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《泰安地区发热伴血小板减少综合征病毒分子流行病学与抗原性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
目录中文摘要·············································································································1英文摘要·············································································································4符号说明·············································································································7前言·················································································································8第一部分泰安地区SFTSV的分离鉴定及流行病学分析·······················11实验材料与方法·······················································································12结果·······································································································24附图·······································································································27讨论·······································································································28小结·······································································································31第二部分泰安市SFTSV的生物信息学研究···········································32实验材料与方法·······················································································33结果·······································································································38附图·······································································································40讨论·······································································································42小结·······································································································43第三部分泰安地区SFTSV毒力及抗原性研究·······································44 实验材料与方法·······················································································45结果·······································································································49讨论·······································································································51小结·······································································································52附录···············································································································53参考文献···········································································································54综述···············································································································58致谢···············································································································65攻读学位期间发表的学术论文······································································66原创性声明·······································································································67 泰山医学院硕士学位论文泰安地区发热伴血小板减少综合征病毒分子流行病学与抗原性研究研究生：吕强专业：病原生物学导师：史卫峰教授中文摘要目的2006年以来，在我国河南、安徽、山东等地的部分农村地区陆续报道了一种不明原因的以发热、血小板减少综合征、白细胞减少综合征为主要症状的临床病例，部分患者出现呕吐、肌痛和局部淋巴结肿大，少数严重病例因多器官功能衰竭而死亡。2010年，我国研究人员从上述患者体内分离出一种新型病原体，命名为发热伴血小板减少综合征病毒(Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus，SFTSV)又称为新布尼亚病毒，为布尼亚病毒科，白蛉病毒属。随后在韩国、日本及我国至少16个省份也相继检测到SFTSV的广泛流行。山东作为SFTSV的主要流行地区之一，除了烟台、沂源地区外，2015年在泰安市当地蜱虫体内也检测到了SFTSV核酸分子。目前关于泰安地区SFTSV的流行病学、遗传特征、进化规律及致病特性等方面的研究尚无相关报道。为此，本研究针对泰安市疑似SFTS病人进行SFTSV核酸检测，根据确诊的SFTS病人开展流行病学分析，获得泰安地区SFTSV病毒全基因组，分析其遗传进化规律及分子生物学特点，阐明SFTSV的基因重组、基因重配规律，结合病毒的毒力及免疫血清对SFTSV的抑制作用，初步探究泰安地区SFTSV的生物学特性，为SFTSV的防控、治疗提供理论基础。研究方法1.泰安地区SFTSV的分离鉴定及流行病学分析收集2015年和2016年期间，泰安市三甲医院中疑似SFTS病人信息及临床诊疗过程和血液样本。统计分析泰安地区所有SFTS病人的流行病学特征及实验室检测结果规律。检测样本中SFTSV核酸分子，进行病例确诊，并分离血清中SFTSV，通过1代和2代测序技术获得病毒全基因组。2.泰安地区SFTSV的生物信息学学研究将分离自泰安地区的SFTSV全基因组参考GenBank收录的SFTSV基因组序列，1 泰山医学院硕士学位论文利用Muscle软件比对剔除掉碱基缺失大于10%的序列，RAxML软件构建SFTSV全长基因及L、M、S序列的进化树，研究泰安及国内外地区SFTSV分离株的遗传进化关系，并筛选SFTSV基因重配株，分析SFTSV重配的规律。结合RDP4.0(RecombinationDetectionProgram)软件检测SFTSV毒株间的重组事件，阐明重组在病毒的进化过程中的作用。3.泰安地区SFTSV的毒力及抗原性研究利用Vero细胞测定病毒的TCID50，分析病毒的毒力水平。将本实验室分离保存的流行分支毒株免疫3-4周龄SPF级C57小鼠，制备免疫血清，通过等量不同亚型SFTSV分离株与不同浓度的免疫血清孵育后接种Vero细胞，测定病毒增殖活性的变化，比较免疫血清与不同亚型毒株的交叉反应性，初步探究泰安地区不同亚型SFTSV的抗原性特点。结果在泰安地区3所三甲医院共采集29例疑似SFTS患者的血样，已确诊15例（51.7%）为SFTSV核酸阳性。在SFTSV的L、M、S片段特异性检测引物中，M、S片段检出率（93.3%）高于L片段（73.3%）。15例病人主要临床表现发热（100.0%）和消化道症状（53.3%），所有病例实验室检查均出现血小板降低，大部分病例白细胞降低（86.7%）、肝肾功能异常（86.7%）。所有病例均发生于春夏两季。发病人群以农村居住地区60~80岁老年人为主（73.3%），女性（60%）多于男性（40%），有2人有明确蜱虫叮咬史。根据筛选的GenBank已收录的SFTSV毒株序列（223条L、222条M和432条S序列）以及182株SFTSV全基因组，对分离自泰安地区并已获得全长基因的12株SFTSV进行遗传进化分析，结果显示泰安地区2015~2016年SFTSV新分离株中11株属于C3亚型，1株属于C4亚型。