牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用

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论文提交日期：2016.04.28论文答辩日期：2016.06.04学位授予日期：2016.6学科门类：农学答辩委员会主席：高迎春 符号说明MAP:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis副结核分枝杆菌PCR:Polymerasechainreaction,聚合酶链反应IGRA：IFNGamaReleaseAssay，伽马干扰素释放实验SDTH:SkinDelayed-typeHypersensitivity，皮肤变态反应ELISA：enzyme-linkedimmunosorbentassay，聚合酶链式反应CFT：ComplementFixationTest，补体结合实验AGID:agargelimmunodifusion，琼脂凝胶免疫扩散实验dNTP:Deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸bp：Basepair,碱基对DNA：Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸Amp：Ampicillin，氨苄青霉素LB：Luria-bertanimedium，LB-培养基IPTG:isopropyl-β-d-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷BSA：BovineSerumAlbumin，牛血清白蛋白PBS：Phosphatebufferedsaline,磷酸缓冲液OD：Opticaldendity,光密度 目录中文摘要............................................................................................................................................IABSTRACT.......................................................................................................................................III1引言..............................................................................................................................................11.1副结核分枝杆菌与牛副结核病简介......................................................................................11.1.1副结核分枝杆菌................................................................................................................11.1.2牛副结核病在生产上引起的危害以及与人类的关系..................................................11.2牛副结核检测方法...................................................................................................................41.2.1细菌学检测............................................................................................................................41.2.2分子生物学检测..................................................................................................................51.2.3皮肤变态反应（SDTH）......................................................................................................61.2.4IFN-γ释放试验（IGRA）..................................................................................................61.2.5酶联免疫吸附试验（ELISA）...........................................................................................71.2.6补体结合试验（CFT）........................................................................................................71.2.7琼脂扩散试验（AGID）......................................................................................................81.3总结与展望...............................................................................................................................81.4研究目的...................................................................................................................................82材料与方法....................................................................................................................................92.1细菌培养方法的建立...............................................................................................................92.1.1实验材料...............................................................................................................................92.1.2实验方法.............................................................................................................................102.1.3培养基验证.........................................................................................................................112.2副结核特异性片段IS900的PCR方法的建立...................................................................112.2.1实验材料.............................................................................................................................122.2.2实验方法.............................................................................................................................122.3副结核分枝杆菌特异性抗原的克隆、表达与纯化...........................................................142.3.1实验材料.............................................................................................................................142.3.2副结核特异性重组蛋白克隆...........................................................................................162.3.3副结核分枝杆菌重组蛋白的诱导表达与纯化..............................................................20 2.4副结核特异性蛋白MAP1345与MAP0862的串联表达......................................................212.4.1引物设计..............................................................................................................................222.4.2片段扩增与目的片段回收.................................................................................................222.4.3重叠延伸PCR......................................................................................................................222.4.4重组质粒构建与诱导表达...............................................................................................222.4.5SDS-PAGE鉴定...................................................................................................................232.4.6包涵体形式目的蛋白纯化...............................................................................................232.4.7WesternBlot鉴定...........................................................................................................232.5副结核特异性序列人工合成多肽........................................................................................232.6重组蛋白、多肽间接ELISA方法的建立..........................................................................242.6.1实验血清.............................................................................................................................242.6.2实验用试剂与溶液配制....................................................................................................242.6.3主要仪器设备.....................................................................................................................252.6.4间接ELISA操作步骤........................................................................................................252.6.5ELISA条件优化.................................................................................................................252.7细菌分离培养方法对临床样本牛进行检测.......................................................................262.7.1实验材料.............................................................................................................................262.7.2实验方法.............................................................................................................................262.8PCR方法对临床验本牛进行检测......................................................................................272.8.1实验材料.............................................................................................................................272.8.2实验方法.............................................................................................................................272.9ELISA应用..............................................................................................................................282.9.1实验材料.............................................................................................................................282.9.2试验方法.............................................................................................................................282.10皮肤变态反应检测...............................................................................................................292.10.1实验材料...........................................................................................................................292.10.2试验方法...........................................................................................................................292.10.3结果判定步骤..................................................................................................................293结果...............................................................................................................................................303.1副结核培养基制备.................................................................................................................30 