苹果类受体激酶MdSOBIR1抵抗苹果真菌病害的机理初探

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１：０４３４分类号：Ｓ６６１．１授予学位单位代码１１学号：２０１５０２４６山東農業大學硕士学位论文苹果类受体激酶ＭｄＳＯＢＩＲ１抵抗苹果真菌病害的机理初探ｕａ－ＴｈｅＤｉｓｅａｓｅＲｅｓｉｓｔａｎｃｅＰａｔｈｗａｙＲｅｌｔｅｄｂｙＲｅｃｅｔｏｒｌｉｋｅｇｐＫｉｎａｓｅＭｄＳＯＢＩＲｌ１ｉｎＡｐｐｌｅＴｏｗａｒｄｓｉｔｓＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＦｕｎｇｉ研究生：刘秀霞学科专业：果树学研究方向：果树遗传育种与生物技术学院：园艺科学与工程学院指导教师：吴树敬教授陈学森教授２０１８年６月１０日 论文提交日期：2018年5月8日论文答辩日期：2018年6月7日学位授予日期：2018年6月19日学位类别：农学硕士答辩委员会主席：马锋旺 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研宄所取得的成果。对在论文研宄期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研宄所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：ｊｊｉｔ导师签名：祕＾：Ｊ＼〇日期：ｌｒ＞＼８．Ｌ 符号说明MAMPs:Microbe-associatedmolecularpatterns微生物相关分子模式PAMPs:Pathogen-associatedmolecularpattern病原物相关分子模式PRRs:Patternrecognitionreceptors模式识别受体MTI:MAMP-triggeredimmunity模式触发免疫ETI:Effector-triggeredimmunity效应子触发免疫RLK:Receptor-likekinases类受体激酶RLP:Receptor-likeproteins类受体蛋白LRR:Leucine-richrepeats富亮氨酸重复序列HR:Hypersensitiveresponse过敏反应Flg22:FlagellinFragment细菌鞭毛蛋白N端22个保守的活性肽物质Bd:Botryosphaeriadothidea苹果轮纹病菌Vm:ValsamaliMiyabeetYamada苹果腐烂病菌PtoDC3000:Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000丁香假单胞菌MAPK:Mitogen-activatedproteinkinase丝裂原活化蛋白激酶ROS:Reactiveoxygens活性氧SA:Salicylicacid水杨酸JA:Jasmonicacid茉莉酸ET:Ethylene乙烯MS:MurashigeandSkoogmediaMS培养基LB:LuriabertanimediumLB培养基YEP:YeastMannitolmediumYEP培养基KB:King’sBmedium金氏B培养基PBS:Phosphatebuffersolution磷酸缓冲液TBS:TrisbuffersolutionTris缓冲盐溶液PCR:Polymerasechainreaction聚合酶链式反应PR:Pathogenesisrelatedprotein病程相关蛋白ChiB:Basicchitnase碱性几丁质酶蛋白ACS:1-Aminocyclopropane-1-carboxylicacidsynthaseACC合成酶 NPR1:Non-expressorofpathogenesisrelatedgenes1病程相关非表达子1SAR:Systemicacquiredresistance系统获得性抗性HR:Hypersensitiveresponse过敏反应At:Arabidopsisthaliana拟南芥Md:Malusdomestica苹果Vv:Vitisvinifera葡萄Os:Oryzasativa水稻Sl:Solanumlycopersicum番茄 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................III1前言..........................................................................................................................................11.1植物抗病机制.......................................................................................................................11.1.1植物防御反应....................................................................................................................11.1.2植物防御反应中的信号途径...........................................................................................21.2植物免疫反应......................................................................................................................31.3植物免疫受体......................................................................................................................31.4植物类受体激酶..................................................................................................................41.4.1植物类受体激酶的结构....................................................................................................41.4.2植物类受体激酶的分类和作用.......................................................................................41.5植物类受体激酶SOBIR1的研究......................................................................................61.5.1SOBIR1与RLP互作参与植物免疫...............................................................................61.5.2SOBIR1参与免疫信号转导.............................................................................................71.5.3SOBIR1参与植物生长发育的调控.................................................................................71.6植物类受体激酶FLS2的研究...........................................................................................72材料与方法.............................................................................................................................82.1试验材料..............................................................................................................................82.1.1植物材料...........................................................................................................................82.1.2致病真菌和细菌...............................................................................................................82.1.3菌株和质粒.......................................................................................................................92.1.4酶及生化试剂...................................................................................................................92.1.5培养基配制........................................................................................................................92.1.6溶液配制...........................................................................................................................92.1.6.1MS培养基母液配方......................................................................................................92.1.6.2原生质体分离溶液......................................................................................................102.1.6.3WesternBlot所需溶液.................................................................................................102.1.6.4DAB染色所用试剂.....................................................................................................11 2.2试验方法............................................................................................................................112.2.1植物总RNA提取...........................................................................................................112.2.2反转录cDNA合成.........................................................................................................122.2.3基因克隆PCR扩增.......................................................................................................122.2.4PCR产物胶回收.............................................................................................................122.2.5酶切和连接体系..............................................................................................................132.2.6大肠杆菌感受态细胞转化..............................................................................................132.2.7质粒DNA的提取..........................................................................................................132.2.8农杆菌的转化.................................................................................................................132.2.9‘王林’愈伤转化...............................................................................................................142.2.10转化拟南芥...................................................................................................................142.2.11WesternBlot...................................................................................................................142.2.12接菌试验.......................................................................................................................152.2.12.1愈伤组织接真菌试验.................................................................................................152.2.12.2拟南芥叶片接真菌试验............................................................................................152.2.12.3拟南芥接种DC3000试验........................................................................................152.2.13DAB和台盼蓝染色......................................................................................................162.2.14分离原生质体...............................................................................................................162.2.15烟草瞬时转化...............................................................................................................162.2.16总酚含量测定...............................................................................................................162.7.17苯胺蓝染色...................................................................................................................173结果分析..............................................................................................................................173.1MdSOBIR1的抗病性研究................................................................................................173.1.1MdSOBIR1的生物信息学分析.....................................................................................173.1.2MdSOBIR1亚细胞定位.................................................................................................193.1.3腐烂病菌侵染特异性诱导MdSOBIR1基因表达........................................................203.1.4超表达MdSOBIR1降低愈伤组织对苹果轮纹病菌的抗性........................................213.1.4.1超表达MdSOBIR1促进轮纹病菌诱导的苹果愈伤病斑扩展.................................213.1.4.2超表达MdSOBIR1降低轮纹病菌诱导的总酚物质积累.........................................223.1.4.3超表达MdSOBIR1降低轮纹病菌诱导的抗病相关基因表达水平.........................22 