除了已报道的C1-C5、J1-J3亚型外，在SFTSVL和S序列进化树中发现了潜在的C6和J4两个新亚型。SFTSV基因重配分析中发现了以12种重配方式存在的26个重配毒株，其中16个重配毒株为首次发现。重组分析显示，在14条序列中存在20个重组事件，首次发现了SFTSV基因组中的多重重组事件及S序列的重组事件，但泰安地区毒株中未发生基因重配和重组现象。7.5作为流行分支C3亚型SFTSV毒株MYD，病毒毒力（1×10TCID50/0.1ml）略高于5C4亚型毒株ZCY（1×10TCID50/0.1ml）。制备的MYD抗体阳性血清对两者均具有抑制作用，交叉反应性差异不显著。2 泰山医学院硕士学位论文结论:1.泰安地区SFTS疑似病例多由SFTSV感染引起，与国内其它流行地区特征相似，以春夏两季流行为主，多发生在山地丘陵地带的农村地区。2.泰安地区2015~2016年SFTSV分离株多属于C3亚型，少数属于C4亚型。同时对GenBank收录的SFTSV进行生物信息学分析，发现了两个潜在的新亚型：C6、J4。3.泰安地区SFTSV毒株未发现基因重组和重配事件，但在其他地区SFTSV毒株中发现了26株重配毒株，其中16株重配毒株为新发现，且SFTSV可发生多重重组事件，S序列也可发生重组事件。4.泰安地区流行分支C3亚型毒株的小鼠免疫血清对母本毒株和C4基因型毒株抑制效果差异不显著，初步说明该地区C3亚型与C4亚型毒株间或不存在抗原性变化。关键词：发热伴血小板减少综合征病毒；流行病学；遗传进化；基因重组和重配；生物学特性3 泰山医学院硕士学位论文MOLECULAREPIDEMIOLOGYANDBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFSEVEREFEVERWITHTHROMBOCYTOPENIASYNDROMEVIRUSINTAIANPostgraduate:QiangLvMajor:PathogenicBiologyTutor:Prof.WeifengShiABSTRACTObjectiveSince2006,anoutbreakofanunknowninfectiousdiseaseoccurredinruralareasofHenan,AnhuiandShandongprovinces,China.Majorclinicalpresentationsofthepatientsincludedfever,thrombocytopenia,leukocytopeniaandgastrointestinalsymptoms.Suchpatientsmaypresentnausea,muscleachesandregionallymphadenopathy.Fewseverepatientswouldprogresstomultipleorganfailureorevendeath.AnovelviralpathogenwasisolatedfromthesepatientsandwasnamedSevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromevirus(SFTSV)in2010.SFTSV,alsoknownasthenewbunyavirus,belongstothephlebovirusgenus,thefamilyofBunyaviridae.Sincethen,SFTSVinfectionhasbeenidentifiedinSouthKroea,Japanandatleast16provincesfromChina.ShandongwasthemajorepidemicareaofSFTSV,suchasYantaiandYiyuan.SFTSVhasalsobeendetectedinTaianin2015.However,noepidemiology,geneticcharacteristics,evolutionarypatternandpathogenicfeaturesofSFTSVisolatedfromTaianhavebeenreported.Inthepresentstudy,wedetectedSFTSVfromsuspiciouspatientsinTaian,Shandong.WethencarriedoutanepidemiologicalanalysisaccordingtotheconfirmedSFTSpatientsandobtainedcompletegenomesequencesofSFTSV.Thegeneticvariationandmolecularbiologicalfeatures,generecombinationandreassortmentofSFTSVwerefurtheranalyzed.Inaddition,westudiedthevirulenceofthevirusandtheinhibitioneffectofSFTSVofimmuneserum.OurstudywouldprovideatheoreticalbasisforthepreventionandcontrolofSFTSVinTaian.Methods1.Isolation,identificationandepidemiologicalanalysisofSFTSVinTaianBloodsamplesofthesuspectedSFTSpatientswerecollectedduring2015and20164 泰山医学院硕士学位论文fromthreesentinelhospitalsinTaian..WedetectedthenucleicacidmoleculesofSFTSVtoidentitytheSFTSpositivepatientsandisolatedthevirusesfromthesepatients.BoththeSangerandthenextgenerationsequencingtechnologieswereusedtoobtainthecompletegenomeoftheviruses.2.BioinformaticsanalysisofSFTSVinTaianSFTSVreferencegenomesequenceswereobtainedfromGenbank.MultiplesequencealignmentwasperformedusingMuscleandsequenceswhoselengthswere10%shorterthanthegenewereremoved.RAxMLwasusedtoconstructthephylogenetictreeusingtheL,M,Sgenesequences,respectively.WethenanalyzedthepotentialSFTSVreassortantsandrecombinants.3.VirulenceandantigenicityofSFTSVisolatedfromTaianThevirus’TCID50wasmeasuredusingVerocellsandthevirulenceofSFTSVwasdetermined.The3-4weeksoldSPFC57micewereimmunizedwiththeepidemicstrainsisolatedinourlaboratorytoobtaintheimmuneserum.VerocellswereculturedandinoculatedwiththesameamountofC3andC4strains,aswellaswithdifferentconcentrationsoftheanti-serum.ThevirusproliferationactivitywasdeterminedtocomparethecrossreactivitybetweendifferentsubtypesofSFTSVwithimmuneserumandtostudytheantigeniccharacteristicsofdifferentsubtypesofSFTSVinTaian.Results1.29bloodsamplesofsuspectedSFTSpatientswerecollectedfromthreesentinelhospitalsinTaian,and15cases(51.7%)wereSFTSVnucleicacidpositive.ThreespecificprimerstargetingtheL,MandSfragmentofSFTSV,wereused.TheMandS(93.3%)detectionratewashigherthanthatofLfragment(73.3%).Majorclinicalsymptomsofthefifteenpatientsincludedfever(100%)andgastrointestinalsymptoms(53.3%).Allcaseshadthrombocytopeniaandmostcases(86.7%)presentedleukopenia,liverandkidneydysfunction(86.7%)throughlaboratoryexaminations.Moreover,allthe15caseswereidentifiedinspringandsummer,andmostofthem(73.3%)livedinruralareaswiththeagesbetweensixtyandeigthy,Femalepatientsaccountedfor60%,andatleasttwopatientshadaclearhistoryoftickbite.2.Atotalof12full-lengthgenomessequencesofSFTSVisolatedfromTaianwereobtainedinthepresentstudy.Inaddition,223L,222Mand432SgenesequencesweredownloadedfromGenBank,including182wholegenomesequencesofSFTSV.Ourphylogeneticanalysesshowedthat11SFTSVstrainsfromTaianduringtheperiodof2015~2016belongedtotheC3subtyp,andonebelongedtotheC4subtype.Apartfromthe5 