3.2基于副结核特异性片段IS900的PCR方法的建立..........................................................313.3副结核分枝杆菌特异性抗原的克隆、表达与纯化..........................................................323.3.1PCR扩增结果......................................................................................................................323.3.2重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析.................................................................................333.3.3Westernblot鉴定结果..................................................................................................363.4ELISA方法的建立.................................................................................................................363.4.1优化后的ELISA条件........................................................................................................363.4.2阴阳性血清临界值的确立...............................................................................................373.4.3特异性试验结果................................................................................................................383.4.4符合性试验.......................................................................................................................383.5牛感染副结核后不同时期几种副结核特异性蛋白的抗体变化规律............................413.6检测方法在临床上的应用.....................................................................................................463.6.1细菌分离培养方法对临床样本牛进行检测..................................................................463.6.2PCR方法对300头临床牛进行检测................................................................................463.6.3ELISA应用..........................................................................................................................473.6.4皮试试验检测山东地区牛...............................................................................................474讨论...............................................................................................................................................484.1细菌分离培养以及PCR鉴定.................................................................................................484.2重组蛋白在血清学诊断中的应用........................................................................................494.3皮肤变态反应检测结果.........................................................................................................515结论...............................................................................................................................................53参考文献.........................................................................................................................................54致谢..................................................................................................................................................60发表文章.........................................................................................................................................62 山东农业大学硕士学位论文中文摘要牛副结核病是由副结核分枝杆菌引起的一种慢性消化系统疾病，副结核分枝杆菌能引起感染牛的产奶量下降、持续性消瘦、顽固性下痢甚至死亡，给畜牧业带来了巨大的经济损失，同时有研究表明该菌与人的克罗恩病有关，因此该病引起了研究人员越来越多的关注。副结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，具有较强的环境抵抗力，牛通常在幼年期经口感染该菌并具有一个较长的亚临床期，后期才表现出临床症状。目前对于牛副结核病尚无有效的治疗方法，及时发现并淘汰感染牛是净化牛场最有效的方法，由于机体感染该菌后存在细胞免疫与体液免疫分离的特点，给该病的及时检测带来了很大困难，前期研究发现该病在感染前期以细胞免疫为主并伴随着间歇排菌，经过2到5年亚临床期后体液免疫应答增强，同时排菌量明显增加，针对感染后的不同时期，几种检测方法的敏感性与特异性存在较大的差异，加之副结核分枝杆菌与牛结核分枝杆菌以及其他环境分枝杆菌存在高度同源性，给牛副结核病诊断带来了很大的困难。所以，建立理想的牛副结核病检测方法有利于及早发现感染牛并及时淘汰出群，对该病在牛场净化具有很大的帮助。基于牛副结核病的免疫学规律，研究副结核病的诊断方法，以及不同诊断方法适用于副结核感染的不同时期具有重要意义。本论文主要研究了牛副结核病原学检测和体液免疫检测方法，并对所建立的方法与常规变态反应进行了比较，分析了各种方法检测的特点。病原学检测方法研究中，本研究将草分枝杆菌用甘油琼脂复苏后，转接到甘油肉汤培养基中扩大培养，采用蒸馏法，结合石油醚反复抽提，成功制备了草分枝菌素。将草分枝菌素按1%加入潘氏培养基中，成功制备适合副结核分枝杆菌生长的培养基。用副结核分枝杆菌参考株P18对制备的培养基进行了验证，结果表明，本研究制备的副结核培养基对副结核分枝杆菌具有良好的培养能力。根据副结核特异性插入序列IS900，设计引物一对特异性引物（IS900F和IS900R），建立了能够检测副结核分枝杆菌的特异性PCR方法，并用4株副结核分枝杆菌，以及牛结核分枝杆菌、草分枝杆菌、禽结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌进行了验证，证实了该方法良好的敏感性和特异性。使用建立的PCR检测方法，对山东地区采集的300份粪便样品进行检测，其中有38份为阳性。血清学检测方法研究中，我们采用大肠杆菌原核系统，克隆表达了5个副结核特异性蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963，将表达产物纯化并定I 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用量后，初步建立针对各蛋白抗体的ELISA检测方法，并用临床样本对5个重组蛋白在血清学诊断中的作用进行研究，结果MAP0862与MAP1345具有较好的诊断价值，对300份临床血清的检测结果表明，两者与IDEXX牛副结核检测试剂盒的符合率分别为94.3%与93.7%。同时还将具有良好抗原性的两个基因MAP0862与MAP1345进行串联表达，并探索串联表达蛋白在血清学诊断中的作用,结果串联表达的MAP0862-1345与两个蛋白在单独存在的情况下诊断效果类似，其与IDEXX副结核检测试剂盒的总符合率为92.7%。使用初步建立的基于不同副结核特异性蛋白的间接ELISA方法对实验室保存的人工感染副结核后不同时期的牛血清进行检测，研究感染后不同时期血清中针对几种特异性蛋白的抗体变化规律。通过对特异性表达蛋白的结构分析，选择各蛋白强抗原表位进行了化学合成，探索合成多肽在血清学诊断中的作用,结果基于MAP0862的2#多肽与基于MAP1345的3#多肽具有良好的诊断价值。对山东某牛场300头青年牛分别用本研究所建立的PCR方法和针对特异性蛋白的ELISA方法，以及经典的皮肤变态反应，商品化ELISA方法进行了检测，结果表明使用不同的检测方法检测结果存在差异。本研究初步建立了适合于牛副结核病诊断的细菌培养、PCR检测和抗体诊断方法。关键字：副结核分枝杆菌；牛副结核病；细菌分离培养；PCR；血清学诊断方法II 山东农业大学硕士学位论文AbstractBovineparatuberculosisisachronicdigestivesystemdiseasescausedbyMycobacteriumavium.subspparatuberculosis(MAP),asaresultoftheserioussymptomsofdairycattleinfectedwithMAP,suchasthedeclineofmilkproduction,losefleshcontinuously,intractablediarrheaandevendeath,Bovineparatuberculosisbringsagreateconomiclosstoanimalhusbandry.There'salsoevidenceshowsthatithasrelationshipswithChron'sdisease,researchersbringsmoreattentionsonthisdisease.MAPisanintracellularbacteriumandhasastrongenvironmentalresistance.Bovineparatuberculosisinyoungcalvesisusuallythroughtheoralrouteandhavealongsubclinicalstage.Theclinicalsymptomsaccursatthelateperiod.CurrentlythereisnoeffectivetreatmentforBovineparatuberculosis,findandknockouttheinfectionbovinesistheeffectivewaytopurificationthedairyfarm.Becausethebodyafterinfectedwiththebacteriahavethefeaturesoftheseparationofcellularimmunityandhumoralimmunity,itbringsalotoftroubletodetectthediseaseintime.AttheearlystageofBovineparatuberculosis,cellularimmunityisthemainimmuneresponsewithbacteriumexcretionintermittently,whilethehumoralimmunityisenhancedwithbacteriumexcretiongraduallyincreasedaftera2-5yearssubclinicalstage.Thesensitivityandspecificityofdiffererntdetectionmethodsvariesalotaimingatdifferentstagesafterinfection,togetherwiththehighlyhomologousbetweenMAPandMycobacteriumbovies,there'sabigtroubleindeseasedignosis.EstablishBovineparatuberculosisdetectionmethodisbeneficialtofindcattleinearlyinfectionandeliminateintime,togreatlyhelppurifythedairyfarm.ResearchofdiagnosismethodsofBovineparatuberculosisanddifferentdiagnosissuitablefordifferentstagesafterinfectionisofgreatimportanceintermsofimmunelawofBovineparatuberculosis.ThisarticleismainlyfocusedonpathogendetectionandimmunedetectionofBovineparatuberculosis,andcomparethesedetectionmethodsestablishedwithtraditionalSTDH.Inpathogendetection,werecoveriedMycobacteriumphleiusingGlycerolAGARmedium,andthentransfertoGlycerinbrothmedium,afteraseriesofdistillationandextraction,mycobactinwassuccessfullyachieved.Addthemycobactinat1%intothemedium,weproductparatuberculosisculturemediumsuccessfully.ThedetectionresultsofrecoveryofP18showedthatthemediumisofgoodcultureability.AspecificPCRdetectionmethodswassuccessfullyestablishedaccordingtoMAPspecificinsertsequenceIS900byaIII 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用pairofprimers,andthesensitivityandspecificityofthismethodwasverifiedbyMycobacteriumbovies,Mycobacteriumphlei,MycobacteriumaviumandMycobacteriumintracellulare,thedetectionresultof300fecalsamplesshowsthattherewere38positivesamples.Inserologicaldetection,weexpressedfiveMAPspecificproteinincludingMAP0855,MAP0862,MAP1345,MAP2154,MAP2963.Thesespecificproteinobtainedbyprokaryoticexpressionwereusedascoatingantigenafterpurifedandquantification,fiveindiretELISAmethodswereprimaryestablishedafteraseriesofoptimization.ThedetectionresultsoftheseELISAmethodsshowedthatMAP0862andMAP1345areofgooddiagnosticvalue,andthecoincideratewithIDEXXkitwere94.3%and93.7%.Inthisstudy,wealsoresearchedtheserologicaldetectionresultsofMAP0862andMAP1345incooperation,theresultshowedthatthecoincideratewithIDEXXkitis92.7%.TheseELISAmethodsprimarilyestablishedwereusedtodetectbovineserumsindifferenttimesafterinfectionandresearchchangerulerofantibodytodifferentspecificantigen.Throughanalyzingthestructureofthespecificproteinexpression,thestrongepitopeswereselectedtochemicalsynthesis,MAP2#andMAP3#basedonMAP0862andMAP145areofgooddiagnosticvalue.Thedetectionresultsof300youngcattlefromadairyinShandongusingPCRandELISAmethodsestablishedinthisresearch,traditionalSTDHandcommercialELISAkitshowedthatusingdeferentdetectionmethodsthereexistdifference.Thisstudypreliminarilyestablishedbacterialculture,PCRdetectionandantibodydiagnosticmethodsuitableforBovineparatuberculosis.Keywords:Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis;Bovineparatuberculosis;Bacterialculture;PCR;SerologicaltestIV 山东农业大学硕士学位论文1引言1.1副结核分枝杆菌与牛副结核病简介1.1.1副结核分枝杆菌副结核分枝杆菌（Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisMAP）属于禽分枝杆菌副结核亚种，形状成细长状、短棒状与球杆状，大小为0.5-1.5μm，不形成芽胞、荚膜和鞭毛，革兰氏染色阳性，由于其具有耐酸性，对于副结核分枝杆菌的染色通常采用抗酸染色法。副结核分枝杆菌具有较强的环境抵抗力，能长时间的存活于被污染的土壤、水源中一年以上(Arsenaultetal.,2012)，因此环境一旦被污染，即对周边生物存在着长期的威胁。1.1.2牛副结核病在生产上引起的危害以及与人类的关系副结核分枝杆菌能引起反刍动物以慢性肠炎为典型病症的副结核病(Manningetal.,2001)。1895年Johne与Frothingham首先发现副结核病，并于1910年首次从牛体上分离到MAP(Lombardetal.,2013)。目前该病于美国、澳大利亚、日本、英国等世界各国广泛流行，一项美国国家动物健康系统的调查发现美国22%的牛场内至少10%的牛患有副结核病(Lombard,2011)。由于其造成奶牛体重下降、产奶量降低、生产性能下降给奶牛行业带来了极大的损失，根据发病情况不同每头牛的损失从40美元到227美元不等。该病仅在美国动物性食品方面的损失每年就可达到2.5亿美元(Lombard,.,2013)。我国最早牛副结核病例于1955年在内蒙古自治区的一个牧场发现，随后在黑龙江、贵州、河北等多个地区相继报告此病，几乎遍及我国大部分北方区域(何昭阳等,1991)。目前随着我国国民生活水平的不断提高，国民对于奶制品的需求随之也不断增长，急需大量高产、优质奶牛，造成全国甚至全球范围内奶牛种群的流通，为本病的传播提供了有利条件(巩红霞等.,2015)。副结核分枝杆菌除了感染牛、绵羊、山羊、骆驼等反刍动物外，还能感染包括马、猪、鹿、鼬、鸽、斑鸠等多种哺乳动物和禽类。目前有很多有关野羊、野牛和鹿，还有犀牛、水牛野生反刍动物的副结核病报道(Motiwalaetal.,2004)。该病已经有上百年的历史，对于该病目前尚无有效的防治措施，各种防治措施仍然是基于实验水平(刘倩1 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用等.,2011)。为了防治该病多年来研究人员试验了链霉素、氨苯砜、异烟肼等多种抗分枝杆菌的药物来治疗该病，然而对于本病治疗均未获得满意疗效。