介导等温扩增技术(LAMP)Notomi在2000年提出RT-LAMP技术即为环介导等温扩增技术，该方法对检测病原的特点是简单、便捷、高特异性、高敏感性及成本低，对于试验条件不高，不需要PCR仪，检测结果仅仅只需要检测者肉眼就能观判定，对猪场中快速鉴别有很大帮助[67]。虽然该方法简便，但是该实验在操作过程中很容易受到气溶胶污染[68]。汤小真等[69]利用PEDVN基因设计特异性的LAMP引物，建立了LAMP的方法用于检测PEDV。高睿泽等[70]根据TGEVN基因序列设计了LAMP引物，建立了TGEV的RT-LAMP快速检测方法。4.5PCR检测技术PCR方法生物优点有特异性强、敏感性高等，随着分子生物学的快速发展，PCR检测方法也有了很大的改进，如定量PCR、RT-PCR、多重PCR、免疫PCR、巢式PCR等，是目前常用的分子生物学检测技术[71]。张利卫等[72]根据PDCoVM基因序列设计引物，建立了SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法用于检测PDCoV，对临床腹泻样品198份进行检测其阳性率为20.7%。Marthaler等[73]发现M基因引物灵敏度高且稳定性好。曹贝贝等[74（]2015）根据PEDV的N基因序列设计了特异性引物，据此建立了SYBRGreenI荧光定量PCR方法用于诊断PEDV，为我国PEDV的定量分析及早期诊断提供了技术手段，该方法还可以用8 于PEDV疫苗效果的评价。张坤等[75]建立了检测TGEV、PEDV和PoRV多重RT-PCR方法，为临床诊断节省时间。韩丽等[76]根据PDCoVN基因和PEDVM基因序列设计引物，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的双重RT-PCR方法，共检测临床样品111份，其中PDCoV有22份阳性样品，阳性率达19.8%，PEDV有27份阳性样品，阳性率是24.3%，PDCoV和PEDV混合感染有10份样品，阳性率是9.0%。刘玲玲等[77]根据PDCoVN基因和TGEVN基因序列设计引物建立了能同时检测PDCoV和TGEV的双重RT-PCR方法，对252份临床样品进行检测，检出PDCoV有31份阳性样品，其阳性率为12.3%，TGEV有12份阳性样品，其阳性率为4.8%，PDCoV和TGEV混合感染有2份阳性样品，阳性率为0.8%。郑丽等[78]根据PDCoVM基因建立了RT-PCR方法，对110份临床样品进行检测，发现阳性检出率为11.8%。Sinha等[79]采用RT-PCR方法，对来自美国18个州的1734份样本进行检测，证明美国出现了PDCoV最晚于2013年8月。Wang等[80]以香港株PDCoVHKU15-155毒株的M基因与N基因作为靶基因，设计了特异性引物，建立了检测PDCoV的RT-PCR方法，第一次确定美国出现了PDCoV。陈建飞等[3]根据PDCoVE和M蛋白基因设计引物建立了RT-PCR方法，在2014年~2015年期间共采集临床腹泻病料232份，运用RT-PCR方法进行检测，发现PDCoV阳性率达10.3%（24/232）。Song等[16]以PDCoVN基因为靶基因建立了巢式RT-PCR的检测方法，在江西地区对2012年~2015年采集的356份猪粪便或肠道样品进行检测，发现PDCoV阳性率为33.7%，PDCoV与PEDV混合感染率是19.7%。9 引言近些年来，猪腹泻性冠状病毒病的流行与爆发日益增多，是目前影响养猪业发展的重要原因之一。PDCoV、TGEV和PEDV是影响猪病毒性腹泻的主要病原，它们可引起猪群相似的临床症状，并且经常以混合感染的情况出现，这给临床诊断和防控工作带来了极大的难度，因此对病毒性腹泻疾病的防治需要在严格控制饲养管理的基础上，找到病原以减少对养猪业的损失。病毒性腹泻病的流行病学调查可找到引起疾病发生的因素，在多个因素存在的情况下，可以抓住引起疾病的主要因素，对病毒性腹泻的防控具有十分重要的意义。本研究利用RT-PCR的检测方法，对2017年至2018年河南省部分地区内不同规模大小的猪场对临床表现有腹泻症状的病料进行RT-PCR检测，通过对PDCoV、PEDV和TGEV在河南省不同地区、不同季节、不同生长时期猪群的检测，为河南省猪病毒性腹泻的流行情况奠定了基础。李衡等[81]对我国华中、华南和西南等地区12个省市的13个流行毒株的主要基因即S基因、M基因和ORF3基因进行了序列测定和分析，其中，S蛋白能介导病毒与细胞的吸附和融合并能诱导宿主产生中和抗体；作为跨膜蛋白的M蛋白是猪流行性腹泻病毒刺激机体产生抗体保护的重要结构蛋白之一，同时在病毒装配和出芽过程中发挥极其重要的作用；ORF3基因为毒力基因，与病毒毒力强弱有关，所编码的蛋白具有离子通道活性。而N蛋白是一种可以抑制干扰素的产生并诱导细胞凋亡的调节蛋白。因此本研究以PEDVORF3基因、S基因、N基因、M基因为切入点，对病毒的遗传变异情况进行研究，从而对我国PEDV的流行做更深一步的研究。与此同时，用DNAstar软件分析流行毒株的基因序列和推导的氨基酸序列之间的同源性以提供了一个重要的理论参考，用于对我们省的分子流行病学的调查和控制。研究分子流行病学调查和病毒主要基因的遗传进化分析为未来的PED防治和疫苗开发提供了理论依据。10 试验一河南省部分地区猪群腹泻类冠状病毒的流行病学调查1材料与方法1.1材料1.1.1病料采集从2017年2月至2018年1月，分别对河南省信阳、濮阳、南阳、驻马店等15个地市46个不同规模大小的猪场进行调查，共采集255份腹泻样品（见表1-1）。样品采集过程中详细记录，包括每一份样品采集的地区、时间和对应的猪群免疫情况。本研究所用到的PDCoV、PEDV和TGEV的阳性对照为河南省动物性食品安全重点实验室保存。表1-1腹泻病料采集统计情况Table1-1Diarrheadiseasecollectionstatistics猪场编号采集时间采集样品数(份)地区12017.2.1712洛阳22017.2.266三门峡32017.3.83濮阳42017.3.1111濮阳52017.3.154安阳62017.3.183漯河72017.3.2012南阳82017.3.246驻马店92017.3.256驻马店102017.4.510濮阳112017.4.84开封122017.4.144濮阳132017.4.58平顶山142017.4.1210平顶山152017.4.1912周口162017.5.133周口172017.5.155南阳182017.5.155南阳192017.5.163濮阳202017.5.222濮阳212017.5.2512南阳222017.5.256南阳232017.5.253南阳242017.6.136驻马店252017.6.222周口11 262017.7.148开封272017.8.64濮阳282017.8.106洛阳292017.8.226濮阳302017.9.256洛阳312017.9.264新乡322017.10.115郑州332017.10.221新乡342017.10.293济源352017.11.265鹤壁362017.11.72信阳372017.11.93濮阳382017.12.82周口392017.12.2010驻马店402017.12.281信阳412017.12.313济源422018.1.13信阳432018.1.44平顶山442018.1.134周口452018.1.1312周口462018.1.195平顶山1.1.2主要试剂在北京全式金生物科技有限公司购买TRizonl试剂；氯仿、异丙醇、75%酒精等试剂为国产或进口试剂；在美国OMEGA生物技术公司购买质粒抽提纯化试剂盒；在南京诺唯赞生物科技有限公司购买Vazyme反转录试剂盒、2×TaqPCRMix酶；在北京博迈德生物技术有限公司购买DM2000+DNAMarker、DM5000+DNAMarker；在生工生物工程(上海)股份有限公司购买快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。1.1.3主要仪器冷藏冰箱购自海尔公司；AB204-N型电子天平购自Mettler-ToledoGroup；NanoDrop-2000超微量紫外分光光度仪；DYCZ-Ш28A型电泳槽购自北京六一仪器厂；PTC-200型PCR仪、-80℃超低温冰箱；紫外凝胶成像系统购自美国SIM公司；移液器购自德国Eppendorf公司；超净工作台购自苏州金净公司。1.1.4主要试剂配制1.1.4.150×TAE配制用电子天平称取242g的Tris和37.2g的Na2EDTA·2H2O，再用800mL的去离子水与其充分混匀溶解，然后加57.1mL的冰醋酸溶液，去离子水定容到1000mL，混匀以备用。使用时稀释至1×TAE即可。1.1.4.21%琼脂糖凝胶使用电子天平量取1g琼脂糖于三角瓶中，然后加入100mL1×TAE的电泳缓冲液，用12 微波炉加热使其充分溶解（约2-3min），自然冷却至不烫手时加入5µL核酸染料，摇晃混匀后，倒入放置好的凝胶槽中，室温使其凝固（20min）。1.1.4.3LB液体培养基NaCl和Tryptone各称取10g，YeastExtract称取5g于锥形瓶中，加入800mL去离子水使其充分溶解，调节PH值至7，然后定容至1000mL，高压后，在4℃保存。1.1.4.4LB固体培养基在100ml的配制好的LB液体培养基中加1.5g琼脂粉，然后进行高压灭菌，冷却至50-60℃时，在无菌环境下倒入灭菌后的平皿中，待其凝固后，放入4℃保存。1.2方法1.2.1样品处理将猪腹泻样品（肠内容物或粪便）分别用PBS（青霉素100U/mL、链霉素100μm/mL）按照1:5的比例稀释，震荡混匀后，4℃5000rpm离心20min，小心吸取上清液，分装EP管中保存在-80℃，用于病料检测。1.2.2引物设计应用Premier5.0基因分析软件，参照GenBank中登录的HKU15-155毒株(登陆号JQ065043.2)PDCoVS基因序列设计一对引物，扩增PDCoVS基因片段大小为543bp；MillerM60毒株(登录号DQ811786.2)TGEVN基因序列设计一对引物，扩增TGEVN基因片段大小为324bp；CV777毒株(登陆号AF353511.1)PEDVM基因序列设计一对引物，扩增PEDVM基因片段大小为298bp；并利用软件合成，引物由武汉奥科引物合成有限公司合成。（见表1-2）表1-2PCR扩增所用引物序列信息Table1-2TheinformationofprimersuquenceforthePCRamplification引物名称序列（5'-3'）退火温度(℃)扩增长度(bp)PrimerSequence(5'-3')Amplicontemperature(℃)Fragmentsize(bp)PDCoV-FGACCCTAAATCTGCCGTTAGAG56543PDCoV-RTGTTGGAGAGGTGAATGCTATGTGEV-FCGCTATCGCATGGTGAAG58324TGEV-RGGATTGTTGCCTGCCTCTPEDV-FCAACAGCAGAAGCCCAAAC58298PEDV-RGCTCACGAACAGCCACATT1.2.3病料总RNA的提取将上述处理好的腹泻样品上清液进行总RNA的提取。按照如下步骤：（1）取处理好的样品上清液400µL于1.5mL的RNase-Free离心管中，加入800µLTrizonl，震荡混匀，室温孵育8~10min；13 （2）加入160µL的氯仿溶液，剧烈震荡20s，然后室温静置5min，4℃离心12000rpm10min；可见样品出现分层：最下层为红色有机相，中间白色层为蛋白质等杂质，最上层为含RNA无色水相。（3）吸取700µL上清液于新的RNase-Free离心管中，并加入700µL的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min,然后4℃、12000rpm离心10min;（4）离心后弃上清，加入1000µL的RPE（1‰DEPC水配制的75%乙醇）溶液用于洗脱RNA，然后10000rpm离心3min;（5）弃上清，短暂离心后吸弃液体，静置5min，最后用30µLRNA溶解液溶解RNA，-80℃保存备用；1.2.4反转录反转录按照诺唯赞HiScript○RⅡReverseTranscriptase反转录试剂盒进行反转录，具体步骤如下:（1）取7μL病毒RNA，加入1μLOligodT23VN于1.5mLEP管中，混匀后置65℃水浴锅中水浴5min。然后迅速放冰盒上静置2min。（2）依次加入10μL2×RTMix，2μLHiScript○RⅡEnzymeMix。吹打混匀后封口，置于50℃水浴锅中45min。（3）放于85℃水浴锅中5min。-20℃保存备用。1.2.5样品常规PCR检测25µLPCR扩增体系加入样品加入量cDNA模板2µL上游引物0.5µL下游引物0.5µL2×TaqPCRMix酶13µLddH2O9µL25µLPCR反应条件循环数：135156℃/温度：95℃94℃72℃72℃58℃时间：5min1min45s40s10min1.2.6电泳将凝胶板小心放入电泳槽中，取6µLPCR产物加入加样孔，同时取4µLDNAMarkerDM2000+作为参照。接通电源后电泳约30min。结束后将凝胶板放入紫外凝胶成像仪下查看14 结果。2结果与分析2.1RT-PCR扩增结果2017年2至2018年1月采集来自15个地区46个不同规模大小的猪场共255份腹泻病料，对所采集的腹泻样品进行PDCoV、PEDV、TGEV的RT-PCR检测，结果PEDV显示目的片段约为298bp；PDCoV显示目的片段约为543bp；TGEV显示目的片段约为324bp（如图1-1），将PCR产物经过克隆后进行碱基测序，结果显示本试验中的克隆部分与参照的PEDV的M基因、PDCoV的S基因和TGEV的N基因核苷酸同源性为100%。2017年2至2018年1月共采集猪场255份腹泻病料，经检测发现，其中PEDVPCR检测有115份阳性病料，阳性率为45.10%；TGEVPCR检测有68份阳性病料，阳性率为26.67%；PDCoV检测有47份阳性病料，阳性率是18.43%(见表1-3)。图1-1PEDV、PDCoV和TGEV目的片段的RT-PCR扩增结果Fig.1-1RT-PCRamplicationofPEDV,PDCoVandTGEVM:DL2000Marker;1,3,5:PEDV,PDCoV,TGEVPCR产物;2:PEDV阴性对照;4:PDCoV阴性对照;6:TGEV阴性对照M:DL2000Marker;1,3,5:PCRproductofPEDV,PDCoV,TGEV;2:NegativecontrolofPEDV;4:NegativecontrolofPDCoV;6:NegativecontrolofTGEV表1-32017~2018采集病料检测结果Table1-3.Thedetectionresultsofthediseasesamplesfrom2017to2018.PEDV阳性数(份）PDCoV阳性数(份）TGEV阳性数(份)时间样品总数(份）(阳性率，%)(阳性率，%)(阳性率，%)2017~2018255115（45.1）47（18.43）68（26.67）15 2.2PDCoV、TGEV和PEDV混合感染情况检测结果2017年至2018年共采集不同规模大小的猪场255份腹泻病料，经检测发现，PDCoV、TGEV和PEDV存在混合感染情况，结果如表1-4和图1-2。