泰山医学院硕士学位论文previouslyreportedC1-C5andJ1-J3subtypes,twonewsubtypes,C6andJ4,werefoundinthephylogenetictreesoftheLandSsequences.Furthermore,26reassortantstrainswerefoundandtheybelongedto12differentreassortmenttypes,with16strainsreportedforthefirsttime.Inaddition,therewere20recombinationeventsin14sequences,andmultiplerecombinationeventswereidentifiedtooccureinasingleSFTSVgenome.Remarkably,recombinationeventwasfoundintheSgenesegnmentforthefirsttime.However,nogenereassortantsandrecombinantswerefoundintheTaianstrains.3.AsarepresentativestrainoftheC3subtypeSFTSV,MYD,thevirusvirulence(17.55×10TCID50/0.1ml)wasslightlyhigherthantheC4subtypestrainZCY(1×10TCID50/0.1ml).TheantibodypositiveseramadebyMYD,hadinhibitoryeffectonbothofthesubtypes,andthecrossreactivitywasnotsignificant.Conclusion1.MostofthesuspectedcasesofSFTSwerecausedbySFTSVinTaian.TheSFTSVpeakswerefoundinspringandsummer,andmostofthepatientslivedinruralareasfullofmountainous.2.MostSFTSVisolatedinTaianbelongedtotheC3subtypeandonlyonebelongedtotheC4subtype.Inparticular,weindentifiedtwonovelpotentialsubtypes:C6andJ4.3.NogenereassortmentandrecombinationeventswerefoundintheTaianstrains.However,26strainsfromotherregionswerefoundtobereassortants,with16werediscoveredforthefirsttime.MultiplerecombinationeventshavealsoidentifiedandsomeofthemoccurredintheSgenefragment.4.TherewasnosignificantdifferenceintheinhibitoryeffectofimmuneserumtheSFTSVbetweentheC4andC3subtypes.ThisindicatedtherewasnoantigenicchangebetweensubtypesC3andC4ofSFTSVisolatedfromTaian.Keywords:Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus(SFTSV);epidemiology;geneticevolution;genereassortantandrecombination;biologicalcharacteristics6 泰山医学院硕士学位论文符号说明英文缩写英文全称中文全称bpbasepair碱基对BLASTBasiclocalaligmentsearchtool同源性搜索工具cDNAComplementaryDNA互补DNACPECytopathicEffect细胞病变效应ddH2Odouble-distilledwater双蒸水DEPCDiethypyrocarbonate焦碳酸二乙酯ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验EPEppendorfEP管FBSFetalBovineSerum胎牛血清MLMaximum-1ikelihood最大似然法MinMinute分钟NaClSodiumchloride氯化钠NPnucleoprotein核蛋白NSsnon-structureSprotein非结构蛋白ODOpticaldensity光密度PBSphosphatebufferedsolution焦磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应RDPReeombiantionDetectionProgram重组检测程序RNARibonucleicAcid核糖核酸rpmrevolutionsperminute每分钟转数SFTSseverefeverwiththrombocytopenia发热伴血小板减少综合syndrome征TAETris-acetate-EDTATAE缓冲液TCID50Tissuecultureinfectivedose50半数组织培养感染剂量VeroGreenmonkeykidneycellline非洲绿猴肾细胞7 泰山医学院硕士学位论文前言在2006年以来，在我国中东部部分农村地区大量报道了一种不明原因的以发热伴血小板减少综合征(Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome，SFTS)为主要症状的临床病例，多数表现为发热和血小板降低，部分伴有呕吐、纳差等消化道和肌痛、关节肿痛症状，实验室检查多呈现白细胞计数降低和肝功能、肾功能异常，严重者可因多器官功能衰竭而死亡，不同地区死亡率存在差异，多介于2.5%～30%之间，平[1-3]均为12%。2010年，在上述病例体内，我国研究人员分离出一种新病原体，命名为发热伴血小板减少综合征病毒(severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus,[1]SFTSV)。该病毒为布尼亚病毒科，白蛉病毒属成员，通过电镜观察，病毒颗粒直径[1,2,4]在80~120nm之间，其表面含有脂质包膜，内有三个以螺旋对称方式组成的核壳。SFTSV与布尼亚病毒科其它成员相似，为分节段的单股负链RNA病毒，其基因组结构依据序列大小分为大(L)、中(M)、小(S)3个节段，分别编码4个不同的蛋白：L片段含有6368个核苷酸，编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNApol-ymerase,RdRp)；M片段含有3378个核苷酸，编码病毒的C端糖蛋白(glycoprotein，Gc)和N端糖蛋白(glycoprotein，Gn)；S片段为双义RNA链，分别编码N端正向编码核蛋白(nucleoprotein，NP)和C端反向编码非结构蛋白(non-structureSprotein，[1,5]NSs)。2010年SFTSV在我国河南省、安徽省、山东省首次报道后，随后在我国湖北、[1,浙江、辽宁等10余省份实验室确认SFTSV在当地广泛流行，病例报告数逐年增多6]。除我国外，日本、韩国地区也陆续报道了SFTSV感染病例，美国密西西比州新发[7-9]现与SFTSV高度相似的Heatrland。SFTSV感染具有明显的季节性，全国各地多[6,10,11]以春、夏两季多发，并随纬度的升高，发病时间及高峰呈现后移趋势。在SFTSV流行地区，地形地势多为山地丘陵，当地气候温暖湿润、植被茂密丰盛，适合多种媒[12,13]介生物的生长繁殖，蜱虫为SFTSV最为可疑的传播媒介。在多个SFTSV流行区域的蜱虫体内可检出病毒核酸阳性，且从蜱虫体内分离出的毒株与人血清中分离的[1,14,15]SFTSV基因组高度同源，部分SFTS病人在发病前有明确的蜱虫叮咬史。野生动物和家养动物为该病毒的扩大宿主，国内多个SFTSV流行地区的野生和家养的动[10,16,17]物血清流行病学调查中，都可检出SFTSV的RNA和抗体阳性。SFTSV在国内多个地区报道中，部分感染病例因接触SFTS病人急性期血液或者分泌物而发生聚[18-20]集性传播。8 泰山医学院硕士学位论文依据其基因组的遗传进化关系和地理分布特征，SFTSV的L、M、S序列的进化[21]树均呈现为两大主要分支，即中国支（China）和日本支（Japan）。中国支中大部分毒株分离自中国地区，包括C1、C2、C3、C4、C5亚型5个分支，以C2、C3、C4基因型为主；日本支中的毒株主要分离自韩国、日本地区，以日本毒株分离率较高，[21]该分支包括J1、J2、J3亚型，其中以J1基因型为主。基因重组和重配在RNA病毒进化和适应宿主过程中扮演着重要角色，不同基因型的病毒共同感染宿主时，病毒间片段的置换或者序列的重新组合，往往能够使病毒[22,23]本身更好的适应宿主、逃避宿主免疫应答。在SFTSV的L和M序列中均已有重[24]组事件发生的报道，这可能是SFTSV形成多种亚型的重要原因。白蛉病毒属成员中，所有病毒都有报告发生过基因重配，SFTSV的重配毒株都分离自中国地区，以[25-27]河南地区毒株为主，和病毒的流行、进化密切相关。山东省为SFTSV的主要流行地区之一，在省内烟台、沂源等地区的病人血清及家养动物血清、野外游离蜱虫中都有SFTSV被检测到或分离到的报道，并对不同地[14,28,29]区和宿主来源的毒株进行了比较研究。上述两个地区SFTS病例流行病学和国内其它地区相似，其中淄博市和泰安市相毗邻，病毒可能会通过多种途径跨区域传播。2015年在山东省泰安市首次报道了在当地蜱虫体内检测到SFTSV核酸分子阳性，证实了泰安地区为SFTSV流行区域，而历年来泰安市各级医院中不明原因的发热伴血[30]小板减少综合征病人极有可能为SFTSV感染所致。泰安市旅游资源丰富，每年都会有大量游客进山游览，且当地部分农民长期居住在山地丘陵地带，以农业、采茶业、林业等为主要收入，为病毒的感染和传播提供了有利条件。但关于泰安地区SFTSV的致病特性、有效检测方法及与国内其它地区毒株的遗传进化关系等分子流行病学规律尚无研究报道。