该病的传染源主要是处于排菌期的牛，通过粪便、乳汁向外排菌，易感牛往往在早期阶段即通过经口途径感染该菌(Manning,etal.,2001)，目前也有相关报道表明怀孕期感染牛能通过胎盘传播的方式传播副结核分枝杆菌(Buergeltetal.,2003)。感染副结核后的牛往往具有一个较长的亚临床期，后期才表现出临床症状，在亚临床期通常不表现出明显的症状，感染前期以细胞免疫为主，在此阶段几乎不排菌或伴随着间歇少量排菌，经过一个2到5年的亚临床期后体液免疫应答增强，同时排菌量明显增加(Syametal.,2014)，人工感染动物实验表明在初次感染MAP后于第10-14月后排菌量逐渐下降，再次感染该菌十个月后机体同时伴随着血清抗体水平增加与排菌量增多现象(Lepperetal.,1989)。自然感染MAP的动物中有95%—98%在2.2岁龄至11.7岁龄出现血清抗体转阳，根据感染剂量的不同，被感染动物开始排菌以及抗体转阳时间具有很大差异。在MAP检测中，年龄可以作为判断MAP感染阶段的指标，通常很难检测到青年动物的排菌情况以及血清抗体，感染该病的老年动物很可能出现排菌、血清抗体转阳以及典型临床症状。此时感染牛出现临床症状，主要表现有体重下降，病牛早期出现间歇性腹泻，以后变成顽固性腹泻，粪便稀薄，常呈喷射状排出，恶臭，带有气泡和黏液(Chietal.,2002)。尾根及会阴部常混有粪污。腹泻有时可停止，也能复发。随病程进展，病牛高度贫血和消瘦，精神委顿，常伏卧。泌乳停止，被毛粗乱无光，严重下颌及垂皮水肿，最后因衰竭死亡,病程几个月或1～2年。Twort等人于1910年在人工培养基上成功地培养出病原菌，并命名为牛副结核分枝杆菌后，本病才最后得以确认(Twort,1922)。自此以后，各国对本病的认识和报道极为普遍。牛副结核病一年四季均可发生，无明显季节流行性，该病在散养群体中主要以散发为主，规模化养牛场主要以区域性流行为主(Shankaretal.,2010)。对该病缺乏了解以及重视度，在引种时未经过严格的检疫，对于检测为阳性的牛不及时淘汰以及缺乏有效的检测方法是造成多年来副结核病持续流行与不断爆发的主要原因(孔繁德,2004)。作为一种在全世界范围内广泛饲养的家畜，牛为人类提供肉制品以及相关的乳制品，使得牛与人类的关系较之其他动物更为密切(巩强等,2012)。作为易感动物，感染副结核分枝杆菌的牛在排菌期对人类存在着潜在的威胁。作为副结核分枝杆菌的易感动物，牛感染副结核分枝杆菌后经过一个较长的亚临床期后进入临床期，此时可以通过鼻汁、痰液、乳汁、粪便排出体外，污染周围的饲料、土壤、饮水以及空气，2 山东农业大学硕士学位论文当出现临床症状以后阳性牛的粪便中带菌量可达到1010CFU/g粪便，使得周围的易感动物接触并感染该菌，同时又由于该菌具有较强的环境抵抗力，能够长时间的存在于被污染的环境中，造成了被污染的的地区长时间具有感染能力，具有很大的威胁(林涛,2012)。牛副结核病遍布全世界。如英国、丹麦、法国、德国、荷兰、美国、澳大利亚、新西兰、加拿大等养牛业发达的国家尤为多见。据报道，英国牛副结核病感染率在15％-33％之间，每年损失200万-300万英镑。本病被认为是英国某些地区最重要的疾病，最近英格兰的一份调查材料表明有l8％的流行率。Buergelt等对美国佛罗里达州的4500头牛进行ELISA检测，其中8％的肉牛和17％的奶中出现阳性抗体(Woodbineetal.,2009)。该病在法国流行30多年，从2个县扩散到41个县，死亡率为8%(Mercieretal.,2010)。在荷兰，每年损失为12%~l5%，在美国已确认30个州360个牧场存在本病，感染牛群每年损失为l2%，威斯康星州的畜产品牧业每年至少损失5000万美元，全美国的奶业损失每年达l5亿英磅。在冰岛估计l5年间死于本病的羊75000~l00000只。欧洲、美国、加拿大、印度和新西兰都有羊副结核病存在，损失严重，但引起注意不够。据调查，副结核病正在世界范围内逐渐传入新的地区，一些国家如肯尼亚“该病显示出惊人的增加”。本病已构成一个危害广泛的急迫的国际问题。在我国，本病于1955年在内蒙古自治区的呼盟谢尔塔拉牧场首次发现并被北京农业大学确诊。1958年吉林农业大学报道长春市奶牛场一例副结核病牛(孟文军等,2015)。此后辽宁、黑龙江、内蒙、贵州、陕西、河北等许多地区相继对本病进行了报导，本病几乎遍及东北、西北、华北、内蒙等地区，吉林是本病发生比较重的地区。据动物检疫站介绍，在我国进口的牛羊中副结核病检出率也很高。近年来由于奶牛和肉牛发展非常迅速，生产规模越来越大，集约化程度越来越高，牛流动范围越来越广，副结核病发生呈扩大的趋势，1971年世界有43个国家报道此病，到了1978年则有168个国家报道此病。牛副结核病的流行严重地影响畜牧业的持续健康发展，不仅造成奶牛乳房炎、结核性肠炎等疾病，还造成奶牛产乳量降低，更严重威胁着公共卫生安全。在牛副结核病流行的国家中，人类始终受到该病的潜在威胁，除非消灭牛副结核病，否则人类副结核病的控制是不会成功的。因此，要从根本上控制牛副结核病的发生与流行，必须加强对本病的诊断学和综合防治措施的研究，从而为控制和消灭牛副结核病提供技术支持。虽然目前副结核病尚未被作为人畜共患病，但是已经有越来越多的证据表明该菌与人的克罗恩病有关。克罗恩病是一种慢性消化系统疾病，主要以消瘦、持续性腹泻，肠炎症状为3 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用特征，与副结核病症状极为相似。近几年研究人员通过细菌分离培养、PCR等方法从克罗恩病患者身上检测到副结核分枝杆菌该病与副结核分枝杆菌的关系已经引起了研究人员的高度重视，进一步的净化副结核病不仅关系到畜牧业安全，而且与人类的安全问题息息相关(Debetal.,2011)。目前国内关于牛副结核病的研究较少，同时对于该病尚未有太高的重视度，进一步对牛副结核病进行研究具有重要的意义。作为一种胞内寄生菌，牛感染副结核特殊的免疫学变化规律对该病的及早诊断带来了很大的困难，因此建立牛感染副结核模型能研究感染后的免疫学变化规律，并可以采用不同的检测方法对免疫学变化规律进行一个持续的追踪，也同时能评价各种检测方法在感染后不同时期的诊断效果。1.2牛副结核检测方法1.2.1细菌学检测细菌学检测分为细菌镜检和细菌分离培养两种方法，当其中一种为阳性时，即可判断为阳性个体。应用于细菌学检测的样品主要为采集的牛粪便与病死牛解剖具有明显病变的肠段以及淋巴结。副结核分枝杆菌属于革兰氏阳性菌，细胞壁中含有大量的糖脂，普通的染色方法很难使其着色(乔艳双,2007)。通常采用萋尔-尼尔逊抗酸染色法进行染色，抗酸杆菌呈特征性的红色，而其它细菌和细胞呈蓝色。MAP在显微镜下呈红色球杆状，成丛成团存在，背景为蓝色，应用细菌镜检要求待检样品中含有一定的带菌量同时要求检测人员具有丰富的经验。MAP细菌分离培养具有很高的特异性，被作为诊断副结核病的参考标准(OIE,2008)。由于牛感染该病后的不同时期排菌情况不同，因此该方法针对不同的感染阶段敏感性不同，在感染后期，患病动物排菌量明显增加，使用细菌分离培养能有效检测出此阶段的感染个体。根据相关研究报道，依据牛感染副结核后机体状态的不同，细菌分离培养方法的敏感性从39.0%至92.0%不等(McGregoretal.,2015)，因此应用该方法不能有效的检测出不同感染时期的个体。另外MAP分离培养极为困难，在添加了草分枝杆菌素的副结核培养基中培养16周方可见菌落(Lybecketal.,2011)。这种方法检测成本较高、周期过长，往往会错过最佳淘汰时间，带来极大传播风险，严重危害健康牲畜，且该方法操作步骤复杂繁琐，对检测人员的专业技能也有很高的要求。为了克服副结核培养基配制的难题，4 山东农业大学硕士学位论文我们提取了草分枝杆菌素并配制了副结核培养基，同时比较了对于粪便样品的两种处理方法，我们实验室在样品（如粪便、肠内容物等）处理过程中发现过高浓度的草酸处理会杀死副结核分枝杆菌，过低浓度的草酸处理会导致部分芽孢杆菌无法杀死而致使培养基污染；另外待处理的样品来源，样品体积与草酸处理的时间都需要有一定的经验。除了上述从粪便、肠段以及淋巴结中分离MAP外，还有研究人员从血液、淋巴液以及肠道内容物中分离MAP(Kholetal.,2014)，这些方法同样存在着上述缺点。1.2.2分子生物学检测1987McFadden等人首次发现了副结核特异性插入片段IS900(McFaddenetal.,1987)，现在，针对MAP特异性片段IS900的PCR检测方法已经被作为确诊副结核的检测技术(王建峰等,2012)。PCR方法存在着敏感性高的特点，通过对畜群淋巴液的检测发现，应用PCR方法检测有27.1%的样品为副结核阳性，而阳性样本通过细菌分离培养、ELISA等方法其阳性检出率仅为31%(Khol,etal.,2014)。同时与其他方法相比，该方法节约检测成本与检测时间。本实验室根据副结核特异性插入片段IS900序列，设计了一对特异性引物用于副结核检测，经过一系列条件优化，建立了副结核诊断的PCR方法。使用该方法对采集的300份临床粪便样品进行检测，结果其中有38份为副结核阳性，使用商品化的副结核ELISA试剂盒对相应血清进行检测，有22份在血清学诊断上显示为阳性。该结果表明相比血清学检测，PCR方法具有更高的敏感性，可以检测出少量排菌的阳性牛个体。该检测结果与上述研究报道中的结果相似(Möbiusetal.,2008)。应用PCR的方法，不仅能检测粪便和组织中的带菌情况，同时也可以从奶样、血样以及淋巴液中进行病原检测。有文献报道PCR方法检测的特异性约为97%，其敏感性约为60.0%(Botsarisetal.,2013)。但是PCR方法自身存在着假阳性的缺点，同时根据使用引物的不同以及检测人员的操作技术水平不同，往往会导致检测结果不同(陈茹等,2009)。有报道称基于IS900的PCR方法通过部分环境微生物基因组也能扩增出与预期MAP大小相同的片段，为了降低假阳性的出现，基于IS900片段进行的酶切反应可以有效的降低假阳率(郭莹莹等,2014)。除IS900外，被鉴定出的副结核特异性序列ISMav2、F57与ISMap02也可应用于副结核的PCR检测(Stabeletal.,2005)。Sevilla通过将IS1311片段进行酶切反应，能有效地将MAP、禽结核分枝杆菌与结核分枝杆菌进行鉴别诊断，同时能够对MAP进行分型(Sevillaetal.,2005)。5 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用近年来，荧光定量PCR已经被广泛应用于副结核的鉴别诊断(Kraliketal.,2011)，该方法具有快速、灵敏度高的特点，应用此方法能够从血液、牛奶、粪便组织与环境中检测到副结核的存在情况。此方法受到样品核酸纯度的影响较大,改进DNA提取的方法，使用高纯度的核酸有助于提高该方法的准确性(Donatetal.,2015)。目前尚无基于分子生物学的副结核标准诊断方法，进一步的开发利用分子生物学对于副结核进行诊断具有广阔前景。1.2.3皮肤变态反应（SDTH）皮肤变态反应是基于迟发型变态反应原理进行的检测，其检测机制主要为针对细胞免疫，使用价值较为有限(Rousseyetal.,2014)。本方法能检测出处于感染早期的牛，但是针对感染中后期的牛则效果不明显。我们前期对山东某牛场300头青年牛使用皮肤变态反应检测，结果有33头牛为副结核阳性，但对这33头牛进一步用商品化ELISA抗体检测试剂盒进行检测，结果只有9头牛检测为阳性，该结果表明使用皮试试验能更为有效的检测出可能处于感染副结核早期的牛。然而由于禽结核菌素与副结核菌素存在抗原成分不明确的缺点，同时与其他环境分枝杆菌存在共同抗原，因此很容易产生非特异性反应(李明等.,2015)。另外，皮肤变态反应操作比较困难，在检测中需对检验牛进行两次保定，对于可疑样本需进行复检，耗费人力，在生产中很难普及。1.2.4IFN-γ释放试验（IGRA）1989年Wood等首次建立了IFN-γ释放试验用来检测结核杆菌感染(Burrellsetal.,1995)。该方法是通过检测经提纯结核菌素（PPD）刺激16h~24h培养的全血中γ干扰素（IFN-γ）的释放水平来判断牛是否感染结核，体外培养的外周血致敏T淋巴细胞经相同抗原再次刺激时会快速分泌IFN-γ。针对副结核的检测同样适用该方法，使用γ干扰素释放试验能够检测到感染副结核牛早期Th1型细胞介导的细胞免疫反应，及时发现处于早期感染阶段的牛(Burrells,etal.,1995)。刺激实验使用的副结核菌素能够刺激致敏淋巴细胞快速产生γ干扰素，但同样因为菌素成分的复杂性及分子杆菌之间的同源性，容易引起交叉反应导致假阳性(Bannantineetal.,2002)。目前国际上尚无统一副结核γ干扰素检测标准，且由于根据刺激原类型以及使用量的不同，该方法的敏感性和特异性存在较大差异(Kalisetal.,2003)，据报道根据判断标准的不同，在牛群中进行的副结核γ干扰素释放实验特异性从67%到94%，敏感性则从13%到85%不等(Hudaetal.,2003)。6 山东农业大学硕士学位论文1.2.5酶联免疫吸附试验（ELISA）目前已有商品化的副结核ELISA诊断试剂盒用于牛副结核病的诊断，针对血清中副结核特异性抗体的检测是目前最常用的副结核检测方法。1978年Jorgensen首先采用酶联免疫吸附试验（ELISA）诊断牛副结核病(Jørgensen,1981)，目前商品化ELISA试剂盒主要检测牛血清中以及牛奶中的副结核抗体。MAP除了与结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、禽结核分支杆菌、草分支杆菌存在严重交叉反应之外，还与放线菌属、链霉菌属等存在交叉反应，因此在ELISA检测中存在着严重的假阳性现象(Bannantineetal.,2014)。为了减少假阳性，研究人员一方面通过亲和层析、凝胶层析等方法提纯包被抗原，另一方面是排除待检血清中非特异性抗体的干扰(Alyetal.,2015)，目前有学者用热处理的草分支杆菌素与待检血清反应(Leeetal.,2014)，以减少其他干扰菌的交叉反应。基于副结核的ELISA诊断关键的是寻找到具有诊断价值的副结核特异性蛋白，Leite等人通过蛋白组学寻找到了11种在感染副结核感染早期分泌的特异性蛋白抗原(Leiteetal.,2015)，通过体外表达并将蛋白纯化后作为包被抗原，通过ELISA实验持续追踪针对几种蛋白的抗体在人工感染副结核不同时期变化的规律，结果发现针对特定蛋白的抗体可以在感染的早期阶段检测到。本实验室也以pET-32a原核表达载体，成功表达了其中6个特异性蛋白，分别为MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP0862-1345。将6个蛋白纯化定量后作为包被抗原，建立了检测牛副结核病的ELISA方法，并对临床采集的副结核阳性血清、牛结核阳性血清、牛布病阳性血清、牛大肠杆菌阳性血清以及健康阴性牛血清进行了检测，其中重组蛋白MAP0862以及MAP1345能有效将副结核阳性血清与其他干扰血清相区分，其诊断用价值在进一步研究开发。ELISA检测同样存在着敏感性低的缺点，有研究表明细菌分离试验与ELISA实验的符合率仅有37%(Chiodini,1993)。ELISA的敏感性同样取决于病畜所处的年龄段与所属类型，澳大利亚在奶牛群体中进行的一项研究发现针对2、3、4岁龄的奶牛，ELISA的敏感性分别为1.2%、8.9%、11.6%，针对6岁龄后群体该方法的敏感性为15%(Jubbetal.,2004)。Nielsen等人对黄牛群体进行的研究发现针对不同年龄段的牛ELISA方法的敏感性从7%到94%不等(Nielsenetal.,2008)。1.2.6补体结合试验（CFT）补体结合试验是用以检测动物感染病原菌或免疫后血清抗体的一种经典试验方法，主要检测血清中的IgG与IgM型抗体，该方法具有较好的敏感性与特异性。Kalis等人通7 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用过CFT与ELISA检测牛副结核血清抗体的研究表明，CFT的敏感性高于ELISA方法，能更有效的检测出早期临床样本(Kalis,etal.,2003)。但CFT检验操作复杂，需要同时满足检测系统（溶菌系统）与指示系统（溶血系统）成立，对于溶血素、补体以及抗原稍有疏忽就会导致较大的误差，同时该方法缺少统一操作标准以及标准阳性血清，且对于不同的病原规程操作方法不一(颜思通等,2004)，在生产中较难普及。颜思通等通过采用微量CFT对副结核病进行检测，在一定程度上降低了操作难度，便于在生产中的使用(颜思通,等,2004)。1.2.7琼脂扩散试验（AGID）琼脂扩散试验作为一种经典的免疫学实验也一直被应用于副结核病的诊断，其具有操作简便、可靠的特点(Gumberetal.,2006)。一项在新西兰与澳大利亚在小型反刍动物上进行的副结核检测结果表明，琼脂扩散试验的敏感性与特异性均高于ELISA(Hopeetal.,2000)。应用于琼脂扩散试验的抗原是副结核P18的提取物，然而目前缺少标准提取规程。另外，其特异性和敏感性仍需更多的试验数据支持，目前该方法难以进入实用阶段。1.3总结与展望副结核感染后机体的免疫反应规律较为复杂，需要结合不同感染时期阶段的特征以及牛群年龄的实际情况灵活使用几种检测方法进行持续追踪，寻找到适合不同时期的检测方法。比如副结核感染的育成牛通常处于早期感染阶段，此时应该重点考虑采用针对细胞免疫反应的检测方法，可采用皮肤变态反应与γ干扰素释放试验进行检测，并结合抗体检测以及细菌分离培养。对于2岁龄后的疑似感染牛，应重点结合针对体液免疫的检测方法，采用ELISA方法、补体结合试验以及琼脂扩散试验检测血清中针对副结核抗体水平，同时结合分子生物学方法以及细菌分离培养方法检测粪便中的带菌情况，并辅以DTH检测与γ干扰素释放试验。由于牛副结核病暂时无特效治疗方法，对阳性个体的及时淘汰是预防和控制该病的主要手段；该病潜伏时间较长，对于曾发生此疾病的流行区或者面临严重威胁的地区，应通过多种方法定期检测种群状态，及时淘汰阳性牛，控制该病发生发展。8 山东农业大学硕士学位论文1.4研究目的本文旨在通过优化副结核分枝杆菌的培养条件和PCR扩增程序，建立牛副结核病原学检测方法。通过寻找具有诊断价值的副结核的特异性抗原，建立基于血清学检测的ELISA方法。通过对所建立的方法与IDEXX副结核抗体检测试剂盒进行比较，分析各种检测方法的特点。2材料与方法2.1细菌培养方法的建立副结核分枝杆菌属于胞内寄生菌，具有很强的环境抵抗力，能长时间的存在于被污染的饲料，土壤以及水源中(付志金等,2013)，然而副结核分枝杆菌的培养极为困难，菌种复苏需要在添加了草分枝杆菌素的副结核培养基上面培养30天左右，体外分离培养需要在添加了草分枝杆菌素的副结核培养基上培养90以上，目前国际上对于副结核的培养一直是个难题，因此建立副结核分枝杆菌的分离培养方法具有十分重要的意义。副结核培养基配制的核心难点在于草分枝杆菌素的提取，目前国外有商品化的草分枝杆菌素，但是由于其价格昂贵，很难应用于生产实践中来。本次我们为了克服培养基配置的困难，参考相关文献，成功提取了草分枝杆菌素并成功的配置了副结核培养基。2.1.1实验材料2.1.1.1实验用菌株：草分枝杆菌，编号4.1180，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；牛型副结核分枝杆菌菌株P18，编号C68678，副结核分枝杆菌菌株P10，编号C68679，副结核分枝杆菌菌株III—V，编号C68681，副结核分枝杆菌菌株316F，编号C68682，均购自中国兽医药品监察所微生物保藏中心。2.1.1.2溶液及试剂配制：试剂：丙酮、石油醚、胰蛋白胨、氯化钠、牛肉膏、甘油、丙酮酸钠、琼脂、孔雀石绿购自国药集团；氯化十六烷基吡啶（HPC）购自sigma公司，货号C9002-25G。培养基制备：⑴甘油琼脂培养基：蛋白胨5g，酵母膏3g，甘油20g，使用1000mlddH20溶解，加入琼脂15g，调节至pH7.0-7.2，高压灭菌，倒斜面。⑵甘油肉汤培养基：牛肉汤1000ml、蛋白胨10g、氯化钠5g、甘油40ml。将蛋白胨和氯化钠按比例加入牛肉汤中，加热溶解，以氢氧化钠溶液调整PH至6.8~7.0继续煮沸10分钟，补足失去水分，加入甘油后混匀，用滤纸滤过，116℃灭菌40分钟。