所检测样品总的混合感染阳性率为21.96%；其中PEDV和PDCoV混合感染率为14.12%，PEDV和TGEV混合感染率为5.49%，PDCoV和TGEV混合感染率为2.35%和三种病原混合感染阳性率为1.96%。表1-4PDCoV、TGEV和PEDV混合感染情况调查表Table1-4SurveyofCo-infectionwithPDCoV,TGEV,andPEDV病原样品总数阳性数样品阳性率PEDV/PDCoV3614.12%PEDV/TGEV145.49%255TGEV/PDCoV62.35%PEDV/TGEV/PDCoV51.96%总计5621.96%16.00%14.12%14.00%12.00%10.00%8.00%5.49%6.00%4.00%2.35%1.96%2.00%0.00%PEDV/PDCoVPEDV/TGEVTGEV/PDCoVPEDV/TGEV/PDCoV样品阳性率图1-2PDCoV、TGEV和PEDV混合感染情况调查结果柱状图Fig.1-2HistogramoftheresultsoftheinvestigationofmixedinfectionsofPDCoV,TGEV,andPEDV2.3不同地区的猪群腹泻冠状病毒的阳性率2017年2至2018年1月共采集来自15个地区46个不同规模大小的猪场255份腹泻病料，经检测结果如表1-5和图1-3，根据地区划分，安阳、鹤壁、新乡、漯河、三门峡、信阳地区检测发现腹泻冠状病毒感染的阳性率最高达100%；在鹤壁、洛阳、三门峡、郑州地区检测结16 果只存在PEDV的感染；而在开封地区只检测到了PDCoV的感染，在漯河地区发现检测PDCoV的阳性率最高。从整体来看，PEDV在河南地区的感染较为严重，并且分散的区域相对较多。表1-5河南省不同地区猪场检测腹泻阳性率Table1-5DiarrheapositiverateofpigfarmsindifferentareasofHenanprovince.PEDV阳性数(份)TGEV阳性数(份)PDCoV阳性数(份地区检测样品数(份)(阳性率,%)(阳性率,%)(阳性率,%)安阳44(100)4(100)2(50)鹤壁55(100)0(0)0(0)济源63(50)1(16.67)2(33.33)开封120(0)0(0)2(16.67)洛阳2411(45.83)0(0)0(0)漯河33(100)1(33.33)3(100)南阳4322(51.16)6(13.95)8(18.6)平顶山279(33.33)17(62.96)8(29.63)濮阳469(19.57)11(23.91)1(2.17)三门峡66(100)0(0)0(0)郑州52(40)0(0)0(0)新乡55(100)2(40)0(0)信阳66(100)0(0)4(66.67)周口3520(57.14)10(28.57)17(48.57)驻马店2810(35.71)16(57.14)0(0)AB17 CD图1-3河南省不同地区猪场检测腹泻情况分布Fig.1-3DiarrheadistributioninpigfarmsindifferentareasofHenanprovince.A：检测样品阳性分布；B：检测PDCoV阳性分布；C:检测PEDV阳性分布；D:检测TGEV阳性分布；A:positivedistributionoftestsamples;B:detectionofPDCoVpositivedistribution;C:detectionofPEDVpositivedistribution;D:detectionofTGEVpositivedistribution;2.4不同时间PEDV、TGEV和PDCoV检测结果根据不同时间检测腹泻冠状病毒感染情况如表1-6和图1-4，运用RT-PCR方法在7-8月份PDCoV、TGEV和PEDV均未检测到，PEDV在一月份检出率最高达96.43%；PDCoV在一月份检出率最高达82.14%。而PEDV、PDCoV和TGEV在春冬季节感染相对较高，其中PEDV在冬季的检出率高达85.48%，PDCoV和TGEV在春季的检出率分别为14.39%和45.45%。显示腹泻冠状病毒的感染受季节变化影响，在较低环境中容易发生腹泻冠状病毒的感染。18 表1-6不同时间猪场腹泻检测阳性率Table1-6PositiverateofdiarrheadetectioninpigfarmsindifferenttimesPEDV阳性数(份)TGEV阳性数(份)PDCoV阳性数(份)时间检测样品数(份)(阳性率,%)(阳性率,%)(阳性率,%)2017.21814(77.78)0(0)0(0)2017.34516(35.56)18(40)13(28.89)2017.4487(14.58)38(79.17)2(4.17)2017.53918(46.15)4(10.26)4(10.26)2017.682(25)5(62.5)0(0)2017.780(0)0(0)0(0)2017.8160(0)0(0)0(0)2017.9107(70)2(20)0(0)2017.1095(55.56)0(0)0(0)2017.11107(70)0(0)0(0)2017.121612(75)1(6.25)5(31.25)2018.12827(96.43)0(0)23(82.14)图1-4不同时间猪场腹泻检测阳性率分布情况Fig.1-4Distributionofpositiveratesofdiarrheainpigfarmsatdifferenttimes2.5不同生长阶段PEDV、PDCoV和TGEV检测结果运用RT-PCR方法进行PEDV、PDCoV和TGEV病原核酸检测，按照不同生长阶段进行比较，结果见表1-7和图1-5，河南省不同猪群中哺乳仔猪感染PEDV阳性率为75.90%，PDCoV的阳性率为48.19%，而TGEV在哺乳仔猪阶段的阳性率为13.25%。在母猪阶段PEDV的感染也相对较高为27.59%，而PDCoV较低为2.59%。从整体来看，猪群感染腹泻类冠状病毒大多处于哺乳仔猪阶段。19 表1-7不同生长阶段PEDV、PDCoV和TGEV检测阳性率Table1-7PositiveratesofPEDV,PDCoV,andTGEVatdifferentstagesofgrowth猪群PEDV阳性数(份)TGEV阳性数(份)PDCoV阳性数(份)检测场数检测样品数(份)阶段(阳性率,%)(阳性率,%)(阳性率,%)哺乳仔猪208363(75.9)11(13.25)40(48.19)保育猪95620(35.71)27(48.21)4(7.14)母猪1711632(27.59)30(25.86)3(2.59)图1-5不同生长阶段PEDV、PDCoV和TGEV检测阳性率Fig.1-5PositiverateofdetectionofPEDV,PDCoVandTGEVatdifferentgrowthstages2.6河南省对腹泻冠状病毒免疫和未免疫猪场感染情况对不同猪场免疫情况进行调查如表1-8和图1-6。经调查发现，未经免疫的猪场感染PDCoV、PEDV和TGEV的阳性率均较高，分别为20.88%、54.40%和34.07%。免疫的猪场（免疫过PEDV和TGEV）感染PEDV阳性率为21.92%和感染TGEV的阳性率为8.22%。通过数据显示，免疫的猪场尽管感染的阳性率有所降低，但是仍然存在腹泻冠状病毒的感染。20 表1-8河南省不同猪场对腹泻冠状病毒免疫情况调查表Table1-8ImmunestatusofdiarrheacoronavirusindifferentpigfarmsinHenanProvincePEDV阳性数(份)TGEV阳性数(份)PDCoV阳性数(份)免疫情况样品数(份)(阳性率,%)(阳性率,%)(阳性率,%)免疫7316(21.92)6(8.22)9(12.33)未免18299(54.4)62(34.07)38(20.88)60.00%54.40%50.00%40.00%34.07%30.00%21.92%20.88%20.00%12.33%8.22%10.00%0.00%免疫未免PEDV阳性率TGEV阳性率PDCoV阳性率图1-6河南省不同猪场对腹泻冠状病毒免疫情况调查Fig.1-6ImmunestatusofdiarrheacoronavirusindifferentpigfarmsinHenanProvince3.结论与讨论2014年新发的PDCoV开始对我国养猪业造成影响，因为与TGEV和PEDV有极其相似的临床症状，因此猪群感染PDCoV后，很容易引起混淆，它们均可造成猪群严重腹泻，呕吐等症状，已经制约我国养猪业的发展。本实验利用PCR检测方法，对2017年至2018年期间采集的255份来源于河南省部分地区的腹泻病料进行检测，检测出PEDV有115份阳性病料，阳性率为45.10%；检测出PDCoV有47份阳性病料，阳性率为18.43%；检测出TGEV有68份阳性病料，阳性率为26.67%。结果显示在河南省地区已经存在新发的PDCoV，这可能会在对猪发生腹泻类冠状病毒的防治上产生一定的影响。根据地区划分，安阳、鹤壁、新乡、漯河、三门峡、信阳地区检测发现腹泻冠状病毒感染的阳性率最高达100%；由此可见，腹泻冠状病毒对河南部分地区危害严重，应加强对其重视，提早做好防范措施。通过在不同时间采集的腹泻样品调查中发现，PDCoV、TGEV和PEDV的感染情况在7-8月份均未检测到，而PEDV在其他月份均有检出，其中在1月份检测到的阳性率最高；PDCoV在春冬季节感染相对较高，这将预示着PDCoV的感染可能与季节变化有关。通过21 检测发现TGEV、PDCoV和PEDV存在混合感染，所检测样品总的混合感染阳性率为21.96%；其中PEDV和PDCoV、PEDV和TGEV、PDCoV和TGEV的混合感染率分别为14.12%、5.49%和2.35%，同时在检测过程中发现PDCoV、PEDV和TGEV三者混合感染的阳性率为1.96%。混合感染的存在极大的增加了对其防治的难度，应密切关注猪群的变化情况，并尽早做出应对方案以减少其造成的经济损失。根据猪群生长阶段划分，新生仔猪PDCoV阳性率最高为48.19%，其次是保育猪为7.14%，最低的是母猪为2.59%。PEDV在哺乳仔猪、保育猪和母猪的阳性率分别为75.90%、35.71%和27.59%。表明PDCoV和PEDV在哺乳仔猪阶段感染最为严重，由于哺乳仔猪自身免疫系统不健全，这就造成对哺乳仔猪危害严重且一旦发病难以控制的原因之一。在对不同猪场腹泻冠状病毒免疫情况调查中发现，未经免疫的猪场感染PDCoV的阳性率为20.88%、PEDV的阳性率为54.40%和TGEV的阳性率34.07%。免疫的猪场（免疫过PEDV和TGEV）感染TGEV的阳性率为8.22%和PEDV的阳性率为21.92%。通过数据显示，免疫的猪场尽管感染腹泻冠状病毒的阳性率有所降低，但是仍然存在腹泻冠状病毒的发生。这表明使用疫苗免疫可以起到一定的效果，但可能还受到其他因素的影响，如体质差异、混合感染、疫苗和饲养管理等。免疫的猪场对PDCoV的感染有所降低，其原因还有待更深一步的研究。22 试验二PEDV河南流行株S基因遗传进化分析1材料与方法1.1材料1.1.1病料与菌株本试验所用的样品为2017年2月至2018年1月期间，从河南省15个地区不同规模大小的猪场共255份腹泻病料。根据试验一检测结果，从中挑取有代表性的地区、不同时间、不同猪场的18份阳性样品用于扩增PEDVS基因全长。1.1.2主要试剂本试验中所用的主要试剂同试验一1.1.2。1.1.3主要仪器设备本试验中所用的仪器设备同试验一1.1.3。1.2方法1.2.1引物设计引物设计参考经典株CV777基因序列（登录号AF353511.1），采用Primer5.0分析软件，针对S（S1、S2）基因区域设计了2对扩增引物。引物S1-F/S1-R扩增片段包含PEDVS1全长序列，扩增片段大小是2325bp；引物S2-F/S2-R扩增片段包含PEDVS2全长，扩增片段为2150bp；如表2-1。表2-1PCR扩增引物Table2-1TheprimersusedforPCRamplification引物序列(5’-3’)片段长度(bp)PrimerSequence(5’-3’)Lengthofproduct（bp）PEDVS1FAGTGGCGCTGTGATTGA2325PEDVS1RTAGGCGTGCCAGTAATCAACPEDVS2FTGATTACTGGCACGCCTAAA2150PEDVS2RCCGTCACATTTGAAGCTTGTC1.2.2病毒RNA的提取及反转录将采集的18份猪腹泻样品用PBS（青霉素100U/mL、链霉素100μm/mL）按照1:5的比例稀释混合，涡旋振荡，5,000rpm离心20min，将上述处理的肠内容物和粪便上清液进行总RNA的提取。具体步骤见试验一1.2.3。并利用诺唯赞反转录试剂盒进行反转录：取7μLRNA与1μL的Oligo(dT)23混合，65℃热激5min，并迅速冰浴5min，依次加入23 ○R10μL2×RTMix，2μLHiScriptⅡEnzymeMix，组成20μL体系，混匀后封口，置于50℃水浴45min。最后85℃5min反应后获得cDNA模板，可直接用于PCR反应。1.2.3PEDVS基因的RT-PCR扩增PCR反应体系：加入样品加入量cDNA模板2µL上游引物0.5µL下游引物0.5µL2×TaqPCRMix酶13µLddH2O9µL25µLPEDVS1/S2PCR反应条件：循环数：1351温度：95℃94℃55℃72℃72℃时间：10min30s30s2min10min待PCR程序完成，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.4PCR产物的回收纯化根据DNA凝胶回收试剂盒说明书将对应的目的片段进行回收。（1）从琼脂糖凝胶中切下目的片段条带，放入高压过的EP管中，称取净重；（2）加入1-2倍体积的BufferPG（如凝胶重100mg，等同于100μL，以此类推）；（3）50℃水浴10min，为了确保胶块充分溶解，期间间隔2~3分钟温和的颠倒离心管；（4）柱平衡：向吸附柱中（在收集管内）加入200μLBufferPS，然后12000rpm离心2分钟，弃去收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管；（5）将步骤（3）所得的溶液加入到吸附柱中，室温放置2min，然后12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体；（6）加入750μLBufferPW于吸附柱，然后12000rpm离心1min，弃去收集管内的废液；（7）然后12000rpm离心1min，弃去收集管中的液体，室温静置数分钟，尽量晾干；（8）将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加50μLBufferEB，室温放置2min，最后12000rpm的离心1min，得到DNA。1.2.5回收纯化的DNA与pMD18-T载体连接将胶回收的目的DNA片段与pMD18-T载体进行连接，连接反应体系为：24 SolutionI5μLpMD18-T载体0.5μLDNA4.5μL10μL将上述反应体系混匀后16℃连接槽中过夜（约15h），连接产物直接用于转化。1.2.6连接产物的转化（1）取5µL连接产物加入50µLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min。（2）然后42℃水浴90s，再立即冰浴15min。