3.1.4.4超表达MdSOBIR1抑制轮纹病菌诱导的ACS基因表达........................................233.1.5超表达MdSOBIR1抑制拟南芥中轮纹病菌诱导的病斑扩展....................................243.1.6超表达MdSOBIR1提高愈伤组织对腐烂病菌的抗性................................................253.1.6.1超表达MdSOBIR1抑制愈伤组织中腐烂病菌诱导的病斑扩展.............................253.1.6.2超表达MdSOBIR促进腐烂病菌诱导的总酚物质积累和MAPK活性..................263.1.6.3超表达MdSOBIR1提高腐烂病菌诱导的抗病相关基因表达.................................263.1.7超表达MdSOBIR1提高拟南芥对腐烂病菌的抗性....................................................273.1.7.1MdSOBIR1抑制拟南芥中腐烂病菌诱导的病斑扩展...............................................273.1.7.2MdSOBIR1转基因抑制拟南芥中腐烂病菌诱导的细胞坏死...................................283.1.8超表达MdSOBIR1特异性增强flg22诱导的拟南芥胼胝质积累..............................293.2MdFLS2的抗病性研究.....................................................................................................313.2.1超表达MdFLS2的fls2突变体拟南芥部分恢复对flg22的敏感性...........................313.2.2超表达MdFLS2提高了拟南芥对轮纹病菌的抗性并恢复了fls2突变体对假单胞菌的抗性...........................................................................................................................................334讨论.......................................................................................................................................364.1MdSOBIR1的保守性分析................................................................................................364.2MdSOBIR1对病害的抗性调控机制................................................................................364.3苹果MdSOBIR1互作蛋白预测.......................................................................................374.4MdFLS2具有flg22识别功能...........................................................................................374.5MdFLS2对病害的抗性调控机制.....................................................................................384.6MdSOBIR1与MdFLS2的相互作用机制预测................................................................38参考文献..................................................................................................................................40附录...........................................................................................................................................49致谢...........................................................................................................................................51攻读学位期间发表论文情况..................................................................................................52 山东农业大学硕士学位论文中文摘要植物类受体激酶作为位于细胞膜上的最重要的一类植物免疫受体，在植物免疫中的作用被广泛研究，其中对类受体激酶SOBIR1（SuppressorofBIR1-1）和FLS2（Flagellinsensing2）的研究较为深入。类受体激酶SOBIR1在拟南芥和番茄中研究较多，拟南芥中研究发现，SOBIR1和BAKI共同调控类受体蛋白AtRLP30介导的免疫反应；番茄中研究表明，SOBIR1能够与类受体蛋白Cf-4和Ve1形成蛋白复合体，参与免疫信号向胞内的传递，调控对病原真菌番茄叶霉病菌和棉花黄萎病菌的抗性。拟南芥中FLS2通过感应细菌N端22个保守性序列活性肽物质flg22，迅速与BAK1形成蛋白复合体向胞内传递免疫信号，引起植物一系列的抗病反应。然而近年来对水稻和葡萄中的FLS2研究发现它们与拟南芥FLS2在识别不同细菌的敏感性和引起的免疫反应方面存在差异。而目前国内外有关苹果类受体激酶SOBIR1和FLS2在抵抗苹果重要病害中的作用研究较少，因此，在本研究中以转苹果同源基因MdSOBIR1和MdFLS2的苹果愈伤组织和拟南芥为材料，研究了它们的编码蛋白质抗苹果主要病害的作用，研究结果如下：1.以‘富士’苹果果皮为材料克隆得到苹果SOBIR1基因并命名为MdSOBIR1。进化树分析表明苹果与拟南芥SOBIR1在不同进化树枝上，亲缘关系较远，表明两者可能存在基因功能进化上的差异；蛋白序列比对表明MdSOBIR1与拟南芥AtSOBIR1相似度为62.89%，具有信号肽区域、亮氨酸富含区域、跨膜区以及胞内激酶区，是典型的富含亮氨酸重复类受体激酶。2.通过转基因愈伤分离原生质体和烟草瞬时转化的方法进行MdSOBIR1-GFP荧光定位，发现MdSOBIR1定位在细胞膜上。3.超表达MdSOBIR1降低了愈伤组织对苹果轮纹病菌的抗性。超表达MdSOBIR1后促进轮纹病菌在苹果愈伤组织中的扩展，接菌后转基因愈伤总酚含量低于对照，并且几丁质酶基因MdChiB、病程相关基因MdPR2、MdPR5，以及乙稀合成基因MdACS4和MdACS1表达量均较对照明显降低，SA途径关键基因MdNPR1则无明显变化。而在拟南芥中异源超表达MdSOBIR1抑制了苹果轮纹病菌的扩展，与愈伤组织结果不一致，需要进一步试验验证。4.超表达MdSOBIR1提高了愈伤组织对苹果腐烂病菌的抗性。超表达MdSOBIR1明显抑制了腐烂病菌在愈伤组织中的扩展，接菌后转基因愈伤总酚含量、MAPK级联激酶活性均明显高于对照，几丁质酶基因MdChiB、病程相关基因MdPR2、MdPR5和SAI 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究5.信号转导途径关键基因MdNPR1表达量均明显升高。拟南芥中异源超表达MdSOBIR1明显抑制腐烂病菌的扩展并降低病菌侵染引起的组织坏死，此结果与愈伤组织中一致。6.MdSOBIR1转基因拟南芥提高对flg22的抗性。超表达MdSOBIR1特异性提高细菌鞭毛蛋白flg22诱导的胼胝质在拟南芥叶片中的积累。7.超表达MdFLS2的fls2突变体拟南芥部分恢复对flg22的敏感性。超表达MdFLS2的fls2突变体拟南芥恢复了flg22处理诱导的根系生长抑制，但响应flg22的标志基因At2g17740、At2g51890和AtFRK1的表达及MAPK激酶活性均显著低于野生型。8.超表达MdFLS2提高了拟南芥对轮纹病菌的抗性并恢复了fls2突变体拟南芥对假单胞菌DC3000的抗性。关键词：苹果；MdSOBIR1；MdFLS2；植物免疫；抗病性II 山东农业大学硕士学位论文AbstractAsthemostimportantclassofplantimmunereceptorsontheplantcellmembrane,receptor-likekinases,havereceivedextensiveattentionintheirroleinplantimmunity.Amongthem,thestudyofreceptor-likekinaseSOBIR1(SuppressorofBIR1-1)andFLS2(Flagellinsensing2)isin-depth.Receptor-likekinaseSOBIR1hasbeenstudiedfurtherinArabidopsisandtomato.StudiesinArabidopsisfoundthatAtSOBIR1isanessentialcomponentofAtRLP30triggeredimmunity.StudieshaveshownthatSOBIR1participatesintheintracellulartransmissionofimmunesignalsthroughtheformationofproteincomplexeswiththetomatoreceptorproteinsCf-4andVel,regulatingtheresistancetothepathogenicfungiFulviafulvaandVerticilliumdahliae.ArabidopsisFLS2formimmunecomplexeswithBAK1protein,whichinducesaseriesofdisease-resistanceresponsesinplants，throughsensing22conservedsequencepeptidesflg22intheN-terminalofbacteria.However,inrecentyears,thehomologousgenesofFLS2inriceandgrapeshavebeenfoundtodifferfromthesensitivitiesandinducedresponsesofArabidopsisFLS2inidentifyingdifferentbacteria.Atpresent,therearefewstudiesontherolesofappleSOBIR1andFLS2intheresistancetoimportantdiseasesatdomesticandabroad.Therefore,applecallusandArabidopsisthalianawerethetransgenicapplehomologuesMdSOBIR1andMdFLS2tostudytheroleofresistancetomajordiseasesinapples.Themainresultsareasfollows:1.ThehomologousgeneofSOBIR1genewasclonedfromthefruitskinof‘Fuji’andnamedasMdSOBIR1.PhylogeneticanalysisshowedthatMdSOBIR1bearsdistantlyrelatedhomologieswithAtSOBIR1inArabidopsisthaliana,indicatingthattheremaybedifferencesingenefunctionevolutionbetweenthem;TheproteincomparisonshowedthatthesimilaritybetweenMdSOBIR1andArabidopsisthalianaSOBIR1was62.89%,withasignalpeptideregion,Leucinerichregions,transmembraneregion,andintracellularkinasedomain.Showsthatitisatypicalleucine-richreceptor-likekinase.2.TheMdSOBIR1-GFPfluorescencelocalizationwasperformedbytransgeniccallusisolationofprotoplastsandtransienttransformationoftobacco.TheresultsshowedthatMdSOBIR1localizestothecellmembrane.3.Over-expressionofMdSOBIR1promotestheexpansionofappleringrotcausalfungiIII 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究inapplecallus,andthecontentsoftotalphenolicintransgeniccallussignificantlylowerthanordinarycallus,andtheexpressionofchitinasegeneMdChiB,disease-associatedgenesMdPR2,MdPR5andethylenesyntheticprecursorgenesMdACS4andMdACS1wassignificantlylowerthanthatofnormalcallus.,SApathwaykeygeneNPR1hasnosignificantdifference.InArabidopsis,theresultsshowedthatoverexpressionofMdSOBIR1inhibitedtheexpansionofcallustoBotryosphaeriadothideaandwasinconsistentwithcallusresults,requiringfurtherexperimentalvalidation.4.OverexpressionofMdSOBIR1enhancesthecallusresistancetoValsamailpathogen.OverexpressionofMdSOBIR1significantlyinhibitedthepropagationofValsamailincallus.ThecontentstotalphenolicandMAPKcascadekinaseactivityofthetransgeniccallusweresignificantlyhigherthanthoseofnormalcallus.TheexpressionofMdChiB,MdPR2,MdPR5andMdNPR1genesweresignificantlyincreased.OverexpressionofMdSOBIR1inArabidopsisthalianasignificantlyinhibitedtheexpansionandreducedthetissuenecrosiscausedbyValsamail.Theresultswereconsistentwiththecallus.5.MdSOBIR1transgenicincreasestheimmunologicalresistancetobacterialflg22.MdSOBIR1transgenicArabidopsisspecificallyincreasedflg22treatment-inducedcalioseaccumulation.6.OverexpressionofMdFLS2intheArabidopsisfls2mutantrestoredtheinhibitionofrootelongationbyflg22,whiletheinductionofflg22-inducedtheexpressionofmarkergenesAt2g17740、At2g51890andAtFRK1andtheinitiationofMAPKsignalingpathwayinMdFLS2overexpressiontransgenicplantswassignificantlylowerthanthatofwildtypeplants.SuggeststheoverexpressingMdFLS2infls2mutantArabidopsispartiallyrestoredthesensitivitytoflg22.7.OverexpressMdFLS2infls2mutantArabidopsisthalianasignificantlyinhibitedtheexpansionofappleringrot.OverexpressMdFLS2infls2mutantArabidopsisthalianarestoredtheresistanceoffls2topv.tomatoDC3000.Keywords:Apple;MdSOBIR1;MdFLS2;plantimmunity;DiseaseresistanceIV 山东农业大学硕士学位论文1前言苹果因口感酸甜、营养价值丰富深受广大消费者喜爱（陈美霞等,2004）。苹果在我国温带地区广泛栽培，为具有重要经济价值的果树树种。在生产中，由苹果轮纹病、腐烂病、黑星病、炭疽病等苹果重要病害引起的苹果产量与品质下降，是严重影响我国苹果产业优质高效与环保绿色发展的重要因子（王金政等,2010）。病害防治一直是苹果果实产前、产中乃至产后果品储藏期的重要问题。分离与鉴定苹果抗病基因对揭示苹果对重要病害的抗病机理及新型防治策略研发具有重要意义。经过长久的研究，在苹果抗病育种和抗病基因的分离鉴定上取得了一定的研究进展。霍夫教授首先发现多花海棠821中存在苹果抗黑星病（Venturiainaequalis）的显性基因Vf，并经杂交育种培育出抗病品种，到目前为止，在苹果属植物中已鉴定出9种苹果抗黑星病基因（Joshietal.,2011;Gao&weg,2006），5个苹果抗白粉病基因（James&Evans,2004），但这些基因抗病性并不持久。