9 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用2.1.1.3实验设备：MilliQ超纯水仪，Millipore，Bedford，MA，美国；低温高速离心机，Eppendorfcentrifuge5810R；生物安全柜，LABCONCO，Purifier，Biologicalsafetycabinet；细胞培养箱，FORMASCIENTIFIC，高压蒸汽灭菌锅：HIRAYAMA；SpectraMAX190吸光计，美国MolecularDevice公司。2.1.2实验方法2.1.2.1草分枝杆菌培养：取一支冻存的草分枝杆菌，接种到一支甘油琼脂斜面培养基上面，37℃温箱培养一周左右，待生长状态良好后，将菌体洗下接种甘油肉汤液体培养基后于37℃温箱进行培养，培养20天后取出培养基，将菌体于高压锅121℃高压60min后取出培养基，带温度冷却后使用四层纱布滤除菌体，将菌体于37℃烘箱干燥，收集菌块并称重。2.1.2.2草分枝杆菌素提取：称取草分枝杆菌菌体100g放入1000ml烧瓶中，加入丙酮300ml，装上自来水冷却的回流冷凝器70—80℃水浴提取15min，倾出提取液并以滤纸滤过；将滤液加入蒸馏器中蒸馏，回收丙酮，直至丙酮全部挥发；将所剩残渣刮下，放入脂肪提取器中，用30~60℃的石油醚反复抽提5~8小时，至石油醚无色为止。将抽提后的残渣取出，自然干燥，红棕色的物质即为草分枝杆菌素，研磨成粉末装瓶备用。2.1.2.3副结核培养基的配制（见表1）表1副结核培养基配制原材料Table1MaterialofMAPculturemedium副结核培养基配制原材料胰蛋白胨9g氯化钠4.5g牛肉膏2.7g甘油27ml丙酮酸钠4.1g琼脂15.3g草分枝杆菌素0.1g灭菌水870ml新鲜鸡蛋黄120ml2%孔雀石绿水溶液5.1ml10 山东农业大学硕士学位论文将前六种物质与加热后的无菌水充分混匀后冷却备用；使用1ml无水乙醇将草分枝杆菌素充分溶解；将孔雀石绿水溶液加入蛋黄中充分搅拌混匀；将草分枝杆菌素与蛋黄孔雀石绿混合液一同加入冷却至56℃水溶液中，使用四层纱布过滤，分装玻璃A管，摆成斜面，在80℃流通蒸汽水浴锅中灭菌，灭菌后取两支培养基置于37℃温箱中进行无菌检验，合格后培养基置于4℃冰箱保存。2.1.3培养基验证2.1.3.1复苏菌种验证培养基：取四支冻存的副结核菌种，分别为P18，编号C68678；P10，编号C68679；III—V，编号C68681；316F，编号C68682。无菌开启菌种后分别使用1ml灭菌生理盐水将菌种溶解，接种到一支配置好的副结核斜面培养基上，置于37℃温箱中进行培养。2.1.3.2细菌分离培养验证培养基：取1g粪便加入装有35—40ml无菌水的50ml离心管中，在水平振荡器上震荡30min，将离心管垂直放置30min，从上半部分中吸取5ml出来加入到另一个装有25ml0.9%十六烷基吡啶（HPC）水溶液的50ml离心管中，颠倒数次离心管，充分混匀后垂直在室温条件下放置过夜（16—24h）净化后，接种4支副结核培养基，每支接种0.1ml管底的沉淀物，将培养基置于37℃温箱中进行培养。2.2副结核特异性片段IS900的PCR方法的建立聚合酶链式反应是从20世纪80年代中期开始发展起来的，通过一对特异性引物，在DNA聚合酶、dNTP的作用下经历“变性—退火—延伸”循环步骤对DNA模板进行扩增，实现在短时间内将DNA模板进行几十万倍的扩增，通过该方法能检测样品中存在的少量DNA以达到检测目的。副结核分枝杆菌与结核分枝杆菌以及其他环境分枝杆菌存在较高的同源性，给鉴别诊断带来了困难，副结核分枝杆菌有19个不同的插入序列，每个插入序列有其独特的拷贝数。IS900一般为14~20个拷贝，其长度为1451bp（G+C含量为66%，IS1311有7个拷贝，ISMav2有3个拷贝，f57有一个拷贝，Locus255有一个拷贝。目前常用的副结核检测特异性序列主要有IS900ISMav2、F57与ISMap02(Möbius,etal.,2008)，本次选取副结核特异性插入序列IS900作为研究对象，研究基于IS900的分子生物学诊断方法。11 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用2.2.1实验材料2.2.1.1菌株与基因组：牛型副结核分枝杆菌菌株P18，编号C68678；副结核分枝杆菌菌株P10，编号C68679；副结核分枝杆菌菌株III—V，编号C68681；副结核分枝杆菌菌株316F，编号C68682。结核分枝杆菌基因组、草分枝杆菌基因组、禽结核分枝杆菌基因组由本实验室保存。2.2.1.2试剂与耗材：细菌基因组小量提取试剂盒（CodeNo9765），Q5DNA高保真聚合酶(M0491S)购自NEB公司2.2.2实验方法2.2.2．1IS900引物设计从Genbank上调取IS900基因序列，登录号：S74401.1，使用Primer5软件设计了一对引物（见表2），扩增大小为315bp的基因片段。表2IS900引物序列Table2PrimersequenceofIS900IS900引物序列IS900FGCACCTTGTTCAAATCGTIS900RAATCTCCTTCGGCCATC2.2.22副结核分枝杆菌基因组提取提取副结核分枝杆菌的基因组作为模板。副结核分枝杆菌属于革兰氏阳性菌，按照Takara细菌基因组提取试剂盒（CodeNo:7963）提取革兰氏阳性菌的提取步骤进行提取：⑴分别取生长状态良好的副结核分枝杆菌P18，P10，III—V，316F，无菌条件下使用灭菌水将菌体洗脱后于80℃水浴锅灭活两小时，使用罗氏真空陶瓷珠将菌体打碎，用1.5ml离心管收集不要超过1.0E+09的细胞用，12,000rpm离心2分钟，弃上清。⑵加入500μl的BufferBS重悬细菌、加入50μl的Lysozyme(20mg/ml)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60分钟（期间间隔20分钟颠倒混匀一次）。⑶12,000rpm离心5分钟，弃上清。12 山东农业大学硕士学位论文⑷加入180μl的BufferGL、20μl的ProteinaseK(20mg/ml）和10μl的RNaseA(10mg/ml），充分吸打混匀，于56℃水浴温育10分钟，至溶液透明、澄清。加入200μl的BufferGB和200μl的100%乙醇，充分混匀。处理好的细胞按如下操作进行：⑸将SpinColumn安装在CollectionTube上，溶液移至SpinColumn中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。⑹将500μl的BufferWA加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。⑺将700μl的BufferWB加入至SpinColumn中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。⑻重复操作步骤⑺。⑼将SpinColumn安置于CollectionTube上，12,000rpm离心2分钟。⑽将SpinColumn安置于新的1.5ml离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入50～200μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置5分钟。将灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至65℃使用时有利于提高洗脱效率。⑾12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离下液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入50～200μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。⑿基因组DNA定量。提取得到的基因组DNA可通过电泳或测定吸光度定量。2.2.2.3PCR扩增条件分别以提取的四株副结核分枝杆菌的基因组作为模板，使用引物IS900F与IS900R扩增目的基因，反应组分为：2×MasterMix25μL，上下游引物（10μM—50μM，设置5个引物梯度浓度）各2.5μL，基因组2μL，加灭菌ddH2O至50μL。反应程序为：98℃30S;98℃10S，50℃—60℃（设置8个梯度退火温度）20S，72℃20S（30个循环）；72℃10min延伸PCR反应。13 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用2.2.2.4特异性试验按照优化后的PCR反应程序，分别取四株副结核分枝杆菌基因组与本实验室保存的牛结核分枝杆菌基因组、草分枝杆菌基因组、禽结核分枝杆菌基因组、胞内分枝杆菌基因组作为模板进行反应扩增，研究本方法的特异性。2.3副结核分枝杆菌特异性抗原的克隆、表达与纯化副结核分枝杆菌与禽结核分枝杆菌、环境分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、BCG存在共同抗原，在鉴别诊断时很容易产生干扰。目前关于副结核的诊断用抗原缺乏研究以及报道，这使得研究以及开发具有鉴别诊断作用的抗原具有十分重要的意义。根据文献报道，Leite等人通过比较基因组学寻找到了11种副结核特异性抗原，其仅在副结核分枝杆菌中表达，不存在于其他干扰菌中(Leite,etal.,2015)。为了研究其在鉴别诊断中的作用，我们通过NCBI数据库调取相关抗原的核酸序列并对其氨基酸序列进一步验证确定了其特异性，对几种副结核特异性抗原通过软件分析其抗原性，选取其中五个具有良好抗原性的副结核特异性抗原进行克隆、表达与纯化，并进一步对其在血清学诊断中的作用进行了探索。2.3.1实验材料2.3.1.1菌株与载体副结核分枝杆菌牛型参考株P18（C68678），购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），原核表达载体pET-32a由本实验室保存。2.3.1.2试剂与耗材细菌基因组小量提取试剂盒（CodeNo9765）、限制性内切酶EcoRI、XhoI，T4DNA连接酶购自Taraka公司，Q5DNA高保真聚合酶(M0491S)购自NEB公司，异丙基-b-D-硫代半乳糖苷(IPTG，CodeNoA100487)购自上海生工、真空采血管（CodeNo367812）购自BD公司，牛副结核间接ELISA试剂盒（CodeNoP07130-5）购自IDEXX公司，副结核菌素购自中国兽医药品监察所，HRP标记的羊抗鼠、兔抗牛酶标抗体分别购自Sigma公司。2.3.1.3溶液及试剂配制方法14 山东农业大学硕士学位论文⑴LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌30分钟。⑵氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。⑶质粒提取溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min，贮存于4℃。⑷质粒提取溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS。2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。⑸质粒提取溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。⑹TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。1MTrisCl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800mlH2O中溶解121gTris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：700mlH2O中溶解186.1gNa2EDTA-2H2O，用10MNaOH调pH8.0(需约50ml)，补H2O到1L。⑺苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。⑻无水乙醇。⑼70%乙醇。⑽RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris-Cl(pH7.5)，5mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。⑾灭菌双蒸水ddH2O。⑿50×TAE：称取242gTris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA（pH8.0），使用800mlddH2O充分溶解后定容至1000ml，使用浓度为1×。⒀0.8%琼脂糖凝胶制备：称取0.8g琼脂糖加入到量取好的100ml1×的TAE溶液中，于微波炉内充分融化后加入5μLGoldenview，混匀，倒入制胶盒槽中，插入梳子，待胶凝固后拔出梳子。15 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用⒁100mMCaCl2溶液：称取11.1gCaCl2，使用100mlddH2O充分溶解后使用0.22μL滤器过滤，配制成1M/L的储液，使用时10倍稀释。⒂包涵体洗涤液1：20mMTris，5mMEDTA，0.5%Tritonx-100，使用盐酸调PH至7.4。⒃包涵体洗液2：20mMTris，5mMEDTA，2M尿素，使用盐酸调PH至7.4。⒄变性液：20mMTris，5mMEDTA，8M尿素；复性液：20mMTris，0.5mMEDTA，50mMNaCl，1%甘氨酸，1mMDTT，0.1mM谷胱甘肽。使用盐酸调PH至7.4。2.3.1.4主要仪器设备微量分光光度计，Nenodrop2000c；PCR仪：biomtera，Professional，Geramy；组织匀浆机，美国ProScientific；MilliQ超纯水仪，Millipore，Bedford，MA，美国；低温高速离心机，Eppendorfcentrifuge5810R；生物安全柜，LABCONCO，Purifier，Biologicalsafetycabinet；细胞培养箱，FORMASCIENTIFIC，高压蒸汽灭菌锅：HIRAYAMA；SpectraMAX190吸光计，美国MolecularDevice公司。2.3.2副结核特异性重组蛋白克隆2.3.2.1菌种复苏取一支冻存的副结核菌种P18使用1ml无菌生理盐水复溶后接种两支副结核培养基，于37℃温箱内培养30天至长出乳白色颗粒状菌落，用生理盐水洗下菌落后用于全基因组提取。2.3.2.2引物设计以及PCR扩增条件使用Primerprimer5.0软件针对五个重组蛋白设计了五对特异性引物，含酶切位点，分别用于五条基因片段扩增，引物序列见表3，引物由北京中美泰和公司合成。表3基因引物序列Table3Primersequence基因名登录号引物序列核酸分子量蛋白大小（不含标签）F:CCGGAATTCCGTGCGAGCCTATGTATC945bp34KDMAP0855GI:41397420R:CCGCTCGAGTTACGATTGGTCAACGAGF:CCGGAATTCATGCGCTTCGTAAACGG1032bp39.9KDMAP0862GI:41395310R:CCGCTCGAGTTATGGCTTCCTCGTAAA16 山东农业大学硕士学位论文F:CCGGAATTCCGATTCCGGTTCTTCTAC555bp19.6KDMAP1345GI:41395795R:CCGCTCGAGTTAATACGTCGGGGTCTTF:CCGGAATTCCGGGGCGATTCAAAGT435bp15.8KDMAP2154GI:41396607R:CCGCTCGAGTTAGCGGCAGACGAGTAMAP2963GI:41397420F:CCGGAATTCGAAAAGCCAGGGATTGC759bp28.3KDR:CCGCTCGAGTCAGGTGAAGTTGGGTGA注：下划线部位为引入的酶切位点PCR反应组分模板2μL2×MasterMix25μL上游引物2μL下游引物2μLddH2O19μLPCR反应程序：98℃30S；98℃10S，52-56℃20S，72℃20-30S（30个循环）；72℃10min延伸PCR反应。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定目的条带大小，将大小符合预期的PCR产物使用胶回收试剂盒进行回收。表4五个片段的扩增条件Table4Amplificationconditionsoffivesequence退火温度延伸时间MAP085552℃30SMAP086252℃30SMAP134554℃20SMAP215452℃20SMAP296356℃25S2.3.2.3载体与目的片段双酶切反应使用限制性内切酶EcoRI、XhoI分别对五个片段胶回收产物与原核表达载体pET-32a进行双酶切反应，使用胶回收试剂盒分别回收双酶切后的目的产物，反应体系与反应步骤如下：17 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用PCR胶回收产物10μLEcoRI1μLXhoI1μL10×HBuffer2μLddH2O6μL37℃水浴3hpET-32a5μL（约1.5μg）EcoRI1μLXhoI1μL10×HBuffer2μLddH2O11μL37℃水浴3h2.3.2.4连接反应使用分光光度计对双酶切后回收的目的片段进行定量，将双酶切后的产物片段与载体按照5:1的摩尔比进行连接，反应体系与步骤如下：PCR双酶切产物2μL载体双酶切产物2μLT4DNA连接酶1μL10×Buffer1μL双蒸水4μL16℃过夜连接2.3.2.5感受态细胞的制备以及转化感受态细胞制备：取保存的BL21菌种，于新鲜不含抗性的LB平板上划线，置于37℃温箱过夜培养，挑取单菌落接种新鲜不含抗性的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌至OD600为0.4，取出试管进行冰浴15min，从其中取5ml菌液于4℃离心机4000rpm离心5min，弃去上清；使用遇冷的100mMCaCl2溶液轻轻的将菌体重悬至原体积，冰浴2min,于4℃离心机4000rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤三次；最后使用遇冷的100mMCaCl2溶液将菌液定容至3ml，加入25%体积的甘油，于-80℃冰箱保存。18 山东农业大学硕士学位论文转化：取遇冷的1.5ml离心管加入200μL预先制备的感受态细胞，加入2μL连接产物，冰浴30min；将离心管置于42℃水浴锅热激1min，立即取出后冰浴2-3min，加入800ml新鲜不含抗性的LB液体培养基，37℃200rpm摇菌45min；将离心管取出后4000rpm离心10min，弃去800μL上清，将剩余菌体重悬，使用涂布棒将菌液均匀的涂布在新鲜含氨苄抗性的LB（100ug/ml）平板上，将平板置于37摄氏度温箱内进行过夜培养。2.3.2.6重组菌PCR鉴定挑取单个菌落接种新鲜含氨苄抗性的LB（100ug/ml）液体培养基中，37℃200rpm摇菌，取1μL菌液作为模板，分别使用设计的引物相应的进行菌液PCR鉴定，反应体系以及步骤如下：反应体系模板1μL2×MasterMix12.5μL对应上游引物1μL对应下游引物1μLddH2O8.5μL反应步骤：PCR反应程序：98℃30S；98℃10S，52-56℃20-30S，72℃20S（30个循环）；72℃10min延伸PCR反应。使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物大小进行鉴定，对于大小正确的菌液提取质粒。2.3.2.7质粒提取⑴挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20mlLB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃200rmp振荡培养过夜（约12-14hr）。⑵取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上几分钟，使培养基尽可能流尽。⑶菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀)室温下放置5-10min。