（3）加入950µLLB液体培养基（不含氨苄青霉素，Amp），37℃振荡培养（150~210rpm）1h，使菌液复苏并表达抗性。（4）37℃摇菌培养30min左右时，向含Amp(100µg/mL)的LB固体培养平皿上加入42µLX-gol(20mg/mL)和42µLIPTG(20mg/mL)，涂布均匀，避光放置在超净工作台。（5）将37℃培养60min之后的菌液，8000rpm离心5min，无菌弃上清，用50µLLB液体培养基（不含Amp）重新悬浮。（6）无菌条件下将重悬液滴加到固体LB（含Amp）培养板上，涂布均匀。（7）将培养板放置37℃培养箱中正放培养30min，再倒置培养14~16h。准备挑斑。1.2.7重组质粒的提取挑取步骤1.2.6培养板取单个菌落数个，分别接种于5mL的LB液体（培养基含Amp100µg/mL)中，37℃震荡培养12~16h。按质粒提取试剂盒说明书进行质粒的提取，具体操作步骤如下：（1）取4mL菌液12000rpm离心1min，弃上清，收集菌体，加入600µL菌液重悬；（2）加入100µLBufferL2，温和上下颠倒溶液10次，溶液变为澄清的紫色，裂解时间不要超过2min；（3）加入350µLBufferN3（确认已加过RNaseA），立即上下颠倒混匀，至紫色溶液变为黄色并由黄色沉淀形成；（4）12000rpm离心5min后，吸取上清至新的EP管中，加入200µL异丙醇，上下颠倒使其混匀；（5）将混合液转入吸附柱，12000rpm离心15s后,弃去收集管中废液，分批重复次操作直至样品全部上完；加入150µLBufferPB，12000rpm离心15s；（6）加入400µLBufferPW（确保已加入无水乙醇），然后12000rpm离心1min；（7）将吸附柱放入新的收集管中，向吸附膜中间部位悬空加入50µLBufferEB，室温放置2min，12000rpm离心1min，收集管内即为重组质粒。1.2.8PEDVS基因组序列的测定及遗传变异分析将提取的质粒和选取的PCR产物送去武汉奥科引物合成有限公司进行测序。对完成测25 序的基因序列进行比对分析，利用DNAStar软件处理测序所得PEDVS基因并与GenBank上登录的PEDV参考流行毒株（表2-2）进行核酸序列比对及同源性分析，分子进化树用MEGA6.0软件建立，进化树的可靠性用bootstrap进行检验，重复1000次。表2-2PEDVS参考序列Table2-2PEDVSreferencesequences毒株登录号国家登录时间StrainGenBankCountryTimeCH/HNZZ47/2016KX981440China/Henan2016CH/HNLH/2015KT199103China/Henan2015CH/HNAY/2015KR809885.1China/Henan2015CH/HNQX-3/14/2016KR095279.1China/Henan2016CH/ZMDZY/11/2013KC196276.1China/Henan2013CH/85-7-mutant1/2016KX839247.1China/Nanjing2016CH/FJZZ-9/2012KC140102.1China/Fujian2012XY2013KR818832.1China/Guangdong2015GD-B/2012JX088695.1SouthChina2012LZW/2014KJ777678.1China/Beijing2014SD-M/2012JX560761.1China/Shandong2012AH2012KC210145.1Ching/Nanjing2012KNU-1305/2013KJ662670.1Korea2013KNU/141112/P5/2015KR873434.1SouthKorea2015MYZ-1/JPN/2013LC063846.1Japan2015OKY-1/JPN/2014LC063847.1Japan2015KCH-2/JPN/2014LC063845.1Japan2015CV777AF353511.1Switzerland2001USA/Oklahoma466/2014KR265845.1USA2016USA/MEX/104/2013KJ645708.1USA2014USA/Colorado420/2014KR265812.1USA20162结果与分析2.1样品扩增结果本试验从河南省不同规模的猪场采集255份临床腹泻样品，从运用RT-PCR方法检测出PEDV阳性样品中选取18份对S基因进行扩增，结果见图2-1，其中S1基因扩增产物约为2300bp；S2基因扩增产物约为2100bp。通过对阳性产物进行送奥科引物合成有限公司测序，并对其进行测序拼接和比对，与预期结果一致，依照样品采集地区分别命名，见表2-3。26 图2-1PEDVS1、S2基因PCR扩增结果Fig.2-1PCRamplificationofPEDVS1andS2genesM：DL5000Marker；S1：S1基因目的片段PCR产物；S2：S2基因片段PCR产物；1，2：阴性对照M:DL5000Marker;S1:S1genefragmentPCRproduct;S2:S2genefragmentPCRproduct;1,2:negativecontrol表2-3本研究中PEDVS基因序列样品信息Table2-3TheinformationofPEDVSgenesequencesinthisstudy毒株名称来源地区采样时间StrainnameSourceareaSamplingtimeCH-XinY-G30/2018信阳，河南2018.1CH-ZKfugou-377/2018周口，河南2018.1CH-ZKluyi-373/2018周口，河南2018.1CH-zmd-G9/2017驻马店，河南2017.12CH-HBs-21/2017鹤壁，河南2017.11CH-LHS-G38/2017漯河，河南2017.3CH-NYS-G40/2017南阳，河南2017.3CH-PDSLS-3L/2018平顶山，河南2018.1CH-XinY-11/2017信阳，河南2017.11CH-ZKTKS-G14/2017周口，河南2017.6CH-hb-13/2017鹤壁，河南2017.11CH-Jiyuan2/2017济源，河南2017.1CH-PDSYX-G37/2018平顶山，河南2018.1CH-Xinxiang-1C/2017新乡，河南2017.9CH-XinY-G23/2017信阳，河南2017.12CH-AY2/2017安阳，河南2017.3CH-ZK/2017周口，河南2017.4CH-ZZ/2017郑州，河南2017.1027 2.2PEDVS基因测序比对分析2.2.1PEDVS基因核苷酸与氨基酸序列分析由表2-4和2-5可知，本试验得到的18株PEDVS地方流行株与国内外参考毒株进行核苷酸与氨基酸同源性分析。结果显示：本实验的18株地方流行株之间的核苷酸氨基酸同源性分别为95.3~100%和95.2~100%；与河南省往年毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为95.4~99.2%和95.1~99.1%；与中国其他地方流行株的核苷酸和氨基酸的同源性为93~98.9%和92~98.8%；与韩国毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性为96.1~99%和95.6~98.9%；与日本毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性为95.4~99.5%和95.1~99.6%；与经典毒株CV777之间的核苷酸和氨基酸同源性为93.8~95.8%和93.2~96.3%。表2-4本试验中PEDVS基因与其他地区毒株核苷酸同源性分析Table2-4AnalysisofnucleotidehomologybetweenPEDVSgeneandotherstrainsinthisexperiment核苷酸同源性/%毒株Nucleotidehomology/%Strain中国中国河南美国韩国日本CV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapan本研究的93~98.995.4~99.295.9~9996.1~9995.4~99.593.8~95.8所有毒株表2-5本试验中PEDVS基因与其他地区毒株氨基酸同源性分析Table2-5AnalysisofaminoacidhomologybetweenPEDVSgeneandotherstrainsinthisexperiment氨基酸同源性（%）Aminoacidhomology(%)毒株中国中国河南美国韩国日本StrainCV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapanCH-zmd-G9/201794.9~9695.4~96.195.9~96.296.1~96.299.696.3CH-ZZ/201792.1~98.896~98.698.7~99.199~99.196.1~96.293.5CH-AY2/201792.1~98.695.8~98.998.4~98.898.8~98.896~96.193.5CH-hb-13/201794.8~95.195.1~95.895.6~95.995.8~95.999.396.2CH-HBS-21/201794.8~95.195.1~95.895.6~95.995.8~95.999.396.2CH-LHS-G38/201791.9~98.395.6~98.798.2~98.698.6~98.695.8~95.993.3CH-PDSYX-G37/201894.8~95.995.4~9695.8~96.196~96.199.5~99.696.2CH-Xinxiang-1C/201792~9895.3~98.497.7~98.198.195.6~95.793.3CH-XinY-G23/201792.1~98.695.9~98.998.5~98.898.8~98.995.9~9693.4CH-Jiyuan2/201794.4~95.595.1~95.795.4~95.795.6~95.798.7~98.995.828 CH-XinY-G30/201892.4~98.195.5~98.497.8~98.198.195.3~95.493.6CH-XinY-11/201792.1~98.495.9~98.898.3~98.698.5~98.695.7~95.893.4CH-PDSLS-3L/201894.7~95.895.2~95.995.7~95.995.999.3~99.496.1CH-NYS-G40/201792.2~98.896.1~99.198.5~98.998.8~98.995.9~9693.6CH-ZK/201792.1~98.695.8~98.898.2~98.698.696~96.193.5CH-ZKfugou-377/201892~98.695.8~98.798.4~98.698.5~98.695.6~95.793.3CH-ZKluyi-373/201892.1~98.395.6~97.998.2~98.598.4~98.595.6~95.793.2CH-ZKTKS-G14/201792.1~97.995.4~98.197.6~97.997.8~97.995.1~95.293.52.2.2PEDVS基因核苷酸及氨基酸序列分析利用DNAstar生物软件，对扩增的18个PEDVS基因与经典毒株CV777核苷酸比对发现，其中本研究的毒株除了CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSLS-3L/2018、CH-PDSYX-G37/2018、CH-zmd-G9/2017，其他毒株在第167处发生G的插入；在第176~182处发生AGGGTGT的插入；在第184~186处发生AAT的插入；在433~434出发生GA的插入；在第183处，CH-ZKfugou-377/2018、CH-ZKluyi-373/2018、CH-ZKTKS-G14/2017、CH-ZZ/2017插入C，CH-AY2/2017、CH-LHS-G38/2017、CH-NYS-G40/2017、CH-Xinxiang-1C/2017、CH-XinY-G23/2017、CH-XinY-G30/2018、CH-XinY-11/2017、CH-ZK/2017插入T；CH-ZKluyi-373/2018、CH-ZZ/2017在第432处发生T的插入，而在CH-ZKfugou-377/2018、CH-ZKTKS-G14/2017、CH-AY2/2017、CH-LHS-G38/2017、CH-NYS-G40/2017、CH-Xinxiang-1C/2017、CH-XinY-G23/2017、CH-XinY-G30/2018、CH-XinY-11/2017、CH-ZK/2017插入C；在第487~492处发生缺失CGTGAT。本研究的18株河南毒株根据核苷酸推导的氨基酸序列与经典毒株CV777相比，如表2-6，在第56位发生G的插入；在第59~62位发生QGVN的插入；在第144~145位发生ND插入；在第163~164位发生RD的缺失；CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSLS-3L/2018、CH-PDSYX-G37/2018、CH-zmd-G9/2017在第163处发生R-Q的突变。氨基酸发生突变多达89处，其中大多数突变位于S1区。表2-6PEDVS基因推导氨基酸差异分析Table2-6AnalysisofPEDVSgenededucedaminoaciddifferences毒株5659606162144145163164Strain-------RDCV777-------RDCH-AY2/2017GQGVNND--CH-hb-13/2017-------Q.CH-HBS-21/2017-------Q.CH-Jiyuan2/2017-------Q.CH-LHS-G38/2017GQGVNND--CH-NYS-G40/2017GQGVNND--29 CH-PDSLS-3L/2018-------Q.CH-PDSYX-G37/2018-------Q.CH-Xinxiang-1C/2017GQGVNND--CH-XinY-G23/2017GQGVNND--CH-XinY-G30/2018GQGVNND--CH-XinY-11/2017GQGVNND--CH-ZK/2017GQGVNND--CH-ZKfugou-377/2018GQGVNND--CH-ZKluyi-373/2018GQGVNND--CH-ZKTKS-G14/2017GQGVNND--CH-zmd-G9/2017-------Q.CH-ZZ/2017GQGVNND--CH85-7-mutant1/2016-------..CHFJZZ-92012GQGVNND--PEDV-S-AH2012GQGVNND--CHHNAY2015GQGVNND--CHHNLH2015GQGVNND--CH/HNQX-3/14/2016G--------CH/HNZZ47/2016GQG--ND--CH/ZMDZY/11/2013GQGVNND--GD-B/2012GQGVNND--LZW/2014GQGVNND--XY2013GQGVNND--SD-M/2012-------Q.KNU-1305/2013GQGVNND--MYZ-1/JPN/2013-------Q.KCH-2-JPN-2014-------Q.KNU-141112-P5/2015GQGVNND--OKY-1-JPN-2014-------Q.USA-Colorado420-2014GQGVNND--USA-MEX-104-2013GQGVNND--USA-Oklahoma466-2014GQGVNND--注：”-”代表缺失2.2.3PEDVS基因的系统发育进化树分析为了进一步了解PEDV河南流行毒株与其他国内外的毒株的关系，将本试验所扩增的18条S基因序列和21条PEDVS的参考毒株基因序列进行比对，并绘制出系统发育进化树（图2-4）。