Norelli等（1994）将抗菌相关信号肽AttacinE导入‘M26’，获得了抗火疫病菌侵染的植株。然而相对于对非生物逆境抗性的研究，如抗寒、旱等，我国在苹果抗病基因的分离鉴定方面的研究进展较小，目前只获得了稳定的抗苹果黑星病的转基因植株(Gao&weg,2006)。因此苹果抗病基因的筛选与鉴定工作仍需重视，开展该项研究对于苹果抗病品种培育与改良具有深远意义。植物在感应病原菌侵染诱导产生免疫反应时，首先通过模式识别受体引发抗病反应（Göhreetal.,2008），因此，类受体激酶作为植物体内最大的一类免疫识别受体在植物抗病研究中受到广泛关注（Monaghan&Zipfel,2012）。研究表明SOBIR1是植物抗病反应的正向调控因子，模式植物拟南芥中过量表达SOBIR1能够组成型激活植物的抗病反应，包括植物细胞死亡和防御反应（Gaoetal.,2009）；番茄类受体激酶SOBIR1因与番茄类受体蛋白Cf-4形成蛋白复合体，在对病原真菌番茄叶霉病菌的抗性中起必要作用（Liebrandetal.,2013），使SOBIR1成为研究热点；拟南芥类受体激酶FLS2对细菌鞭毛蛋白flg22的抗性作用已研究得非常透彻，成为植物对病原微生物识别、产生抗性机制研究的经典模式（Sunetal.,2012,2013）。MdSOBIR1与MdFLS2可能在植物细胞中应用不同的分子机制来感受不同病原菌入侵的类激酶受体蛋白。而该类激酶受体在苹果抗病中的作用及其在真菌病害中调控的苹果抗病的分子机制，至今仍不清楚。1.1植物抗病机制1.1.1植物防御反应1 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究植物由于无法移动的特性，在自然界中受到各种病虫害的胁迫，为了适应这些生物胁迫，植物在长期的进化过程中形成了多种防御机制，包括组成型防御机制和诱导型防御机制（Hammond-kosacketal.,2003）。组成型防御机制（constitutivedefence）是植物原本具有的，能够阻碍病原菌侵入或昆虫取食的物理、化学因素。包括植物表面的机械抵御，如叶片蜡质层、种子和果实的坚硬外壳以及植物上的刺、荆棘等；植物体内本身含有一些化学物质，比如杀菌物质和植物毒素（次生代谢物质或昆虫生长调节剂）等，能够通过杀伤外来微生物、对昆虫产生毒性等作用有效抵御病虫害。植物的诱导型防御机制（induceddefence）在病虫害诱导下产生，包括毒性物质的增加、有毒化合物和防御蛋白产生以及产生局部过敏反应（HR）或系统获得性抗性（SAR）等，在植物自我保护作用中十分重要。植物的各种防御机制在抵御病虫害过程中相互协同作用，共同抵御生物胁迫对植物的危害。1.1.2植物防御反应中的信号途径SA途径是植物体内的重要信号转导途径，主要介导植物对专性寄生病原菌的抗性。研究表明，植物在受到病菌侵染后SA含量会成倍增加，外源施加SA也可使植物抗性增强并产生SAR。SA在响应部位产生，被运输到效应部位与靶细胞上的受体形成复合体，该复合体将病原信号转移到胞内，诱导胞内第二信使产生，并最终引起胞内各种抗性反应（彭金英等，2005）。SA信号转导途径的关键基因NPR1大量表达能诱导植物抗病相关基因表达，引起抗病反应，研究表明PR1、PR2和PR5是SA信号途径诱导表达的基因。在烟草叶片中分离得到SA受体蛋白SABP，具有过氧化氢酶催化活性，SA在植物体内的大量积累时可结合SABP，使其失去这种催化功能，促使H2O2积累，从而通过直接抑菌作用、诱导HR反应及MAPK活性增强等作用提高植物抗病能力（杨洪强等，2003）。茉莉酸和乙烯（JA/ET）途径是植物另一条重要的抗病信号途径，主要介导植物对兼性寄生病原物的抗性，植物防御素（PDFL2）是其标志产物。JA和ET可独立诱导PDFL2的表达并具有协同作用。PDFL2作用于病原菌原生质膜上，致使质膜选择透性破坏，Ca2+流入而K+流出，原生质体外泄，电化学势失衡，从而降低其致病性（张海文等，2002）。病菌处理和外源施加JA/ET均可增强植物SAR。PDFL2不能被SA诱导表达，说明JA/ET介导的抗性反应不依赖于SA途径，但该机制的受体基因至今还未分2 山东农业大学硕士学位论文离得到，其作用机制也不完全清楚（Liechti&Farmer,2002）。SA与JA/ET两种信号转导途径在介导防御反应时相互独立发挥作用，然而大量试验结果证明参与两种信号途径的成员能够相互影响（Kunkel&Brooks,2002），且相互作用关系复杂，通过拮抗或协同作用整合信号途径以发动适当的防御反应（Doaresetal.,1995;Lorenzoetal.,2003）。1.2植物免疫反应植物在感应到非自身病原物质或寄主衍生的损害物质后，其先天免疫系统受到激活（Jones&Dangl,2006；BollerT&Felix,2009）。植物首先通过模式触发免疫（MAMP-triggeredimmunity，MTI）初步抵抗病原物的侵染。保守的微生物相关分子模式（microbe-associatedmolecularpatterns，MAMPs）通过模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRRs）识别病原菌并诱导产生MTI（Jongeetal.,2011）。病原微生物进一步通过分泌效应蛋白产生毒性来抑制MTI，这些效应蛋白被植物体内的抗性蛋白检测，激活植物的第二层免疫机制，效应子触发免疫（effector-triggeredimmunity，ETI），通常会引起植物产生过敏反应（HR）促使局部产生程序性宿主细胞死亡（Liebrandetal.,2013）。大量的试验证明植物免疫识别受体引起的PAMPs和类受体蛋白识别病原菌分泌的效应蛋白引起的ETI存在交叠（Postmaetal.,2015）。MTI和ETI在功能上均通过利用免疫受体识别病原物质的相应配体产生适当的防御反应，共同抵抗病原菌的侵入。1.3植物免疫受体植物体内的免疫受体一般存在于植物细胞质内或细胞质膜上。而植物细胞表面受体以类受体激酶（receptor-likekinases，RLK）和类受体蛋白（receptor-likeprotein，RLP）为代表（Antolin-Lloveraetal.,2012,Monaghan&Zipfel,2012）。现已发现的定位于细胞膜上的大多数免疫受体为类受体激酶，此类激酶通常含有胞外的富亮氨酸重复序列或赖氨酸基序来进行病原菌配体的识别和胞内激酶区域激活下游信号的表达（Bietal.,2014）。赖氨酸基序类受体激酶CERK1（ChitinElicitorReceptorKinase）通过识别真菌几丁质来介导免疫反应抵抗真菌侵染；FLS2（FlagllinSensing2）和EFR（EF-TuReceptor）是重要的富亮氨酸重复类受体激酶，分别参与细菌鞭毛蛋白和延伸因子Tu蛋白的识别（Monaghan&Zipfel,2012）。在配体识别过程中，FLS2和EFR都能与富亮氨酸重复的类受体激酶SERK3/BAK1(SomaticEmbryogenesisReceptorKinase3/BrassinosteroidInsensitive1AssociatedreceptorKinase1)形成蛋白复合体。研究3 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究表明SERK3/BAK1对FLS2和EFR识别配体的过程没有影响，但其作为信号增强因子起作用，加强信号向胞内传递，共同调控细胞内各种免疫信号的产生（Gómez-Gómez&Boller,2000;Zipfeletal.,2006）。类受体蛋白（RLPs）是植物体内第二大类细胞表面受体。RLPs与RLKs具有相似的结构，但是缺乏胞质内的激酶结构（Wangetal.,2008）。RLPs在防卫反应和植物生长发育中起作用，比如Cf和Vel蛋白介导的防御反应，Clavata蛋白在分生组织维持中的重要作用等（Jonesetal.,1994;Kawchuketal.,2001）。RLP由于不具有胞内激酶区域被认为缺少信号向胞内转运的功能，人们推测其需要通过RLK的协助作用转运信号物质，诱导胞内免疫反应。大量试验结果也证明了这一点，例如拟南芥CLV2与跨膜的激酶Coryne以及富亮氨酸重复类受体激酶CLV1形成蛋白复合体（Zhuetal.,2010;Bleckmannetal.,2010）；TMM需要LRR-RLKErecta激活下游信号的表达（Jinetal.,2012）。1.4植物类受体激酶以上研究均表明植物类受体激酶无论是在单独的病原菌识别和信号转导方面还是与类受体蛋白协同作用形成复合体，激活、增强下游信号转导方面都起到必不可少的作用（Strous&Gent,2002;Raiborgetal.,2003）。研究类受体激酶的抗病作用对抗病基因的筛选意义深远。1.4.1植物类受体激酶的结构植物类受体激酶一般包括N端信号肽区域、胞外受体结构域、跨膜结构域和蛋白激酶接触反应结构域（Stone&Walker,1995）。信号肽位于胞外，具有疏水功能，起到识别信号物质的作用，是信号识别中心；不同类型的RLKs胞外受体结构域一般有很大不同，进而促使它们在信号转导途径中的作用不同。此结构域负责结合信号分子，形成二聚体以激活胞内激酶域的信号转导活性（Walkeretal.,1994），是激酶的信号结合中心；跨膜结构域连接胞外与胞内区域，信号分子通过此结构传递到胞内区域，一般由22-28个氨基酸构成；胞内蛋白激酶域具有磷酸化位点，其可磷酸化反应受蛋白激酶和蛋白磷酸酶调控，是信号分子的级联反应中心（Becraftetal.,1998;Leaseetal.,1998）。1.4.2植物类受体激酶的分类和作用目前研究表明，植物类受体激酶的胞内区域一般较保守，而胞外区域结构差异较大，负责识别和接受不同的配体，因此根据胞外受体结构域的不同可划分为7个亚家族：4 山东农业大学硕士学位论文1）富亮氨酸重复类受体激酶（leucine-richreceptorkinases,LRR-RLKs），此类激酶在植物体内广泛存在，占整个类受体激酶数量的一半以上，特点是一般都含有22-24个富含亮氨酸的氨基酸序列并且核心部位有7个保守氨基酸残基：XXLXLXX(X代表不确定氨基酸残基)(Alietal.,2007;Songetal.,2008;路梅等,2006)，此重复序列在胞外受体结构域以串联重复的形式存在，推测与受体形成有关（Staskawiczetal.,1995）。研究表明，LRR-RLKs在病原菌配体的识别和胞内激酶区域激活下游信号的表达等方面具有重要作用。这方面的研究对拟南芥FLS2的研究比较透彻。AtFLS2作为植物体内的PPRs能够感知细菌鞭毛蛋白携带的22个多肽flg22的侵染（Gomez-Gomez&Boller,2000），感受到此信号刺激后立即与另一类受体激酶BAK1互作（Chinchillaetal.,2007;Heeseetal.,2007;Schulzeetal.,2010），形成蛋白复合体后磷酸化胞内的BIK1（Botrytis-inducedkinase1），BIK1与FLS2/BAKI形成复合体，在感受到flg22信号后又立即分开（Luetal.,2010;Zhangetal.,2010），最终将信号传递给钙调蛋白及磷酸化级联反应等调控下游免疫反应（Asaietal.,2002;Boudsocqetal.,2010）。LRR-RLK还具有调控植物生长发育信号转导的功能，例如拟南芥中调控茎端分生组织的CLV1信号转导。类受体激酶CLV1在拟南芥中具有抑制细胞增殖的功能，其稳定性依赖于与类受体蛋白CLV2形成蛋白复合体。此蛋白复合体作为共受体，与配体CLV3特异性结合，从而激活信号转导途径，对茎细胞启动因子WUS的表达起抑制作用（Brandetal.,2000;Schoofetal.,2000;Ohyamaetal.,2009）。除此之外，LRR-RLK还具有介导植物激素信号转导的作用。类受体激酶BIR1可感知BR信号，研究发现，BIR1可能是BR的受体或其受体复合体的一个限速组分（Heetal.,2000）；并且RPK1-RLK也可参与ABA信号途径，调控对ABA的敏感性，RPK1的基因缺失会使拟南芥叶片表现衰老延迟（Yurikoetal.,2005）。这都说明其在激素信号转导中的作用。2）赖氨酸基序类受体激酶（Lysine-richreceptorlikekinase）。近年来发现，拟南芥赖氨酸基序类受体激酶CERK1（ChitinElicitorReceptorKinase）通过识别真菌几丁质来介导免疫反应抵抗真菌。AtCERK1能够直接结合病原菌几丁质，然后通过其胞外域的赖氨酸基序（LysM）去激活植物免疫反应。3）病程相关蛋白5类受体激酶（pathogenesis-relatedprotein5-likereceptorkinase,PR5K-RLK），胞外结构域序列与PR5序列相似(Wangetal.,1996;Huetal.,1997)，参与植物自交不亲和防御反应功能作用。5 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究4）表皮生长因子类受体激酶（epidermalgrowthfactor-likerepeats,EGF-RLK）EGF-RLK不具有信号肽序列，取而代之的是12个保守的半胱氨酸残基（Heetal.,1998;Heetal.,1999;Decreuxetal.,2006）。目前仅在拟南芥中分离得到此类激酶pro25，其胞外域与植物细胞壁相连接，介导质膜与细胞壁的互作，参与植物的抗病防御反应。5）外源凝集素结合域类受体激酶（lectin-bindingdomain,LB-RLK）。拟南芥中有30多个此类基因。其胞外区域由球形结构域和PAN结构域两个区域构成。其中球形结构域负责与胞外配体结合，并且是蛋白与甘露糖相互作用的部位；PAN结构域则负责与蛋白或者碳水化合物互作（Wasanoetal.,2003;Chenetal.,2006）。推测该蛋白功能为与果胶结合，研究表明其激酶活性功能可被果胶寡聚酶激活。6）类肿瘤坏死因子类受体激酶（tumornecrosisfactorreceptor-like,TNFR-RLK）此类激酶胞外由一个富半胱氨酸序列组成，与植物的生长发育有关，在玉米组织中，对其表皮细胞分化影响较大（Jinetal.,2000）。7）S-结构域类受体激酶（s-domain,S-RLK）此类激酶含有12个保守的富半胱氨酸的氨基酸序列，与植物的生长发育和自交不亲和等作用相关（Leietal.,2002）；但在拟南芥中，机械损伤和细菌感染会诱导该基因的表达升高，因此S-RLK可能也参与植物的免疫防御反应（Pastugliaetal.,2002）。1.5植物类受体激酶SOBIR1的研究1.5.1SOBIR1与RLP互作参与植物免疫LRR-RLKs含有胞外富亮氨酸重复序列结合效应物和胞内激酶区域负责激活下游信号，而RLP不具有负责转运信号的胞内激酶区域，因此一般认为RLK在RLP的信号转运过程中起必要作用。在SOBIR1的很多研究中也证实了其与不同的类受体蛋白互作，协同引起抗病免疫的作用。番茄类受体蛋白Cf-4和Ve1分别调控对病原真菌番茄叶霉病菌和棉花黄萎病菌抗性，而番茄类受体激酶SOBIR1对于Cf-4和Ve1受体的稳定性是必须的，说明在植物体内RLP与SOBIR1存在复合体关系（Liebrandetal.,2013），SOBIR1对于RLP介导的免疫途径中是必要的。LepR3是最近克隆得到的甘蓝型油菜黑胫病抗性基因，编码一类类受体蛋白，通过本氏烟模式植物体系研究发现，BnSOBIR1与LepR3互作，沉默SOBIR1降低了LepR3引起的过敏反应，说明LepR3介导的对油菜茎基溃疡病菌的抗性需要SOBIR1的参与（Ma&Borhan,2015）。6 山东农业大学硕士学位论文1.5.2SOBIR1参与免疫信号转导富亮氨酸重复的类受体蛋白RXEG1，能够特异性识别糖苷水解酶12蛋白XEG1（Maetal.,2017）。RXEG1通过LRR区域与XEG1结合，与类受体激酶BAK1和SOBIR1形成蛋白复合体共同转导XEG1诱发的防御信号。试验证明SOBIR1的沉默对于RXEG1介导的过敏反应仅有轻微的减弱，但是明显影响了免疫信号向下游的传递，比如对ROS积累和CYP71D20诱发明显降低（Wangetal.,2018）。说明SOBIR1在免疫信号转导过程中作为信号增强因子起重要作用。1.5.3SOBIR1参与植物生长发育的调控SOBIR1调控拟南芥的花器官脱落。拟南芥NEVERSHED(NEV)是调控花器官脱落的必须因子，研究发现nev突变体抑制花器官脱落，而nevsobir1双突变体拟南芥表现为花器官正常脱落，因此SOBIR1作用为花器官脱落的抑制剂，又被命名为EVERSHED(EVR)（Leslieetal.,2010）。SOBIR1基因受到强光照射的诱导表达，SOBIR1具有增强植物抗盐碱、光防御等抗逆能力的作用，研究发现sobir1突变体表现为对高生长素和高盐敏感（Coletteetal.,2011）。1.6植物类受体激酶FLS2的研究FLS2在拟南芥中作为一种PRR感应细菌鞭毛蛋白的其活性肽物质flg22引起免疫反应的机理研究已非常透彻。当感应到flg22时，FLS2立即与另一类受体激酶BAK1形成蛋白复合体，此复合体可磷酸化细胞质定位的类受体胞浆激酶BIK1，与之形成复合体，在传递flg22信号后又立即释放。随后flg22信号激活MAPK级联途径和钙依赖性蛋白激酶独立发挥作用或者由两者协同下游FLS2/BAK1受体复合体激活flg22响应基因的表达。同时，flg22响应还能够引起Ca2+通量提高、活性氧和乙烯产生、胼胝质积累和气孔关闭等反应共同抵御病菌侵染（图1）（Dodds&Rathjen,2010;Boller&Felix,2009;Schwessinger&Ronald,2012）。7 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究图1拟南芥中FLS2信号通路研究Fig.FLS2signalingpathwayinArabidopsis近年来，FLS2在其他物种中的同源基因的功能也有较多研究。与AtFLS2对于不同病原细菌的识别与免疫抗性相似的特点不同，水稻OsFLS2和葡萄VvFLS2对于不同flg22序列的感知特性或敏感度不同。试验结果表明，水稻稻黄单胞菌（Xoo）所携带的flg22区氨基酸变化，能够避开水稻中的鞭毛蛋白检测系统，而该系统保留了对其他细菌病原体的识别能力（Wangetal.,2015）；葡萄VvFLS2对于病原细菌B.phytofirmans的flg22肽段衍生物的识别能力及诱发的免疫抗性也较弱（Trdáetal.,2014）。2材料与方法2.1试验材料2.1.1植物材料本试验为2015年9月至2017年10月于山东农业大学作物生物学国家重点实验室进行。本试验采用的材料主要为苹果愈伤组织和拟南芥。普通‘王林’苹果愈伤组织和‘MdFLS2-2HA’转基因拟南芥为实验室保存，哥伦比亚野生型拟南芥（ArabidopsisthalianaColumbia）和fls2拟南芥突变体种子均由美国得克萨斯A&M大学MPMI实验室赠送；‘SOBIR1-2HA’超表达苹果愈伤组织、‘SOBIR1-GFP’超表达愈伤组织、‘SoBIR1-GFP’转基因拟南芥为试验转基因获得。苹果愈伤组织于MS培养基上培养，生长条件为24℃，暗培养。