⑷加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物(不要振荡)，冰浴5min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。19 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用⑸加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。⑹上清液移入干净1.5ml离心管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，12000rmp离心10min。（450μl的苯酚/氯仿/异戊醇。）⑺小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，12000rpm离心10min。⑻弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5min。⑼吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。⑽将沉淀溶于20μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRnaseA，约4μl)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。提取的质粒送中美泰和公司测序，将测序结果与NCBI上公布的序列进行比对，将含阳性质粒的菌液加入25%体积的甘油-20℃保存。2.3.3副结核分枝杆菌重组蛋白的诱导表达与纯化2.3.3.1目的蛋白诱导表达取五个含阳性质粒的重组菌，转接新鲜含氨苄抗性（100μg/mL）的LB液体培养基中，摇菌至OD600至0.6~0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，于摇床中30℃150rpm摇菌6h，收集菌液离心收集菌体并称重。2.3.3.2蛋白可溶性分析取菌体使用生理盐水进行重悬，使用超声破碎仪对菌体进行破碎（15%功率；超声2S，停2S；总时间5min），整个超声过程于冰上进行。分别取超声破碎后的上清以及沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，对五个目的蛋白的可溶性进行鉴定。2.3.3.3目的蛋白纯化可溶性蛋白纯化方法：按照GE蛋白纯化试剂盒（HisTrapFFcrude）纯化可溶性蛋白的说明分别配制BindingBuffer(含20mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液)与含8M尿素的BindingBuffer，含8M尿素的ElutionBuffer(含500mM咪唑的20mM磷酸盐溶液)并分别调PH至7.4。用配置好的BindingBuffer将菌体沉淀重悬后进行超声裂解，裂解产物于4℃离心机13000×g离心30分钟后弃去上清。用含8M尿素的BindingBuffer将沉淀20 山东农业大学硕士学位论文重悬后冰浴四小时至沉淀完全溶解，使用0.45μm滤器对蛋白溶液进行过滤，过滤液按照上述试剂盒说明书纯化目的蛋白。包涵体蛋白纯化方法：超声破碎后的菌体经4℃、12000rpm离心20min收集沉淀菌体，每克菌体使用40ml包涵体洗液1重悬后，经4℃、12000rpm离心25min收集沉淀；沉淀用40ml包涵体洗液2重悬，搅拌溶解1h，经4℃12000rpm离心25min后弃去上清；沉淀加入40ml含8M尿素的变性液室温搅拌2h，4℃12000rpm离心25min；吸取上清溶液使用0.45μm滤器过滤后装于处理后的透析袋内在4℃环境下依次在含8M、6M、4M、2M、0M尿素的复性液中进行透析复性。复性蛋白使用Hiprep26/10Desalting脱盐后置换到PBS溶液中。2.3.3.4纯化后目的蛋白的定量使用BCA试剂盒（货号P0009，碧云天）对纯化后的蛋白进行定量，操作步骤如下：1.蛋白标准品的准备a.取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mgBSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。2.BCA工作液的配制按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。b.加适当体积样品到96孔板的样品孔中。如果样品不足20μl，加标准品稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。c.各孔加入200μlBCA工作液，37ºC放置20-30分钟。d.用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的波长的吸光度。e.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。2.4副结核特异性蛋白MAP1345与MAP0862的串联表达基于MAP1345与MAP9862初步建立的ELISA方法具有较高的符合率，为了进一步探索具有良好抗原性的副结核特异性蛋白MAP1345与MAP0862在协同作用下在血清学诊断中的作用，我们通过串联的方式对两个特异性的蛋白进行表达。21 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用2.4.1引物设计首先使用DNAstar软件分析MAP0862与MAP1345蛋白中具有良好抗原性的部位并对其中所含的酶切位点进行分析，在设计的引物序列中引入一段柔性氨基酸序列保证串联表达的两个蛋白保持蛋白构象，同时有利于蛋白可溶性表达，对副结核特异性蛋白MAP1345与MAP0862进行了串联表达。串联表达用特异性引物序列见表5。表5串联表达用特异性引物序列Table5PrimersequenceofMAP0862-1345引物名称引物序列扩增长度MAP1345P1CCGGAATTCCGATTCCGGTTCTTCTAC（EcoRI）555bpMAP1345P2TGAACCACCACCACCTGAACCACCACCACCATACGTCGGGGTCTTGTMAP0862P3GGTGGTGGTGGTTCAGGTGGTGGTGGTTCAATGCGCTTCGTAAACGG1032bpMAP0862P4CCGCTCGAGTTATGGCTTCCTCGTAAA(XhoI)注：下划线部位为引入的酶切位点，黑体部位为引入的柔性氨基酸序列2.4.2片段扩增与目的片段回收以副结核分枝杆菌P18基因组作为模板，使用引物P1与P2扩增MAP1345基因，使用引物P3与P4扩增MAP0862基因，反应组分为：2×MasterMix25μL，上下游引物（10μM）各2.5μL，基因组2μL，加灭菌ddH2O至50μL。反应程序为：98℃30S;98℃10S,54℃20S,72℃20S（30个循环）;72℃10min延伸PCR反应。PCR反应结束后使用胶回收试剂盒对两个产物进行回收。2.4.3重叠延伸PCR使用分光光度计对两个PCR回收产物浓度测定后按照1:1等量混合作为PCR反应模板，使用引物P1与P4对模板进行扩增,PCR反应体系与程序参照2.4.2，获得MAP1345与MAP0862的融合基因。2.4.4重组质粒构建与诱导表达使用限制性内切酶EcoRI、XhoI分别对融合基因MAP1345-0862与原核表达载体pET-32a进行双酶切后回收目的片段，按照一定比例将两种回收产物混合后使用T4DNA22 山东农业大学硕士学位论文Ligase进行连接，将连接产物转化进入BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单个菌落摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定，将含阳性质粒的重组菌转接含氨苄抗性的新鲜LB培养基37℃摇菌至OD600为0.6-0.8时加入终浓度为1mM/L的IPTG，继续摇菌4小时后收集菌体。2.4.5SDS-PAGE鉴定取诱导后菌液超声破碎（30%功率；超声2S；暂停2S；超声10min）。分别取标签蛋白，全菌蛋白，超声后沉淀，超声后上清进行SDS-PAGE凝胶电泳验证目的蛋白大小以及可溶性。2.4.6包涵体形式目的蛋白纯化对于经鉴定为包涵体形式的重组蛋白MAP0862-1345，超声破碎后的菌体经4℃、12000rpm离心20min收集沉淀菌体，每克菌体使用40ml包涵体洗液1重悬后，经4℃、12000rpm离心25min收集沉淀；沉淀用40ml包涵体洗液2重悬，搅拌溶解1h，经4℃12000rpm离心25min后弃去上清；沉淀加入40ml含8M尿素的变性液室温搅拌2h，4℃12000rpm离心25min；吸取上清溶液使用0.45μm滤器过滤后装于处理后的透析袋内在4℃环境下依次在含8M、6M、4M、2M、0M尿素的复性液中进行透析复性。复性蛋白使用Hiprep26/10Desalting脱盐后置换到PBS溶液中。2.4.7WesternBlot鉴定纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后使用伯乐凝胶转印系统转印到PVDF膜上，使用副结核单克隆抗体作为一抗，HRP标记的羊抗鼠酶标抗体作为二抗，进行WesternBlot鉴定。2.5副结核特异性序列人工合成多肽为了探索几种副结核特异性抗原具有鉴别诊断作用的多肽序列，我们使用软件对氨基酸序列进行分析，找到疏水性较好、可能存在抗原位点的氨基酸序列由上海生工公司进行了人工多肽合成，对应副结核特异性抗原的多肽序列见表，其中斜体部分为为了保证多肽构象添加的柔性氨基酸序列。23 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用表6多肽序列Table6Peptidesequence多肽名来源多肽序列多肽长度MAP1#MAP0855APRPTKRGGGSSPDEHDPPDVRGGGSEQTPERDK46AAGGGSKDDDPPTRMAP2#MAP0862TDQKRDWTSGGGTVDRRRRDGTPRYSLDSGGG45AAASRRRRDRFTRKPMAP3#MAP1345KPLDKARAKSGGDRDAYVTGQERALDDKTPTY32AAMAP4#MAP2154RGDSKSEFPGLRWPLRRFSRGNSGVSGQQPGSNR36AAKLMAP5#MAP2963YHRRRLHSGGGRNPDGGGSDELDQDNATRYIR32AA2.6重组蛋白、多肽间接ELISA方法的建立2.6.1实验血清副结核病阳性牛血清18份、布病阳性牛血清10份、牛结核阳性血清15份、卡介苗免疫牛血清10份、牛阴性血清58份均由本实验室鉴定保存；300份临床牛来自山东某牛场。2.6.2实验用试剂与溶液配制⑴包被液：pH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液:称取0.75g碳酸钠，1.46g碳酸氢钠，加去离子水定容至500ml。⑵0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4):称取0.2g磷酸二氢钾，2.90g磷酸氢二钠，8g氯化钠，加去离子水定容到1000ml。⑶血清稀释液：0.02mol/LPBS(pH7.4)+0.1%BSA：称取0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸盐缓冲液溶解定量至100g。⑷封闭液：0.02mol/LPBS(pH7.4)+5.0%脱脂奶：称取5.0gBSA加配好的0.02mol/LPBS溶解定量至100ml；0.02mol/LPBS(pH7.4)+5.0%明胶：称取5.0g明胶加配好的0.02mol/LPBS溶解定量至100ml；0.02mol/LPBS(pH7.4)+5.0%脱脂奶：称取5ml马血清加配好的0.02mol/LPBS溶解定量至100ml；⑸洗涤液：0.02mol/LPBS(pH7.4)+0.05%Tween-20:100ml0.02mol/L磷酸盐缓冲液中加入50μlTween-20，震荡混匀。⑹显色液：TMB-过氧化氢尿素溶液(PR1200)购自北京索莱宝公司。⑺终止液：1mol/LHCL溶液：用量筒量取8.36ml质量浓度为37%的浓盐酸，倒入已经装有大约50~70ml蒸馏水的烧杯中，要不断搅拌，待冷却后转移到容量瓶中定容至100ml，即可配置成1MHCL。24 山东农业大学硕士学位论文⑻兔抗牛抗体购自sigma公司，使用时按照1：10000进行稀释。2.6.3主要仪器设备DEM-III型全自动洗板机，北京托普公司；多通道连续波长酶标仪SpectraMAX，美国MolecularDevices。2.6.4间接ELISA操作步骤⑴抗原包被：将纯化并定量后的重组蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP1345-0862以及人工合成的多肽使用1×碳酸盐缓冲液稀释后按照一定稀释度进行稀释，100μL每孔包被酶标板，4℃过夜包被。⑵洗板：倾去包被液，使用洗涤液洗板三次，最后一次拍干。⑶封闭：每孔加入100μL封闭液，4℃过夜封闭。⑷洗板：倾去封闭液，使用洗涤液洗板三次，最后一个拍干。⑸加一抗：每孔加入100μL稀释后的待检牛血清样品，37℃孵育30min。⑹洗板：倾去待检样品，使用1×PBST洗板三次，最后一个拍干。⑺加二抗：每孔加入100μL稀释好的HRP标记的兔抗牛酶标抗体，37℃孵育30min.⑻洗板：倾去二抗，使用洗涤液洗板三次，最后一个拍干。⑼显色：每孔加入100μLTMB显色液，避光显色15min。⑽终止读值：每孔加入50μL1MHCL终止显色，使用酶标仪读取OD450nm数值。2.6.5ELISA条件优化2.6.5.1使用棋盘法确定最佳抗原包被条件以及最佳血清稀释度将纯化定量后的抗原分别使用1×碳酸盐缓冲液按照200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml四个稀释度进行稀释，稀释后加入酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜后PBST洗板三次；每孔加入100μL含5%脱脂奶粉的PBST4℃过夜封闭后使用。将阴阳性血清按照1:25、1:50、1:100、1:200四个稀释度进行稀释后加入酶标板中，每孔100μL，37℃作用30min，PBST洗板三次；每孔加入100μL1:10000稀释的HRP标记的兔抗牛酶标抗体，37℃作用30min，洗板后每孔加入100μLTMB显色液室温避光显色15min，每孔加入50μL1MHCL终止反应，测定OD450数值，以阳性血清与阴性血清的最适OD450比值（P/N）所对应的抗原包被浓度与血清稀释度作为最佳浓度。25 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用2.6.5.2最佳封闭条件的确立确定最佳抗原包被浓度与血清稀释度后，分别使用含5%脱脂奶粉、5%马血清、5%明胶的PBST溶液作为封闭液，进一步优化该ELISA方法，以背景值最低时的封闭液作为最佳封闭液。2.6.5.3最佳酶标抗体浓度的确立按照优化后的上述ELISA条件，将HRP标记的兔抗牛酶标抗体分别进行1:2500、1:5000、1:10000、1:20000稀释后进行ELISA反应，选择P/N值最大时的酶标抗体稀释度作为最适工作浓度。2.6.5.4阴阳性血清临界值的确立取实验室鉴定保存的58份牛阴性血清使用该ELISA方法测定OD450数值，计算平均值——（X）与标准差（SD），以X+3SD作为阴阳性临界值，当检测样本结果大于该临界值判定为阳性，小于该临界值判定为阴性。2.6.5.5特异性试验按照优化后的ELISA方法，取实验室保存的牛副结核阳性血清、牛结核阳性血清、牛布病阳性血清、卡介苗免疫牛血清、牛大肠杆菌阳性血清、牛阴性血清进行检测以验证基于不同抗原的ELISA实验的特异性。2.6.5.6符合性试验按照建立的ELISA方法对300份临床采集的牛血清进行检测，将检测结果与IDEXX副结核ELISA试剂盒检测结果进行比对，计算二者符合率。2.7细菌分离培养方法对临床样本牛进行检测2.7.1实验材料300份临床牛粪便采集在山东某牛场，样品做好编号，-20℃保存；副结核培养基由本实验室制备，参照2.1.2.3。2.7.2实验方法按照2.1.3.2建立的粪便细菌分离方法，使用十六烷基吡啶（HPC）对粪便样品进行处理，每份样品接种2只副结核培养基，将副结核培养基置于37℃温箱进行培养，持续观察生长状态，及时将污染的培养基弃去。26 山东农业大学硕士学位论文2.8PCR方法对临床验本牛进行检测采集300头牛的粪便样品，使用粪便基因组提取试剂盒提取粪便全基因组使用建立的基于副结核特异性片段IS900的PCR检测方法对300头牛粪便进行检测。2.8.1实验材料300份临床牛粪便采集在山东某牛场，样品做好编号，-20℃保存；粪便基因组提取试剂盒购自天根公司(CodeNo:DP328)2.8.2实验方法2.8.2.1粪便基因组提取临床采集牛副结核病可疑牛场粪便，使用天根粪便基因组提取试剂盒提取粪便全基因组，按照试剂盒说明书操作步骤如下：⑴称取粪便样品200mg至2ml离心管中，并将离心管置于冰上。⑵向样品中加入1.4ml缓冲液GSL，间歇振荡1min至样品混匀。⑶70℃孵育5min。⑷涡旋15sec。12,000rpm(~13,400×g)离心1min。转移上清液1.2ml至新的2ml离心管。⑸加入一个抑制剂吸附片InhibitEX，振荡至吸附片彻底打开重悬。室温孵育1min，使吸附片能充分作用。⑹12,000rpm(~13,400×g)离心3min。⑺将上一步所得上清液转移至新的1.5ml离心管，重复步骤6。⑻转移所得上清液200µl至新的1.5ml离心管，加入15µlProteinaseK。⑼加入200µl缓冲液GB，涡旋15sec。⑽70℃孵育10min。注意：简短离心以收集管壁及管盖上的液滴。⑾加入200µl无水乙醇，涡旋混匀。注意：简短离心以收集管壁及管盖上的液滴。⑿将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CR2中，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。⒀向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CR2放入收集管中。27 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用⒁向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CR2放入收集管中。⒂重复操作步骤⒁。⒃将吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。⒄将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存提取的核酸。2.8.2.2粪便样品PCR检测使用建立的基于副结核特异性插入序列IS900的PCR方法对提取的粪便样品核酸进行检测，操作步骤参照2.2.3，检测阳性数。2.9ELISA应用2.9.1实验材料300份牛血清采集在山东某牛场；牛感染副结核后不同时期的血清由本实验室制备保存。2.9.2试验方法分别使用基于副结核特异性抗原MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP0862-1345建立的ELISA方法，对300份临床采集的血清样本进行检测，相关操作步骤参照2.6.5，将检测结果与IDEXX副结核检测试剂盒检测结果进行对比，分别计算阳性符合率、阴性符合率以及总符合率。我们实验室前期对2头牛进行人工感染副结核分枝杆菌，分别标号为7、8号牛。分别使用IDEXX副结核抗体检测试剂盒与基于六种副结核特异性抗原的间接ELISA方法分别检测7号牛与8号牛感染后不同时期血清进行检测，研究感染后不同时期血清中针对六种副结核特异性蛋白的抗体变化规律。28 山东农业大学硕士学位论文2.10皮肤变态反应检测皮肤变态反应是基于迟发型变态反应原理进行的检测，能检出感染初期大部分隐性感染或者出于亚临床期未表现出明显症状的个体。此次我们使用副结核菌素对山东某牛场300头青年牛进行了皮肤变态反应检测。