牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备与双抗夹心ELISA方法的建立

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1、密级：：论文编号中国农业科学院学位论文牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备与双抗夹心ＥＬＩＳＡ方法的建立ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｇａｉｎｓｔＢｏｖｉｎｅＶｉｒａｌＤｉａｒｒｈｅａＶｉｒｕｓａｎｄＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａＤｏｕｂｌｅＡｎｔｉｂｏｄｙＳａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡｆｏｒＶｉｒｕｓＤｅｔｅｃｔｉｏｎ硕士研究生：宋文凤指导教师：薛飞研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究

2、所研究生院２０１８年６月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备与双抗夹心ELISA方法的建立PreparationofMonoclonalAntibodiesagainstBovineViralDiarrheaVirusandEstablishmentofaDoubleAntibodySandwichELISAforVirusDetection硕士研究生：宋文凤指导教师：薛飞研究员申请学位类别：兽医硕士专业领域名称：兽医培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2018年6月Secrecy:No.

3、ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationPreparationofMonoclonalAntibodiesagainstBovineViralDiarrheaVirusandEstablishmentofaDoubleAntibodySandwichELISAforVirusDetectionM.S.Candidate：SongWenFengSupervisor：ProfessorXueFeiDegree：MasterofVeterinaryMedicineSpecialty:

4、VeterinaryMedicineJune2018III摘要牛病毒性腹泻(Bovineviraldiarrhea,BVD)又称为粘膜病(Mucosaldisease,MD)，是由牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus,BVDV）引起，临床症状主要为精神沉郁、流涎、产奶量下降甚至停奶、腹泻和结膜炎等，孕牛出现流产、产出畸形胎儿或产出持续感染（PI）牛，新生犊牛因严重腹泻而死亡。PI牛一生持续带毒并不断持续向外界排毒，是BVDV最主要的传染源。牛病毒性腹泻流行范围广，给全球养牛业造成了巨大的损失。BVDV的

5、E0蛋白是最保守的结构蛋白之一，能被分泌到细胞外，样品不用做任何处理就能用抗原捕获ELISA(ACE-ELISA)检测，具有重要的诊断价值；E2是BVDV的主要保护性抗原；p80蛋白结构保守，针对p80的单抗能区分出动物是疫苗免疫还是自然感染的，可以用于鉴别诊断，有利于BVDV的净化。目前国外开发的抗原捕获ELISA(ACE)具有良好的敏感性、特异性和可重复性，可以用于检测BVDV的抗原，是一种操作简单且经济的可以检测PI牛的方法。目前我国尚缺乏可用的特异性良好的针对BVDV的p80、E0及E2蛋白的单克隆抗体，亦无自主研发的检测B

6、VDV抗原的试剂盒，因此急需开展相关的研究。本研究利用MDBK细胞大量培养BVDV致细胞病变型毒株VEDEVAC和非致细胞病变型毒株3877，通过PEG浓缩和蔗糖密度梯度离心法纯化病毒作为免疫原，免疫Balb/c小鼠，通过间接ELISA和间接免疫荧光（IFA）进行阳性杂交瘤细胞的筛选。经过3次亚克隆