拟南芥培养条件为22℃，光周期10h光照/14h黑暗，光照强度60%，于培养箱中培养。2.1.2致病真菌和细菌8 山东农业大学硕士学位论文苹果轮纹病菌为Botryosphaeriadothidea（下文简称为Bd），苹果腐烂病菌为ValsamaliMiyabeetYamada（下文简称为Vm），病原性细菌假胞单菌PtoDC3000（Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000）。本研究所用的病菌由青岛农业大学李保华教授、山东农业大学刘会香教授和储昭辉教授惠赠。2.1.3菌株和质粒大肠杆菌菌株(Escherichia.coli)为DH5α；农杆菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)为LBA4404；表达载体为PCB302-2HA2.1.4酶及生化试剂限制性内切酶和T4连接酶购自NEB公司，dNTPs、TaqDNA聚合酶、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和植物总RNA提取试剂盒均购自康为世纪，DNA提取试剂盒为天根公司产品，PhusionHigh-FidelityDNApolymerase高保真酶和ReverAidTMFirstStrandcDNASynthesis反转录试剂盒购自Thermo公司，荧光定量染料FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Rox)购自罗氏公司，福林酚、DAB·4HCl、TrypanBlue、AnlineBlue和100%TritonX-100均购自索莱宝科技有限公司，Hybond-N＋尼龙膜、PVDF膜(0.45μm)等购自Amresco公司，引物由上海生物工程公司合成。2.1.5培养基配制MS培养基：大量元素(20×)50mL，有机(100×)10mL，铁盐(200×)5mL，微量元素(100×)10mL，蔗糖30g，琼脂7g，PH调至5.8，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。PDA培养基：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂粉12g，pH调至7.0，定容到1000mL，121℃高压灭菌20min。LB培养基：0.5%酵母提取物，1.0%氯化钠，1.0%胰蛋白胨，1.5%琼脂粉(固体)，PH调至7.5，121℃高压灭菌20min。YEP培养基：1.0%酵母提取物，1.0%胰蛋白胨，0.5%氯化钠，1.5%琼脂粉(固体)，PH调至7.5，121℃高压灭菌20min。KB培养基：眎蛋白胨20g，KZHPO1.5g，MgSo40.4g，甘油1mL，pH调至7.0-7.2，蒸馏水定容至1L。固体培养基为KB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%(w/V)。2.1.6溶液配制2.1.6.1MS培养基母液配方9 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究MS大量元素(20×):KN0338g，KH2PO43.4g，NH4NO333g，MgSO4·7H2O7.4g，CaCl2·2H2O8.8g，加水定容至1L。MS有机(100×):10mg盐酸硫胺素B1，200mg甘氨酸，50mg盐酸吡哆素B6，50mg盐酸，10g肌醇，加水定容至1L。MS微量元素(100×):MnSO4·H2O1.69g，ZnSO4·7H2O0.86g，H3BO30.62g，KI0.083g，Na2MoO4·2H2O0.025g，CuSO4·5H2O0.0025g，CoCl2·6H2O0.0025g，加水定容至1L。MS铁盐(200×):EDTA2Na7.46g，FeSO4·7H2O5.56g，加水定容至1L。2.1.6.2原生质体分离溶液酶解液：0.4%离析酶（macerozymeR10），1.5%纤维素酶（cellulaseR10），KCl0.02M，2%蔗糖，MES(pH5.7)0.02M，甘露醇0.5M。W5溶液：NaCl0.154M，CaCl20.125M，KCl0.005M，MES(pH5.7)0.002M。MMg溶液：甘露醇0.4M，MgCl20.015M，MES(pH5.7)0.004M。WI溶液：KCl0.02M，甘露醇0.5M，MES(pH5.7)0.004M。2.1.6.3WesternBlot所需溶液IP缓冲液：5mLTris-HCl(1M，pH7.5)，3mLNaCl（5M），100μLEDTA（0.5M），1mL1.0%Triton-X100，proteaseinhibitor2片，定容至100mL。PBS缓冲液:NaCl8g，KH.2PO40.24g，KCl0.2g，Na2HPO412H2O3.628g，ddH2O定容到1L。PBST缓冲液:1mLTritonX-100，PBSBuffer定容至1L，混匀。TBS缓冲液：NaCl（5M）100mL，Tris-HCl(1M，pH7.5)20mL，定容至1000mL。TBST缓冲液：NaCl（5M）100mL，Tris-HCl(1M，pH7.5)20mL，1mL0.05%Tween-20，定容至1000mL。4×SDS上样缓冲液：Tris-HCl(0.5M，pH6.8)2.5mL，DTT0.39g，SDS0.5g，溴酚蓝0.025g，2.5mL甘油。转膜缓冲液：Tris5.8g，甘氨酸2.9g，甲醇200mL，SDS0.37g，定容至1000mL。电泳液缓冲液：Tris3.03g，甘氨酸18.77g，SDS1g，定容至1000mL。封闭液：脱脂奶粉5g，100mLTBST。5%牛血清蛋白：BSA5g，100mLTBST。显影液(2.5×)：亚硫酸钠33.75g，米吐尔1.55g，溴化钾20.95g，纯水（50℃）定容至1000mL。10 山东农业大学硕士学位论文定影液：冰乙酸12.6g，硼酸7.5g，硫代硫酸钠240g，亚硫酸钠15g，钾明矾15g，纯水（50℃）定容至1000mL。2.1.6.4DAB染色所用试剂磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.2）：KCl0.04g，KH2PO40.048g，NaCl1.58g，K2HPO40.36g，加蒸馏水定容至200mL，调pH至7.2。30%TritonX-100：100%TritonX-1002.82mL，磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.2）7.28mL，38℃水浴2-3h使其充分溶解。0.01%TritonX-100的配制：30%TritonX-10040μL，磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.2）120ml。DAB染色液（1mg-1•mL）：DAB·4HCl200mg（用少量0.01M的磷酸盐缓冲液完全溶解），0.01%TritonX-10020μL，磷酸盐缓冲液（0.01M，pH7.2）定容至200ml。脱色液：乙醇：乳酸：甘油=3:1:12.2试验方法2.2.1植物总RNA提取参照康为世纪RNA提取试剂盒的方法提取RNA，具体方法如下：RNA提取步骤均在冰上进行（除DNaseI加入步骤），采用4℃离心。1）将500μLRLS溶液（加入巯基乙醇）加入DEPC水泡过的1.5mL离心管中，研磨适量植物材料加入离心管中，涡旋振荡，12000rpm离心1min。2）吸取上清加入新的离心柱中，12000rpm离心1min。3）吸取上清加入新的离心管中，加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将液体转入新的离心柱，12000rpm离心1min。4）弃废液，向离心柱中加入RW1350μL，12000rpm离心1min，弃废液。5）向离心柱中加入DNaseI工作液80μL，室温放置15min，加入350μLRW1，12000rpm离心1min，弃废液。6）向离心柱中加入PW漂洗液500μL，12000rpm离心1min，弃废液。重复此操作一次。7）将空的离心柱和收集管12000rpm离心2min，然后将离心柱放入新的1.5mL离心管，悬空滴加RNase-free水30μL，室温放置2min，12000rpm离心1min，得到洗脱的RNA用核酸定量仪测定浓度。11 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究2.2.2反转录cDNA合成反转录使用Thermo公司生产的ReverAidTMFirstStrandcDNASynthesis试剂盒，参照操作步骤如下：1)2μgRNA提取液，加入到无DEPC水处理的小离心管中，加入1μLOligo(dt)18，用无RNA酶的ddH2O补足12μL；2)65℃5min，取出后立即置于冰上；3)加入4μL5×ReactionBuffer，2μLdNTPmix(10mM)，1μLRiboLockRNaseInhibitor，1μLRevertAidM-MuLVReverseTranscriptase；4)42℃60min，进行反转录，70℃加热10min；5)将得到的cDNA第一链于-20℃保存。2.2.3基因克隆PCR扩增以cDNA为模板，高保真酶反应体系（50μL）：5×HFbuffer：10μL，dNTP（2.5mM）：4μL，Primers（10μM）：各2.5μL，cDNA：3μL，PhusionEnzyme:0.5μL，ddH2O补充至50μL。PCR反应条件：98℃预变性3min，98℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸1-5min，重复步骤34个循环，72℃延伸10min，4℃停止。反应结束后，加入适量5×Loadingbuffer，进行琼脂糖凝胶电泳，回收正确大小的条带。2.2.4PCR产物胶回收参照康为世纪快速琼脂糖凝胶回收试剂盒的方法进行回收，具体过程如下：1)将正确大小的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下，放入离心管称重。2)向离心管中加入3倍体积的BufferPG(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl)。3)50℃孵育10min，使胶块完全溶解。4)可选步骤，若目的片段小于500bp或大于4kb，加入等量异丙醇，使其充分混匀(每100mg加100μl异丙醇)。5)将吸附柱放入收集管中加入200μlBufferPS，12,000rpm离心2分钟，倒掉管中的液体，将吸附柱放回收集管。6)把上一步骤的溶液转移至吸附柱中，静置2分钟，12,000rpm离心1分钟，倒掉管中的液体，吸附柱放回收集管。7)向吸附柱中加入500μlBufferPG，12,000rpm离心1分钟，弃掉废液，把吸附柱12 山东农业大学硕士学位论文放回收集管。8)向吸附柱中加入650μlBufferPW(加入乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉管中的液体，把吸附柱放回收集管。9)12,000rpm离心2分钟，弃废液。10)将吸附柱转入新的管中，悬空滴加30-50μl无菌水，静置2分钟。12,000rpm离心2分钟，收集溶液，-20℃保存。2.2.5酶切和连接体系酶切体系：PCR产物30μL，NEBBuffer3.5μL，酶I0.5μL，酶II0.5μL，RNaseA0.5μL。合适温度金属浴2.5h，琼脂糖凝胶电泳，回收。连接反应：目的基因片段7μL，载体2μL，NEBBuffer1.1μL，DTT（0,4M）0.1μL，T4连接酶0.2μL，ddH2O补足至11μL。2.2.6大肠杆菌感受态细胞转化1)将保存在-80℃冰箱中的感受态细胞取出，冰浴融化，取50μl感受态细胞加入连接产物轻轻混匀，冰浴放置30min。2)37℃热激1.5min，冰上静置2min，加入200μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时。3)4000rpm离心4min，吸走多余的上清，用枪吸打混匀。4)将菌液滴于含有抗生素的LB板上，用玻璃棒涂匀，37℃倒置培养12h左右。2.2.7质粒DNA的提取1)将菌液1.5mL菌液倒入离心管中，12,000rpm离心40s，弃上清。2)加入200μl提取液Ⅰ，振荡器震荡充分混匀。3)加入200μl提取液Ⅱ，上下颠倒混匀，冰上5min。4)加入200μl提取液Ⅲ，上下颠倒混匀，冰上5min。5)12,000rpm离心10min，将上清转移至新的离心管，加入500-600μl异丙醇，上下颠倒混匀。6)12,000rpm离心10min，弃上清，吸走剩余的液体。7)加入1mL70%乙醇洗沉淀，使沉淀飘起来。8)12,000rpm离心1min，弃上清，吸走剩余乙醇。9)室温下彻底晾干，至无乙醇味，加入30μl无菌水，充分溶解沉淀，-20℃保存。2.2.8农杆菌的转化13 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究1）将保存在-80℃的农杆菌感受态在冰上融化，2μl质粒加入100μl感受态中，轻轻混匀，冰上静置30min，液氮速冻1min，42℃热激2min。2）加入800μl无抗YEP，28℃摇菌培养3h。3）4000rpm离心2min，弃上清，将剩余菌液混匀，在加有抗生素的YEP培养基上涂匀，28℃培养48h。2.2.9‘王林’愈伤转化1）农杆菌活化：试管中加入2mL含有抗生素的YEP培养液，100µL含有目的质粒的农杆菌菌液，28℃，200rpm培养10h。取1mL培养液加入到30mL含抗生素的YEP培养液中，继续震荡培养至OD=0.6-0.8。5000rpm，离心10min，弃上清，用等量无菌水重悬。2）侵染愈伤：选用生长12-14d的‘王林’愈伤，取适量加入农杆菌重悬液中。28℃，200rpm培养20min，纱布过滤出去菌液，并在无菌滤纸上吸干菌液，于无抗生素的培养基上预培养2d。3）转基因愈伤筛选：准备含有羧苄青霉素（300mg/L）和抗生素的培养基，将预培养的愈伤以薄层铺在培养基上，将新长出的愈伤转移到新的含抗性的培养基上，筛选3代，即可进行验证。2.2.10转化拟南芥1）农杆菌活化：活化方法与2.2.14拟南芥活化方法基本相同，但重悬液选用5%的蔗糖溶液。2）侵染：选用生长30d左右的已抽出花絮的拟南芥，用菌液侵沾含苞未放的花絮15s。将侵染后的拟南芥暗处理24h，然后正常培养。3）筛选：收取转化后的拟南芥种子，用75%的乙醇浸泡2min，40%次氯酸钠浸泡15min杀菌消毒后在含有抗生素的培养基上筛选。将生长较好的植株移出，继续收种，重复筛选3代，获得纯合子。2.2.11WesternBlot1）样品制备：样品用液氮研磨好，加入适量IpBuffer继续研磨至解冻，将样品倒入1.5mL离心管，4℃，14800rpm离心10min，将上清移入新的离心管，弃沉淀。将上清液和4×SDSLoadingBuffer以1:3体积混匀，95℃加热10min，-20℃保存。2）聚丙烯酰胺凝胶配制分离胶：30%丙烯酰胺6.8mL，Tris-HCl(1.5M，PH8.8)5.2mL，20%SDS100μL，14 山东农业大学硕士学位论文10%AP200μL，TEMED8μL，ddH2O补至20mL。浓缩胶：30%丙烯酰胺1.36mL，Tris-HCl(1M，PH6.8)1.04mL，20%SDS40μL，10%AP80μL，TEMED8μL，ddH2O补至8mL。3）电泳：将备用的蛋白样品解冻加入凝胶孔中，在浓缩胶中，45V恒压电泳45min，后在分离胶中110V电泳1.5h，至溴酚蓝跑出停止电泳，去除浓缩胶保留分离胶。4）转膜：硝酸纤维素膜在无菌水中轻摇浸泡15min，然后将胶和硝酸纤维素膜一起在转膜液中轻摇浸泡15min。在转膜仪上依次叠放厚滤纸、纤维素膜、凝胶、厚滤纸，注意铺平，无气泡。每块胶恒流0.06A，转膜1h。5）免疫：将纤维素膜浸泡在含有5%牛奶的PBST溶液中轻摇封闭1h，然后换上新的加入1/1000一抗的5%牛奶PBST溶液，4℃轻摇过夜。倒出一抗溶液回收，用PBST溶液清洗3次，每次轻摇5min。加入含有1/10000二抗的牛奶PBST溶液，轻摇1h。倒掉二抗，PBSTBuffer轻摇洗膜三次，每次5min。6）显影：将显影试剂A和B等体积混匀并在纤维素膜上均匀涂开，将纤维素膜用保鲜膜封好，固定在压片夹中。在暗室中将x光片覆盖在膜上，根据信号强弱判断曝光时间。然后在显影液中浸泡1-2min，定影液中1min，即可拿出暗室，观察蛋白信号。2.2.12接菌试验2.2.12.1愈伤组织接真菌试验选用生长12d长势均等的普通‘王林’愈伤组织和转基因愈伤，将生长状态一致、大小相等的菌饼接种在愈伤组织培养皿的中央。24℃暗培养，2-3d观察愈伤发病情况。2.2.12.2拟南芥叶片接真菌试验选用生长20d左右，未抽薹的拟南芥叶片，置于带滤纸的培养皿中，用无菌水将滤纸打湿，在叶片上放置生长状态一致、大小相等的菌饼。24℃暗培养，2-3d观察叶片发病情况。2.2.12.3拟南芥接种DC3000试验拟南芥叶片注射DC3000菌液试验中，将冻存于-80℃的菌液活化，挑取单克隆，于24℃，220rpm条件下培养12h，用MgCl-12（10µmol·L）溶液将菌液稀释至OD600=0.0002，用1ml的针管于叶背面注射等量的菌液于叶片。接种后2h、72h，分别取接菌叶片，进行细菌繁殖量计算（Luetal.,2010）。具体方法如下：接菌叶片首先用70%乙醇浸泡20Sec，然后用无菌水冲洗3次，0.5cm直径打孔器取大小相同的叶片，15 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究充分研磨叶片。收集研磨液，进行梯度稀释，取100μL稀释液在KB培养基上，28°C培养2d，统计菌落数量，计算cfu值。2.2.13DAB和台盼蓝染色选取接种轮纹病菌3d和腐烂病菌2d的拟南芥叶片（根据发病情况），进行染色。DAB染色：将叶片浸泡在DAB染色液中，抽真空10min使叶片完全浸入液体。遮光轻摇10h染色，照光1h。将染色液倒出，用无菌水冲洗叶片3次，置于脱色液中，80℃加热至叶片完全脱色，观察染色情况。台盼蓝染色：将甘油、乳酸和无菌水等体积混合，加入10mg台盼蓝粉末和10g苯酚，配成台盼蓝染液。将叶片浸泡在煮沸的台盼蓝染液中煮2min。取出叶片用无菌水冲洗干净，置于2.5g/mL的水合氯醛中，摇床上脱色过夜。2.2.14分离原生质体1）将10mL酶解液置于55℃加热10min，在冰上冷却至室温。加入100μLCaCl2（1M）混匀后倒入培养皿中。2）选取生长12d左右的愈伤组织，取2g置于酶解液中，使之分散均匀。抽真空30min，24℃暗培养12h。3）用手轻摇培养皿释放原生质体，加入10mLW5Solution，使用75um孔径的尼龙膜过滤，滤液置于50mL圆底离心管中，用5mLW5Solution冲洗培养皿，冲洗3次过滤。4）400rpm离心2min，弃上清。加入10mLW5，轻摇混匀。冰上静置30min使原生质体沉淀。弃上清，加入2mLMMgSolution，冰上备用。