2.10.1实验材料提纯副结核菌素（购自中国兽医药品监察所）、游标卡尺、剪毛剪、0.9%氯化钠溶液、止血钳、酒精棉球、碘酒棉球、1ml塑料注射器、记录本、玻片、试管、解剖器械。2.10.2试验方法⑴注射步骤及术前处理：将牛只编号在颈侧中部上三分之一处剪毛（或提前一二天剪毛），三个月以内的犊牛，在肩胛部进行，直径10cm。用游标卡尺测量中央皮皱厚度，作好记录。注意，术部无明显的红、肿、热、硬等病变。⑵注射剂量：不论牛只大小一律皮内注射0.1ml（含2000IU的PPD-A）。即将牛副结核分枝杆菌PPD-A用0.9%氯化钠注射液稀释成每毫升2万IU后，皮内注射。冻干PPD-A稀释后应在当天用完，剩余的弃之。⑶注射方法：先以5%的碘酒棉球对术部进行消毒，再用75%的酒精棉球进行脱碘后，皮内注射定量的牛副结核分枝杆菌PPD-A。确保液体注射部位的正确，注射后局部应出现小疱，如果对注射有疑问，应选择15cm处的部位或对侧重做。⑷注射次数和观察反应：皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并以卡尺测量皮皱厚度，作好详细记录。对疑似反应牛应立即在同一侧以同一批PPD-A，同一剂量进行第二回皮内注射，再经72h观察反应结果。对阳性牛和疑似反应牛，于注射后96h和120h再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。2.10.3结果判定步骤阳性反应：局部有明显的炎性反应，皮厚差大于或等于4.0mm。疑似反应：局部炎性反应不明显，皮厚差大于或等于2.0mm、小于4.0mm。阴性反应：无炎性反应。皮厚差在2.0mm以下。29 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用3结果3.1副结核培养基制备草分枝杆菌复苏后于37℃温箱培养一周左右，每支生长状态良好的甘油琼脂斜面培养的草分枝杆菌转接一瓶三角瓶装1L甘油肉汤培养基，共转接了十八瓶，培养20天后取出培养基，于高压锅121℃高压60min后取出，待温度冷却后使用四层纱布滤收集菌体，将菌体于37℃烘箱干燥，收集菌块，使用菌块按照草分枝杆菌素提取步骤进行提取，共获得8.9g草分枝杆菌素。按照副结核培养基配制流程配制了副结核培养基，通过菌种复苏验证了培养基的有效性，经过30天培养复苏的四株菌株均在培养基上正常生产。对来自临床的300份样本进行细菌分离培养，未从临床上分离到副结核野毒株。草分枝杆菌素提取步骤见图1，副结核培养基制备与菌种生长状态示意图见图2。图1草分枝杆菌素提取步骤示意图Figure1SketchesofMycobactinextraction注：提取的副结核分枝杆菌素呈红棕色片状。30 山东农业大学硕士学位论文图2副结核培养基制备与菌种生长状态示意图Figure2PreparationofMAPculturemediumandgrowthstatusofMAP注：图左为制备的副结核培养基；图右为在副结核培养基上生长的副结核分枝杆菌，呈白色颗粒状。3.2基于副结核特异性片段IS900的PCR方法的建立使用该方法对提取的副结核菌株P10、P18、316F、III—V基因组进行扩增，均在位置出现单一扩增条带。经过条件摸索，PCR反应体系反应组分为：模板2μLExTaqDNA聚合酶25μLIS900F2μLIS900R2μLddH2O19μL反应程序为：98℃30S;98℃10S，55℃20S，72℃20S（30个循环）；72℃10min延伸PCR反应。在特异性试验中，使用四株副结核分枝杆菌基因组与本实验室保存的牛结核分枝杆菌基因组、草分枝杆菌基因组、禽结核分枝杆菌基因组、胞内分枝杆菌基因组进行扩增，结果只有四株副结核分枝杆菌基因组在位置出现单一扩增条带，而其他干扰菌的基因组均未出现目的条带，表明该方法具有较好的特异性，见图3。31 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用图3IS900PCR特异性实验结果Figure3SpecificexperimentalresultofIS900PCR注：1：P10，2P18，3：316F，4：III—V，5：牛结核分枝杆菌:，6：草分枝杆菌，7：禽结核分枝杆菌，8：胞内分枝杆菌3.3副结核分枝杆菌特异性抗原的克隆、表达与纯化3.3.1PCR扩增结果以副结核分枝杆菌P18基因组为模板分别对MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963进行PCR扩增，扩增出了目的大小与预期一致五个片段，见图3，分别以MAP0862与MAP1345基因为模板，经过重叠延伸PCR，扩增出了与预期大小一致的目的蛋白，见图4.图4五个PCR产物扩增图Figure4Amplificationfigureof5PCRproducts注:M:DL2000DNAMarker；1:MAP0855PCR产物；2：MAP0862PCR产物；3：MAP1345PCR产物；4：MAP2154PCR产物；5：MAP2963PCR产物32 山东农业大学硕士学位论文图5MAP0862、MAP1345、MAP0862-1345PCR扩增图Figure5PCRamplificationofMAP0862、MAP1345、MAP1345-0862注：M：DL2000MARKER1:MAP0862PCR产物2:MAP1345PCR产物3:MAP1345-0862PCR产物3.3.2重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析分别取诱导重组菌超声后上清、超声后沉淀、纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后，一块凝胶进行考马斯亮蓝染色；另外一块凝胶上的纯化后的目的蛋白使用伯乐凝胶转印系统转印到PVDF膜上，使用牛副结核阳性血清作为一抗，1:5000稀释的HRP标记的兔抗牛酶标抗体作为二抗，进行WesternBlot鉴定。33 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用图6六个重组蛋白的可溶性分析Figure6SolubleanalysisofsixrecombinantproteinM:蛋白Marker；1：含pET-MAP0855质粒的重组菌超声后上清；2：含pET-MAP0855质粒的重组菌超声后沉淀；3：含pET-MAP0862质粒的重组菌超声后上清；4：含pET-MAP0862质粒的重组菌超声后沉淀；5：含pET-MAP1345质粒的重组菌超声后上清；6：含pET-MAP1345质粒的重组菌超声后沉淀；7：含pET-MAP2154质粒的重组菌超声后上清；8：含pET-MAP2154质粒的重组菌超声后沉淀；9：含pET-MAP2963质粒的重组菌超声后上清；10：含pET-MAP2963质粒的重组菌超声后沉淀；11：含pET-MAP0862-1345质粒的重组菌超声后上清；6：含pET-MAP0862-1345质粒的重组菌超声后沉淀；34 山东农业大学硕士学位论文图7纯化后的五个目的蛋白Figure7Fiveproteinafterpurification注：M:蛋白分子量标准，1：His蛋白，2：纯化后的MAP0855蛋白，3：纯化后的MAP0862蛋白，4：纯化后的MAP1345蛋白，5：纯化后的MAP2154蛋白，6：纯化后的MAP2963蛋白图8纯化后的重组蛋白MAP0862-1345Figure8RecombinantproteinMAP0862-1345afterpurification注：M:蛋白分子量标准；1：纯化后的重组蛋白MAP0862-134535 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用3.3.3Westernblot鉴定结果纯化的重组蛋白MAP1345-0862、MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上进行Westernblot分析，结果在预期位置出现杂交条带，见图9图9重组蛋白Westernblot结果鉴定图Figure9Westernblotanalysisoftherecombinantprotein注：M：蛋白Marker；1:纯化后的MAP0862-1345蛋白，2：纯化后的MAP0855蛋白，3：纯化后的MAP0862蛋白，4：纯化后的MAP1345蛋白，5：纯化后的MAP2154蛋白，6：纯化后的MAP2963蛋白3.4ELISA方法的建立3.4.1优化后的ELISA条件采用方阵试验确定了最佳抗原包被浓度与血清稀释度，分别对三种不同的封闭液对本ELISA方法实验的背景值影响进行比较，对酶标抗体的最佳稀释度进行确立，同时在此基础上对该ELISA的其他条件进行确立，各优化后的最佳稀释条件见表7。36 山东农业大学硕士学位论文表7重组蛋白最佳ELISA条件Table7TheoptimizedconditionsoftheindirectELISA重组蛋白重组蛋白包被条件封闭条件待检血清酶标抗体MAP085520ng/ml5%明胶的PBST溶液1:2001:100004℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30minMAP086225ng/ml5%明胶的PBST溶液1:1001:10000最4℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30min佳MAP134525ng/ml5%脱脂奶的PBST溶液1:1001:50004℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30min参MAP215425ng/ml5%明胶的PBST溶液1:2001:10000数4℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30minMAP296320ng/ml5%脱脂奶的PBST溶液1:1001:100004℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30minMAP0862-134525ng/ml5%脱脂奶的PBST溶液1:1001:50004℃包被过夜4℃包被过夜37℃30min37℃30min3.4.2阴阳性血清临界值的确立取实验室保存的58份牛副结核阴性血清使用基于MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP0862-1345的ELISA方法测定OD450数值，经计算平均值与SD，以平均值加3倍的SD值作为阳性临界值，当结果大于临界值时判定为阳性，各结果见表8表8重组蛋白ELISA临界值Table8Cut-offvalueofrecombinantproteinELISA平均值SD临界值MAP08550.4120.0890.68MAP08620.2240.0550.389MAP13450.2580.0610.441MAP21540.3350.0760.563MAP29630.2460.0680.45MAP0862-13450.3550.0670.55637 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用3.4.3特异性试验结果使用初步建立的几种ELISA方法对经鉴定保存的血清进行检测以验证该方法的特异性，其中副结核病阳性牛血清18份、布病阳性牛血清10份、牛结核阳性血清15份、卡介苗免疫牛血清10份、牛阴性血清58份。结果见表9。表9重组蛋白ELISA特异性实验结果Table9Thespecificityexperimentresultsofrecombinantprotein副结核病阳性牛布病阳性牛血清牛结核阳性血清卡介苗免疫牛血牛阴性血清血清清P*N*PNPNPNPNMAP08551442841137850MAP08621711921328949MAP134516201031228553MAP215416237510461444MAP296315328411371246MAP0862-13451621911428850注：“P*”代表检测结果判定为阳性的结果，“N*”代表检测为阴性的结果。3.4.4符合性试验分别使用几种建立的ELISA方法对300份牛血清进行检测，并将结果与IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒检测结果进行比对，经阳性符合率以及阴性符合率，以及计算二者总符合率，结果见表10。基于各蛋白的间接ELISA符合率结果见表10-1至10-6。表10重组蛋白ELISA符合率结果Table10CoincidencerateofrecombinantproteinELISA阳性符合率阴性符合率总符合率MAP085557.7%86.8%84.3%MAP086276.9%96.0%94.3%MAP134580.7%94.9%93.7%MAP215419%72.0%73.6%MAP296350.0%90.1%86.7%MAP0862-134573.1%94.5%92.7%38 山东农业大学硕士学位论文表10-1MAP0855-iELISA符合率Table10-1CoincidencerateofMAP0855-iELISAIDEXXPN合P153651MAP0855N11238249合26274300表10-2MAP0862-iELISA符合率Table10-2CoincidencerateofMAP0862-iELISAIDEXXPN合P201131N6263269MAP086226274300合表10-3MAP1345-iELISA符合率Table10-3CoincidencerateofMAP1345-iELISAIDEXXPN合P211435MAP1345N5260265合26274300表10-4MAP2154-iELISA符合率Table10-4CoincidencerateofMAP2154-iELISAIDEXXPN合P55863MAP2154N21216237合2627430039 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用表10-5MAP2963-iELISA符合率Table10-5CoincidencerateofMAP2963-iELISAIDEXXPN合P132740MAP2963N13247260合26274300表10-6MAP0862-1345-iELISA符合率Table10-6CoincidencerateofMAP0862-1345-iELISAIDEXXPN合P191534MAP0862-1345N7259266合26274300使用IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒对300份临床血清进行检测，结果其中有26份显示为副结核阳性，274份为副结核阴性。分别使用初步建立的基于六种重组蛋白的ELISA方法对于这300份血清进行检测并计算符合率。其中基于MAP0862的ELISA方法与IDEXX检测试剂盒的总符合率最高，为94.3%，基于MAP2154的ELISA方法与IDEXX检测试剂盒的总符合率最低，为73.6%。此次我们共收集到300份临床样本，对于初步建立的基于六种副结核特异性蛋白的间接ELISA方法符合率的计算需要补充阳性样本进行进一步评价。基于六种重组蛋白的ELISA方法在本次检测中均存在着阳性符合率低的缺点，分析原因是由于阳性样本较少，对于进一步的客观评价基于六种蛋白的ELISA方法的可行性，需要进一步的增加检测样本。实验结果中存在着阳性符合率低的缺点，分析可能原因一是其中阳性样本较少导致阳性符合率较低，在本次检测中使用IDEXX副结核检测试剂盒共检测26份副结核阳性血清，后期需要进一步增加副结核阳性样本以对该方法进行进一步评价。二是牛感染副结核后不同时期MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP1345-0862蛋白的表达量不同，导致牛血清中针对该蛋白的特异性抗体含量不同，对于蛋白表达量较低时期应用该方法可能不能有效的检测出抗体存在。40 山东农业大学硕士学位论文3.5牛感染副结核后不同时期几种副结核特异性蛋白的抗体变化规律我们实验室前期对3头牛进行人工感染副结核分枝杆菌，分别标号为7、8、9号牛。由于9号牛血清丢失，只收集到了其中两7号牛与8号牛血清。使用IDEXX副结核抗体检测试剂盒检测7号牛与8号牛感染后不同时期血清抗体变化规律。7号牛不同时期的血清检测结果均表现出较低的抗体检测值，全程被判定为阴性。8号牛感染4周后判定为阳性并持续升高维持在较高的水平，在第14周抗体达到最高水平，在第14周后抗体水平逐渐下降，在第20周之后判定为阴性。为了研究感染后不同时期针对几种特异性抗原的抗体变化规律，使用基于六种副结核特异性抗原的ELISA方法对7号牛与8号牛不同时期的血清进行检测，研究感染后不同时期血清中针对六种副结核特异性抗原的抗体变化规律，并使用初步建立的临界值判定阴阳性。血清中针对六种副结核特异性蛋白的抗体变化规律见图10至图18。图10MAP0855抗体变化规律Figure10AntibodychangeregularityofMAP08557号牛感染后不同时期的血清使用基于MAP0855的抗体检测均判定为阴性，表现出较低的抗体检测值。8号牛感染4周后的血清使用基于MAP0855的抗体检测判定为副结核阳性，针对MAP0855的抗体水平持续升高至第8周达到最高水平，之后抗体水平开始下降，至第14周后抗体水平降到临界值附近，在第24周后抗体水平有平缓的上升趋势，仍维持在临界值附近。41 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用图11MAP0862抗体变化规律Figure11AntibodychangeregularityofMAP08627号牛感染后不同时期的血清使用基于MAP0862的抗体检测均判定为阴性，表现出较低的抗体检测值。8号牛感染4周后的血清使用基于MAP0862的抗体检测判定为副结核阳性，针对MAP0862的抗体水平持续升高至第8周达到最高水平，之后抗体水平开始出现下降，第12周至第32周基于MAP0862的抗体水平持续维持在相同的水平，至第32周仍判定为阳性。图12MAP1345抗体变化规律Figure12AntibodychangeregularityofMAP13457号牛不同时期的血清使用基于MAP1345的抗体检测结果全程围绕在临界值附近，抗体水平较低。42 山东农业大学硕士学位论文8号牛感染4周后的血清使用基于MAP1345的抗体检测判定为副结核阳性，针对MAP1345的抗体水平持续升高，至第8周达到最高水平，之后抗体水平开始出现下降，到第14周达到临界值附近，之后抗体水平出现小幅度的上升趋势，至第28周后仍能判定为阳性。图13MAP2154抗体变化规律Figure13AntibodychangeregularityofMAP2154感染后的血清使用基于MAP2154的抗体检测持续判定为阴性，针对MAP2154的抗体水平一直维持在较低的水平，血清中缺乏针对MAP2154的特异性抗体。图14MAP2963抗体变化规律Figure14AntibodychangeregularityofMAP296343 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用7号牛不同时期的血清使用基于MAP1345的抗体检测结果全程围绕在临界值附近，抗体水平较低。8号牛感染4周后的血清使用基于MAP2963的抗体检测判定为副结核阳性，针对MAP2963的抗体水平持续升高，至第8周后达到最高水平，之后抗体水平开始出现下降，持续到第20周，在第24周出现短暂的抗体水平上升趋势，之后下降，感染后至第32周的血清均判定为阳性。图15MAP0862-1345抗体变化规律Figure15AntibodychangeregularityofMAP0862-13457号牛不同时期的血清使用基于MAP1345的抗体检测结果全程围绕在临界值附近，抗体水平较低。8号牛感染4周后的血清使用基于MAP0862-1345的抗体检测判定为副结核阳性，针对MAP0862-1345的抗体水平持续升高，至第8周达到最高水平，之后抗体水平开始出现下降，到第14周达到临界值附近，之后抗体水平出现小幅度的上升趋势，至第32周后仍能判定为阳性。