且随着越来越多的SFTSV在我国和韩国、日本等地被分离报道，关于SFTSV新的遗传特征、进化规律也亟待阐明。SFTSV不同基因型间病毒表面抗原的差异，对SFTSV致病性的研究也尚无相关报道。为了解泰安市SFTS流行病学特征、比较泰安地区SFTSV不同片段检测方法的灵敏性，阐明泰安地区SFTSV与国内外其它地区的SFTSV分子流行病学特征，以及抗SFTSV的免疫血清对泰安地区SFTSV毒株的抑制作用和不同亚型SFTSV的抗原性差异特点，本课题从在2015年和2016年泰安市三所三级甲等医院，即泰安市中心医院、泰山医学院附属医院、解放军八十八医院，采集所有疑似发热伴血小板减少综合征病人血液样本，并对所有样本进行SFTSV核酸检测，统计所有病例临床诊治及9 泰山医学院硕士学位论文流行病学资料；将实验室检测SFTSV核酸阳性样本血清处理后进行病毒培养、分离，测得泰安地区SFTSV全基因组，分析新分离的泰安地区SFTSV分离株同国内外其它地区病毒全基因组的遗传进化关系，掌握泰安地区和国内外SFTSV基因进化、重组和重配特性；利用泰安地区流行分支毒株免疫小鼠制备阳性血清，分析免疫血清对SFTSV的抑制作用，初步探讨泰安地区不同亚型SFTSV分离株的抗原性差异，为疫苗研发工作的开展提供理论基础。10 泰山医学院硕士学位论文第一部分泰安地区SFTSV的分离鉴定及流行病学分析泰安市地处山东省中部，东邻SFTSV省内流行区域淄博市，西隔黄河与SFTSV最主要的流行地区河南省相望。当地农民主要以种植业和畜牧业作为主要经济收入，居住环境植被覆盖率高，适合多种媒介生物和啮齿类动物生存繁殖，与其它SFTSV流行地区地理特征、气候特征、人群特征相似。2015年报道了在泰安市当地蜱虫体内检测到了SFTSV病毒RNA阳性，且泰安市各级医院每年都会有不明原因的以发[30]热和血小板减少为主要临床表现病人。泰安市旅游资源丰富，每年吸引大量游客进山游览，人员流动频繁，为病原体的传播形成了有利条件，因此，针对泰安市SFTSV流行情况及SFTS流行病学的研究亟待展开。本部分通过收集2015~2016年期间，对泰安市三级甲等医院中所有疑似发热伴血小板减少综合征病人的血液样本进行SFTSV核酸检测。同时采集病例信息，并对SFTSV核酸阳性病人进行跟踪调查，统计分析SFTS病人年龄、性别、职业、居住地及治疗过程临床症状特征，为泰安地区针对SFTSV预防、诊断、治疗提供科学依据。11 泰山医学院硕士学位论文实验材料与方法1.实验材料1.1实验仪器表1-1主要仪器信息仪器名称仪器型号生产厂家或品牌生物安全柜1300SERIESAThermoFisher公司-80℃医用低温箱MDF-U54V日本松下株式会社CO2培养箱371ThermoFisher公司荧光定量PCR仪7500Fast美国应用生物系统公司医用冷藏冰箱BCD-241TMCN青岛海尔股份有限公司液氮罐NWISWF亚西橡塑机器有限公司恒温水浴锅HH·S21-4-S新苗医疗器械制造有限公司台式高速冷冻离心机AuegraX30R美国贝克曼库尔特有限公司台式高速离心机Pico21ThermoFisher公司HR-8801格兰仕微波炉P70F23P-G5格兰仕集团公司PH计PHS-25上海雷磁电子天平YP5102上海光正医疗仪器有限公司电泳仪JS-Ppwer300上海培清科技有限公司纯水仪NWISUFHealForce公司PCR仪96well美国应用生物系统公司荧光定量PCR仪LightCycler96罗氏磁力搅拌器HS10大龙多样品组织研磨机Tissuelyser-48上海净信实业发展有限公司凝胶成像仪QUANTUM北京五洲东方科技有限公司单量道加样器Eppendorf多量道加样器Eppendorf精密鼓风干燥箱Bon-80上海三腾仪器有限公司高压灭菌锅MLS-3751日本松下株式会社12 泰山医学院硕士学位论文1.2实验试剂表1-2主要试剂及来源试剂名称试剂来源Trizol宝生物(大连)工程有限公司无水乙醇天津市凯通化学试剂有限公司氯仿天津市凯通化学试剂有限公司异丙醇天津市凯通化学试剂有限公司引物和探针生工生物工程股份有限公司PCR试剂盒2xEsTaqMasterMixKit康为试剂反转录试剂盒TaKaRa,Cat.#RR037ATMPrimeScriptRTReagentKit(PerfectRealTime)琼脂糖全式金生物技术有限公司RPMIMedium1640basic(1x)赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司Loadingbuffer全式金生物技术有限公司青链霉素混合液(100x)索莱宝生物科技有限公司FBSBiologicalIndustries胰蛋白酶-EDTA消化液索莱宝生物科技有限公司50XTBE电泳缓冲液索莱宝生物科技有限公司核酸染料康为试剂Trans2KDNAMarker全式金生物技术有限公司DEPCSigma-Aldrich中国1.3主要试剂的配制方法1.3.1DEPC水溶液：配制1LDEPC水溶液，首先用量筒量取1L双蒸水倒入锥形瓶，然后在生物安全柜里将1mlDEPC溶于水中，用不透光纸袋包裹锥形瓶，用来避光，放置磁力搅拌器上，缓慢搅拌过夜，分装置200ml玻璃瓶中，121℃高压灭菌后4℃贮存。1.3.21xTAEBuffer:抽取20ml50×TAEBuffer，取980ml灭菌双蒸水，混匀后13 泰山医学院硕士学位论文室温下放置备用。1.3.375%乙醇:无水乙醇和DEPC水体积按照3:1比例混合，混匀后放置在4℃贮存。1.3.4细胞生长液：RPMIMedium1640basic+10%FBS+1%青链霉素混合液。1.3.5细胞维持液：RPMIMedium1640basic+2%FBS+1%青链霉素混合。1.3.60.10mol/LPBS缓冲液:国产分析纯试剂8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4溶解在800ml蒸馏水,用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L。1.4Vero细胞购自中科院上海细胞生物所2实验方法2.1样本采集用含有枸橼酸钠的5ml无菌真空管采集从2015年06月开始到2016年10月，在山东省泰安市中心医院、解放军八十八医院和泰山医学院附属医院住院的SFTS疑似病例急性期血液5ml。依据卫生部办公厅公布的《发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）》上，疑似病例指具有以下流行病学史（病毒流行期间，曾在山地丘陵地区生活、工作或者发病前短期内有被蜱叮咬史）和发热等临床症状且实验室检查血小板、白细胞降低者。记录样本采集时间及病人基本资料信息，包括病人年龄、性别、居住地址、工作、入院体温、临床症状和血常规、尿常规、肝肾功能检测结果，病人出院后记录病人诊治过程中一系列临床症状及检查结果。2.2样本处理病人全血分装到1.5ml无RNA酶且无菌离心管中，于4℃离心机内，3500rmp/min,离心10min，吸取上层血清，分装保持于1.5ml无菌离心管中，至于-80℃冰箱保存，用于后续病毒分离(一周内可保存在冰箱)。注意事项：所有样本均在泰山医学院生物安全二级实验室的样本处理实验间（负压）进行处理。相关实验人员应身穿隔离服，佩带口罩和一次性乳胶手套。实验过程产生的所有实验废物均收入医疗废物专用垃圾袋中，并于当天高压灭菌，所有工作完成后方可离开实验室。2.3提取血清中RNA血清样本中RNA通过Trizol法提取，其实验原理如下：Trizol主要含有三种有14 泰山医学院硕士学位论文机试剂，分别为酚、B-巯基乙醇和异硫氰酸胍。酚能使核蛋白质与核酸解聚，使蛋白质变性。异硫氰酸胍可以使蛋白质变性剂、溶解，并使细胞骨架结构消失、讲解，细胞核酸与核蛋白分离。B-巯基乙醇可破坏RNase中蛋白质结构，防止RNA被酶降解。氯仿，其主要作用为加速水相和有机相的分层，且可以使蛋白质变性。分层后的上层水相为酸性，RNA分子溶解在水相中，DNA分子则会沉淀在水相和下层酚分界面中间。异丙醇可以沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀。然后，残留的异丙醇通过乙醇进行洗涤，痕量的乙醇在常温放置后，短期便可快速挥发掉，最终析出RNA。提取的步骤如下：1）取300µL病人血清于1.5mL离心管内，加入800µLTrizol试剂；2）上下颠倒混匀后，在室温下放置10min；3）加入200µL氯仿试剂后，放入多样品组织研磨机，60Hz频率下震荡3min；4）在室温环境下静置5min；5）放入低温离心机内，选用4℃，10000rpm/min，离心15min；6）将离心后的离心管取出，可看到液体分为上、中、下三层。吸取500µL上层上清液，转移至另一个无RNA无菌1.5mL的离心管中；7）加入和上清液等量的异丙醇，然后轻柔颠倒多次，混匀后放置在室温环境下，5min；8）将静置后的离心管放入-20℃冰箱，再静置30-40min；9）从-20℃冰箱中取出静置后的离心管，选用4℃，10000rpm/min，离心10min；10）倒掉上清液后，加入500µL75%乙醇（DEPC水配制）；11）在普通离心机中短转离心6-7秒后，缓慢倒出上清，然后重复步骤(10)，再倒出上清；12）残留在离心管中液体用移液器吸掉后，开盖静置适当时间，挥发残留乙醇；13）用30µL的无菌DEPC水溶解RNA，然后进行反转录实验或储存在-80℃冰箱中短期保存。提取时需要注意一些问题：所有的操作步骤要在到超净台内进行、离心管和枪头需经过0.1%DEPC水处理。所有的操作需要配带一次性橡胶手套且动作小心、细致。目的：防止外源性RNAse的污染降解RNA；RNA的完整性易被剧烈震荡破坏，影响后续实验结果。15 泰山医学院硕士学位论文2.4反转录cDNA合成通过反转录试剂盒将上述Trizol法从血清中提取的RNA做反转录，合成cDNA，具体步骤如下：1)在生物安全柜中配置反转录所需体系，将5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）、PrimeScriptRTEnzymeMixI、Randomprimer、RNaseFreedH2O于冰盒上融化后备用。2)根据表1-3配制反转录体系，混匀后短转5～7s。表1-3反转录反应体系组成体积/μl5×PrimeScriptBuffer2.0PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5Randomprimer1.0RNaseFreedH2O1.5RNA模板5总计103）根据表1-4的反应程序，在普通PCR仪中设定反转录程序。