2.2.15烟草瞬时转化进行农杆菌活化，活化方法与2.2.14拟南芥活化方法相同。将活化后的菌体用MgCl2（10mM），MES（10mM），AS（150μM）的水溶液重悬，使OD=0.5。将重悬液避光静置3h，进行注射。注射选用生长3-4周的健康烟草，用1mL注射器在叶片背面进行。注射后2-3d进行表达检测。2.2.16总酚含量测定1）样品准备：取适量苹果愈伤并进行称重记录，液氮速冻研磨，加入20mL80%丙酮溶液，4℃浸提2h，吸取上清，将剩余残渣再次加入80%丙酮浸提一次。将两次浸提液混合，旋蒸除去丙酮，剩余溶液5000r·min-1离心2min，上清液用去离子水定容于20mL容量瓶。16 山东农业大学硕士学位论文2）含量测定：总酚含量测定采用Waterhouse检测方法并略有修改。采用FD法。取1mL滤液加入福林酚试剂，2mL7.5%Na2CO3和6mL蒸馏水，反应1h，使用分光光度计进行检测。以没食子酸为标准物质做标准曲线，得到回归方程y=8.7816x-0.0787，R2=0.9933。样品中总酚含量以没食子酸含量表示，其单位为mg·g-1。2.2.17苯胺蓝染色1）样品处理：将转基因拟南芥和野生型叶片分别浸泡于10mMMgCl2（对照）、DC3000（OD600=0.02）的MgCl2溶液和10μMflg22，溶于MESBuffer（25mMMES-KOH,pH=6.5和10mMKCl溶液）。置于24℃暗处理12h。2）脱色：用苯酚：甘油：乳酸：ddH2o：乙醇=1:1:1:1:2按体积混合制备脱色液，将叶片浸于脱色液中抽真空15min，65℃加热至叶绿素完全脱去（30min左右），将样品转移至新的脱色液中避光静置12h。3）染色：用50%的乙醇冲洗样品并用ddH2o冲洗干净，将样品浸于含有0.01%苯胺蓝的150mMK2HPO4（pH=9.5）溶液中染色30min。4）观察：将样品置于50%甘油中备用，使用荧光显微镜进行观察。3结果分析3.1MdSOBIR1的抗病性研究3.1.1MdSOBIR1的生物信息学分析拟南芥中研究表明，类受体激酶AtSOBIR1可通过与类受体蛋白AtRLP30互作参与新型蛋白质的受体激发子SCFE1诱导的触发免疫（Zhangetal.,2013）。为了研究苹果中SOBIR1的在苹果中的同源基因编码的蛋白质的免疫性质，以‘富士’苹果果皮为材料克隆得到苹果中SOBIR1基因并命名为MdSOBIR1。将MdSOBIR1和AtSOBIR1蛋白序列进行比对和进化树分析，通过对MdSOBIR1的结构和功能预测及基因功能进化分析，为后续功能研究奠定基础。根据ExPASy预测，MdSOBIR1预测蛋白质分子量为69595.85，等电点为9.11，共编码631个氨基酸。通过DNAMAN将MdSOBIR1与拟南芥AtSOBIR1进行氨基酸序列比对蛋白相似度为62.89%，其中两者在胞内激酶区相似度很高。使用SMART网站进行蛋白结构功能域分析，分析结果如图2所示：其信号肽区域（Signalpeptide）氨基酸序列为1-25；富亮氨酸重复区域（Leucinerepeatdomain），氨基酸序列为70-174；跨膜17 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究区域（Transmemberanedomain）为273-295；膜内激酶区域（Kinasedomain）氨基酸序列为336-626，表明MdSOBIR1是典型的富含亮氨酸类受体激酶。图2AtSOBIR1与MdSOBIR1蛋白序列比对Fig.2AtSOBIR1andMdSOBIR1proteinsequencealignment对不同物种的SOBIR1氨基酸序列进行进化树分析，探究该基因的起源和进化关系。使用AtSOBIR1的蛋白质序列在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行Blast分析，得到14个不同物种的SOBIR1同源蛋白序列，然后用MEGA5软件构建系统进化树（图3）。发现拟南芥SOBIR1在一个进化树枝上，而苹果和梨在另一个进化树枝上，AtSOBIR1与MdSOBIR1属于远亲同源，两者可能存在基因功能进化上的差异。18 山东农业大学硕士学位论文图3MdSOBIR1与其他物种的进化树分析。比例尺代表分支长度Fig.3PhylogenyanalysisofMdSOBIR1andotherreportedproteins.Thescalebarrepresentsthebranchlength3.1.2MdSOBIR1亚细胞定位为研究MdSOBIR1的功能，通过农杆菌转化获得MdSOBIR1-GFP超表达苹果愈伤组织，愈伤组织蛋白鉴定如图（4）所示。图4MdSOBIR1-GFP超表达愈伤组织蛋白鉴定Fig.4ProteinsidentificationofMdSOBIR1-GFPover-expressedcallus为进行MdSOBIR1蛋白的功能研究，将超表达MdSOBIR1-GFP的苹果愈伤组织分离原生质体进行亚细胞定位，通过荧光显微镜观察，如图（5A）所示，在原生质体细胞质膜观察到绿色荧光；通过农杆菌介导的瞬时转化法在烟草中瞬时表达MdSOBIR1-GFP，通过荧光显微镜下观察发现，如图（5B）所示，在烟草细胞质膜观察到绿色荧光，以上结果说明，MdSOBIR1定位于细胞膜上。19 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究图5MdSOBIR1亚细胞定位（A）超表达MdSOBIR1-GFP愈伤组织原生质体GFP定位。Wl代表对照；MdSOBIR1-GFP代表超表达愈伤组织（B）烟草MdSOBIR1-GFP瞬时表达GFP定位。GFP代表带有GFP标签的空载体；MdSOBIR1-GFP代表带有GFP标签的MdSOBIR1载体Fig.5MdSOBIR1subcellularlocalization（A）localizationofMdSOBIR1-GFPcallusprotoplast.Wlstandsforcontrol;MdSOBIR1-GFPindicatesoverexpressionofcallus（B）TobaccoMdSOBIR1-GFPtransientexpressionlocalization.GFPstandsforemptyvectorwithGFPtag;MdSOBIR1-GFPindicatesMdSOBIR1vectorwithGFPtag.3.1.3腐烂病菌侵染特异性诱导MdSOBIR1基因表达MdSOBIR1作为重要的位于细胞膜上的类受体激酶，具有感应和传递外界病原菌信号并引起胞内各种生理生化反应的作用。为探究苹果主要病害苹果轮纹病和腐烂病菌胁迫对MdSOBIR1基因表达的影响，在本研究中将苹果果实分别接种轮纹病菌和腐烂病菌，并以其病斑为中心，以0.5cm为直径的圆环取与病斑不同距离的果皮（0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm）为样品检测MdSOBIR1的基因表达。结果如图（6）显示，当苹果受到轮纹病菌侵染后，MdSOBIR1基因表达没有明显变化；当苹果受到腐烂病菌侵染后，MdSOBIR1表达量显著升高，在距病斑0-0.5cm处样品中表达量是对照的31.5倍。说明腐烂病菌能特异性提高MdSOBIR1的表达。由此可推测，轮纹病菌和腐烂病菌感染的机理不同；MdSOBIR1在响应腐烂病菌侵染方面可能作用更强。20 山东农业大学硕士学位论文图6病菌诱导的MdSOBIR1基因表达（A）轮纹病菌处理苹果果实对MdSOBIR1表达的影响。CTRL表示对照；Bd表示接种轮纹病菌（B）腐烂病菌处理苹果果实对MdSOBIR1表达的影响。CTRL表示对照；Vm表示接种腐烂病菌。0.5、1、1.5分别代表距离病斑0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm的圆环状样品。Fig.6FungalinducedMdSOBIR1geneexpression（A）TheeffectofB.dothideainfectionontheexpressionofMdSOBIR1geneinapplefruit.CTRLindicatescontrol;BdindicatesinoculationwithB.dothidea（B）TheeffectofV.maliinfectionontheexpressionofMdSOBIR1geneinapplefruit.CTRLindicatescontrol;BdindicatesinoculationwithV.mali.0.5,1,1.5respectivelyrepresentring-shapedsamples0-0.5cm,0.5-1cm,and1-1.5cmfromlesions.3.1.4超表达MdSOBIR1降低愈伤组织对苹果轮纹病菌的抗性通过农杆菌介导的转化法在苹果愈伤组织中超表达MdSOBIR1，并成功得到超表达MdSOBIR1的愈伤组织，蛋白鉴定如图所示（图7）。图7MdSOBIR1-HA超表达愈伤组织蛋白鉴定Fig.7ProteinsidentificationofMdSOBIR1-HAover-expressedcallus3.1.4.1超表达MdSOBIR1促进轮纹病菌诱导的苹果愈伤病斑扩展本研究中对对照和超表达MdSOBIR1愈伤组织进行接种轮纹病菌试验，结果如（图8,A）所示，接种轮纹病菌3天后，超表达MdSOBIR1愈伤组织发病程度显著高于对照；通过对病斑面积统计分析发现，对照平均发病面积为9.49cm2，超表达MdSOBIR1愈伤组织平均发病面积为13.28cm2（图8,B），超表达MdSOBIR1降低了愈伤组织对苹果轮纹病菌的免疫抗性。21 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究图8愈伤组织接种轮纹病菌表型（A）轮纹病菌侵染苹果愈伤组织表型（B）轮纹病菌侵染苹果愈伤组织病斑大小统计Fig.8CallusInoculationwithB.dothidea.（A）ThephenotypeofapplecallusafterinfectedbyB.dothidea(B)AnalysisoftheDiseaseSizeofAppleCallusInfectedbyB.dothidea3.1.4.2超表达MdSOBIR1降低轮纹病菌诱导的总酚物质积累总酚类物质是植物体内分布最广的次生代谢物，酚类物质含量在植物抗病方面发挥着非常重要的作用。本试验以接种轮纹病菌的超表达MdSOBIR1愈伤组织和对照病斑为中心，以0.5cm为直径的圆环取与病斑不同距离的愈伤组织（0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm）和发病部位（标记为核）为样品检测总酚含量。总酚含量测定结果分析显示：总酚含量由样品发病区域为中心向外逐渐降低，并且发病区域MdSOBIR1超表达愈伤组织总酚含量低于普通愈伤组织（图9）。图9轮纹病菌侵染苹果愈伤引起的总酚含量变化检测Fig.9DetectionofchangesinTotalphenolscontentinducedbyinfectionofB.dothidea3.1.4.3超表达MdSOBIR1降低轮纹病菌诱导的抗病相关基因表达水平病程相关蛋白（pathogenesis-relatedproteins，PRs）是植物在感受到病菌侵染或受到逆境胁迫时产生的一类蛋白，其中PR2和PR5等是参与SA信号转导途径调控的病程相关基因，在植物防卫反应中起重要作用（Thommaetal.,1998）。本试验对接种轮纹病菌的超表达MdSOBIR1和对照愈伤组织进行qRT-PCR检测，超表达MdSOBIR1愈伤22 山东农业大学硕士学位论文组织中，MdPR2和MdPR5表达水平显著低于普通苹果愈伤，SA信号转导途径关键基因MdNPR1的表达水平无显著差异（图10）。几丁质酶也是病原菌诱导产生的一类防御反应蛋白，现已证明，几丁质酶可通过裂解菌丝末端而抑制很多真菌的生长，其高水平表达能够减轻病原菌引起的病害。我们检测了接种轮纹病菌后几丁质酶基因MdChiB的表达，结果显示，超表达MdSOBIR1愈伤显著降低了轮纹病诱导的MdChiB基因表达，在距离病斑0-0.5cm的超表达MdSOBIR1愈伤组织样品中该基因表达量仅为CTRL的23.1倍，而相同条件下的对照的表达倍数为75.7倍（图10）。图10轮纹病菌诱导的抗病相关基因表达。0.5、1、1.5分别代表距离病斑0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm的圆环状样品。Fig.10Resistancetodisease-relatedgenesinducedbyB.dothidea.0.5,1,1.5respectivelyrepresentring-shapedsamples0-0.5cm,0.5-1cm,and1-1.5cmfromlesions.3.1.4.4超表达MdSOBIR1抑制轮纹病菌诱导的ACS基因表达ACS是乙烯合成过程的限速酶，对乙烯合成有重要的调控功能。在植物组织中，ACS表达水平一般较低，但生物和非生物胁迫可诱导其迅速合成致使乙烯含量迅速增加。ACS基因是JA/ET信号转导途径的关键基因（石英，2003）。qRT-PCR检测研究结果分析表明，当受到轮纹病菌侵染后，愈伤组织中MdACS4表达水平显著升高，在距离病斑0-0.5cm的样品中，对照ACS4表达量为超表达MdSOBIR1愈伤的27.6倍（图11）。23 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究图11轮纹病菌诱导的ACS基因表达。0.5、1、1.5分别代表距离病斑0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm的圆环状样品。Fig.11TheACSgeneexpressioninducedbyB.dothidea.0.5,1,1.5respectivelyrepresentring-shapedsamples0-0.5cm,0.5-1cm,and1-1.5cmfromlesions.3.1.5超表达MdSOBIR1抑制拟南芥中轮纹病菌诱导的病斑扩展为了进一步研究MdSOBIR1在抵御轮纹病菌侵染中的作用，我们通过农杆菌介导的转化法在拟南芥中超表达MdSOBIR1，并成功获得转基因植株，筛选得到7#、8#和12#三个转基因株系，然后经3代筛选获得纯合体（图12）。图12MdSOBIR1-GFP转基因拟南芥蛋白鉴定Fig.12ProteinidentificationofMdSOBIR1-GFPTransgenicArabidopsis取超表达MdSOBIR1转基因拟南芥叶片和野生型叶片进行接种轮纹病菌试验，每个株系接菌30个叶片，接菌3d后观察发病表型并统计发病情况。试验结果表明，接种轮纹病菌后在野生型拟南芥中可明显观察到叶片发黄和菌丝扩展，超表达MdSOBIR1转基因拟南芥叶片则保持相对完整的绿色且菌丝扩展面积较小（图13,A、B）；说明超表达MdSOBIR1转基因拟南芥中明显抑制轮纹病菌的扩展。此结果与苹果愈伤组织研究结果不一致，因此MdSOBIR1对轮纹病菌的抗性还需要进一步通过改进试验方法来验证。24 山东农业大学硕士学位论文图13拟南芥叶片接轮纹病菌表型(A)轮纹病菌病菌侵染拟南芥表型(B)轮纹病菌侵染拟南芥叶片台盼蓝染色表型Fig.13ArabidopsisleafinoculationwithrotB.dothidea.(A)ThephenotypeofArabidopsisthalianaInfectedbyB.dothidea.(B)B.dothidea.infectionInducedtrypanbluestainingphenotypeofArabidopsisLeaves3.1.6超表达MdSOBIR1提高愈伤组织对腐烂病菌的抗性3.1.6.1超表达MdSOBIR1抑制腐烂病菌诱导的病斑扩展本研究中对对照和超表达MdSOBIR1愈伤组织进行接种腐烂病菌试验，结果如图（14,A）所示，接种腐烂病菌3d后，超表达愈伤组织发病程度显著小于对照；通过对病斑面积统计分析发现，普通愈伤组织平均发病面积为23.55cm2，超表达愈伤组织平均发病面积为14.01cm2（14,B），说明超表达MdSOBIR1明显抑制腐烂病菌在愈伤组织中的扩展。图14愈伤组织接种腐烂病菌表型（A）腐烂病菌侵染苹果愈伤组织表型（B）腐烂病菌侵染苹果愈伤组织病斑大小统计Fig.14CallusInoculationwithV.mali（A）ThephenotypeofapplecallusafterinfectedbyV.mali.(B)AnalysisoftheDiseaseSizeofAppleCallusInfectedbyV.mali25 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究3.1.6.2超表达MdSOBIR促进腐烂病菌诱导的总酚物质积累和MAPK活性本研究对对照和超表达MdSOBIR1愈伤组织进行总酚含量测定。结果如图15所示，总酚含量由样品发病区域为中心向外逐渐降低，超表达MdSOBIR1愈伤组织总酚含量明显高于对照（图15）。说明超表达MdSOBIR1通过提高酚类物质合成来增强抗病性。图15腐烂病菌侵染苹果愈伤引起的总酚含量变化检测Fig.15DetectionofchangesintotalphenolscontentinducedbyinfectionofV.maliMAPK级联途径在植物体内参与多种信号转导，在植物抗病信号转导途径中也发挥着非常重要的作用。在试验中，按照上述取样方法取愈伤组织样品内、中、外圈（发病部位愈伤组织死亡，无法测定MAPK活性），检测MAPK活性发现，当受到腐烂病菌侵染时，超表达MdSOBIR1愈伤组织中MAPK活性明显升高（图16）。图16腐烂病菌诱导的苹果愈伤MAPK活性检测Fig.16DetectionofMAPKactivityinducedbyV.maliinfectioninapplecallus.3.1.6.3超表达MdSOBIR1提高腐烂病菌诱导的抗病相关基因表达qRT-PCR检测结果表明，在接种腐烂病菌的MdSOBIR1超表达愈伤组织中，MdPR2、MdPR5及MdChiB基因表达均显著高于对照。NPR1是调控植物抗病性的一个关键基因，其积累是诱导水杨酸介导的PR基因表达及SAR的产生超表达MdSOBIR1愈伤组织中MdNPR1基因的表达水平显著高于对照（图17）。26 山东农业大学硕士学位论文图17腐烂病菌诱导的苹果愈伤抗病相关基因表达。0.5、1、1.5分别代表距离病斑0-0.5cm、0.5-1cm、1-1.5cm的圆环状样品。Fig.17V.maliInfection-inducedAppleCallusResistanceGeneExpression.0.5,1,1.5respectivelyrepresentring-shapedsamples0-0.5cm,0.5-1cm,and1-1.5cmfromlesions.3.1.7超表达MdSOBIR1提高拟南芥对腐烂病菌的抗性3.1.7.1MdSOBIR1抑制拟南芥中腐烂病菌诱导的病斑扩展取超表达MdSOBIR1转基因拟南芥叶片和野生型叶片进行接种腐烂病菌试验，每个株系接菌30个叶片，接菌2d后观察发病表型并统计发病情况。