结果显示整体大致可分为三个大群（G1、G2、G3）。其中本研究的18株PEDVS基因序列分别处于G2、G3群中；CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSYX-G37/2018、CH-PDSLS-3L/2018、CH-zmd-G9/2017和三株日本毒株（MYZ-1/JPN/2013、KCH-2-JPN-2014和OKY-1-JPN-2014）共同属于第二群，说明本研究中的这六株与日本毒株的亲缘关系较近；本研究的剩余12株与往年的国内流行毒株、两个韩国毒株30 和三个美国毒株都同处于同一分支，G3群又可分为三个亚群（G3-1、G3-2和G3-3），中国河南往年毒株（CH/HNLH/2015、CH/HNZZ47/2016和CH/HNAY/2015）和CH-Xinxiang-1C/2017、CH-XinY-11/2017、CH-XinY-G23/2017、CH-AY2/2017、CH-LHS-G38/2017、CH-ZK/2017、CH-NYS-G40/2017、CH-ZKfugou-377/2018、CH-XinY-G30/2018、CH-ZKTKS-G14/2017、CH-ZKluyi-373/2018和CH-ZZ/2017共同组成G3-3亚群，说明往年河南毒株与本研究的2017~2018年河南毒株的遗传距离较近；经典毒株CV777与本试验的河南毒株亲缘关系相对较远，其与中国其他地区往年的两个毒株（SD-M/2012和CH85-7-mutant1/2016同属一个分支。图2-4PEDVS基因核苷酸序列的系统进化树Fig.2-4PhylogenetictreeofthenucleotidesequenceofthePEDVSgene注：表示实验室分离的毒株Note:expressthePEDVstrainsinthisstudy31 3结论与讨论为了研究河南地区PEDV毒株近年来的变异情况，本研究在2017~2018年选取河南省不同规模大小的猪场共18个PEDVS全基因的序列，并对其进行测序分析。其S基因之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.3~100%和95.2~100%；与河南地区往年流行毒株的核苷酸和推导氨基酸的同源性分别为95.4~99.2%和95.1~99.1%；与中国其他地方流行株的核苷酸和氨基酸的同源性为93~98.9%和92~98.8%；与韩国毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性为96.1~99%和95.6~98.9%；与日本毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性为95.4~99.5%和95.1~99.6%；与经典毒株CV777之间的核苷酸和氨基酸同源性为93.8~95.8%和93.2~96.3%。本研究结果显示当前中国PEDV流行毒株与经典毒株CV777的同源性相对较低，S基因与中国其他地区早期毒株的S基因相比发生了明显的变化，而与日本毒株的同源性相对较高。本研究的毒株除CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSLS-3L/2018、CH-PDSYX-G37/2018、CH-zmd-G9/2017外，其他毒株在第167处发生G的插入；在第176~182处发生AGGGTGT的插入；在第184~186处发生AAT的插入；在433~434出发生GA的插入；CH-ZKluyi-373/2018、CH-ZZ/2017在第432处发生T的插入，而在CH-ZKfugou-377/2018、CH-ZKTKS-G14/2017、CH-AY2/2017、CH-LHS-G38/2017、CH-NYS-G40/2017、CH-Xinxiang-1C/2017、CH-XinY-G23/2017、CH-XinY-G30/2018、CH-XinY-11/2017、CH-ZK/2017插入C；在第487~492处发生缺失CGTGAT；本研究的18株河南地区毒株根据推导的氨基酸序列与CV777相比发现，在第56位发生G的插入；在第59~62位发生QGVN的插入；在第144~145位发生ND插入；在第163~164位发生RD的缺失；CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSLS-3L/2018、CH-PDSYX-G37/2018、CH-zmd-G9/2017在第163处发生R-Q的突变。氨基酸发生突变多达89处，其中大多数突变位于S1区。本试验所测得的18株S基因经过分析发现均发生有插入、缺失和突变现象，这也可能是当前PEDV疫苗失去保护效力的原因，对流行毒株与国内外毒株之间免疫原性差异的研究，有助于为研制PED疫苗提供理论基础。对S基因序列的遗传进化树分析显示，CH-hb-13/2017、CH-HBS-21/2017、CH-Jiyuan2/2017、CH-PDSYX-G37/2017、CH-PDSLS-3L/2018、CH-zmd-G9/2017和三株日本毒株（MYZ-1/JPN/2013、KCH-2-JPN-2014和OKY-1-JPN-2014）共同属于一个分支，说明本研究中的这六株与日本毒株的亲缘关系较近；经典毒株CV777与本试验18株PEDV毒株遗传距离相对较远。说明河南地区流行毒株与传统的疫苗毒株的S基因相比存在较大差异，这可能是近几年来造成PEDV免疫失败的原因之一。32 试验三PEDVORF3、N、M基因的遗传进化分析1材料与方法1.1材料1.1.1病料与菌株本试验所用的样品为2017年2月至2018年1月期间，从河南省15个地区不同规模大小的猪场采集的255份腹泻病料。根据试验一检测结果，从中挑取有代表性的地区、不同时间、不同猪场的阳性样品25份用于对PEDVORF3、N、M基因的遗传进化分析。1.1.2主要试剂本试验中所用的主要试剂同试验一1.1.2。1.1.3主要仪器设备本试验中所用的仪器设备同试验一1.1.3。1.2方法1.2.1引物设计参考经典株CV777基因序列（登录号AF353511.1），采用Primer5.0引物设计软件，分别针对M、N、ORF3基因区域设计了3对扩增引物。引物M-F/M-R为包含PEDVM基因全长，扩增片段长度为841bp；引物ORF3-F/ORF3-R为包含PEDVORF3基因全长，扩增目的大小为1327bp；引物N-F/N-R为包含PEDVN基因全长，扩增目的片段大小为1417bp。如表3-1。表3-1PCR扩增引物Table3-1TheprimersusedforPCRamplification引物序列(5’-3’)片段长度(bp)PrimerSequence(5’-3’)Lengthofproduct（bp）PEDVNFCCCTCCAGCAAGGTTCAA1417PEDVNRGCAACCCAGACAACTCCAPEDVORF3FCCGTAATACTACAGAGGAGC1327PEDVORF3RATAGCCATCTTGACACCATAPEDVMRTGTAACGCTAACACTCCTT841PEDVMFTGGCGACTGTGACGAAAT1.2.2病毒RNA的提取及反转录将采集的25份猪腹泻样品用PBS（青霉素100U/mL、链霉素100μm/mL）按照1:5的比例33 稀释，涡旋振荡，然后5,000rpm离心20min，将上述处理的肠内容物和粪便上清液进行总RNA的提取。具体步骤见试验一1.2.3。并利用诺唯赞反转录试剂盒将RNA进行反转录。具体步骤见试验一1.2.4。1.2.3PEDV的PCR扩增PCR反应体系：加入样品加入量cDNA模板2µL上游引物0.5µL下游引物0.5µL2×TaqPCRMix酶13µLddH2O9µL25µL引物RT-PCR扩增反应条件：循环数：135156℃/温度：95℃94℃72℃72℃58℃时间：10min30s30s1min10min待PCR程序完成后取5μLPCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。1.2.4PCR产物的回收纯化依照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收相对应的目的片段。1.2.5回收纯化的DNA与pMD18-T载体连接将胶回收产物连接到pMD18-T载体，连接反应体系为：SolutionI5μLpMD18-T载体0.5μLDNA4.5μL10μL将上述反应体系混匀后16℃连接槽中过夜（约15h），连接产物直接用于转化。1.2.6连接产物的转化按照实验室常规方法进行操作，具体步骤见试验二1.2.6。1.2.7重组质粒的提取挑取步骤1.2.6培养板中阳性的单个菌落，分别接种于5mL的LB液体培养基（含Amp100µg/mL)中，37℃过夜培养。然后按美国OMEGA生物技术公司的质粒抽提纯化试剂盒说明书进行质粒的提取。1.2.8PEDVORF3、M、N基因组序列的测定及遗传变异分析34 将提取的质粒和选取的PCR产物送去武汉奥科引物合成有限公司进行测序。对测序正确的基因序列进行比对，利用DNAStar软件对本研究测序所得PEDVM、N和ORF3基因与GenBank上登录的PEDV参考流行毒株（表3-2）进行核酸序列比对及同源性分析，分子进化树用MEGA6.0进行建树，进化树的可靠性用bootstrap进行评价，重复次数为1000次。表3-2PEDVORF3、M和N参考序列Table3-2PEDVORF3,M,andNreferencesequences毒株登录号国家登录时间StrainGenBankCountryTimeCH/HNZZ47/2016KX981440China/Henan2016CH/HNLH/2015KT199103China/Henan2015CH/HNAY/2015KR809885.1China/Henan2015CH/HNQX-3/14/2016KR095279.1China/Henan2016CH/ZMDZY/11/2013KC196276.1China/Henan2013CH/85-7-mutant1/2016KX839247.1China/Nanjing2016CH/FJZZ-9/2012KC140102.1China/Fujian2012XY2013KR818832.1China/Guangdong2015GD-B/2012JX088695.1SouthChina2012LZW/2014KJ777678.1China/Beijing2014SD-M/2012JX560761.1China/Shandong2012AH2012KC210145.1Ching/Nanjing2012KNU-1305/2013KJ662670.1Korea2013KNU/141112/P5/2015KR873434.1SouthKorea2015MYZ-1/JPN/2013LC063846.1Japan2015OKY-1/JPN/2014LC063847.1Japan2015KCH-2/JPN/2014LC063845.1Japan2015CV777AF353511.1Switzerland2001USA/Oklahoma466/2014KR265845.1USA2016USA/MEX/104/2013KJ645708.1USA2014USA/Colorado420/2014KR265812.1USA20162结果与分析2.1样品扩增结果本试验从2017~2018年河南省15个地区检测出115份PEDV阳性样品。从中选择了25份阳性样品对ORF3基因、M基因、N基因进行遗传进化分析。运用RT-PCR检测方法对ORF3基因、M基因和N基因进行PCR反应，结果见图3-1；其中M基因扩增产物约为35 800bp；N基因扩增产物约为1500bp；ORF3基因扩增产物约为1300bp。通过对阳性产物进行扩增，并对其进行测序和比对，与预期结果一致，根据样品采集地点分别命名，见表3-3。图3-1PEDVM、N和ORF3基因PCR扩增结果Fig.3-1PCRamplificationofPEDVM,NandORF3genesM：DL2000Marker；1：M基因PCR扩增片段；3：N基因PCR扩增片段；5：ORF3基因PCR扩增片段；2，4，6：阴性对照M:DL2000Marker;1:MgenePCRamplificationfragment;3:NgenePCRamplificationfragment;5:ORF3genePCRamplificationfragment;2,4,6:negativecontrol表3-3本研究中PEDVORF3、M和N基因序列样品信息Table3-3SampleinformationofPEDVORF3,M,andNgenesequencesinthisstudy毒株名称来源地区采样时间StrainnameSourceareaSamplingtimeCH-AY-1/2017安阳，河南2017.3CH-AY-2/2017安阳，河南2017.3CH-ZMD-G9/2017驻马店，河南2017.12CH-ZMD-G10/2017驻马店，河南2017.12CH-XinX-2C/2017新乡，河南2017.9CH-XinX-1C/2017新乡，河南2017.9CH-LH-1/2017漯河，河南2017.3CH-ZKFG-374/2018周口，河南2018.1CH-ZKLY-373/2018周口，河南2018.1CH-ZKFG-377/2018周口，河南2018.1CH-ZKLY-370/2018周口，河南2018.1CH-XYHC-G23/2017信阳，河南2017.12CH-HEB-13/2017鹤壁，河南2017.11CH-HEB-21/2017鹤壁，河南2017.1136 CH-JY-2/2017济源，河南2017.1CH-JY-3/2017济源，河南2017.1CH-XYBsq-G29/2018信阳，河南2018.1CH-XYBSQ-G30/2018信阳，河南2018.1CH-PDSYX-G34/2018平顶山，河南2018.1CH-PDSYX-G37/2018平顶山，河南2018.1CH-NY-1/2017南阳，河南2017.3CH-NY-7/2017南阳，河南2017.3CH-XinY-11/2017信阳，河南2017.11CH-ZK-G14/2017周口，河南2017.6CH-PDSLS-2L/2018平顶山，河南2018.12.2PEDVORF3基因测序比对分析2.2.1PEDVORF3基因核苷酸与推导氨基酸同源性分析如表3-4和3-5所示，PEDVORF3基因经CLUSTALW软件分析，得出25株河南地区毒株ORF3序列之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95%~100%和95.6%~100%；将本研究所得的ORF3序列与2013~2016年河南地区毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为91.6%~99.7%和95.4%~100%；与中国其他地区毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.6%~99.7%和96.5%~100%；与经典毒株CV777之间核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%；与韩国毒株的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.6%~99.9%和96.4%~100%；与日本毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为95.9%~99.9%和96.9%到100%。