44 山东农业大学硕士学位论文图16His蛋白抗体变化规律Figure16AntibodychangeregularityofHisprotein感染后不同时期的血清使用纯化后的His蛋白包被的酶标板进行检测，不同时期测定的OD值均小于几种副结核特异性蛋白的临界值，因此可以排除标签蛋白在血清学诊断中的干扰。为了研究具有较好诊断作用的MAP0862与MAP1345的可能抗原位点，我们使用DNAstar软件分析了其中具有良好抗原性的位点，将多肽序列进行人工合成，并同样初步摸索ELISA条件，对其在血清学诊断中的作用进行研究，检测其在8号感染牛血清中的抗体变化规律，见图17与图18。图17MAP0862与MAP2#抗体变化规律Figure17AntibodychangeregularityofMAP0862andMAP2#45 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用8号牛血清中针对人工合成的多肽MAP2#与MAP0862出现了较好的一致性，变化趋势相同，MAP2#可以作为副结核诊断用抗原。图18MAP1345与MAP3#抗体变化规律Figure18AntibodychangeregularityofMAP1345andMAP3#8号牛血清中针对人工合成的多肽MAP3#与MAP1345出现了较好的一致性，变化趋势相同，MAP3#可以作为副结核诊断用抗原。3.6检测方法在临床上的应用3.6.1细菌分离培养方法对临床样本牛进行检测本次检测未从临床上分离到副结核分枝杆菌，污染率较高，存在芽孢、霉菌污染结果，同时由于长期培养，对于培养基有较高的要求，进一步的改进培养基有利于长时间培养。3.6.2PCR方法对300头临床牛进行检测使用建立的基于副结核特异性片段IS900的PCR检测方法对300头牛粪便进行检测，有38份显示为副结核阳性。46 山东农业大学硕士学位论文3.6.3ELISA应用分别使用基于副结核特异性抗原MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP0862-1345对300份临床血清进行检测并使用IDEXX试剂盒进行对比。检测出的阳性数、阴性数以及与IDEXX总符合率见表11。表11基于重组蛋白的ELISA与IDEXX试剂盒符合率Table11CoindicencerateofrecombinantELISAwithIDEXX重组蛋白阳性数阴性数与IDEXX总符合率MAP08555124984.3%MAP08623126994.3%MAP13453526593.7%MAP21546323773.6%MAP29634026086.7%MAP0862-13453426692.7%IDEXX262743.6.4皮试试验检测山东地区牛使用副结核菌素在300头牛上进行皮肤变态反应检测，其中有33头显示为副结核阳性。47 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用4讨论牛副结核病是一种慢性传染病，由于其潜伏期较长，存在一个较长的亚临床期，处于亚临床期的牛无明显的症状，同时排菌量不明显，血清中的抗体水平不高，给及时发现并淘汰阳性牛带来了很大的困难(Sweeney,1996)。作为一种胞内寄生菌，感染副结核的牛存在着细胞免疫与体液免疫分离的现象，目前对于副结核的检测主要有基于病原学、细胞免疫以及体液免疫的检测方法(Slanaetal.,2008)，由于三种检测方法基于的原理不同，针对感染后的不同阶段，不同方法的敏感性与特异性存在着较大的差异，本次我们希望系统的比较基于不同检测原理的检测方法的适用阶段，以对副结核的检测提供帮助。本次我们通过从基于病原学检测的细菌分离培养与PCR检测、基于细胞免疫的皮肤变态反应，基于体液免疫的ELISA，对机体感染副结核分枝杆菌进行研究。4.1细菌分离培养以及PCR鉴定对于病原学检测，本次成功的配制了副结核培养基并通过菌种复苏对培养基的有效性进行了验证，然而并未从临床上分离到副结核感染菌，目前副结核细菌分离一直是一个难题，对于样品的处理方法十分重要，过高浓度的酸处理会引起样品中的副结核分枝杆菌被杀死，过低浓度的酸处理不能完全的杀死样品中的干扰菌导致培养基的污染。同时由于长期培养，对于培养基的保存期也提出了很高的要求，进一步的优化样品处理方法以及增加培养基的保存时间十分重要。建立的基于副结核特异性插入序列IS900的PCR诊断方法具有较好的特异性，可以检测出粪便样品中是否带菌，使用建立的基于副结核特异性片段IS900的PCR检测方法对300头牛粪便进行检测，有38份显示为副结核阳性，对于26头使用IDEXX试剂盒判定为阳性的牛，本次使用PCR方法有22头检测判定为阳性，其余4头判为阴性，另外有16头血清学检测为阴性的牛的粪便样品检测为副结核阳性。分析原因是由于部分处于血清学检测为阳性的牛并未出现排菌现象或者是粪便中含有极少量的菌，应用PCR方法未能检测出来，同时对于在PCR检测中呈阳性而血清学检测中呈阴性的牛，是由于感染个体出现了明显的排菌现象，然而血清中针对副结核的抗体水平未达到检出水平。48 山东农业大学硕士学位论文4.2重组蛋白在血清学诊断中的应用基于体液免疫的检测，我们主要是寻找具有鉴别诊断作用的副结核特异性抗原，本次我们成功的表达了具有较高纯度的六个副结核特异性蛋白，并通过SDS-PAGE与Western-blot对其蛋白分子量大小、表达形式以及抗原性进行分析。SDS-PAGE结果表明目的蛋白符合预期大小。经过纯化获得了具有较高纯度的六个副结核特异性蛋白，Western-blot结果表明这六个重组蛋白具有较好的反应性。将表达的副结核特异性蛋白纯化定量后包被酶标板，经过一系列条件摸索，初步建立了针对六种副结核特异性蛋白的间接ELISA方法，分别计算了阳性临界值、进行了特异性实验以验证几种干扰血清对其影响。目前仍然缺少牛副结核病的诊断参考标准，当前IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒被美国农业部作为标准在全国范围内对牛副结核病进行检测，此次我们以IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒检测结果作为参考标准，使用基于六种原核表达的副结核特异性抗原的间接ELISA对300份临床牛血清进行检测，使用判定的阴阳性临界值对临床血清阴阳性进行判定，并将检测出的结果与IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒检测标准进行对比，同时计算符合率。本次检测使用IDEXX试剂盒共检测出26份阳性血清，274份阴性血清，在300头青年牛群体中的检测结果表明该牛场牛副结核阳性率为8.67%，由于还可能存在着处于亚临床期的感染牛，血清中的抗体水平较低未达到检出水平，也显示出该牛场存在着较高的牛副结核感染率。提示我们对于牛场的副结核发病现状需要引起重视。其中基于副结核特异性蛋白MAP0862与MAP1345的检出结果与IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒总符合率最高，分别为94.3%与93.7%，表明基于副结核特异性蛋白MAP0862与MAP1345的间接ELISA方法具有较好的符合率，其中阴性符合率分别为96.0%与94.9%，阳性符合率分别为76.9%与80.7%，阳性率较低，分析原因是由于检测样本中阳性样本太少，进一步需要增加检测样本量以对本方法的阳性符合率进行验证。为了进一步探索在协同作用下副结核特异性蛋白MAP0862与MAP1345在血清学检测中的作用，对两个蛋白进行了串联表达，研究其在血清学诊断中的作用。使用基于MAP1345-0862蛋白初步建立的ELISA方法检测300份临床血清的结果与IDEXX试剂盒进行对比，分别计算总符合率、阴性符合率与阳性符合率，分别为92.7%、94.5%、49 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用73.1%，其检测结果与副结核特异性蛋白MAP0862与MAP1345在单独存在下的诊断作用效果相似，并没有明显变化。基于副结核特异性蛋白MAP0855与MAP2154的检出结果与IDEXX牛副结核抗体检测试剂盒的总符合率最低，分别为84.3%与73.6%，阳性符合率分别为57.7%与19%，这两种蛋白在诊断中的作用效果不明显，分析原因一方面是由于机体感染该菌后这两种蛋白的表达量不高，血清中针对这两种蛋白的抗体水平较低，因此阳性检出率较低。另外一方面是由于可能在机体感染的不同时期，这两种蛋白的表达量不同，本次检测的样本处于的感染阶段这两种蛋白的表达量不高。此次我们共收集到300份临床样本，对于初步建立的基于六种副结核特异性蛋白的间接ELISA方法符合率的计算需要补充阳性样本进行进一步评价。基于六种重组蛋白的ELISA方法在本次检测中均存在着阳性符合率低的缺点，分析原因是由于阳性样本较少，对于进一步的客观评价基于六种蛋白的ELISA方法的可行性，需要进一步的增加检测样本。实验结果中存在着阳性符合率低的缺点，分析可能原因一是其中阳性样本较少导致阳性符合率较低，在本次检测中使用IDEXX副结核检测试剂盒共检测26份副结核阳性血清，后期需要进一步增加副结核阳性样本以对该方法进行进一步评价。二是牛感染副结核后不同时期MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963、MAP1345-0862蛋白的表达量不同，导致牛血清中针对该蛋白的特异性抗体含量不同，对于蛋白表达量较低时期应用该方法可能不能有效的检测出抗体存在。我们实验室前期对3头牛人工感染副结核分枝杆菌，分别标号为7、8、9号牛，其中9号牛的实验样本丢失，只收集到了7号牛与8号牛的血清。其中对7号牛在感染后不同时期进行的皮肤变态反应检测均具有较高的检测值，然而对其血清进行的抗体检测结果表明抗体维持在较低的水平，这提示我们牛副结核病诊断潜在的困难性。皮肤变态反应主要是基于细胞免疫，对于7号牛感染后不同时期的的检测结果表明该头牛在感染后机体存在着较强的细胞免疫反应，然而采集的不同时期的血清中抗体水平维持在较低的水平表明盖头牛在感染后的体液免疫反应水平较低。为了研究血清中针对几种副结核特异性蛋白的抗体变化规律，使用基于几种副结核特异性蛋白的间接ELISA方法对我们实验室前期保存的副结核感染后不同时期的血清进行检测。由于7号牛感染后不同时期的血清抗体变化不明显，本次主要讨论8号牛感染副结核后不同时期血清中分别针对5种重组蛋白MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2154、MAP2963的抗体变化规律，结合血清中针对各种蛋白的抗体水平变化可以50 山东农业大学硕士学位论文发现，血清中针对MAP2154的抗体变化规律不明显，在全程可以判为阴性。在感染后的前8周，针对MAP0855、MAP0862、MAP1345、MAP2963抗体水平显著上升，并且均在第8周达到抗体水平最高峰。在随后的第8到14周，血清中针对4种重组蛋白的抗体水平开始下降。在第14周时，针对MAP0855的抗体水平降低到临界值以下，此时针对MAP0855的抗体检测结果可以判定为阴性，针对MAP1345、MAP2963的抗体检测结果降到临界值附近，仍可判定为阳性，针对MAP0862的抗体水平仍维持在较高水平，在第14周至20周时针对4种副结核特异性蛋白的抗体变化不明显，对于MAP0855的抗体检测值仍然判为阴性。第20周至第24周，血清中针对MAP0855、MAP1345、MAP2963的抗体水平均出现上升趋势，针对MAP0862的抗体变化维持在之前的水平，按照确定的阳性判定标准，使用基于这四种特异性蛋白的ELISA方法均可以将感染牛判定为阳性。第24周至第32周，血清中针对MAP0855、MAP0862的抗体变化维持在之前的水平，针对MAP1345、MAP2963的抗体水平出现下降趋势，针对MAP1345的抗体水平降到临界值附近，此时使用基于MAP0855、MAP0862、MAP2963的ELISA方法可以将感染牛判定为阳性。为了研究具有较好诊断作用的MAP0862与MAP1345中可能存在的抗原位点，我们使用DNAstar软件分析了其中具有良好抗原性的位点，将具有良好抗原性的多肽序列进行人工合成，并同样初步摸索ELISA条件，对其在血清学诊断中的作用进行研究，检测其在感染牛血清中的抗体变化规律。人工合成的多肽序列对于人工感染副结核牛的血清检测结果与MAP0862与MAP1345的检测结果一致，表明合成的多肽序列具有较好的诊断作用，可以研究其进一步在血清学诊断中的应用。4.3皮肤变态反应检测结果本次通过皮肤变态反应在山东某牛场对300头牛进行检测，计算皮厚差，结果表明其中有33头显示为副结核阳性，使用皮肤变态反应检出阳性率为11%。由于皮肤变态反应使用的副结核菌素是一种复合物，与牛结核分枝杆菌存在共同抗原成分，对于部分牛结核阳性牛，使用皮试实验同样会有部分个体会显示为副结核阳性，然而由于皮肤变态反应检测成本较低，目前仍然是大部分牛场常用的检测方法，因此比较皮试检测结果同样具有重要性。使用IDEXX副结核检测试剂盒对33头在皮试中显示副结核阳性牛的51 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用血清学检测结果有9头牛为副结核阳性，如果单从阳性率分析，皮试检测具有更高的敏感性，但是考虑到副结核菌素成分不明，很容易与牛结核分枝杆菌以及其他环境分枝杆菌，因此其特异性仍有待进一步研究，部分由于其他干扰菌引起的牛感染会导致假阳性结果的出现。52 山东农业大学硕士学位论文5结论5.1成功提取了草分枝杆菌素并制备了副结核培养基。5.2基于副结核特异性序列IS900的PCR检测方法能够有效的检测出待检样品中的病原，特异性好。5.3原核表达副结核分枝杆菌5个特异性蛋白，并对其ELISA诊断价值进行了评价。其中，MAP0862与MAP1345具有较好的诊断价值，与IDEXX副结核检测试剂盒的总符合率分别为94.3%与93.7%。串联表达的MAP0862-1345与两个蛋白在单独存在的情况下诊断效果类似，与IDEXX副结核检测试剂盒的总符合率为92.7%。5.4使用基于不同检测原理的检测方法对于副结核的检测结果存在差异，应通过多种方法定期检测种群状态，及时淘汰阳性牛，控制该病发展。53 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用参考文献陈茹,刘中勇,高小博,刘志玲,吴晓薇,曾碧健,罗长保,林志雄.副结核荧光PCR试剂盒研制与应用.微生物学通报,2009,36(2):292-297.付志金,宋战昀,侯红燕,王振国,王亚丽,王全凯.吉林省梅花鹿副结核病血清流行病学调查.中国农学通报,2013,29(29):57-60.巩红霞,巩强.人克罗恩氏病与奶中副结核菌-人类关注的热点.医学信息,2015,28(7).巩强,巩红霞.牛乳中副结核分枝杆菌套式PCR检测方法的建立.中国生物制品学杂志,2012,25(008):1045-1048.郭莹莹,陈关勇,马世福.副结核分歧杆菌IS900基因的检测方法.养殖技术顾问,2014(4):219-219.何昭阳,韩有库,顾万钧,钱爱东,李卯年.牛副结核ELISA诊断方法研究.畜牧兽医学报,1991,22(1):57-60.孔繁德.副结核分枝杆菌诊断技术的研究进展.检验检疫科学,2004,14(B12):57-60.林涛.规模化奶牛场副结核快速诊断方法的比较,of甘肃农业大学,2012.刘倩,唐泰山,廉慧锋,王凯民,张常印,雷治海.副结核分支杆菌Hed蛋白的抗原性分析及在间接ELISA中的应用.南京农业大学学报,2011,34(1):113-117.李明,贾红,鑫婷,郭晓宇,袁维锋,侯邵华,侯强,高新桃,吴竞,董瑞凯.牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价.中国畜牧兽医,2015,42(10):2544-2550.孟文军,刘刚,王建东.牛副结核病的临床及病理学诊断.上海畜牧兽医通讯,2015(2):54-55.乔艳双.成年牛副结核病的诊治和防控.畜牧兽医科技信息,2007(3):48-48.王建峰,黄素文,刘思国,倪建波,王春,张吉红,于纪棉,朱堂明,黄绍棠.牛副结核分枝杆菌LAMP快速检测方法的建立.中国预防兽医学报,2012,34(7):555-557.颜思通,林志雄,朱道中,鱼海琼,曹志玲.微量补体结合试验检测牛,羊副结核病的研究.中国动物检疫,2004,21(11):23-26.54 山东农业大学硕士学位论文AlySS,GardnerIA,AdaskaJM,AndersonRJ.Off-siterearingofheifersreducestheriskofMycobacteriumaviumssp.paratuberculosisELISAseroconversionandfecalsheddinginaCaliforniadairyherd.Journalofdairyscience,2015,98(3):1805-1814.ArsenaultRJ,LiY,BellK,DoigK,PotterA,GriebelPJ,KusalikA,NapperS.Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinhibitsgammainterferon-inducedsignalinginbovinemonocytes:insightsintothecellularmechanismsofJohne'sdisease.Infectionandimmunity,2012,80(9):3039-3048.BannantineJP,BaechlerE,ZhangQ,LiL,KapurV.GenomescalecomparisonofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosiswithMycobacteriumaviumsubsp.aviumrevealspotentialdiagnosticsequences.Journalofclinicalmicrobiology,2002,40(4):1303-1310.BannantineJP,LiL,MwangiM,CoteR,GarayJAR,KapurV.CompletegenomesequenceofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis,isolatedfromhumanbreastmilk.Genomeannouncements,2014,2(1):e01252-01213.BotsarisG,LiapiM,KakogiannisC,DoddCE,ReesCE.DetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinbulktankmilkbycombinedphage-PCRassay:evidencethatplaquenumberisagoodpredictorofMAP.Internationaljournaloffoodmicrobiology,2013,164(1):76-80.BurrellsC,InglisN,DaviesR,SharpJ.DetectionofspecificTcellreactivityinsheepinfectedwithMycobacteriumaviumsubspeciessilvaticumandparatuberculosisusingtwodefinedmycobacterialantigens.Veterinaryimmunologyandimmunopathology,1995,45(3):311-320.BuergeltC,WilliamsE.InuteroinfectionofpregnantcattlebyMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisdetectedbynestedpolymerasechainreaction.JournalofAppliedResearchinVeterinaryMedicine,2003,1(4):279-284.ChiodiniR.AbolishMycobacteriumparatuberculosisstrain18.Journalofclinicalmicrobiology,1993,31(7):1956.ChiJ,VanLeeuwenJA,WeersinkA,KeefeGP.Directproductionlossesandtreatmentcostsfrombovineviraldiarrhoeavirus,bovineleukosisvirus,Mycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosis,andNeosporacaninum.Preventiveveterinarymedicine,2002,55(2):137-153.DebR,SaxenaVK,GoswamiP.DiagnostictoolsagainstMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisinfectioninanimals:Areview.AgriculturalReviews,2011,32(1):46-54.55 