试验结果表明，接种病菌后叶片发病处呈腐烂状，可观察到明显的病斑扩展，发病部位首先发黄，继而发生褐色软烂病症，超表达MdSOBIR1转基因拟南芥叶片的发病程度显著低于对照（图18,A）；通过对病斑面积进行统计分析发现，在野生型拟南芥的30片叶片中，发病面积占叶片面积1%-5%的叶片为12片，发病面积占叶片面积20%-50%的叶片数为11片，发病叶片集中于这两个等级。而转基因拟南芥的3个株系，叶片发病面积菌集中于0%-1%和1%-5%的等级中（表1）。说明超表达MdSOBIR1转基因拟南芥中明显抑制病菌的扩展。27 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究表1腐烂病菌诱导的拟南芥叶片发病程度统计表Table.1AnalysisofthediseaseseverityofArabidopsisthalianainducedbyV.mali发病等级样品名称接种样品数12345Col3031221127#301556408#3012945012#301112700发病等级：1.发病面积占叶片面积0%-1%；2.发病面积为1%-5%；3发病面积为5%-20%；4.发病面积为20%-50%；5.发病面积为50%-80%Incidencelevel:1.Incidenceareais0%-1%ofleafarea;2.Incidenceareais1%-5%;3Incidenceareais5%-20%;4.Incidenceareais20%-50%;5.Incidenceareais50%-80%3.1.7.2MdSOBIR1转基因抑制拟南芥中腐烂病菌诱导的细胞坏死通过台盼蓝染色可以鉴定损伤或坏死的细胞。正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能进入细胞内；而丧失活性的细胞或遭到破坏的细胞质膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。本试验为鉴定腐烂病菌对植物细胞活性的破坏，对接菌叶片进行台盼蓝染色，试验结果表明，野生型拟南芥被台盼蓝染色面积远大于转基因叶片（图18,B），说明MdSOBIR1能够抵御腐烂病菌对细胞的损伤。植物细胞在受到病原菌感染时，会发生过敏反应，引起大量的活性氧产生和积累。某些活性氧在感染初期可以充当信号分子，促使植物组织产生防御反应；然而活性氧具有极强的氧化活性，其在体内的过量积累能与大量生物分子发生反应，引起机体损伤。植物机体内含有活性氧清除机制，能抵御活性氧积累造成的伤害，活性氧清除能力强的植物在抗逆能力较强。试验通过检测腐烂病菌感染后期拟南芥野生型和MdSOBIR1转基因拟南芥叶片中的活性氧含量，结果如图（18,C）显示，超表达MdSOBIR1降低了腐烂病菌诱导的拟南芥叶片活性氧产生。28 山东农业大学硕士学位论文图18拟南芥叶片接腐烂病菌表型(A)腐烂病菌病菌侵染拟南芥表型(B)腐烂病菌侵染拟南芥叶片台盼蓝染色表型(C)腐烂病菌侵染拟南芥叶片ROS染色表型Fig.18ArabidopsisleafinoculationwithrotV.mali(A)ThephenotypeofArabidopsisthalianaInfectedbyV.mali(B)V.maliinfectionInducedtrypanbluestainingphenotypeofArabidopsisLeaves(C)PhenotypeofROSstaininginleavesofArabidopsisthalianainducedbyV.mali3.1.8超表达MdSOBIR1特异性增强flg22诱导的拟南芥胼胝质积累胼胝质的积累在植物抗病反应中具有非常重要的作用，形成一个物理屏障，有效阻碍病原菌对寄主细胞的穿透过程。在试验中将MdSOBIR1转基因拟南芥与野生型分别用10mMMgCl2（对照）、DC3000（OD600=0.02）的MgCl2溶液和溶于MESBuffer（25mMMES-KOH,pH=6.5和10mMKCl溶液）的10μMflg22溶液，24℃暗处理12h。然后用苯胺蓝染色，在荧光显微镜下观察胼胝质积累。结果显示：SOBIR1微弱提高DC3000引起的胼胝质积累，明显提高了flg22侵染诱导的胼胝质积累（图19）。29 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究图19拟南芥叶片的胼胝质积累Fig.19calloseaccumulationinArabidopsisthalianaleaves3.1.9MdSOBIR1转录组分析为深入研究MdSOBIR1超表达对苹果基因转录调控的影响，为探究其抗病分子机制提供理论依据。将生长14d的MdSOBIR1超表达愈伤组织和普通‘WL’愈伤组织以及两者分别接种轮纹病菌和腐烂病菌的样品进行转录组测序，通过差异基因的Pathway富集分析等筛选MdSOBIR1可能参与的抗病相关的信号转导途径。根据前人大量研究表明，SOBIR1作为LRR-RLK在植物免疫途径中通常通过与各种RLP互作，形成蛋白复合体在病原菌信号传递过程中起到关键作用，根据转录组测序结果分析，在得到的基因差异较大（log2FoldChange>2）的抗病相关的RLP中，得到两种病菌在转基因株系中引起特异性表达的RLPs，在后续试验中可进行验证和互作试验。表2轮纹病菌诱导MdSOBIR1超表达愈伤特异表达的RLP编码基因Table2InductionofRLP-encodingGenes’expressionbyB.dothideainCallusoverexpressionofMdSOBIR1基因序列号GeneID类别Classlog2FoldChangeMDP0000471111C-Terminallyencodedpeptidereceptor2，CEPR24.700439718MDP0000515395MIK2/MDIS1-INTERACTINGRECEPTORLIKEKINASE22.14IMK2(INFLORESCENCEMERISTEMRECEPTOR-LIKEMDP0000283736-2KINASE2)30 山东农业大学硕士学位论文表3腐烂病菌诱导MdSOBIR1超表达愈伤特异表达的RLP编码基因Table3InductionofRLP-encodingGenes’expressionbyV.maliinCallusoverexpressionofMdSOBIR1基因序列号GeneID类别Classlog2FoldChangeMDP0000723491ElongationfactorTu(EF-Tu)receptor,EFR7.577428828MDP0000779032Mdis1-interactingreceptorlikekinase2，MIK27.46760555MDP0000301936putativereceptor-likeproteinkinase,At3g471107.118941073MDP0000707827leucine-richrepeattransmembraneproteinkinase,At3g75705.247927513Pathway富集分析将差异基因按照基因功能进行了分类。如图（20）所示，轮纹病菌侵染诱导的差异基因的富集功能途径较分散，其中泛素介导的蛋白水解、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化及过氧化物酶体等功能差异基因数量较多，但仅有过氧化物酶途径基因富集显著。腐烂病菌侵染诱导的差异基因的富集功能途径集中在植物激素信号转导途径，并且富集显著。植物过氧化物酶和植物激素如水杨酸、茉莉酸以及乙烯等广泛参与植物抗病植物抗病反应，可进一步鉴定MdSOBIR1转基因是否通过改变此2方面功能途径诱导植物抗病。图20SoBIR1-CK/SoBIR1-Bd和SoBIR1-CK/SoBIR1-Vm差异基因的富集功能途径。x轴代表富集因子。y轴代表路径名称。颜色表示Q-值(高：白，低：蓝)，越低的Q-值表示越显著的富集。Fig.20SoBIR1-CK/SoBIR1-BdandSoBIR1-CK/SoBIR1-Vm’spathwayfunctionalenrichmentofdifferentexpressiongenes.Thex-axisrepresentstheenrichmentfactor.They-axisrepresentsthepathname.ColorsrepresentQ-values(high:white,low:blue),lowerQ-valuesrepresentmoresignificantenrichment3.2MdFLS2的抗病性研究3.2.1超表达MdFLS2的fls2突变体拟南芥部分恢复对flg22的敏感性31 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究flg22对根系生长的抑制是检测植株对flg22敏感性的经典实验（Gómez-Gómezetal.,2000;Chinchillaetal.,2007）。将拟南芥野生型Col、fls2突变体及MdFLS2转基因系分别播种在含flg22的培养板中并以普通培养基做对照，正常条件下垂直放置培养10d，统计根系长度。结果表明：flg22能抑制野生型拟南芥植株的根系伸长，而对fls2突变体没有影响，并且将MdFLS2在fls2突变体中超表达，恢复了flg22对fls2根系生长的抑制作用（图21）。AtFRK1、At1g51890和At2g17740为拟南芥中响应flg22处理的标志性基因（Heetal.,2006）。本研究检测到转基因拟南芥株系在flg22处理后被诱导的标志性基因的表达情况。结果表明，在转基因株系中flg22对标志性基因表达的诱导作用显著低于野生型（图22）。MAPK信号转导途径中MPK6和MPK3的激活是拟南芥对flg22进行响应的另一标志性事件（Sunetal.,2013）。flg22处理能够激活野生型拟南芥中MPK6和MPK3，而对fls2突变体及转基因株系没有激活作用（图23），说明MdFLS2对flg22的敏感性不如野生型。图21flg22对野生型、fls2及转基因拟南芥株系根系伸长的影响Fig.21Theeffectofflg22onArabidopsisrootelongationinwildtype,fls2andtransgeniclines32 山东农业大学硕士学位论文图22flg22对野生型、fls2及转基因拟南芥株系中flg22特异响应基因表达的诱导作用Fig.22Theinductionofflg22-responsivemarkergenesbyflg22inwild-type,fls2andtransgeniclines图23flg22对野生型、fls2突变体及转基因株系中MAPK信号的诱导激活Fig.23TheactivationofMAPKsignalingbyflg22inwildtype,fls2andtransgeniclines.3.2.2超表达MdFLS2提高了拟南芥对轮纹病菌的抗性并恢复了fls2突变体对假单胞菌的抗性FLS2在苹果中的同源基因MdFLS2的病原菌识别和抗病能力一直未见报道。本试验中利用实验室保存的在Atfls2突变体上转MdFLS2的转基因拟南芥纯合体30#和34#以及fls2突变体进行病原菌抗性试验，验证了MdFLS2对轮纹病菌和细菌DC3000的抗性作用。叶片发黄并伴有灰黑色病斑为拟南芥叶片接种轮纹病菌侵染的病症。与野生型叶片相比，在相同的接种时间内，超表达MdFLS2的叶片较绿，保持完整，病症显著减轻（图24）。根据Mosquera等（2009）的研究方法，进一步比较了轮纹病菌在不同样品中的扩33 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究展量。结果表明：在转基因株系的叶片所提取的RNA组织样本中，轮纹病菌β-tubulin的扩增亮度显著低于野生型拟南芥叶片中β-tubulin的扩增量（图25,A）；qRT的研究结果显示，30#、34#两系的β-tubulin的含量分别为野生型叶片中的7.1%、12.6%（图25,B）。说明，轮纹病菌在转基因株系叶片中扩展与生长显著低于野生型，MdFLS2超表达提高了植株对轮纹病菌的抗性。假单胞菌DC3000是植物免疫反应机制研究中使用的模式菌。可以看到，叶片接种假单胞菌DC3000后，fls2发病最重，野生型其次，与前人研究结果一致（Zipfeletal.，2004），但是与突变体fls2相比，转基因系30#、34#发病显著降低，叶片绿色程度保持最好（图26）；而DC3000在叶片中繁殖的定量研究结果也表明，在30#、34#两系中，病菌的繁殖数量显著低于fls2突变体（图27）。图24拟南芥叶片轮纹病菌接种侵染病症Fig.24ThesymptomofB.dothideainfectedArabidopsisleaves图25轮纹病菌在拟南芥叶片中的扩展统计（A）接菌后叶片轮纹病菌β-tubulin基因半定量检测（B）接菌后叶片发病面积统计Fig.25TheExtendedStatisticsofB.dothideainArabidopsisLeaves（A）Semi-quantitativedetectionofRotavirusgeneβ-tubulininleavesafterinoculation（B）Incidenceofleafareaafterinoculation34 山东农业大学硕士学位论文图26假单胞菌DC3000接种野生型、MdFLS2超表达系、fls2突变体的表型Fig.26ThesymptomofDC3000-infectedArabidopsisleaves图27DC3000接种拟南芥后细菌含量Fig.27DC3000bacterialcontentafterinoculationwithArabidopsis.35 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究4讨论4.1MdSOBIR1的保守性分析定位在细胞膜上的受体在植物防卫反应中处于前线位置，研究其如何感知病原菌攻击对于推进人们对植物先天免疫的理解十分重要。LRR-RLK是植物和动物中最重要的一类免疫受体（Kawai&Akira,2010）。近年来，植物类受体激酶由于在感受和传递病原信号方面的重要功能被广泛研究（MonaghanandZipfel,2012），尤其在拟南芥和番茄中的研究较为深入（Zipfeletal.,2006；Liebrand.,2013）。但是对于苹果中同源基因MdSOBIR1的抗病机制的研究尚未见报道。本试验经过亚细胞定位和蛋白序列分析表明MdSOBIR1是一类定位在细胞膜上的典型的富亮氨酸重复的类受体激酶，而其蛋白序列与拟南芥相似度并不高，相似度为62.89%，其中胞内区域更为保守（图3,4）。系统进化树分析表明，MdSOBIR1与AtSOBIR1属于远亲同源，与梨PrSOBIR1亲缘关系最近（图2），其执行功能与机制可能与AtSOBIR1存在差异，MdSOBIR1的特异性功能值得深入研究。4.2MdSOBIR1对病害的抗性调控机制已有研究表明，苹果SOBIR1同源基因在受到梨火疫病原细菌（Erwiniaamylovora）侵染过程中，表现出了基因上调（Jensenetal.,2012）。本试验对‘富士’苹果材料分别接种轮纹病菌和腐烂病菌，发现腐烂病菌特异性诱导MdSOBIR1基因表达（图5），暗示该基因可能参与腐烂病菌诱导的抗性途径。为研究MdSOBIR1在病原诱导应激信号通路中的作用，本试验评估了MdSOBIR1稳定表达的转基因愈伤和拟南芥对2种苹果主要真菌性病害和一种细菌的免疫反应。超表达MdSOBIR1提高了愈伤组织对腐烂病菌和flg22的抗性但增加了对轮纹病菌的敏感性。已有试验结果表明，白粉病诱导PR1、PR5和NPR1基因表达提高（Singhetal.,2013;Fryeetal.,1998），参与SA介导的信号通路。Kang等使用SA处理或烟草花叶病毒感染烟草叶片，包括几丁质酶在内的多种病程相关蛋白基因表达量被强烈诱导升高。我们通过试验发现，腐烂病菌诱导的超表达MdSOBIR1愈伤中PR2、PR5、ChiB及NPR1基因表达明显高于普通愈伤，表明超表达MdSOBIR1通过增强SA信号转导途径抵御腐烂病菌的侵染。AtMAPK3和AtMAPK6和AtMAPK4这3个MAPKs不仅参与植物生物和非生物胁迫（Droillardetal.,2002），还参与激素信号转导途径（Bush&Krysan,2007），尤其在36 山东农业大学硕士学位论文植物抗病中的作用研究日益增多（Brodersenetal.,2006）。MdSOBIR1超表达提高腐烂病菌诱导的MAPK3和MAPK6表达活性升高，提高植物抗病能力。MdSOBIR1转基因拟南芥同样表现出腐烂病菌抗性，抑制病菌侵染引起的组织坏死。MdSOBIR1超表达愈伤对轮纹病菌的侵染更敏感，PR2、PR5和ChiB的表达量均低于普通苹果愈伤，由于超表达MdSOBIR1拟南芥与愈伤接种轮纹病菌表型相反，因此对轮纹病的抗性还需要进一步研究。4.3苹果MdSOBIR1互作蛋白预测SOBIR1作为调控RLPs的功能的必要RLK，被认为能够与多种RLPs互作执行生物学功能（Liebrandetal.,2014）。近年来大量研究表明SOBIR1与不同的参与植物防御反应和生长发育的RLPs互作：LepR3是最近克隆得到的甘蓝型油菜黑胫病抗性基因，编码一类类受体蛋白，通过本氏烟模式植物体系研究发现，BnSOBIR1与LepR3互作，参与LepR3介导的对油菜茎基溃疡病菌的抗性（Ma&Borhan,2015）。根据以上大量研究，我们推测MdSOBIR1通过与具有免疫调节作用的RLPs互作参与免疫反应。为筛选互作蛋白，我们将普通‘WL’愈伤、‘MdSOBIR1’超表达愈伤以及两者分别接种轮纹病菌和腐烂病菌的样品进行转录组分析，得到具有明显差异的编码RLPs的植物防御基因。分析得到候选互作基因MdCEPR2（MDP0000471111）、MdMIK2（MDP0000779032）以及拟南芥EFR、FLS2同源基因（MDP0000723491、MDP0000707827）。虽然研究证实MdSOBIR1不与大部分RLKs互作，但WeiguoZhang等（2003）研究发现SCEF1触发的免疫由AtRLP30介导，并受到类受体激酶SOBIR1和BAK1调控，说明SOBIR1与RLPs形成的复合体可与RLKs相互作用共同调控免疫反应。4.4MdFLS2具有flg22识别功能本试验结果表明MdFLS2在fls2突变体中过表达，赋予fls2突变体识别flg22的能力，具体表现为根系伸长受到flg22抑制（图19），说明苹果MdFLS2不仅能够识别flg22，而且具有将信号进一步向下游进行传递的能力。在接种革兰氏阴性菌假单胞菌DC3000的试验中发现拟南芥突变体fls2不能够识别病原菌入侵，不产生活性氧、不具有对DC3000的免疫抗性；而超表达MdFLS2拟南芥株系能够识别假单胞菌DC3000，引起活性氧产生，并且具有较强的病原菌抗性，再次说明MdFLS2具有识别细菌鞭毛蛋白flg22能力。但其响应flg22的标志性基因表达的诱导倍数及MAPK激活响应上，远远低于野37 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究生型（图20,21），可能反映出在信号识别后，受体对下游信号传递具有不同的调控方式，该研究结果与Sun等（2013）、Schwessinger等（2011）的研究结果一致。