表1-4RT-PCR反应程序温度时间42℃15min85℃5s4℃~注意事项：配制体系时，不能在样本处理间进行，加入RNA模板则需要在生物安全柜中，加入RNA后不能在离心管内进行吹打，避免形成RNA气溶胶，污染所用实验试剂；实验操作过程所用一切耗材应预先经过DEPC水处理，相关人员佩戴手套与口罩，防止RNA样品被外环境的RNA酶降解，加样完成后，剩余的RNA应立即放回-80℃冰箱保存。2.5巢式PCR检测SFTSV核酸分子将上述获得cDNA，采用套式PCR检测SFTSV核酸。具体步骤如下：1)引物设计与合成：根据SFTSV基因序列，使用PrimerPremmier5.0设计检测SFTSV基因组中L、M、S序列的内外侧引物(Outer为外侧引物、Inner为内侧引物)，送至上海生物工程技术服务有限公司合成。设计引物见表1-5。16 泰山医学院硕士学位论文表1-5巢式PCR用引物引物序列OuterL-FGGCAGCAAACCAGAAGAAAGOuterL-RTCTTCTTATACATTTCTCCGInnerL-FAGGAGTCCCATGAGACATTGInnerL-RACCGGCCTGAGATGGCATGGOuterM-FACTGGACCTTGTTCTGAATCOuterM-RGCTGTTTTCCCAACCAATGInnerM-FGGTGGCAGGTTGCGAACATGInnerM-RTCCCAACCAATGATCCTGAGOuterS-FCAGCCAGTTTACCCGAACATOuterS-RAGGAAAGACGCAAAGGAGTGInnerS-FTGGCTCCGCGCATCTTCACAInnerS-RGAGTGGTCCAGGATTGCTGTGG2)引物溶解:-20℃冰箱取出引物,在4℃离心机中短转，转数达到10000rpm时停止,按照说明书要求，加入无RNase水，引物工作液浓度为25µM，配制成100µM的储存液。3)配置PCR反应体系：将体系所需试剂于超净台内冰盒中融化备用：2×TaqMasterMix、外侧上游和下游引物、无RNaseddH2O。4)根据表1-6配制第一次PCR反应体系后，根据表1-7设定反应程序，于普通PCR仪中进行第一次PCR反应。表1-6一次PCR反应体系组成体积/μl2×TaqMasterMix12.5Outer-F0.5Outer-R0.5ddH2O9.517 泰山医学院硕士学位论文RNA模板5总计25表1-7套式PCR反应程序温度时间94℃3min94℃30s54℃35cycles45s72℃45s72℃7min4℃~5)二次PCR：取第一次PCR扩增产物5ul作为二次PCR模板，按照表1-8反应体系及表1-7反应条件进行第二次PCR反应。表1-8二次PCR反应体系试剂体积/μl2×TaqMasterMix12.5Inner-F0.5Inner-R0.5ddH2O6.5一次PCR产物5总体积252.6琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物1）用ddH2O水将50×的TAE缓冲液稀释成1×的TAE缓冲液,溶解琼脂糖。2）溶解含有1%琼脂糖的1×的TAE缓冲溶液，使用微波炉缓慢加热琼脂糖溶液至完全溶解，然后冷却至70℃时再按比例加入合适体积的10000×核酸染料，轻轻晃动溶液，使核酸染料和胶液混匀，然后将液态胶轻轻倒入凝胶板中，室温放置40-50min，使胶液凝固。3）琼脂糖凝胶电泳:选取一个加样孔，加入5µLDL2000DNAMarker用来比对18 泰山医学院硕士学位论文PCR产物大小，剩下孔中每孔加入5µLPCR产物。电泳槽中以1×TAE电泳液没过凝胶1-2mm为宜。设置电压为100V，电泳时间为30min。4）结果判断：电泳后的琼脂糖胶块采用凝胶成像仪观察，若阴性对照在目的片段附近有条带，则实验结果不可信，当再重复实验。若阴性对照没有条带，观察样本孔条带大小并与目的片段大小比较，将片段大小符合目的条带的PCR产物送去测序，6对引物的扩增产物，只要有PCR产物经测序分析后为SFTSV核酸，就确认为病毒核酸阳性。2.7Vero细胞复苏1）将Vero细胞从液氮罐中取出，快速转移至37℃水浴锅中，震荡时轻柔而快速，使细胞在2分钟内完全解冻。2）在生物安全柜内，将解冻后的细胞移至无菌的1.5mL离心管中，然后转移到普通离心机上离心3分钟，设定转速为1200rpm/min。3）将离心后的细胞上清液缓慢吸出，然后加入1mL1640完全生长液进行吹打，使细胞沉淀再次重悬。然后转移至一25mL规格的细胞培养瓶中，补加细胞生长液适量并使细胞均匀分布在细胞瓶中，把细胞瓶放置于含有5%CO2的37℃恒温的细胞培养箱进行培养。2.8Vero细胞传代1）镜下观察观察Vero细胞汇合度至95%时，此时胞质饱满，边界清晰，适合进行传代培养，提前紫外照射超净工作台内实验所需物品30min。2）将细胞培养瓶中的1640完全生长液吸出，在细胞培养瓶内滴加2-3mLPBS于，轻轻晃动，将死去的细胞及残留培养液洗脱掉，然后废弃，重复2次。3）将1mL0.25%的胰蛋白酶-EDTA混合液加入细胞培养瓶中，缓慢晃动，使细胞表面被覆盖，放置细胞培养箱中2分钟后，在显微镜下观察。3）细胞在胰蛋白酶作用下，胞质回缩，细胞间出现空隙，等大约80%的细胞回缩成为单个细胞时，迅速终止消化，加入适量细胞生长液，使其覆盖细胞表面。4）用单量道加样器将细胞吹打为单细胞悬液，吹打时操作不可过于剧烈，避免出现泡沫，然后在镜下观察细胞是否完全脱离，若大部分细胞脱落，则将细胞悬液移至1.5mL无菌离心管中，使用普通离心机，1200rpm/min，离心3分钟；5）离心结束后，超净工作台内将装有细胞的离心管中的细胞上清吸出，使用1mL细胞生长液轻柔吹打细胞，使其混匀，分装到2个新25mL规格的细胞培养瓶内，19 泰山医学院硕士学位论文补加适量细胞生长液，继续在5%CO2培养箱中培养。2.9SFTSV的分离培养1）选取一瓶培养在25mL规格的细胞培养瓶中的Vero细胞，当细胞在指数生长期、汇合度在60%-70%时，吸出细胞瓶中的培养液，然后用1640基础培养基轻轻润洗细胞2次，将残留的细胞营养液和死去的细胞洗去。2）吸取200μL阳性病人样本血清，和2mL1640基础培养基混匀，通过直径2um的滤膜过滤，然后加入细胞培养瓶中。使细胞表面被完全覆盖，然后在放入细胞培养箱中，孵育2个小时，同时设置阴性对照组，使用1640基础培养基做相同处理。3）在孵育完成后，加3mL细胞维持液于细胞瓶中，然后放入CO2培养箱中。此为病毒分离培养的第一代，然后每隔12h观察一次细胞，判断细胞是否出现病变。4）在维持8-10天后，将细胞反复冻融3次，然后通过4℃离心机，将反复冻融后的细胞悬液以1200rpm/min，离心3min，吸取1mL细胞上清液，再与1mL1640基础培养基混匀，孵育2h后接种细胞，补加细胞维持液至5mL，此为病毒分离培养第二代，如此传至三代后，然后使用荧光定量PCR对病毒分离结果进行鉴定。注：所有操作过程中，需要严格按照生物安全2级实验室操作标准进行，不得裸露所需操作部位皮肤、结膜。所有处理过血液样本、细胞废液的物品耗材需要在实验完成后进行高压灭菌方可带离实验室。2.10荧光定量PCR鉴定1）根据SFTSV基因序列，使用PrimerPremmier5.0设计SFTSV的S片段特异性引物及探针序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成，设计的探针和引物序列见表1-9。表1-9荧光定量PCR用引物和探针序列引物序列SFTS-F-YINGGGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAAPrimeScriptRTEnzymeMixITGCCTTCACCAAGACTATCAATGTSFTS-Tan-YINGFAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ12）若细胞产生明显CPE，将其放置在-80℃冰箱中冻融三次。3）在4℃离心机内，将冻融后的细胞以每分钟1200rpm转数，离心3min，然后20 泰山医学院硕士学位论文吸取300ul细胞上清，依照上述提取RNA步骤，提取细胞上清液中病毒RNA。4）分别依据第一部分表1-5和表1-6配制反转录体系和设定反转录条件。5）反转录完成后，根据表1-10配制荧光定量PCR反应体系，引物溶解按照上述方法进行，然后设定的反应程序根据表1-11中的步骤进行。表1-10荧光定量PCR反应体系试剂体积/μl2×TaqMasterMix12.5上游引物0.5下游引物0.5TaqMan探针0.5cDNA2总体积25表1-11荧光定量PCR反应程序温度时间95℃10min95℃15s40cycles60℃1min6）结果判定：首先检查阴性对照是否正常，若其出现Ct值，则认为本次实验结果不可信,需要进行重复试验。若阴性对照正常，2535，则病毒分离不成功，放弃培养。11病毒全基因组扩增对于第一部分所分离培养的SFTSV病毒，部分将经过荧光定量PCR检测结果Ct值<25的细胞上清液过滤，送至北京军事医学科学院微生物流行病研究所进行2代测序。部分进行1代测序。1代测序样品需在本实验室内自行扩增SFTSV病毒全基因组，扩增引物序列由北京军事医学科学院微生物流行病所设计赠送。表1-12为所用的19对扩增病毒全基因组的引物序列，扩增SFTSV的L、M、S序列的引物分别有7对、8对、4对。