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用DonatK,KubeJ,DresselJ,EinaxE,PfefferM,FailingK.DetectionofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisinenvironmentalsamplesbyfaecalcultureandreal-timePCRinrelationtoapparentwithin-herdprevalenceasdeterminedbyindividualfaecalculture.Epidemiologyandinfection,2015,143(05):975-985.GumberS,EamensG,WhittingtonR.EvaluationofaPourquierELISAkitinrelationtoagargelimmunodiffusion(AGID)testforassessmentofthehumoralimmuneresponseinsheepandgoatswithandwithoutMycobacteriumparatuberculosisinfection.Veterinarymicrobiology,2006,115(1):91-101.HopeA,KluverP,JonesS,CondronR.Sensitivityandspecificityoftwoserologicaltestsforthedetectionofovineparatuberculosis.Australianveterinaryjournal,2000,78(12):850-856.HudaA,LindP,ChristoffersenA-B,JungersenG.Analysisofrepeatedtestsforinterferon-gamma(IFN-γ)responseandfaecalexcretionfordiagnosisofsubclinicalparatuberculosisinDanishcattle.Veterinaryimmunologyandimmunopathology,2003,94(3):95-103.JørgensenJB.Pathogenicityandimmunogenicityofatypicalmycobacteriaforcalves:Ashortsummary.ReviewofInfectiousDiseases,1981,3(5):979-980.JubbT,SergeantE,CallinanA,GalvinJ.EstimateofthesensitivityofanELISAusedtodetectJohne'sdiseaseinVictoriandairycattleherds.Australianveterinaryjournal,2004,82(9):569-573.KalisC,CollinsM,HesselinkJ,BarkemaH.Specificityoftwotestsfortheearlydiagnosisofbovineparatuberculosisbasedoncell-mediatedimmunity:theJohninskintestandthegammainterferonassay.Veterinarymicrobiology,2003,97(1):73-86.KholJL,PinedoPJ,BuergeltCD,NeumannLM,RaeDO.LymphaticfluidforthedetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisincowsbyPCR,comparedtofecalsamplinganddetectionofantibodiesinbloodandmilk.Veterinarymicrobiology,2014,172(1):301-308.KralikP,SlanaI,KralovaA,BabakV,WhitlockRH,PavlikI.DevelopmentofapredictivemodelfordetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinfaecesbyquantitativerealtimePCR.Veterinarymicrobiology,2011,149(1):133-138.LeiteFL,ReinhardtTA,BannantineJP,StabelJR.EnvelopeproteincomplexesofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisandtheirantigenicity.Veterinarymicrobiology,2015,175(2):275-285.56 山东农业大学硕士学位论文LepperA,WilksC,KotiwM,WhiteheadJ,SwartK.Sequentialbacteriologicalobservationsinrelationtocell‐mediatedandhumoralantibodyresponsesofcattleinfectedwithMycobacteriumparatuberculosisandmaintainedonnormalorhighironintake.AustralianVeterinaryJournal,1989,66(2):50-55.LombardJE.Epidemiologyandeconomicsofparatuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmerica:FoodAnimalPractice,2011,27(3):525-535.LeeSJ,NohKT,KangTH,HanHD,ShinSJ,SohBY,ParkJH,ShinYK,KimHW,YunC-H.TheMycobacteriumaviumsubsp.ParatuberculosisproteinMAP1305modulatesdendriticcell-mediatedTcellproliferationthroughToll-likereceptor-4.BMBreports,2014,47(2):115-120.LombardJ,GardnerI,JafarzadehS,FosslerC,HarrisB,CapselR,WagnerB,JohnsonW.Herd-levelprevalenceofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinfectioninUnitedStatesdairyherdsin2007.Preventiveveterinarymedicine,2013,108(2):234-238.LybeckKR,StorsetAK,DjønneB,ValheimM,OlsenI.FaecalsheddingdetectedearlierthanimmuneresponsesingoatsnaturallyinfectedwithMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.Researchinveterinaryscience,2011,91(1):32-39.ManningE,CollinsM.Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis:pathogen,pathogenesisanddiagnosis.Revuescientifiqueettechnique(InternationalOfficeofEpizootics),2001,20(1):133-150.McFaddenJ,ButcherP,ChiodiniR,Hermon-TaylorJ.Crohn'sdisease-isolatedmycobacteriaareidenticaltoMycobacteriumparatuberculosis,asdeterminedbyDNAprobesthatdistinguishbetweenmycobacterialspecies.JournalofClinicalMicrobiology,1987,25(5):796.McGregorH,AbbottKA,WhittingtonRJ.EffectsofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinfectiononserumbiochemistry,bodyweightandwoolgrowthinMerinosheep:Alongitudinalstudy.SmallRuminantResearch,2015,125:146-153.MöbiusP,HotzelH,RaßbachA,KöhlerH.Comparisonof13single-roundandnestedPCRassaystargetingIS900,ISMav2,f57andlocus255fordetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis.Veterinarymicrobiology,2008,126(4):324-333.MercierP,BaudryC,BeaudeauF,SeegersH,MalherX.EstimatedprevalenceofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisinfectioninherdsofdairygoatsinFrance.VeterinaryRecord:JournaloftheBritishVeterinaryAssociation,2010,167(11).57 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用MotiwalaAS,AmonsinA,StrotherM,ManningEJ,KapurV,SreevatsanS.MolecularepidemiologyofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisisolatesrecoveredfromwildanimalspecies.Journalofclinicalmicrobiology,2004,42(4):1703-1712.NielsenSS,ToftN.Antemortemdiagnosisofparatuberculosis:areviewofaccuraciesofELISA,interferon-γassayandfaecalculturetechniques.Veterinarymicrobiology,2008,129(3):217-235.OIEA.Manualofdiagnostictestsandvaccinesforterrestrialanimals.OfficeInternationaldesEpizooties,Paris,France,2008:1092-1106.RousseyJ,CoussensP.EffectsofregulatoryTcellsonperipheralbloodmononuclearcellresponsestoliveMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisincowswithJohne’sdisease.(VET2P.1035).TheJournalofImmunology,2014,192(1Supplement):207.207-207.207.SevillaI,SinghS,GarridoJ,AdurizG,RodriguezS,GeijoM,WhittingtonR,SaundersV,WhitlockR,JusteR.MoleculartypingofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisstrainsfromdifferenthostsandregions.Revuescientifiqueettechnique-Officeinternationaldesépizooties,2005,24(3):1061.StabelJ,BannantineJ.DevelopmentofanestedPCRmethodtargetingauniquemulticopyelement,ISMap02,fordetectionofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisinfecalsamples.Journalofclinicalmicrobiology,2005,43(9):4744-4750.ShankarH,SinghS,SinghP,SinghA,SohalJ,GreensteinR.Presence,characterization,andgenotypeprofilesofMycobacteriumaviumsubspeciesparatuberculosisfromunpasteurizedindividualandpooledmilk,commercialpasteurizedmilk,andmilkproductsinIndiabyculture,PCR,andPCR-REAmethods.InternationalJournalofInfectiousDiseases,2010,14(2):e121-e126.SlanaI,PaolicchiF,JanstovaB,NavratilovaP,PavlikI.DetectionmethodsforMycobacteriumaviumsubspparatuberculosisinmilkandmilkproducts:areview.VETERINARNIMEDICINA-PRAHA-,2008,53(6):283.SweeneyRW.Transmissionofparatuberculosis.VeterinaryClinicsofNorthAmerica:FoodAnimalPractice,1996,12(2):305-312.SyamR,KollannurJ,RemyaV,KuttyM,BeghumJ,DasP.EFFECTOFSAPONIFIEDKILLEDMYCOBACTERIUMAVIUMSUBSPAVIUMVACCINEONFAECALSHEDDINGOFMAVIUMSUBSPPARATUBERCULOSISINFECTIONINMICE.Ind.J.Sci.Res.Tech,2014,2(3):37-39.58 山东农业大学硕士学位论文TwortC.THEISOLATIONANDPRESERVATIONOFTUBERCLEBACILLIBYMEANSOFGLYCERINE.TheLancet,1922,200(5180):1221.WoodbineKA,SchukkenYH,GreenLE,Ramirez-VillaescusaA,MasonS,MooreSJ,BilbaoC,SwannN,MedleyGF.SeroprevalenceandepidemiologicalcharacteristicsofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosison114cattlefarmsinsouthwestEngland.Preventiveveterinarymedicine,2009,89(1):102-10959 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用致谢时间飞逝，转眼三年的研究生学习生活即将落下帷幕，在这三年的研究生学习阶段，使我受益良多，这一段的经历使我受益颇多，将会影响我以后的人生阶段，也会在我未来的生活和工作给予指导，引领我人生的方向。首先，我将最诚挚的感谢以及尊敬献给我的导师，常维山教授与丁家波研究员，在过去的三年学习阶段中，恩师渊博的学识、严密的逻辑思维方式、严谨的治学态度、活跃的科学思维、精诚敬业的工作作风一直深深地激励着我，将使我终生受益。恩师的言传身教，是我在求学路上最宝贵的收获，是我整个人生中最珍贵的财富，是我心灵深处最深刻的记忆。两位恩师将我领入科研的殿堂，不仅教会了我科研的能力，更从生活上教会了我很多为人处事的道理，接人待物的能力，让我面对挫折时不害怕，让我面对困境时勇于突破困难的藩篱，让我面对成绩时不骄傲，让我面对失败时不沮丧，相信两位老师对我的谆谆教导将会影响我一生的道路，我在今后的日子里不会忘记他们的教导。我的研究生课题是在山东农业大学以及中国兽医药品监察所共同完成的，在此期间，我还是需要再次感谢常维山教授与丁家波研究员两位老师在实验设计上给予我的帮助以及指导，使我锻炼了自己的科研能力，让我掌握了本领，也培养了我对科研的兴趣。感谢动科院各位领导以及预防兽医系的各位老师给予我的指导。感谢中国兽医药品监察所布课题组朱良全副研究员、蒋卉博士、彭晓薇博士在学习以及生活上对我给予的帮助。感谢中国兽医药品监察所细菌室毛开荣研究员对我学习的引领，张尔利老师在草分枝杆菌素提取、副结核培养基制备、细菌分离培养方面给予我的大力帮助。感谢山东农业大学王雪鹏副教授在学习以及实验方面对于我的帮助。感谢山东省奶牛中心杨宏军副研究员在实验动物饲养以及临床实践中给予我提供的多方面帮助以及指导。感谢山东农业大学常维山教授实验室11年的蒋磊师兄、李超师兄、郑蓓师姐、庄燕飞师姐，12级的冯宇师兄、王敏、邢林林、孟芳、戴秀美、崔笑博师姐，以及13级的郭树源、赵翠、庞晓茹、王蕾、解相霞，14、15级的各位师弟师妹对我的帮助。感谢中国兽医药品监察所检测技术研究室的刘灿博士、以及13的张玉杰、张金亚、陈锐、张东东，14级的张阁、孙翠丽，15级的彭勇对我在给予我的帮助。60 山东农业大学硕士学位论文最后感谢山东农业大学与中国兽医药品监察所为我提供的良好的生活环境以及浓厚的学习氛围。再一次向所有关心、指导和帮助过我的各位老师们和同学们表示衷心的感谢！2016年6月山东农业大学61 牛副结核病诊断方法的建立及其初步应用发表文章张振，冯宇，张阁，朱良全，蒋卉，丁家波，赵鹏，常维山.副结核分枝杆菌MAP0862蛋白的表达及在间接ELISA中的初步应用[J].畜牧兽医学报,2016,47(4):789-795.张振，常维山，丁家波.副结核分枝杆菌感染的免疫应答与检测方法研究进展.微生物学报，2016.5.9网络优先发表，2016.10正式发表。张振，张阁，彭永，彭小薇，孙翠丽，常维山，朱良全，丁家波.副结核分枝杆菌MAP0862、MAP1345基因的融合表达及其在间接ELISA中的初步应用.中国兽药杂志，已录用，2016.6正式发表。Zhu,L.,Feng,Y.,Zhang,G.,Jiang,H.,Zhang,Z.,Wang,N.,...&Suo,X.(2016).Brucellasuisstrain2vaccineissafeandprotectiveagainstheterologousBrucellaspp.infections.Vaccine,34(3),395-400.62