另外，根系伸长试验为flg22在长时间处理与响应的结果，而MAPK激活及标志性基因的诱导表达为短时间的反应的结果，因此，这种不同的响应也可能反映了MdFLS2与拟南芥AtFLS2在信号识别与传递上具有不同的机制。Chinchilla等（2006）的研究发现，番茄SlFLS2与拟南芥AtFLS2对flg22变体具有不同的识别反应，本研究结果与之类似。4.5MdFLS2对病害的抗性调控机制Trdá等（2014）发现将VvFLS2在拟南芥中超表达，提高了对真菌病害Botrytiscinerea的抗性。本试验得到了相似的结果：MdFLS2识别来自于细菌的保守性分子，MdFLS2超表达也提高了对真菌病害轮纹病致病菌的抗性，这可能与在MdFSL2转基因植株中SA信号转导水平高，间接提高了对植物对轮纹病菌的抗性有关。4.6MdSOBIR1与MdFLS2的相互作用机制预测拟南芥中研究发现，SOBIR1和BAKI的共同调控，在类受体蛋白AtRLP30介导的触发免疫中起必要作用；而通过感应flg22，拟南芥FLS2又可以与BAK1形成蛋白复合体传递免疫信号，引起植物抗病反应。拟南芥中过表达MdSOBIR1显著提高了对轮纹病菌的抗性，与另一具有免疫功能的类激酶受体MdFLS2在拟南芥中过量表达研究结果相同，因此猜想二者在提高对轮纹病菌的抗性上，可能具有信号交叉的节点。由此可见，MdSOBIR1转基因愈伤提高了对腐烂病菌和flg22的抗性。诸多证据表明MdSOBIR1可通过SA信号转导途径提高腐烂病菌触发免疫的抗性，但其抗病作用很可能通过参与具有抗病能力的RLPs介导的免疫反应完成，其互作蛋白的筛选和鉴定为进一步研究的方向。MdFLS2具有flg22识别功能，同时具有对苹果轮纹病的抗性，其具体反应机制需要进一步研究。我们猜测，在苹果中MdSOBIR1和MdFLS2通过某一类受体蛋白结合，共同介导对flg22的抗性，而这一猜想还需要在后续研究中证实。以上试验材料均为愈伤材料和拟南芥模式植物，拟南芥作为模式植物，在很多物种的抗病试验中都被采用。比如葡萄灰霉病菌接种转基因拟南芥叶片,以拟南芥模式体系接种水稻稻瘟病菌的相关研究报道等，均表明拟南芥体系的可靠性。但是在后续试验中，需要以苹果植株为试材对MdSOBIR1和MdFLS2功能进一步验证。38 山东农业大学硕士学位论文5结论1）MdSOBIR1定位于细胞膜上，具有信号肽区域、亮氨酸富含区域、跨膜区以及胞内激酶区，是典型的位于细胞膜上的富含亮氨酸重复类受体激酶。2）超表达MdSOBIR1通过提高SA信号转导途径和MAPK级联激酶途径提高对腐烂病菌的抗性。3）超表达MdSOBIR1特异性提高拟南芥对细菌鞭毛蛋白N端22个保守的活性肽物质flg22的抗性。4）MdFLS2具有flg22识别功能并将免疫信号传递到下游诱导免疫反应。超表达MdFLS2提高了拟南芥对苹果轮纹病菌和模式细菌假单胞菌DC3000的抗性。39 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究参考文献陈美霞,陈学森.果树果实风味物质组成及其遗传的研究进展,2004,中国园艺学会青年学术讨论会.郭泽建,李德葆.活性氧与植物抗病性[J].植物学报,2000,42(9):881-891.路梅,徐传雨,郭卫东.植物LRR类受体激酶的研究进展.浙江师范大学学报(自然科学版),2006,29(3):322-325.彭金英,黄勇平.植物防御反应的两种信号转导途径及其相互作用[J].植物生理与分子生物学学报,2005,31(04):347-353.石英.胁迫对LE-ACS及乙烯信号转导中核内组分基因表达影响的研究[D].中国农业大学,2003.王金政,薛晓敏,路超.我国苹果生产现状与发展对策.[J].山东农业科学,2010,(6):117-119.杨洪强,接玉玲.植物MAPK及其在病原信号传递中的作用[J].植物病理学报,2003,(01):8-13.张海文,黄荣峰,卢向阳.茉莉素的信号转导与植物的防御反应[J].植物生理学报,2002,38(6):631-635.AliGS,PrasadKVSK,DayI,ReddyAS.Lig-anddependentreductioninthemembranemobilityofflagellinsensitive2,anArabidopsisreceptor-likekinase.PlantandCellPhysiology,2007,48(11):1601-1611.Antolin-LloveraM,RiedM.K,BinderA,ParniskeM.Receptorkinasesignalingpathwaysinplantmicrobeinteractions.AnnuRevPhytopathol,2012,50:451–473.AsaiT,TenaG,PlotnikovaJ,WillmannMR,ChiuWL,Gomez-GomezL.MAPkinasesignallingcascadeinArabidopsisinnateimmunity.Nature,2002,415:977–983.BrandU,FletcherJC,HobeM,MeyerowitzEM,SimonR.DependenceofstemcellfateinArabidopsisonafeedbackloopregulatedbyCLV3activity[J].Science,2000,289(5479):617-619.BoudsocqM,WillmannMR,McCormackM,LeeH,ShanLB,HeP.Differentialinnate40 山东农业大学硕士学位论文immunesignallingviaCa2+sensorproteinkinases.Nature,2010,464:418–U116.BleckmannA,Weidtkamp-PetersS,SeidelCAM,SimonR.StemcellsignalinginArabidopsisrequiresCRNtolocalizeCLV2totheplasmamembrane.PlantPhysiol,2010,152(1):166–176.BiG,LiebrandTW,CordewenerJH,AmericaAH,XuX,JoostenMH.Arabidopsisthalianareceptor-likeproteinatrlp23associateswiththereceptor-likekinaseatsobir1.PlantSignaling&Behavior,2014,9(2).BollerT,FelixG.Arenaissanceofelicitors:Perceptionofmicrobe-associatedmolecularpatternsanddangersignalsbypattern-recognitionreceptors.AnnuRevPlantBiol,2009,60:379–406.Becraft,PhilipW.Receptorkinasesinplantdevelopment[J].TrendsinPlantScience,1998,3(10):384–388.BushSM,KrysanPJ.MutationalevidencethattheArabidopsisMAPkinaseMPK6isinvolvedinanther,inflorescence,andembryodevelopment.JExpBot,2007,58:2181~2191BrodersenP,PetersenM,BjornNielsenH,ZhuS,NewmanMA,ShokatKM,RietzS,ParkerJ,MundyJ.ArabidopsisMAPkinase4regulatessalicylicacid-andjasmonicacid/ethylene-dependentresponsesviaEDS1andPAD4.PlantJ,2006,47:532~546.ChinchillaD,BauerZ,RegenassM,BollerT,FelixG.TheArabidopsisreceptorkinaseFLS2bindsflg22anddeterminesthespecificityofflagellinperception.ThePlantCell,2006,18(2):465–476.ChenX,ShangT,ChenD,LeiC,ZouY,ZhaiW,LiuG,XuJ,LingZ,CaoG,MaB,WangY,ZhaoX,LiS,ZhuL.AB-lectinreceptorkinasegeneconferringriceblastresistance.PlantJournal,2006,46(5):794-804.ColetteA,BochdanovitsZ,JansweijerVM,etal.ProbingtherolesofLRRRLKgenesinArabidopsisthalianarootusingcustomT-DNAinsertionset[J].Plantmolecularbiology,2011,76(1-2):69-83.ChinchillaD,ZipfelC,RobatzekS,KemmerlingB,NurnbergerT,JonesJDG.AflagellininducedcomplexofthereceptorFLS2andBAK1initiatesplantdefence.Nature,2007,448:497–U412.41 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究DoddsPN,RathjenJP.Plantimmunity:towardsanintegratedviewofplant-pathogeninteractions.Nat.Rev.Genet,2010,11:539–548.DecreuxA,ThomasA,SpiesB,BrasseurR,VanCutsemP,MessiaenJ.Invitrocharacterizationofthehomogalacturonan-bindingdomainofthewall-associatedkinaseWAK1,usingsite-directedmutagenesis.Phytochemistry,2006,67(11):1068-1079.DoaresSH,SyrovetsT,WeilerEW,RyanCA.OligogalacturonidesandChitosanActivatePlantDefensiveGenesThroughtheOctadecanoidPathway[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1995,92(10):4095-4098.DroillardM,BoudsocqM,Barbier-BrygooH,LauriereC.DifferentproteinkinasefamiliesareactivatedbyosmoticstressesinArabidopsisthalianacellsuspensions.InvolvementoftheMAPkinasesAtMPK3andAtMPK6.FEBSLett,2002,527:43~50.FryeCA,InnesRW.AnArabidopsismutantwithenhancedresistancetopowderymildew.[J].PlantCell,1998,10(6):947-956.GaoZ,WegWE.TheVfgeneforscabresistanceinappleislinkedtosub-lethalgenes.Euphytica,2006,151(1):123-132.GaoM,WangX,WangD,XuF,DingX,ZhangZ.Regulationofcelldeathandinnateimmunitybytworeceptor-likekinasesinarabidopsis.CellHost&Microbe,2009,6(1),34.GöhreV,RobatzekSBreakingthebarriers:Microbialeffectormoleculessubvertplantimmunity.AnnuRevPhytopathol,2008,46:189–215.Gómez-GómezL,BollerT.FLS2:AnLRRreceptor-likekinaseinvolvedintheperceptionofthebacterialelicitorflagellininArabidopsis.MolCell,2000,5(6):1003–1011.Hammond-KosackK,ParkerJ.Decipheringplant-pathogencommunication:freshperspectivesformolecularresistancebreeding.CurrentOpinioninBiotechnology,2003,14(2):177-193.HeeseA,HannDR,Gimenez-IbanezS,JonesAME,HeK,LiJ.Thereceptor-likekinaseSERK3/BAK1isacentralregulatorofinnateimmunityinplants.PNatlAcadSciUSA,2007,104:12217–12222.HeZ,WangZ,LiJ,ZhuQ,LambC,RonaldP,ChoryJ.PerceptionofBrassinosteroidsbytheextracellulardomainofthereceptorkinaseBRI1.Science,2000,288(5475):2360-2363.42 山东农业大学硕士学位论文HuX,ReddyAS.CloningandexpressionofaPR5-likeproteinfromArabidopsisinhibitionoffungalgrowthbybacteriallyexpressedprotein.PlantMolecularBiology,1997,34(6):949-959.HeZ,CheesemanI,HeD,KohornBD.Aclusteroffivecellwall-associatedreceptorkinasegenesWar1-5andexpressedinspecificorgansofArabidopsisi.PlantMolecularBiology,1999,39(6):1189-1196.HeZ,HeD,KohomeBD.Requirementfortheinducedexpressionofacellwallassociatedreceptorkinaseforsurvivalduringthepathogenresponse.PlantJournal,1998,14(1):55-63.JamesCM,EvansKM.Identificationofmolecularmarkerslinkedtothemildewresistancegenesp1-dandp1-winapple.EucarpiaSymposiumonFruitBreeding&Genetics,2004,663(663):123-127.JonesJDG,DanglJL.Theplantimmunesystem.Nature,2006,444(7117):323–329.JensenPJ,HalbrendtN,FazioG.Rootstock-regulatedgeneexpressionpatternsassociatedwithfireblightresistanceinapple[J].BMCgenomics,2012,13(1):9.JongeRD,BoltonMD,ThommaBP.Howfilamentouspathogensco-optplants:theinsandoutsoffungaleffectors.CurrentOpinioninPlantBiology,2011,14(4),400-406.JoshiSG,SchaartJG,GroenwoldR,JacobsenE,SchoutenHJ,KrensFA.Functionalanalysisandexpressionprofilingofhcrvf1andhcrvf2fordevelopmentofscabresistantcisgenicandintragenicapples.PlantMolecularBiology,2011,75(6),579-591.JonesDA,ThomasCM,Hammond-KosackKE,Balint-KurtiPJ,JonesJDG.IsolationofthetomatoCf-9geneforresistancetoCladosporiumfulvumbytransposontagging.Science,1994,266:789-93.JinSL,KurohaT,HnilovaM,KhatayevichD,KanaokaMM,McabeeJM.Directinteractionofligand–receptorpairsspecifyingstomatalpatterning.Genes&Development,2012,26(2),126.JinP,GuoT,BecraftPW.ThemaizeCR4receptor-likekinasemediatesagrowthfactor-likedifferentiationresponse.Genesis,2000,27(3):104-116.KawaiT,AkiraS.Theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity:updateonToll-likereceptors.Nat.Immunol,2010,11,373–384.43 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究KawchukLM,HacheyJ,LynchDR,KulcsarF,vanRooijenG,WatererDR,RobertsonA,KokkoE,ByersR,HowardRJ.TomatoVediseaseresistancegenesencodecellsurface-likereceptors.