实验步骤如下：21 泰山医学院硕士学位论文表1-12SFTSV全基因组扩增引物扩增序列引物名称序列L片段L-5-Ter-F1ACACAAAGACGCCCAGATGAL1112-R1GACATCTAGAAGGCACTTTGCL968-F1AGGAGCAACAAGCAAACATCATL2253-R1CAATGTACCAGCTGTTCACCAL2136-F1TGGATTGCATGGTGCGAATTGL3135-R1GATCAGATGACCTAGACTCAGL3031-F1CATGCCAGCYAAATTCCACAGL4135-R1TTCTTGTTGGCAGCTCTCCTGL4010-F1GGAACTCTCAGCCACTCTGTTL4963-R1GTAGAGAAGGCCTCTATGATCL4843-F1TAGCCTAGAAGCTGAGAAGAGL5722-R1CCTTGGGTCTTCCTATCATTTL5577-F1ACACTGATATATCAGAGTCAGCL-3-Ter-R1ACACAAAGACCGCCCAGATCM片段M-F1ACACAAAGACGGCCAACAATGM611-R1GTCTGGGAATTCACTTTGGCM526-F1GATAGGGTTCTCTGGATAGGM960-R1ATCCCTCCATATGACACAACGM810-F1GTRCAAGAGAGCTCATCCAAGM1354-R1TTCTTTGCAGGGTAGCACTGM1267-F1GAATTCACATTTGAGGGTAGTTM1922-R1ACCGGGCATCAGGAACAAAATS片段S1-F1ACACAAAGAACCCCCAAAAAAGGS692-R1CCCTTGGCCTTCAGCCACTTS562-F1GCAAGATGCCTTCACCAAGAS1003-R1ACAGTGTCTTGGATGAGGATGS829-F1GACAAAATTAGACCTCCTTCGS1725-R1ACACAAAGAACCCCCTTCATTT1）吸取300μl细胞上清液，过滤后，提取病毒RNA。2）反转录PCR，体系采用40μl，将上述反转录体系等比例扩大4倍，反应程序如表1-2。3）PCR扩增病毒全基因组，反应体系如表1-4，将引物换成所对应的19对引物，22 泰山医学院硕士学位论文然后按照表1-5程序进行PCR扩增。4）琼脂糖凝胶电泳、结果判断按照上述方法进行。5）将扩增出和目的片段大小相符条带的PCR产物送至铂尚生物技术有限公司测序，每一个片段都进行双向测通。6）序列拼接。23 泰山医学院硕士学位论文结果1.SFTS疑似病人SFTSV核酸检测2015年和2016年期间，在泰安市3所三甲医院中总计收集到30例疑似SFTS病人血清，其中29例来自泰安地区，1例来自临沂市郯城县。3所三甲医院中，88医院送检9例、附属医院送检18例、中心医院送检2例，经实验室检测核酸阳性样本15例，阳性率为53.7%(15/29)，其中L片段检出率最低，为73.3%(11/15)，M、S检出率都为93.3%(14/15)，不同片段检测率不同（χ=0.556，P>0.05），差异没有统计学意义。如图1-1所示，一病人血清中SFTSV巢式PCR第二次PCR扩增结果，L、M、S检测都为阳性，其中L片段大小888bp、M片段大小344bp、S片段大小559bp。2.SFTSV的分离及测序病毒在Vero细胞上生长缓慢，第一代培养和第二代培养期间很难引起细胞出现明显CPE，此时可通过荧光定量PCR进行检测，通过CT大小判断病毒含量，若CT值出现逐代降低，则病毒成功在Vero细胞上生长。从第3代开始，病毒致细胞病变作用明显加强，在细胞接毒方式不改变情况下，一般稳定在3天左右能够引起细胞出现明显病变，细胞出现皱缩、脱落、死亡、柳叶刀形状改变。SFTSV从病人血清中分离时，第1代及第2代培养时期内，总计约16天内，细胞很难产生明显CPE，在传至第3代时，一般能够在在第3-5天时引起细胞产生明显CPE，随着病毒培养代次的增加，出现CPE时间明显加快，如图1-2，从病人血清中分离病毒，传至第3代第4天时引起细胞出现明显CPE，此时阴性对照细胞状态良好，而接毒组大量细胞出现胞核皱缩、脱落、死亡、细胞外形呈现柳叶刀形改变。总计在15例确诊SFTS病人血清中分离出12株病毒，分离率为80.0%，其中2015年4株，通过2代测序获得病毒全基因组；2016年8株毒，通过1代测序获得病毒全基因组，图1-3为1代测序扩增病毒全基因组的PCR凝胶电泳图。3.SFTS病人流行病学特征3.1地区分布泰安市共有6个市辖区及县，分别为泰山区、岱岳区、新泰市、肥城市、东平县、宁阳县，6个地区都有疑似SFTS病例，除了新泰市和东平县病例样本尚未检出SFTSV核酸阳性外，其余4个地区都有确诊病例。其中疑似病例数及确诊病例数在前两位的都为泰山区和岱岳区，各地区疑似病例中阳性率及确诊病例数不同，确诊病例数最多的地区为岱岳区(6例)，该地区阳性率为66.7%，具体结果见表1-13。病例高度散发，24 泰山医学院硕士学位论文且主要分布山地丘陵地区。表1-132015年-2016年泰安市疑似SFTS及确诊病例地区分布地区例数阳性病例数阳性率(%)泰山区11436.4岱岳区9666.7新泰市200肥城市22100.0东平县100宁阳县4375.0总计291551.73.2月份分布29例疑似病例中，最早病例出现在4月份，疑似病例3人，其中1人为确诊病例，当月阳性率为33.3%（1/3）。7月份达到高峰，当月疑似病例15人，确诊病例8人，当月阳性率为53.3%（8/15）。疑似病例发病时间一直持续到当年10月份，至今尚无确诊病例。其中确诊的15例SFTS病例，发病时间集中在05月~07月份，7月份为发病高峰，其余两个月份中，五月份确诊病例3人、六月份确诊病例4人，其余月份尚未发现SFTS病例。病例分布具有明显的季节性，如图1-4，蓝色代表疑似病例时间分布情况，橘红色代表确诊病例时间分布情况。疑似病例及确诊病例都从春季开始出现，夏季7月份达到高峰，秋季和冬季无感染病例发生。3.4人群分布SFTS疑似病例年龄介于29岁到84岁之间（64.72±13.9），其中≥40岁人群占比82.8%（24/29）。男性发病15人，发病率51.7%；女性发病14人，发病率为48.3%,男女性别比差异无统计学意义（χ=4.497,P=0.106）。发病人群中，以农民为主，占发病人群的79.3%（23/29）。SFTS确诊病例年龄介于45岁到83岁之间（69.5±10.6）。男性发病5人，发病率17.2%；女性发病9人，发病率为31.0%,女性明显多于男性，差异有统计学意义（χ=9.077,P=0.028）。发病人群全部为农民。见表1-14。25 泰山医学院硕士学位论文表1-142015年~2016年泰安市疑似SFTS病例及确诊病例年龄和性别分布疑似病例确诊病例年龄男女男女~20000020~40200040~60612060~807103880~0301总计1514593.5SFTS患者临床表现及实验室检查结果有2例病人在发病前，有明确的蜱虫叮咬史，大部分SFTS病人急性起病，主要临床表现有发热和消化道症状，15例确诊SFTS病例都有发热症状，53.3%（8/15）病人有消化道症状，无一病人体格检查出现浅表淋巴结肿大现象。实验室检查中，所有病人都出现血小板降低，80.0%（12/15）的病人白细胞降低，80.0%（12/14）的病人肝功能检查结果异常，53.3%（8/14）病人肾功能检查结果异常。见表1-15。15例确诊病例中，2例病人最终治疗无效死亡，6例病例治愈，其余病例放弃治疗或者转院。表1-1514例SFTS临床症状和实验室检测结果临床表现阳性人数阳性率（%）血小板降低14100白细胞降低1280.0消化道症状853.3淋巴结肿大00肝功能异常1280.0肾功能异常853.326 泰山医学院硕士学位论文图1-1巢式PCR检测SFTS病人血清中SFTSV核酸结果1:DNAmarker;2~4:巢式PCR内引物扩增SFTSV的L、M、S序列片段图1-2SFTSV致细胞病变效应图1-3SFTSV全基因组PCR扩增结果M:DNAmarker;1~7:SFTSV的L序列全长；8~15:SFTSV的M序列全长；16~19:SFTSV的S序列全长。疑似SFTS病人确诊SFTS病人月份图1-4泰安市疑似SFTS及确诊SFTS病例时间分布27 泰山医学院硕士学位论文讨论SFTSV自从2010年在我国首次报道后，该病毒所引起的SFTS病例数呈现逐年[6]上增趋势。泰安地区位于山东省西部地区，其地形地貌多山地丘陵，气候温暖湿润，农村地区植被茂密，适合多种媒介生物生长繁殖，与山东省内SFTSV流行地区烟台市、沂源县地理环境、人居方式相似，且可在当地蜱虫体内检测到SFTSV核酸阳性，[29-31]SFTSV很可能为当地疑是SFTS病人的致病病原体。针对泰安地区2015年和2016年疑似SFTS病人血清中SFTSV核酸检测及分离培养结果分析，泰安市为SFTSV自然疫源地，近半数（48.3%）临床疑似SFTS病例由感染该病毒发病。泰安地区病人体内SFTSV不同片段核酸检出率不同，L片段检出率较M片段、S片段检出率低，且在扩增病毒全基因组时，L片段较M片段、S片段难扩增，可能和扩增片段大小、L片段基因组结构更为复杂有关。对于单临床样本检测SFTSV核酸分子时，需要同时检测SFTSV基因组不同片段，以提高检测的准确性。扩增病毒全基因组时，对于较难扩增的SFTSV片段，可以适度提高退火温度或者提高PCR反应体系中cDNA比例，或者在扩增片段起始位点附近重新设计扩增引物，用来提高扩增SFTSV全基因组效率。病毒在Vero细胞上生长缓慢，第一代培养和第二代培养期间很难引起细胞出现明显CPE，此时可通过荧光定量PCR进行检测，通过CT大小判断病毒含量，若CT值出现逐代降低，则病毒成功在Vero细胞上生长。从第3代开始，病毒致细胞病变作用明显加强，在细胞接毒方式不改变情况下，一般稳定在3天左右能够引起细胞出现明显病变，细胞出现皱缩、脱落、死亡、柳叶刀形状改变。SFTSV感染后，临床潜伏期尚不十分明确，根据国家卫生计划生育委员会颁布的《发热伴血小板减少综合征防治指南（2010版）》，潜伏期可能为1周~2周，急性起病，几乎所有病人都有发热伴随血小板减少综合征、白细胞减少综合征临床表现，查体常见浅表淋巴结肿大伴压痛，部分病例有头疼、肌肉酸痛症状，少数严重病人可[32]同时伴有恶心、呕吐纳差、多器官衰竭等症状，甚至引起死亡。针对泰安地区SFTS病人临床症状及实验室检查结果分析，所有的病人都有发热症状，体温最高能达到39.6℃，53.3%的病人出现了恶心、呕吐、纳差等消化道症状，体格检查无一病例出现浅表淋巴结肿大。所有的病例实验室检查都有血小板降低、80.0%的病例白细胞降低和肝功能受损、53.3%病人出现了肾功能受损情况，泰安地区SFTS临床表现及实验室检查结果分析与国内其它地区相似，SFTSV引起的SFTS临床表现无特异性。1528 泰山医学院硕士学位论文例病人中，2例病人经治疗无效死亡，7例病人因病情严重而放弃治疗或者转院，与国内其它地区大部分病例痊愈出院结果不同，说明SFTSV在泰安地区对当地居民健康威胁更加严重，当地居民应该提高对SFTSV的防控意识，临床治疗过程中，对疑似SFTS病人及早进行抗病毒治疗，用以改善预后。值得注意的是，在疑似SFTS病人中，大部分病例有和SFTS病例临床症状、实验室检查结果相似，在8月份甚至有病人最高体温达到42℃，提示当地临床医生，在临床诊断及治疗疑似SFTS过程中，需要与其它出血热疾病、中暑、热射病相区别。泰安市下属6个辖区中，仅东平县和新泰市还未检出阳性病例，但这两个地区送检疑似病例数较少，其病毒流行情况有待进一步研究。