表3-4本试验中PEDVORF3基因与其他地区毒株核苷酸同源性分析Table3-4AnalysisofnucleotidehomologybetweenPEDVORF3geneandotherstrainsinthisexperiment核苷酸同源性/%毒株Nucleotidehomology/%Strain中国中国河南美国韩国日本CV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapan本研究所95.6~99.791.6~99.795.5~99.895.6~99.995.9~99.995.2~97.5有毒株37 表3-5本试验中PEDVORF3基因与其他地区毒株氨基酸同源性分析Table3-5AnalysisofaminoacidhomologyofPEDVORF3genewithotherstrainsinthisexperiment氨基酸同源性（%）Aminoacidhomology(%)毒株中国中国河南美国韩国日本StrainCV777ChinaHenan,ChinaAmericaKoreaJapanCH-ZKLYO-370/201897.8~98.797.2~98.798.2~98.798.2~98.798.795.1CH-ZKLYO-373/201897.8~98.797.2~98.798.2~98.798.2~98.798.795.1CH-ZMDO-G9/201798.7~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.196.4CH-ZMDO-G10/201798.7~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.196.4CH-AYO-1/201798.2~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.195.6CH-AYO-2/201798.2~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.195.6CH-HEB-13/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-HEBO-21/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-JYO-2/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-JYO-3/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-LH-1/201798.7~99.698.1~99.699.1~99.699.1~99.699.696.9CH-NY-1/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-NY-7/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-PDSLSO-2L/201898.7~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.196.4CH-PDSYX-G34/201898.7~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.196.4CH-PDSYX-G37/201898.7~99.197.7~99.198.7~99.198.7~99.199.196.4CH-XinX-1C/201798.2~99.197.7~99.199.198.7~99.199.195.6CH-XinXO-2C/201798.2~99.197.7~99.199.198.7~99.199.195.6CH-XinYO-11/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-XYBSQ-G30/201896.9~97.895.8~97.396.9~97.396.9~97.397.395.6CH-XYBSQ-G29/201896.9~97.895.8~97.396.9~97.396.9~97.397.395.6CH-XYHCO-G23/201799.1~10098.6~10099.6~10099.6~10010096.4CH-ZKFG-377/201898.7~99.698.1~99.699.1~99.699.1~99.699.696CH-ZKFGO-374/201898.7~99.698.1~99.699.1~99.699.1~99.699.696CH-ZK-G14/201796.5~97.395.4~96.996.4~96.996.4~96.996.995.12.2.2PEDVORF3基因核苷酸及推导氨基酸序列分析25株PEDV河南株均有完整的ORF3开放阅读框。没有发现碱基的缺失或是碱基的插入，只存在点突变，其中本研究中的25株与经典毒株CV777核苷酸对比发现，在第62、162、360位处由T突变为C；第63、237、243、264、274、369、450位由C变为T，这与郑逢梅等[39]的研究结果有相同之处；第54、160、235、301位由G突变为A；第238位处由T变位G；第497位处由A变位G。另外，在第21位处有7个（CH-ZKFG-377/2018、CH-ZKFGO-374/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSLSO-2L/2018、CH-ZMDO-G10/2017和CH-ZMDO-G9/2017）发生由A突变为G；第453、480、38 502位处有8个（CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSLSO-2L/2018、CH-ZMDO-G10/2017和CH-ZMDO-G9/2017）分别发生C变T、T变C和G变A；在第393处有16个（除了CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSLSO-2L/2018、CH-ZMDO-G10/2017和CH-ZMDO-G9/2017）分别发生T变C。其推导的氨基酸序列与CV777相比结果显示，有3个毒株（CH-ZK-G14/2017、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018）在第80位发生点突变，即第80位由V变F，在第182位有9个（CH-ZMDO-G9/2017、CH-ZMDO-G10/2017、CH-PDS25LSO-2L/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-LH-1/2017）毒株发生突变，即由Q变H；如表3-6。表3-6PEDVORF3基因推导的氨基酸差异分析Table3-6AminoAcidDifferencesDerivedfromPEDVORF3Genes毒株192570808193103107165168182StrainKLIVLLICSDQCH-ZKLYO-370/2018M.......N..CH-ZKLYO-373/2018M.......N..CH-ZMDO-G9/2017.........NHCH-ZMDO-G10/2017.........NHCH-AYO-1/2017....F......CH-AYO-2/2017....F......CH-HEB-13/2017...........CH-HEBO-21/2017...........CH-JYO-2/2017...........CH-JYO-3/2017...........CH-LH-1/2017..........HCH-NY-1/2017...........CH-NY-7/2017...........CH-PDSLSO-2L/2018.........NHCH-PDSYXO-G34/2018.........NHCH-PDSYXO-G37/2018.........NHCH-XinX-1C/2017.....ST....CH-XinXO-2C/2017.....ST....CH-XinYO-11/2017...........CH-XYBSQ-G30/2018.SVF...F..HCH-XYBSQO-G29/2018.SVF...F..H39 CH-XYHCO-G23/2017...........CH-ZKFG-377/2018...........CH-ZKFGO-374/2018...........CH-ZK-G14/2017.SVFI..F.NHCHHNQX-314/2016...........CH-HNZZ47-2016...........CH-ZMDZY-11/2013...........XY2013.........N.AH2012...........CH-FJZZ-9,2012S..........GD-B/2012...........LZW/2014..........CHHNAY2015...........CHHNLH2015...........USA-Colorado420-2014...........CV777...F......HUSA-MEX-104-2013............USA-Oklahoma466-2014...........KCH-2-JPN-2014......L....KNU-1305/2013...........KNU-141112-P5/2015...........MYZ-1JPN2013...........OKY-1-JPN-2014...........2.2.3PEDVORF3基因的系统发育进化分析根据图3-2，ORF3基因碱基序列的遗传进化树显示，本研究的所有毒株与PEDV参考毒株可以大致分为3个群，本研究的PEDVORF3基因中，CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-PDSLSO-2L/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-ZMDO-G10/2017、CH-ZMDO-G9/20178株同处于1群，且CH-PDSLSO-2L/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-ZMDO-G10/2017、CH-ZMDO-G9/2017又处于1-1亚群，CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017处于1-2亚群；本研究中剩余17株毒株均与中国其他地区的毒株、往年河南地区的流行株、美国毒株、韩国毒株、日本毒株同属于第三群；其中G2群包括CV777和85-7-mutant1/2016毒株。40 64CH-ZKFG-377/2018CH-ZKFGO-374/2018CH/HNLH/2015KCH-2-JPN-2014USA-Oklahoma466-2014KNU-141112-P5/2015USA-Colorado420-2014CH-ZKLYO-373/201896CH-ZKLYO-370/201843CH/HNAY/2015CH-HNZZ47-2016OKY-1-JPN-201467CH-AYO-2/2017CH-AYO-1/201760CH-XYHCO-G23/201761CH-XinXO-2C/201788CH-XinX-1c/201773MYZ-1/JPN/2013G3USA-MEX-104-2013CH-LH-1/201754LZW/2014CH-ZMDZY-11/20133273CH/HNQX-3/14/2016KNU-1305/20138540AH201252XY201341CH-FJZZ-9/2012GD-B/2012CH-NY-7/201744CH-NY-1/201751CH-JYO-3/201765CH-XinYO-11/20177CH-JYO-2/201713CH-HEBO-21/201764CH-HEB-13/201785-7-mutant1/2016G2100CV77787CH-XYBSQ-G30/201899CH-XYBSQO-G29/2018G1-2CH-ZK-G14/2017CH-PDSYXO-G37/201870G1CH-PDSYXO-G34/2018CH-PDSLSO-2L/2018G1-190CH-ZMDO-G10-2017CH-ZMDO-G9-20170.005图3-2PEDVORF3基因核苷酸序列的系统进化树Fig.3-2PhylogenetictreeofthenucleotidesequenceofthePEDVORF3gene注：表示实验室分离的毒株Note:expressthePEDVstrainsinthisstudy41 2.3PEDVN基因测序比对分析2.3.1PEDVN基因核苷酸与氨基酸同源性分析由表3-7和3-8可知，本研究中25株河南地区PEDV毒株之间的N基因核苷酸及推导氨基酸同源性分别为96.2~100%和93.8~99.8%；其中与河南地区往年流行株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为96.9~99.8%和95~99.8%；与中国其他地区流行株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为94.5~99.3%和93.2~99.5%；与韩国毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为97.3~99.1%和94.6~99.1%；与日本株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为97.2~99.1%和94.3~99.1%；与经典毒株CV777核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为94.7~95.8%和93.2~96.8%。