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(11):6511-5.KunkelBN,BrooksDM.Crosstalkbetweensignalingpathwgysinpathogendefense.CurrOpinPlantBiol,2002,5:325-331.LeaseK,InghamE,WalkerJC.ChallengesinunderstandingRLKfunction.CurrentOpinionPlantBiology,1998,1(15):388-392.LorenzoO,PiquerasR,Sanchez-SerranoJJ,SolanoR.ETHYLENERESPONSEFACTOR1integratessignalsfromethyleneandjasmonatepathwaysinplantdefense.PlantCell,2003,5:165-178.LiechtiR,FarmerEE.Thejasmonatepathway.Science,2002,296:1649-1650.LeiH,ZhouB,HongG,HanB.CharacterizationofaS-locus-relatedreceptor-likekinaseclusterinrice.ActaBotanicaSinica,2002,44(11):1346-1350.LiebrandTW,GcVDB,ZhangZ,SmitP,CordewenerJH,AmericaAH.Receptor-likekinaseSOBIR1/EVRinteractswithreceptor-likeproteinsinplantimmunityagainstfungalinfection.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2013,110(24),10010-10015.LiebrandTW,HaVDB,JoostenMH.Twoforall:receptor-associatedkinasesSOBIR1andBAK1.[J].TrendsinPlantScience,2014,19(2):123-132.LuD,WuS,GaoX,ZhangY,ShanL,HeP.Areceptor-likecytoplasmickinase,BIK1,associateswithaflagellinreceptorcomplextoinitiateplantinnateimmunity.ProcNatlAcadSciUSA,2010,107:496–501.LeslieME,LewisMW,YounJY.TheEVERSHEDreceptor-likekinasemodulatesfloralorgansheddinginArabidopsis[J].Development,2010,137(3):467-476.MaL,BorhanMH.Thereceptor-likekinaseSOBIR1interactswithBrassicanapusLepR3andisrequiredforLeptosphaeriamaculansAvrLm1-triggeredimmunity.[J].FrontiersinPlantScience,2015,6(6):933.MonaghanJ,ZipfelC.Plantpatternrecognitionreceptorcomplexesattheplasmamembrane.CurrOpinPlantBiol,2012,15:349–357.44 山东农业大学硕士学位论文MaZ,SongT,ZhuL,YeW,WangY,ShaoY.APhytophthorasojaeglycosidehydrolase12proteinisamajorvirulencefactorduringsoybeaninfectionandisrecognizedasaPAMP.PlantCell,2015,27,2057–2072.MaZ,ZhuL,SongT,WangY,ZhangQ,XiaY.Aparalogousdecoyprotectsphytophthorasojaeapoplasticeffectorpsxeg1fromahostinhibitor.Science,2017,355(6326),710.OhyamaK,ShinoharaH,OgawaohnishiM,MatsubayashiY.AglycopeptideregulatingstemcellfateinArabidopsisthaliana.NatureChemicalBiology,2009,5(8),578-580.PastugliaM,SwarupR,RocherA,SaindrenanP,RobyD,DumasC,CockJM.ComparisonoftheexpressionpatternsoftwosmallgenefamiliesofSgenefamilyreceptorkinasegenesduringthedefenceresponseinBrassicaoleraceaandArabidopsisthaliana.Gene,2002,282(1-2):215-225.PostmaJ,LiebrandT.W.H,BiG,EvrardA,ByeR.R,MbengueM.TheCf-4-likeproteinassociateswiththeBAK1receptorlikekinasetoinitiatereceptorendocytosisandplantimmunity,2015,BioRxivdoi:10.1101/019471RaiborgC,RustenTE,StenmarkH.Proteinsortingintomultivesicularendosomes.CurrOpinCellBiol,2003,15:446–455.SunW,CaoY,LabbyKJ,BittelP,BollerT,BentAF.2012.ProbingtheArabidopsisflagellinreceptor:FLS2-FLS2associationandthecontributionsofspecificdomainstosignalingfunction.ThePlantCell,2012,24(5):1096–1113.SunY,LiL,MachoAP,Han,HuZ,ZipfelC,ZhouJM,ChaiJ.Structuralbasisforflg22-inducedactivationoftheArabidopsisFLS2-BAK1immunecomplex.Science,2013,342(6158):624–628.SinghNK,KumarKRR,KumarD,ShuklaP,KirtiPB.Characterizationofapathogeninducedthaumatin-likeproteingeneAdTLPfromArachisdiogoi,awildpeanut.PlosOne,2013,8(12):e83963-e83963.SticherL,Mauch-ManiB,MétrauxJP.Systemicacquiredresistance.Annu.Rev.Phytopathol,1997,35,235–270.StrousGJ,GentJ.Dimerization,ubiquitylationandendocytosisgotogetheringrowthhormonereceptorfunction.FEBSLett,2002,529:102–109.StoneJM,WalkerJC.Plantproteinkinasefamiliesandsignaltransduction.PlantPhysiology,45 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究1995,108(108):451-457.SongD,LiG,SongF,ZhengZ.MolecularcharacterizationandexpressionanalysisofOsBISERKI,ageneencodingaleucine-richrepeatreceptor-likekinase,duringdiseaseresistanceresponsesinrice.MolecularBiologyReports,2008,35(2):275-283.SchoofH,LenhardM,HaeckerA,etal.ThestemcellpopulationofArabidopsisshootmeristemsismaintainedbyaregulatoryloopbetweentheCLAVATAandWUSCHELgenes[J].Cell,2000,100(6):635-644.SchulzeB,MentzelT,JehleAK,MuellerK,BeelerS,BollerT.RapidHeteromerizationandPhosphorylationofLigand-activatedPlantTransmembraneReceptorsandTheirAssociatedKinaseBAK1.JBiolChem,2010,285:9444–9451.SchwessingerB,RonaldPC.Plantinnateimmunity:perceptionofconservedmicrobialsignatures.AnnuRevPlantBiol,2012,63:451–482.StaskawiczBJ,AusukeiFM,BackerBJ,EllisJG,JonesJDG.Moleculargeneticsofplantdiseaseresistance.Science,1995,268(5211):661-667.TrdáL,FernandezO,BoutrotF,HéloirMC,KelloniemiJ,DaireX.ThegrapevineflagellinreceptorVvfls2differentiallyrecognizesflagellin-derivedepitopesfromtheendophyticgrowth-promotingbacteriumburkholderiaphytofirmansandplantpathogenicbacteria.NewPhytologist,2014,201(4),1371-1384.WangG,EllendorffU,KempB,MansfieldJW,ForsythA,MitchellK,BastasK,LiuCM,WoodsTörA,ZipfelC.Agenome-widefunctionalinvestigationintotherolesofreceptor-likeproteinsinArabidopsis.PlantPhysiol,2008,147:503-17.WalkerJC.StructureandfunctionoftheReceptor-likeproteinkinasesofhigherplants.PlantMolecularBiology,1994,26(5):1599-1609.WangX,ZafianP,ChoudharyM,LawtonM.ThePR5KreceptorproteinkinasefromArabidopsisthalianaisstructurallyrelatedtoafamilyofplantdefenseproteins.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1996,93(6):2598-2602.WasanoN,OhgushiA,OhbaM.Mannose-specificlectinactivityofparasporalproteinsfromalepidoptera-specificBacillusthuringiensisstrain.CurrentMicrobiology,2003,46(1):43-46.46 山东农业大学硕士学位论文WangY,XuY,Sun,Y,WangH,QiJ,WanB.Leucine-richrepeatreceptor-likegenescreenrevealsthatnicotianarxeg1regulatesglycosidehydrolase12mampdetection.NatureCommunications,2018,9(1),594.WangS,SunZ,WangH,LiuL,LuF,YangJ.Riceosfls2-mediatedperceptionofbacterialflagellinsisevadedbyxanthomonasoryzaepvs.oryzaeandoryzicola.MolecularPlant,2015,8(7),1024-1037.WindramO,MadhouP,McHattieS,HillC,HickmanR,CookeE.ArabidopsisdefenseagainstBotrytiscinerea:chronologyandregulationdecipheredbyhigh-resolutiontemporaltranscriptomicanalysis.ThePlantCell,2012,24:3530-3557.YurikoO,KyonoshinM.Leucine-richrepeatreceptor-likekinaseisakeymembrane-boundregulatorofabscisicacidearlysignalinginArabidopsis.PlantCell,2005,17(4):1105-1119.ZhangW,FraitureM,KolbD,LöffelhardtB,DesakiY,BoutrotFF,TörM,ZipfelC,GustAA,BrunnerF.Arabidopsisreceptor-likeprotein30andreceptorlikekinasesuppressorofBIR1-1/EVERSHEDmediateinnateimmunitytonecrotrophicfungi.PlantCell,2013,25:4227-41.ZhuY,WangY,LiR,SongX,WangQ.AnalysisofinteractionsamongtheCLAVATA3receptorsrevealsadirectinteractionbetweenCLAVATA2andCORYNEinArabidopsis.PlantJ,2010,61(2):223–233.ZipfelC,KunzeG,ChinchillaD,CaniardA,JonesJDG,BollerT.PerceptionofthebacterialpampEF-Tubythereceptorefrrestrictsagrobacterium-mediatedtransformation.Cell,2006,125(4),749-60.ZhangJ,LiW,XiangT,LiuZ,LalukK,DingX.Receptor-likecytoplasmickinasesintegratesignalingfrommultipleplantimmunereceptorsandaretargetedbyaPseudomonassyringaeeffector.CellHostMicrobe,2010,7:290–301.47 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究48 山东农业大学硕士学位论文附录表1克隆引物引物名称引物序列PrimernamePrimersequenceMdSOBIR1-BamHI-FF-5'CGGGATCCATGGCAGCCTTATCCGGCA3'MdSOBIR1-SmaI-RR-5'TCCCCCGGGGTGCTTGATTTGAGACAGC3'表2荧光定量引物引物名称引物序列PrimernamePrimersequenceMdActinF-5'TGACCGAATGAGCAAGGAAATTACT3'R-5'TACTCAGCTTTGGCAATCCACATC3'MdPR2F-5'ACTCACAGTCACCATCCTCAAC3'R-5'AATCGAACATCAGCTGAATAGG3'MdPR5F-5'CTCACCTTGGCCATCCTCTT3'R-5'TTGGATGCTAGTTCGAAGC3'MdPR8F-5'CAAAACGGCAACGAAGGAAC3'R-5'AAGTACCACTAGCGGGGTT3'MdNPR1F-5'GATCATGTCAAGGCTCCGAATG3'R-5'GAGATGTTGCTGCTGTTGGAGTG3'MdACS4F-5'GACACACTTGAAAGCCTTG3'R-5'TTTTCGGCCAATGTTGACC3'MdACS1F-5'GCCTTCCGGGTTTTCGA3'R-5'GGCGGCCACAACCATGT3'MdChiBF-5'GTCACTCAGGCATTCTTCG3'R-5'CATGGGTGACATGAGCAAA3'At2g17740F-5'TGCTCCATCTCTCTTTGTGC3'R-5'ATGCGTTGCTGAAGAAGAGG3'At2g51890F-5'CCAGTTTGTTCTGTAATACTCAGG3'R-5'CTAGCCGACTTTGGGCTATC3'AtFRK1F-5'ATCTTCGCTTGGAGCTTCTC3'49 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究R-5'TGCAGCGCAAGGACTAGAG3'β-tubulinF-5'GGAGCTACGCAGAACAACTAAGA3'R-5'CCCACGAGGATCATAGTTGCAACTGA3'50 山东农业大学硕士学位论文致谢本研究是在导师吴树敬教授和陈学森教授的悉心指导下完成的。三年的研究生生活紧张而充实，这段时间中我不仅提高了专业知识和实验技能，更多的是开阔了思维，学会了发现问题、分析问题和独立解决问题，对以后的生活和工作都有极大的帮助。在毕业之际，我要在此感谢指导和帮助我的老师、同学以及支持我的家人和朋友。首先我要感谢关心和指导我的导师吴树敬教授和陈学森教授，老师在我的课题研究、试验进展以及论文撰写过程中都给出了很多宝贵意见，对我的工作顺利完成有非常大的帮助。在三年的研究生活中，老师为我提供了优良的工作和学习环境，并精心为我制定课题并指导完成。老师渊博的专业知识，严谨细致、一丝不苟的作风，以及对科研的严谨和热情一向是我工作、学习中的榜样。在此论文完成之际，谨向导师表示衷心的感谢！感谢何晓文博士和邱化荣博士对我实验的大力帮助！同时感谢吕萍萍硕士、苏丽丽硕士、张伟伟硕士和周茜茜硕士等在实验和生活中所给予的大力支持与帮助。值此，感谢实验室的全体同学！感谢我的父母和家人对我三年来攻读硕士的理解与支持，感谢他们在我求学过程中的付出！感谢他们无私的帮助使我全身心投入到学习和研究工作中，帮助我顺利完成学业。最后，再次对关心和帮助过我的老师、同学以及家人和朋友表示衷心的感谢！本研究得到国家自然科学基金（No.31272132、31672136）与泰山学者建设工程资助，一并致谢！51 苹果类受体激酶MdSOBIR1调控的苹果对真菌病害抗病分子机理研究攻读学位期间发表论文情况1.刘秀霞,梁宇宁,张伟伟,霍艳红,冯守千,邱化荣,何晓文,吴树敬,陈学森,超表达苹果MsFLS2拟南芥识别细菌鞭毛蛋白flg22,提高轮纹病菌抗性的研究,园艺学报,2018,45(5):827–844.2.HeXW,HuoYH,LiuXX,ZhouQQ,FengSQ,ShenX,LiBH,WuSJandChenXS.ActivationofdiseaseresistanceagainstBotryosphaeriadothideabydown-regulatingtheexpressionofMdSYP121inapple.Hort.Res.,2018,5:24.3.何晓文,邱化荣,刘秀霞,李学会,陈学森,吴树敬.一种联合苹果愈伤组织细胞培养和遗传转化鉴定苹果抗病基因的方法（专利公开号：CN106480163A）52