其余4个县、区都存在SFTSV感染病例，病例呈散在分布，多分布与山地丘陵的农村地区，以岱岳区和泰山区阳性病例和疑似病例数最多，提示这两个地区可能为泰安市疫情最为严重区域。在病例的感染时间上，发病时间呈现出明显的季节性，以春、夏两季为主，从4月份开始出现病例，随后病例数逐渐增多，在7月份达到高峰，随后开始下降，和国内其它SFTSV流行地区相似，但10月份只发现疑似病例，而无一人确诊，这可能和样本量不足有关，泰地区SFTS流行时间特征有待进一步研究。在感染人群中，泰安市SFTS病人以老年人为主，感染病例年龄中位数为72岁，可能与泰安市山地丘陵的农村地区年轻劳动力多外出打工，多以老年人常年居住在山间林区生活为主有关。且当地农村人口中多以老年人在家中饲养狗、山羊等蜱虫常寄生动物，进一步扩大了老年人与蜱虫等传播媒介的接触机会。感染人群中，男性5人，女性9人，女性人数明显多于男性，差异有统计学意义，可能与当地农业以采茶业或果树种植为主，从业人员中女性构成比例较高有关，女性比男性更易与蜱虫等传播媒介接触。有两例病人有明确的蜱虫叮咬史，提示当地农业从业人员，更应该在野外劳动过程中，避免媒介生物的叮咬。所有的确诊病例中，尚没有发现因为与SFTS病例接触而导致的病毒传播,临床医护人员及病人家属在诊疗、照顾病人过程中应做好防护措施，避免人际间接触而传播病毒。综上所述，山东省泰安市疑似SFTS病人中存在SFTSV病毒感染，在检测病人体内病毒RNA时，应该结合使用SFTSV基因组不同片段检测引物，优先使用M和S片段引物，结合不同片段的引物扩增结果来进行综合判断，提高诊断准确率。泰安市是发热伴血小板减少综合征病毒的自然疫源地，且在泰安大部分地区都有分布。病毒流行季节主要集中在春夏两季，与当地蜱虫生长繁殖活动规律一致，且部分病例在发病前有明确的蜱虫叮咬史，提示蜱虫可能与该病毒的感染密切相关。泰安市感染29 泰山医学院硕士学位论文SFTSV的人群年龄平均较高，女性多于男性，可能与当地农业种植业人员从业特点和年轻劳动力外出打工有关，提示我们在疑似SFTS病人中，农村居住地区的老年女性值得高度警惕，应对此类疑似感染病例及早开展抗病毒治疗，改善预后。SFTSV在泰安地区致病性较国内其它地区严重，临床从业人员应提高对SFTS病人的诊断和预防措施，防止出现与SFTS病人接触传播病例。针对泰安市农村居住地区和进山游览游客，应及早开展针对防治SFTSV的宣传教育，尤其是中老年人群，提高对SFTSV的警惕性，避免和蜱虫等媒介生物的接触，降低感染SFTSV的可能性。30 泰山医学院硕士学位论文小结1、山东省泰安市大部分县、区疑似SFTS患者中存在SFTSV感染病例，该市存在SFTSV的流行。2、泰安市SFTSV流行以春、夏两季多见，每年7月份为病毒感染的高峰季节，临床上春、夏季节疑似SFTS病人中，农村居住地区的中老年人就诊时应首先考虑该病毒感染，及早开始抗病毒治疗，改善预后。3、在检测和扩增病毒全基因组时，M片段和S片段检出率和扩增效率较L高，应该同时采用多种检测手段，用以提高SFTSV检出率及准确率。4、从病人血清中分离SFTSV毒株时，病毒在Vero细胞上生长缓慢，分离周期长，致细胞病变效应多在培养20d后，病毒能够使细胞出现脱落、皱缩、柳叶刀形改变。31 泰山医学院硕士学位论文第二部分泰安市SFTSV的生物信息学研究[13]SFTSV目前在国际上主要被分为8种基因型。依据不同基因型SFTSV的L、M、S序列在遗传进化树上亲缘关系，SFTSV在系统进化树上形成了两个明显不同的分支，分别命名为中国支（China）和日本支（Japan），其中中国支又分为C1、C2、C3、C4、C5基因型，大部分毒株分离自中国地区，以C2、C3、C4基因型为主；日本支由J1、J2、J3构成，大部分毒株主要分离自韩国、日本地区，又以日本毒株[13]为主，其中以J1基因型为主。病毒间部分片段的置换或者分节段病毒间的序列重新组合，使病毒形成不同的感染特性，更好的适应宿主和逃避宿主的免疫应答，从而使病毒朝向利于本身生长繁殖[22,23]方向发生进化。布尼亚病毒科其它成员中，基因重组和重配为病毒关键的遗传进[25,化机制，其基因重配和重配甚至有可能会引起病毒形成新的亚型和抗原性的改变26]。SFTSV为分节段的RNA病毒，RNA病毒较DNA病毒变异频率较高，当不同毒株感染同一宿主时，毒株间可能发生的基因片段的置换或者不同序列的重新组合形成了SFTSV的基因重组和重配，现有的研究中，SFTSV的L和M序列上重组和部分[24,33]重配毒株可能为病毒不断进化、逃避宿主免疫应答的重要方式。在此，基于SFTSV的体外分离培养及全基因组序列测定，根据截至2016年05月份GenBank收录的所有SFTSV基因组序列，构建系统进化树，确定泰安地区SFTSV的主要基因型，阐明现有SFTSV的遗传学特征。通过一系列生物信息学手段，对所有毒株间基因的重配、重组进行全面的分析,从分子生物学角度为病毒的预防及疫苗研发提供理论基础。32 泰山医学院硕士学位论文实验材料与方法1.实验材料11惠普HPZ840台式工作站具体配置如下：工作站型号HPZ840处理器类型IntelXeonE5-2690(1.8GHz/10M)处理器数目16核运行内存8G主板参数IntelC602操作系统Linux硬盘512GBSATASSD×61.2BioEdit软件一个性能优良的生物序列编辑器，可在Windows系统下运行，基本功能可以对[34]蛋白质、核酸序列进行编辑、排列、处理和分析。1.3jModelTest软件一款用最大似然法(MaximumLikelihood,ML)做系统进化树时筛选核酸替代模[35]型的软件，该软件用Java编写，可以跨平台使用。1.4ModelGenerator软件该软件可以同时支持核苷酸（56种）和氨基酸（96种）替代模型的选择，且以[36]快速著称，尤其适用于大数据。1.5Muscle软件基于本实验室HPZ840台式工作站Linux系统下序列比对软件，其功能仅限于多[37]序列比对，运行速度快。1.6RAxML软件RAxML是用极大似然法建立进化树的软件之一，可在Linux、MacOS、DOS下运行，可以处理超大规模的序列数据，包括上千至上万个物种，几百至上万个已经比[38]对好的碱基序列。1.7MEGA.5软件一款免费软件，可以用来进行序列比对、氨基酸翻译、进化树构建、进化假说验[39]证等，还可以在线通过NCBI进行序列的比对和数据的搜索。33 泰山医学院硕士学位论文1.8RDP.4软件RDP.4(RecombinationDetectionProgramversion4)软件主要用于分析、检测病毒[40]序列的重组信号。该软件内包括了分析重组的RDP法、Botttsacnning法、[41-46]GENECONV法、MaximumChiSquare、Chimaera法、SisterScanning法。2实验方法2.1序列检索登录NCBI，选择BLAST目录下NucleotideBLAST,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome,检索框中粘贴泰安地区SFTSV中任一株病毒全基因组序列，Algorithmparameters中Maxtargetsequence选择5000,其它选择为默认，然后Blast。选择所有Blast出的毒株序列并以GenBank（completesequence）格式下载，使用BioEdit软件打开检查。检索页面如如图2-1。图2-1SFTSV全部序列检索方式图2.2序列筛选1）SFTSV不同节段序列的筛选将下载下的序列通过本实验室编程的计算机软件Phlebo.ExtracTag.py筛选出所有的序列信息，生成.csv文件sequence.csv，然后手动将sequence.csv中的L序列、M序列、S序列的信息分别筛选出来，生成L.csv、M.csv、S.csv文件。然后依照L、M、S序列的信息通过本实验室编程的计算机软件SFTSV-Subdataset.py将病毒的L、M、34 泰山医学院硕士学位论文S序列分别筛选出来，剔除掉碱基缺失大于10%序列后，再分别和本实验室分离自2015年的4株泰安株SFTSV合并。2）SFTSV全基因组序列的筛选在上述得到的所有SFTSV序列中，当L、M、S的序列来自的毒株名称、分离时间、分离地点等背景信息一致时，认为该3条序列来自同一个毒株，构成了一株病毒的全基因组，筛选出符合条件的毒株序列。2.3SFTSV序列比对和全基因组拼接将上述得到的序列通过Muscle软件进行多序列比对，然后将比对后的结果通过BioEdit打开，手动校正序列中存在碱基缺失或者多与的序列，直至序列完全对齐。将全基因组序列按照L、M、S的顺序进行拼接，命名为full-lengthgenome，用于后续分析。2.4检测系统进化树最适核酸替代模型2.4.1jModelTest检测系统进化树最适核酸替代模型：1）载入对齐后的病毒基因组序列xxx.fas，FileLoadDNAalignment2）计算似然值，依次单击AnalysisComputelikelihoodscores3）选择替换数方案，n=3，其余选项默认设置，单击ComputeLike。注:当n=3时，模型数目为24，模型数目越多，越有利于提高构建系统进化树的精确性，但所推荐的模型中，应该适用于建树软件，若建树软件不支持，则计算的模型结果不可用。4）基于不同标准下获得的最佳替代模型，选择不同的标准，依次单击AnalysisDoAICcalculations、AnalysisDoBICcalculations、AnalysisDoDTcalculations，并选择AIC、BIC、DT标准下的所有参数，并分别计算。如图2-2。图2-2基于AIC、BIC、DT标准下参数设置5）查看结果，依次单击ResultsShowresultstable以表格形式保存，也可以依次单击ResultsBuildHTMLlog以网页形式保存。35 泰山医学院硕士学位论文2.4.2ModelGenerator检测系统进化树最适核酸替代模型：1）将需要检测的病毒基因组序列xxx.fas和ModelGenerator放到同一目录下，本实验计算过程中病毒基因组序列和软件都放到了D盘Biosofts目录下ModelGenerator_v_851文件下。2）运行命令，Windows键+R打开命令框，按照图2-3上命令运行ModelGenerator。3）生成Modelgenerator.out文件，读取结果。将通过jModelTest和ModelGenerator软件检测不同序列的核酸替代模型统计到同一个EXCEL表格中，当一个序列的最佳替代模型得到两个检测软件支持时，在结合建树软件支持的类型，选择一个可用的最佳核酸替代模型。