表3-7本试验中PEDVN基因与其他地区毒株核苷酸同源性分析Table3-7NucleotidehomologyanalysisofPEDVNgeneandotherregionsinthisexperiment核苷酸同源性/%毒株Nucleotidehomology/%Strain中国中国河南美国韩国日本CV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapan本研究所94.5~99.396.9~99.897~99.197.3~99.197.2~99.194.7~95.8有毒株表3-8本试验中PEDVN基因与其他地区毒株氨基酸同源性分析Table3-8AnalysisofaminoacidhomologybetweenPEDVNgeneandotherstrainsinthisexperiment氨基酸同源性（%）Aminoacidhomology(%)毒株中国中国河南美国韩国日本StrainCV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapanCH-ZKLYN-373/201895.2~98.697.7~99.398.4~98.698.698.4~98.695.9CH-ZMDN-G9/201796.2~98.697.3~98.298.2~98.498.498.2~98.496.8CH-ZMDN-G10/201796.2~98.697.3~98.298.2~98.498.498.2~98.496.8CH-AYN-1/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-AYN-2/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-HEBN-13/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-HEBN-21/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-JYN-2/201795~98.497.5~99.198.2~98.498.498.2~98.495.7CH-JYN-3/201795.5~98.698~99.398.4~98.698.698.4~98.696.2CH-LHN-3/201795.5~99.598~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-NYBN-7/201793.2~96.495.5~97.196.2~96.496.496.2~96.493.742 CH-NYN-1/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-PDSLSN-2L/201894.1~96.495~95.995.9~96.196.195.9~96.194.6CH-PDSYXN-G34/201896.2~98.497.3~98.298.2~98.498.498.2~98.496.8CH-PDSYXN-G37/201896.2~98.497.3~98.298.2~98.498.498.2~98.496.8CH-XinXBSQN-G29/201892.8~95.293.9~95.594.6~94.894.894.6~94.893.4CH-XinXBSQN-G30/201892.5~94.893.7~95.294.3~94.694.694.3~94.693.2CH-XinXHSN-G23/201795.2~98.697.7~99.398.4~98.698.698.4~98.695.9CH-XinXN-1C/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-XinXN-2C/201795.5~98.998~99.598.6~98.998.998.6~98.996.2CH-XinYN-11/201795.5~98.698~99.398.4~98.698.698.4~98.696.2CH-ZKFGN-374/201895.7~99.198.2~99.898.9~99.199.198.9~99.196.4CH-ZKFGN-377/201895.7~99.198.2~99.898.9~99.199.198.9~99.196.4CH-ZK-G14/201795.5~99.598~98.998.9~99.199.198.9~99.196.2CH-ZKLY-370/201895.2~98.697.7~99.398.4~98.698.698.4~98.695.92.3.2PEDVN基因核苷酸和氨基酸序列分析25株PEDV河南地区毒株均有完整的Ｎ基因开放阅读框，共编码441个氨基酸。经过其与经典毒株CV777核苷酸比对结果如下，在第51、261、327、328、390、471、477、516、702、714、1142、1281位发现由T突变为C；在第84、129、132、153、424、441、621、722、801、813位发现由G突变为A；在第111、126、384、459、909、1056、1223、1239、1249位发现由C突变为T；在第251、948位发现由G突变为C；在第369、725、1080、1190位发现由A突变为T；在第615位发现由T突变为G；在第687、708位发现由A突变为C；在第894位发现由A突变为G；在第1092、1184位发现由T突变为A；在第1192位发现由C突变为A；在第1200、1222位发现由G突变为T；如表3-9，本研究的PEDV毒株所推导的氨基酸与经典毒株CV777相比可知，在第84位处由G突变为A；第123位由K变为N；第142位由A变T；第205位由N变K；第242位由H变L；第381位由L变P；第395位由L变Q；第397位由Q变L；第398位由H变N；第400位由E变D。其中CH-ZMDN-G9/2017、CH-ZMDN-G10/2017、CH-PDSLSN-3L/2018、CH-PDSYXN-G34/2018、CH-PDSYXN-G37/2018、CH-XinXBSQN-G29/2018和CH-XinXBSQN-G30/2018均在第241、252、255位处氨基酸与CV777相比未发生突变，而其他分别突变为R-K、K-R和N-S。43 表3-9PEDVN基因推导的氨基酸差异分析Table3-9AnalysisofaminoaciddifferencesdeducedbyPEDVNgene1122222223333448毒株2401444558999014Strain325612825157802GKANVRHPKNLLQHEVCV777................CH-AYN-1/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-AYN-2/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-HEBN-13/2017ANTK.KL.RSPQLNDSCH-HEBN-21/2017ANTK.KL.RSPQLNDSCH-JYN-2/2017ANTK.KL.RSPQLNDSCH-JYN-3/2017ANTK.KL.RSSQLNDSCH-LHN-1/2017ANTK.KL.RSPQLNDSCH-NYN-7/2017ANTK.KL.RSPQLNDSCH-NYN-1/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-PDSLSN-2L/2018ANTKM.L...PQLND.CH-PDSYXN-G34/2018ANTKM.L...PQLND.CH-PDSYXN-G37/2018ANTKM.L...PQLND.CH-XinXBSQN-ANTKM.L...PQLNDSG29/2018CH-XinXBSQN-ANTKM.L...PQLNDSG30/2018CH-XinXHSN-G23/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-XinXN-1C/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-XinXN-2C/2017ANTK.KLLRSPQLNDSCH-XinYN-11/2017ANTK.KL.RSSQLNDSCH-ZKFGN-374/2018ANTK.KL.RSPQLNDSCH-ZKFGN-377/2018ANTK.KL.RSPQLNDSCH-ZK-G14/2017ANTK.KL.RSPQLN.SCH-ZKLY-370/2018ANTK.KL.RSPQLNDSCH-ZKLYN-373/2018ANTK.KL.RSPQLNDSCH-ZMDN-G9/2017ANTKM.L...PQLND.CH-ZMDN-G10/2017ANTKM.L...PQLND.CH85-7-mutant1/2016................CHFJZZ-92012ANTK.KL.RSPQLN..44 AH2012ANTK.KL.RSPQLN..CHHNAY2015ANTK.KL.RSPQLNDSCHHNLH2015ANTK.KL.RSPQLNDSCHHNQX-314/2016ANTK.KL.RS......CHZMDZY11/2013ANTK.KL.RSPQLND.CH-HNZZ47-2016ANTK.KL.RSPQLNDSGD-B/2012ANTK.KL.RSPQLN..LZW/2014ANTK.KL.RSPQLN.SXY2013A.TKM.LL..PQLND.SD-M/2012A..KM.....PQ.N..KNU-1305/2013ANTK.KL.RSPQLN..MYZ-1JPN2013ANTK.KL.RSPQLN..KCH-2-JPN-2014ANTK.KL.RSPQLN..KNU-141112-P5/2015ANTK.KL.RSPQLN..OKY-1-JPN-2014ANTK.KL.RSPQLN..USA-Colorado420-2014ANTK.KL.RSPQLN..USA-Oklahoma466-2014ANTK.KL.RSPQLN..USAMEX1042013ANTK.KL.RSPQLN..2.3.3PEDVN基因的系统发育进化树分析如图3-3，利用Mega6.0生物软件建立系统发育进化树。本试验的25株河南流行毒株与其他地区毒株大体可分为三个大群。其中CH-XinXBSQN-G29/2018、CH-XinXBSQN-G30/2018、CH-PDSLSN-2L/2018、CH-PDSYXN-G34/2018、CH-PDSYXN-G37/2018、CH-ZMDN-G9/2017和CH-ZMDN-G10/2017七株共同组成G1群；G2群的成员有CH85-7-mutant1/2016、CV777、XY2013和SD-M/2012；本研究中除了G1群的7株外，剩余毒株均处于G3群，属于同群的还有美国毒株、日本毒株、中国毒株和韩国毒株，其中G3群中本研究的大部分毒株与河南地区往年毒株CHHNAY2015、CHHNLH2015、CHHNZZ47-2016的亲缘关系较近。45 CH-XinXN-1C/201788CH-XinXN-2C/20176056CH-AYN-2/2017CH-XinXHSN-G23/201776CH-AYN-1/201753CH-NYN-1/201762CH-LHN-1/2017CH-ZKLY-370/20189837CH-ZKLYN-373/201899CHHNAY201563CHHNLH2015CH-HNZZ47-201647CH-NYBN-7/20177332CH-JYN-2/201777CH-JYN-3/201749CH-XinYN-11/201799CH-HEBN-13/20176691CH-HEBN-21/2017G3CH-ZKFGN-374/20189652CH-ZKFGN-377/201888CH-ZK-G14/2017LZW/2014CHFJZZ-920129367AH2012GD-B/2012USAMEX1042013USA-Colorado420-201499KCH-2-JPN-201468KNU-1305/2013OKY-1-JPN-201467MYZ-1JPN201386KNU-141112-P5/2015USA-Oklahoma466-2014CHZMDZY11/2013CHHNQX-314/2016CH85-7-mutant1/2016100CV7779662SD-M/2012G2XY2013CH-XinXBSQN-G29/201899CH-XinXBSQN-G30/2018CH-PDSLSN-3L/201872CH-PDSYXN-G34/201868G1100CH-PDSYXN-G37/2018CH-ZMDN-G9/201757CH-ZMDN-G10/2017650.005图3-3PEDVN基因核苷酸序列的系统进化树FIG.3-3phylogenetictreeofPEDVNgenenucleotidesequence.注：表示实验室分离的毒株Note:expressthePEDVstrainsinthisstudy46 2.4PEDVM基因测序比对分析2.4.1PEDVM基因核苷酸与氨基酸同源性分析如表3-10和3-11所示，本研究中25株河南地区毒株M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.1~100%和95.6~99.6%；与河南地区往年毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为97.1~99.9%和96~100%；与中国其他地区毒株之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为97.2~99.9%和95.6~100%；与美国毒株之间的核苷酸及氨基酸同源性同源性为98.1~100%和97.4~100%；与日本毒株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.2~99.9%和96.5~100%；与经典毒株CV777之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为97.7~98.2%和95.6~98.7%。表3-10本试验中PEDVM基因与其他地区毒株核苷酸同源性分析Table3-10AnalysisofnucleotidehomologybetweenPEDVMgeneandotherstrainsinthisexperiment核苷酸同源性/%Nucleotidehomology/%毒株中国中国河南美国韩国日本StrainCV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapan本研究所97.2~99.997.1~99.998.1~99.998.2~99.998.2~99.997.7~98.2有毒株表3-11本试验中PEDVM基因与其他地区毒株氨基酸同源性分析Table3-11AnalysisofaminoacidhomologybetweenPEDVMgeneandotherstrainsinthisexperiment氨基酸同源性（%）Aminoacidhomology(%)毒株中国中国河南美国韩国日本StrainCV777ChinaHenan，ChinaAmericaKoreaJapanCH-ZKFG-374/201896.5~99.198.2~99.198.7~99.199.199.198.7CH-ZKFG-377/201896.5~99.198.2~99.198.7~99.199.199.198.7CH-ZK-G14/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-ZKLY-373/201896~98.797.8~98.798.2~98.798.798.798.2CH-ZKLY-370/201896~98.797.8~98.798.2~98.798.798.798.2CH-ZMDM-G9/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-ZMDM-G10/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-AY-2/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-AYM-1/201796.9~10098.2~10010010010098.7CH-HB-13/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-HB-21/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-JY2/201795.6~99.197.4~99.198.7~99.199.199.197.8CH-JY3/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-LH-1/201796.5~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-NY-1/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-NY-7/201796.4~96.596.2~96.598.2~98.596.596.595.6CH-PDSLS-2L/201896~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.247 CH-PDSYX-G34/201896~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-PDSYX-G37/201896~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-XinXiang-1C/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-XinXiang-2C/201796~99.697.8~99.699.1~99.699.699.698.2CH-XinY-11/201795.6~99.197.4~99.198.7~99.199.199.197.8CH-XYBsq-G29/201896~98.796~97.897.4~97.897.897.898.2CH-XYBSQ-G30/201896~98.796~97.897.4~97.897.897.898.2CH-XYhc-G23/201796~99.697.6~99.699.1~99.699.699.698.22.4.2PEDVM基因核苷酸和氨基酸序列分析本试验从2017~2018年获取的25株PEDVM基因序列。与参考毒株CV777经过对核苷酸序列比对结果可知，有7（CH-PDSLSM-2L/2018、CH-PDSYX-G34/2018、CH-PDSYX-G37/2018、CH-ZKFG-374/2018、CH-ZKFG-377/2018、CH-ZMDM-G9/2017、CH-ZMDM-G10/2017）个在第36、297、630位T变C的发生共同突变；在第51、192位发生G变A；在第136、360位发生T变A；在第210、225、234、246位发生C变T；在第615位发生A变C；在第652位发生G变T。推导的氨基酸比对结果发现有4处发生氨基酸的改变，在第17位处有6个（CH-AY-1/2017、CH-HB-13/2017、CH-JY2/2017、CH-JY3/2017、CH-NY-1、CH-NY-7）发生E突变为Q；在第46位处，除了CH-ZKFG-374、CH-ZKFG-377、CH-ZKLYM-370和CH-ZKLY-373外，其他21株发生V-A；在第196位，CH-XYBsq-G29和CH-XYBSQ-G30发生G-S；而在第218位（除了CH-XYBsq-G29和CH-XYBSQ-G30）发生了A突变为S，如表3-12。表3-12M基因氨基酸序列比对Table3-12AminoacidsequencealignmentofMgenes毒株1746196218StrainEVGACV777....CH-PDSLSM-2L/2018.A.SCH-AY-1/2017QA.SCH-AY-2/2017.A.SCH-HB-13/2017QA.SCH-HB-21/2017.A.SCH-JY2/2017QA.SCH-JY3/2017QA.SCH-LH-1/2017.A.SCH-NY-1/2017QA.SCH-NY-7/2017QA.SCH-PDSYX-G34/2018.A.SCH-PDSYX-G37/2018.A.SCH-XinXiang-1C/2017.A.SCH-XinXiang-2C/2017.A.SCH-XinY-11/2017.A.S48 CH-XYBsq-G29/2018.AS.CH-XYBSQ-G30/2018.AS.CH-XYhc-G23/2017.A.SCH-ZK-G14/2017.A.SCH-ZKFG-374/2018...SCH-ZKFG-377/2018...SCH-ZKLYM-370/2018...SCH-ZKLY-373/2018...SCH-ZMDM-G9/2017.A.SCH-ZMDM-G10/2017.A.S85-7-mutant1/2016....CHFJZZ-92012.A.SAH2012.A.SCHHNAY2015.A.SCH/HNLH/2015.A.SCH/HNQX-3/14/2016...SCHZMDZY11/2013.A.SCH-HNZZ47-2016.A.SGD-B/2012.A.SLZW/2014.A.SXY2013.AS.SD-M/2012....KNU-1305/2013.A.SMYZ-1JPN2013.A.SKCH-2-JPN-2014.A.SKNU-141112-P5/2015.A.SOKY-1-JPN-2014.A.SUSA-Colorado420-2014.A.SUSA-Oklahoma466-2014.A.SUSAMEX1042013.A.S2.4.3PEDVM基因的系统发育进化树分析将测得的M基因与GenBank中参考序列构建的系统进化树（图3-4）表明：25株河南毒株与其它地区毒株大致可分为3个大群（G1、G2、G3）。其中CH-XYBsq-G29/2018、CH-XYBSQ-G30/2018和中国广东毒株XY2013同属于G2群，说明本研究中的这两株与中国广东株XY2013的亲缘关系最近；本研究中除了CH-XYBsq-G29/2018、CH-XYBSQ-G30/2018其他毒株均处于G3群中，属于同群的还有中国毒株（包括河南地区往年毒株）、美国毒株、日本毒株和韩国毒株；CV777、85-7-mutant1/2016和SD-M/2012共同组成G1群。49 CHFJZZ-92012USAMEX1042013CH-HNZZ47-2016CHHNAY2015KNU-141112-P52015CH-LH-1-2017USA-Colorado420-2014KCH-2-JPN-2014CH-AY-22017CH-AYM-1201764CH-XYhc-G232017CH-XinXiang-1C20172089CH-XinXiang-2C201714GD-B2012LZW2014PEDV-M-CH/HNLH/2015USA-Oklahoma466-2014OKY-1-JPN-201480CH-HB-13201752CH-HB-21201713G3CH-ZK-G142017CH-JY3-201738CH-NY-1-2017CH-NY-7-20174017CH-JY2201787CH-XinY-11201725KNU-13052013MYZ-1JPN2013CHZMDZY11201311AH201282CH-ZKFG-3742018CH-ZKFG-3772018CH-PDSLSM-2L20186332CH-PDSYX-G342018CH-PDSYX-G37201895CH-ZMDM-G9201772CH-ZMDM-G102017CH-ZKLY-373201883CH-ZKLYM-3702018PEDV-M-CH/HNQX-3/14XY2013CH-XYBsq-G292018G29698CH-XYBSQ-G302018SD-M201285-7-mutant12016G19686CV7770.002图3-4PEDVM基因核苷酸序列的系统进化树FIG.3-4phylogenetictreeofPEDVMgenenucleotidesequence注：表示实验室分离的毒株Note:expressthePEDVstrainsinthisstudy.50 3.结论与讨论根据已有的研究报道，ORF3基因是十分重要的非结构蛋白，尽管其蛋白不参与病毒复制，但是该蛋白的表达可能对PEDV在适应外细胞培养过程中产生影响，与病毒的毒力密切相关。本研究得出25株河南地区毒株ORF3序列之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95%~100%和95.6%~100%；所得的ORF3序列与2013~2016年河南地区毒株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为91.6%~99.7%和95.4%~100%；与经典毒株CV777之间核苷酸及推导氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%；其推导的氨基酸序列与经典毒株CV777相比结果显示，有3个毒株（CH-ZK-G14/2017、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018）在第80位发生点突变，即由V变F，在第182位有9个（CH-ZMDO-G9/2017、CH-ZMDO-G10/2017、CH-PDSLSO-2L/2018、CH-PDSYXO-G34/2018、CH-PDSYXO-G37/2018、CH-XYBSQ-G30/2018、CH-XYBSQO-G29/2018、CH-ZK-G14/2017、CH-LH-1/2017）毒株发生突变，即由Q变H；说明当前流行的河南毒株与早先流行的中国毒株同源性有差异，与经典毒株CV777的同源性相对较低。其中CH-HEB-13/2017、CH-HEBO-21/2017、CH-JYO-2/2017、CH-JYO-3/2017、CH-NY-1/2017、CH-NY-7/2017、CH-XinYO-11/2017、CH-XYHCO-G23/2017与日本毒株氨基酸同源性相对较高，说明它们与日本毒株亲缘关系较近。本研究中25株河南地区PEDV毒株之间的N基因核苷酸及推导氨基酸同源性分别为96.2~100%和93.8~99.8%；其中与河南地区往年流行株之间的核苷酸及推导氨基酸同源性分别为96.9~99.8%和95~99.8%；与经典毒株CV777核苷酸及推导氨基酸的同源性分别为94.7~95.8%和93.2~96.8%。本试验的25株河南流行毒株与其他地区毒株大体可分为三个大群。其中CH-XinXBSQN-G29/2018、CH-XinXBSQN-G30/2018、CH-PDSLSN-2L/2018、CH-PDSYXN-G34/2018、CH-PDSYXN-G37/2018、CH-ZMDN-G9/2017和CH-ZMDN-G10/2017七株共同组成G1群；G2群的成员有CH85-7-mutant1/2016、CV777、XY2013和SD-M/2012；本研究中除了G1群的7株外，剩余毒株均处于G3群，属于同群的还有美国毒株、日本毒株、中国毒株和韩国毒株，其中G3群中本研究的大部分毒株与河南地区往年毒株CHHNAY2015、CHHNLH2015、CHHNZZ47-2016的亲缘关系较近。M基因极其保守可以作为诊断PEDV重要的靶基因之一，其M蛋白具有B细胞表位，可以作为研究预防PED疫苗的候选蛋白[82]。本研究中25株河南地区毒株M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.1~100%和95.6~99.6%；与河南地区往年毒株之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为97.1~99.9%和96~100%；与经典毒株CV777之间的核苷酸及氨基酸同源性分别为97.7~98.2%和95.6~98.7%。本研究结果与刘佳丽等[83]的M基因与CV777之间的同源性的研究结果大致一样。卢冰霞等[84](2015)在对2011-2014年广西地区PEDV检测时，发现M基因序列从氨基酸水平上看，一般同一个猪场或同一个地方流行的PEDV毒株的亲缘关系较近，但也有地域相隔较远，其亲缘关系较近的。将测得的M基因与GenBank51 中参考序列构建的系统进化树发现：25株河南毒株与其它地区毒株大致可分为3个大群（G1、G2、G3）。其中CH-XYBsq-G29/2018、CH-XYBSQ-G30/2018和中国广东毒株XY2013同属于G2群，说明本研究中的这两株与中国广东株XY2013的亲缘关系最近；自2010年末以来，该病引起了中国许多个省份不同规模大小的猪场数以万计的仔猪死亡，严重影响我国的养猪业的发展[36]。对河南地区当前PEDV地方流行毒株进行分子流行病学及病原检测的研究(如对PEDV的S、M、N和0RF3基因的遗传变异研究分析等)，为有效控制与预防猪流行性腹泻的流行提供参考依据。52 全文总结1.通过对河南省不同地区、不同季节和不同猪群的255份腹泻病料进行流行病学调查发现，检测出PEDV有115份阳性病料，阳性率为45.10%；检测出PDCoV有47份阳性病料，阳性率为18.43%；检测出TGEV有68份阳性病料，阳性率为26.67%。结果显示在安阳、鹤壁、新乡、漯河、三门峡、信阳地区检测发现腹泻冠状病毒感染的阳性率最高。PEDV和PDCoV混合感染率较高为14.12%。河南省不同猪群中哺乳仔猪感染PEDV和PDCoV的阳性率均较高，分别为75.90%和48.19%；在河南省地区已经存在新发的PDCoV，这可能会对猪腹泻类冠状病毒的防治造成一定的影响。2.本试验通过对PEDV阳性病料测序，成功获得18株S（S1、S2）基因的全长序列，并对其进行了差异性分析及遗传变异分析。结果显示本研究有部分S基因的河南毒株与日本流行毒株的亲缘关系较近，但整体均与经典毒株CV777相比的遗传距离较远。3.本试验通过对PEDV阳性病料测序，成功获得25株PEDV的ORF3、M、N基因的全长序列，并对其进行了差异性及遗传进化分析。有助于对PEDV在免疫方向深入的研究，为猪流行性腹泻的防治提供参考依据。53 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EPIDEMIOLOGICALSURVEYOFSWINEDIARRHEACORONAVIRUSINSOMEAREASOFHENANPROVINCEANDANALYSISOFITSGENETICEVOLUTIONUSINGPEDVSupervisorProf:WangYabinMasterCandidate:CuiXingeABSTRACTCurrentresearchshowsthatporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),porcinetransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV),andporcineδcoronavirus(PDCoV)arecommonpathogensthatcauseviraldiarrheainpigs.Theyallallowpigsofdifferentgrowthstages.Acutewaterydiarrhoeaandvomitingoccurredinthegroup.Dehydrationresultedinseveredeath,especiallyinsucklingpiglets.Sincethesethreepathogensareindistinguishableinclinicalsymptoms,itisparticularlyimportanttodetectpathogensinsuspectedporcineviraldiarrheacases.ToinvestigatetheprevalenceofviraldiarrheainpigsinHenanProvince,thestudyinvestigatedtheinfectionofdiarrheacoronaviruses(PDCoV,TGEV,andPEDV)inpigsinsomeareasofHenanProvince,andinvestigated25ofthemforPEDV-positivedisease.ORF3,N,andMgeneswereamplifiedandsequenced.EighteenPEDV-positiveSgeneswerealsoamplifiedandsequenced,andweresequencedwithclassicalstrainCV777andthedomesticandforeignepidemicstrains.Geneticevolutionanalysis.1.EpidemiologicalinvestigationofdiarrheacoronavirusinpigsinpartsofHenanProvinceRT-PCRwasperformedon255diarrhealdiseasesamplescollectedfrompigfarmsinsomeareasofHenanProvincefrom2017to2018toanalyzetheprevalenceofPDCoV,PEDVandTGEVinHenanherds.Theresultsshowedthatamong255diarrhealdiseases,115werepositiveforPEDV,accountingfor45.10%,68werepositiveforTGEV,26.67%werepositive,47werepositiveforPDCoV,and18.43%werepositive.TheprevalenceofTGEV,PEDV,andnewPDCoVispresentinmostpigfarmsinHenanProvince.Moreover,thereweredifferentmixedinfectionsamongthethreediarrheacoronaviruses.Amongthem,thecombinedinfectionrateofPEDVandPDCoVwas14.12%,themixedinfectionrateofPEDVandTGEVwas5.49%,andthemixedinfectionrateofPDCoVandTGEVwas2.35%.ThepositiverateofthreepathogenicmixedinfectionsofPEDVandPDCoVandTGEVwas1.96%.Thepositiveratesofcoronavirusinfectionwerealsodifferentindifferentregionswherediarrhealdiseaseswerecollected.Amongthem,thepositiveratesofdiarrhoeacoronavirusinfectionindiarrhealdiseasessubmittedtoAnyang,Hebi,Xinxiang,Luohe,SanmenxiaandXinyangregionswereupto100%.Inthecategoryofinfectedcoronaviruses,onlyPEDVinfectionwasdetectedinHebi,Luoyang,Sanmenxia,andZhengzhou.Twotothreekindsofcoronavirusinfectionswerefoundinotherregions.Overall,PEDVinfectioninHenanwasmoreserious.Andtherearerelativelymanyscatteredareas.Thepositiveratesofcoronavirusatdifferenttimepointswerealsodifferent.ThehighestdetectionratewasinJanuary.PEDVwasashighas96.43%inJanuary.ThePDCoVdetectionratewasashighas82.14%inJanuary,andPDCoV,TGEVandNoPEDVwasdetected.Inaddition,thecoronaviruseshavedifferentinfectionsindifferentstagesofpigs.PDCoVmainlyinfectssucklingpiglets,thepositiverateisashighas48.19%,followedbynurserypigs7.14%,butthesowinfectionrateisonly2.59%;ThepositiveratesofPEDVinsucklingpigletsandnurserypigsandsowswere75.90%,35.71%and27.59%,respectively,indicatingthatPDCoVandPEDVarethemostseriousinfectionsinsucklingpiglets.Theanalysisoftheinfectionratesofimmunizedandnon-immunepigfarmsfoundthatthepositive58 rateofinfectionofPDCoV,PEDVandTGEVinunvaccinatedpigfarmswashigh,being20.88%,54.40%and34.07%,respectively.However,thepositiveratesofPEDVandTGEVininfectedpigfarmsalsoreached21.92%and8.22%,respectively.ThisresultprovidesepidemiologicalinformationforthepreventionandcontrolofswinediarrheacoronavirusinfectioninHenanProvince.2.PhylogeneticanalysisofPEDVSgeneAccordingtothesurveyresultsofswinediarrheacoronavirusinfectioninHenanProvince,selectPEDV-positivematerialsfromrepresentativeregions,differenttimes,anddifferentfarmstoamplifythefulllengthofSgene,andthenanalyzethegeneticevolutionofSgeneaftersequencing.Atotalof18Sgenesequencesweredetectedinthisstudy.Thefragmentsizewasapproximately4150bp.Thenucleotideanddeducedaminoacidhomologybetweenthegenesequenceswas95.3to100%and95.2to100%,respectively.ThenucleotideandaminoacidhomologybetweenthestrainCV777was93.8-95.8%and93.2-96.3%.TheresultsofphylogeneticanalysisofSgenesequencesshowedthatmostofthestrainsinthisstudywereinthesamebranchasthedomesticepidemicstrainsinpreviousyears,twoKoreanstrains,andthreeAmericanstrains.CH-hb-13/2017,CH-HBS-21/2017,CH-Jiyuan2/2017,CH-PDSYX-G37/2018,CH-PDSLS-3L/2018,CH-zmd-G9/2017andthreeJapanesestrains(MYZ-1/JPN/2013,KCH-2-JPN-2014,andOKY-1-JPN-2014)belongtoonebranch,indicatingthatthesixstrainsinthisstudyarecloselyrelatedtoJapanesestrains.3.GeneticandevolutionaryanalysisofPEDVORF3,N,andMgenesInaddition,phylogeneticanalysisofORF3,N,andMgeneswasperformedon25PEDVstrainsofHenan.TheORF3genesequenceofthePEDVstrainwasfoundtoconsistof675nucleotides,allofwhichwerevirulentstrains;thenucleotideanddeducedaminoacidhomologywiththeclassicalstrainCV777was95.2%to97.5%and95.1%,respectively.~96.9%.ThededucedaminoacidsequencecomparedwithCV777showedthattherewerethreepointmutations(CH-ZK-G14/2017,CH-XYBSQ-G30/2018,CH-XYBSQO-G29/2018)atpoint80.Thatis,the80thbitchangesfromVtoF,thereare9inthe182th(CH-ZMDO-G9/2017,CH-ZMDO-G10/2017,CH-PDS25LSO-2L/2018,CH-PDSYXO-G34/2018,CH-PDSYXO-G37/2018,CH-XYBSQ-G30/2018,CH-XYBSQO-G29/2018,CH-ZK-G14/2017,CH-LH-1/2017)mutationsoccur,thatis,fromQtoH;ThephylogenetictreeofthenucleotidesequenceoftheORF3geneshowedthatmostofthestrainstrainsinthisstudybelongedtothesamestrainasthestrainsinotherregionsofChina,thestrainsofHenaninpreviousyears,theAmericanstrain,theKoreanstrain,andtheJapanesestrain..ThenucleotideanddeducedaminoacidhomologybetweentheNgeneofthePEDVstraininthestudywas96.2to100%and93.8to99.8%,respectively;thehomologytothenucleotideanddeducedaminoacidoftheclassicalstrainCV777was94.7respectively.~95.8%,93.2~96.8%.PhylogeneticanalysisrevealedthatmostofthestrainsinthisstudywerecloselyrelatedtothestrainsCHHNAY2015,CHHNLH2015,andCHHNZZ47-2016inpreviousyearsinHenan.Thenucleotideandaminoacidsequenceidentitiesofthe25strainsofMstrainsinHenanwere97.1to100%and95.6to99.6%,respectively.ThenucleotideanddeducedaminoacidhomologiesbetweenthestrainsandtheclassicalstrainCV777were97.7~98.2%and95.6to98.7%.Thededucedaminoacidalignmentresultsshowedthattherewere4aminoacidchanges,andtherewere6atposition17(CH-AY-1/2017,CH-HB-13/2017,CH-JY2/2017,CH-JY3/2017,CH-NY-1,CH-NY-7)EmutationtoQ;atposition46,exceptCH-ZKFG-374,CH-ZKFG-377,CH-ZKLYM-370andCH-ZKLY-373Inaddition,V-Aoccurredin21otherstrains;atposition196,G-SoccurredatCH-59 XYBsq-G29andCH-XYBSQ-G30;andatposition218(exceptCH-XYBsq-G29andCH-XYBSQ-G30)A-S.ThegeneticphylogenetictreeshowedthatthePEDVstraininHenanProvincewasnotinthesamebranchastheclassicalstrainCV777,indicatingthatthereasonthattheoutbreakofporcineepidemicdiarrheaandimmunizationvaccineinpigfarmsisstilldifficulttocontrolmayberelatedtothevariationofmostPEDVHenanepidemicstrains.Keywords:molecularepidemiology;PDCoV;PEDV;RT-PCR;phylogeneticanalysis60