2.5建立遗传进化树将比对齐的后所有的L序列、M序列、S序列和全基因组full-lengthgenom-e的“.fas”的文件另存phylip4文件。然后通过惠普HPZ840台式工作站上RAxML软件建立系统发育树，采用方法为最大似然法(MaximumLikelihood,ML)，核酸替代模型GTRGAMM-A，自举检测值为1000。按照命令mpirun-ncoraxmlHPC-MPIssE3-fa-mGTRRGAMMA-x12345–p12345-N1000-salnxxx.phy-nalnxxx进行计算。运算结束后得到系统进化树文件：RAxML-bipartitions.xxxx。采用同样的方法，将获得的病毒全基因组序列构建系统进化树。注：以上数据处理过程中，所用计算机编程软件和命令均为史卫峰老师编写。2.6SFTSV在遗传进化树上分型使用Dendroscope将上述得到的进化树文件打开。根据遗传进化树的树型和支持率，参考日本学者划分的毒株基因型，将不同分支的毒株进行分型。2.7基因重配分析2.7.1筛选重配毒株当SFTSV毒株的L序列、M序列、S序列中，至少两个序列来自不同基因型时，认为该毒株发生了重配事件。通过观察病毒全基因组构建的L序列、M序列、S序列的系统进化树，对每一个毒株的不同序列进行分型，将不同节段基因型不同的毒株筛选出来，确定所有的重配毒株。2.7.2重配毒株验证1）从不同亚型C1、C2、C3、C4、C5、J1、J2、J3的毒株中筛选3-5条代表性病毒全基因组，将其L序列、M序列、S序列与所有的重配毒株的L序列、M序列、36 泰山医学院硕士学位论文S序列合并成一个数据集。2）采用上述构建遗传进化树方法，比对齐后，构建不同序列的系统进化树。3）采用上述筛选重配毒株的方法，比较筛选的重配毒株是否和上述结果一致，若一致，结果可信。若不一致，保留结果一致部分作为重配毒株。2.8基因重组分析1）运行RDP4.0，分别载入对齐后的所有的毒株的L序列、M序列、S序列的“.fas”的文件。2）打开Options选项，选择RDP法、Botttsacnning法、GENECONV法、MaximumChiSquare、Chimaera法、SisterScanning法六种检测方法后，单击Run进行计算。3）将计算结果以xxx.csv文件导出，统计6种检测方法下对不同可疑重组序列的支持率，至少有5种计算法支持该毒株序列发生重组时，可认为该毒株序列发生了重组事件。统计所有的重组事件，若P<0.001认为该算法支持毒株序列发生了重组事件。37 泰山医学院硕士学位论文结果1.筛选出的序列信息通过泰安株SFTSV病毒全基因在NCBI上比对，总计得到1360条序列，剔除掉所有的L序列、M序列和S序列中碱基缺失大于10%的序列后，在和泰安地区新分离的12株SFTSV的L序列、M序列和S序列汇总，总计得到235条L序列、234条M序列、444条S序列。将背景信息相同的L序列、M序列、S序列筛选出来，总计获得194株病毒全基因组。2.最适核酸替代模型检测结果通过jModelTest和ModelGenerator检测所有SFTSV的235条L序列、234条M序列、444条S序列及194株病毒全基因组后，jModelTest在的三种标准下最适合模型为GTR,ModelGenerator计算结果显示，L、M序列最适合模型为GTR，S序列最适合模型为TVMef，因为所选用的RAxML建树软件支持GTR模型，所以综上所述，遗传进化树在构建过程中选用GTR，不同序列模型选择结果如表2-1。表2-1系统进化树核酸替代模型检测结果GenejModelTestModelGeneratorModelUsedLGTRGTRGTRMGTRGTRGTRSGTRTVMefGTRfull-lengthgenomeGTRGTRGTR3.遗传进化树分析3.1SFTSV所有序列的遗传进化树分析通过对SFTSV的235条L、234条M、444条S序列构建的遗传进化树进行分析，SFTSV的3个片段的遗传进化树上上，除了之前被报道的C1-C5、J1-J3外，在L序列的遗传进化树上发现了一个新的分支，支持率为100%，新分支由10株毒株聚集在一起，其中3株为日本株，7株为中国株，暂时命名为C6亚型，如图2-5中进化树的拓扑结构L序列的蓝色部分，M序列和S序列的系统进化树上并没有发现C6亚型。但在S序列的系统进化树上，发现了一个另一个新分支，支持率为31%，命名为J4亚型，由19株毒株聚集在一起，其中2株为日本株，17株为韩国株，如图2-4中进38 泰山医学院硕士学位论文化树的拓扑结构中S序列的蓝色标注。新分离的12株泰安株，有11个毒株的L序列、M序列、S序列都聚集在C3分支上，为C3亚型。有1个株的L序列、M序列、S序列聚集在C4分支上，为C4亚型，分离自2016年，其位置如如图2-4中L序列、M序列、S序列进化树的拓扑结构中，红色方框标注内。3.2SFTSV全基因组序列的遗传进化树分析在全基因组构建的系统进化树上，除了C1-C5、J1-J3，在SFTSV的L序列上新发现的C6的10个毒株聚集在一起，形成新的分支，支持率为53%。S序列上的J4缺失全基因组序列，没有发现。4.基因重配分析通过对194株SFTSV的L序列、M序列、S序列进行基因分型，总计发现了26株重配毒株，除了之前报道的10株重配毒株外，有16株毒株为新发现。26株重配毒株以12种重配方式存在。组成C6新亚型的10个毒株全部为重配株，且毒株NB32基因组的三个节段分别来自不同的基因型，L序列、M序列、S序列分别为C6、C4、J2基因型。有9株重配毒株的L序列、M序列、S序列以C6、J2、J2方式组成。所有的重配毒株及重配方式见图2-5，黑色三角符号标注的为新发现的16株重配毒株。5基因重组分析通过RDP软件中RDP法、Botttsacnning法、GENECONV法、MaximumChiSquare、Chimaera法、SisterScanning六种方法分别检测SFTSV的L序列、M序列、S序列-3中的重组事件，计算每一种检测方法下重组事件发生的可能性，如果P<1×10，则该计算方法下不支持重组事件发生。6种计算发法下重组事件发生的概率及序列的重组位置起点和终止点如表2-2，其中，NS代表Pvalue>0.05在该检测方法下不支持该序列发生重组事件；†代表核酸位置；***代表Pvalue<10-20;**代表Pvalue<10-10;-3*代表Pvalue<10。39 泰山医学院硕士学位论文图2-3ModelGenerator运行命令行图2-4SFTSV的L序列、M序列、S序列进化树拓扑结构图2-5SFTSV重配毒株及重配方式40 泰山医学院硕士学位论文表2-2.通过六种检测方法确定的SFTSV重组事件重组片段位置基因重组基因序列号|毒株RDPGENECONVBootscanMaxchiChimaeraSiSscan††起始点终止点LKC292349|HNXY_19134075678***************KF711863|2011YSC6040615716**************KF711880|2011YPQ1240615716*********KF711863|2011YSC6022993083NS*******KC292348|HNXY_27822993083NS*******KC292329|HNXY_20631214880***************KC292336|HNXY_3149175616*********KR698352|2013NB3214022519**********KR698352|2013NB3229723656******KR698352|2013NB326346476*******AB983501|SPL060A6338592****NS***MKF711945|2011YSC605853354*NS**NS***KF711930|2011YPQ123372645NS******KR017854|ZJZHSH-WSH13471810NS*******KR017853|ZJZHSH-XAM12991752NS******KR698339|2013NB32304948******KT890281|Jilin17922286******KC292310|HNXY_3127273046******SJQ693010|2011SDLZP071683612******KR698328|2013NB3811781677NS*****41 泰山医学院硕士学位论文讨论SFTSV在流行进化过程中，随着越多的毒株被报道发现，其基因型往往会呈现出一些新的特征。除了之前报道的8种亚型C1-C5、J1-J3外，在SFTSV的L序列上、S序列上分别发现了两个潜在的新亚型，暂时命名为C6和J4。因为S序列上的J4毒株缺少全基因组，因此在全基因组构成的遗传进化树上，只发现了C6亚型。针对C6进一步分析，其在L序列遗传进化树上形成单独分支，支持率为100%，全基因组系统进化树上，其支持率为54%。C6由10株毒株聚集在一起，其中3株为日本株，7株为中国株。新分离的12株来自泰安地区的SFTSV，其中11株毒株基因组3个节段都聚集在C3亚型上，为C3亚型毒株，11株毒株彼此亲缘关系十分接近，与同分离自泰安地区密切相关；1株毒株基因组3个节段都聚集在C4亚型上，为C4亚型，12株泰安地区毒株都和河南地区来源毒株亲缘关系接近，其分子流行病学特征与山东地区和河南省地理位置毗邻特征一致，值得注意的是，河南地区毒株以C2亚型最多见，提示我们泰安地区毒株有可能会存在C2亚型。且同一地区分离出不同亚型的SFTSV，病毒发生重配或重组的几率较高，由而可能导致病毒传播特性、致病性等特性发生改变，当地政府部门及居民应提高对SFTSV的防控意识。通过对SFTSV的基因重配分析，总计发现了26个重配毒株，包含了之前报道的10株重配毒株，其中16个重配毒株为新发现，2015年泰安地区新分离株中，无一株为重配毒株。这26个重配毒株，总计以12种重配方式存在，其中以C6、J2、J2基因型构成毒株的L、M、S序列最多，总计9个毒株发生了此类重配方式。值得注意的是，首次发现了一株毒株NB32，其L、M、S序列分别来自三种基因型，分别为C6、C4、J2。有8株毒株的重配方式，都只有一个序列的基因型与其余两个序列不同。上述发现的C6亚型，全部为重配毒株，进一步说明了基因重配在病毒的遗传进化及新亚型形成过程中，扮演了重要的角色。在对SFTSV基因重组分析中，以往的报道基因重组只有在病毒的L和M序列中发现，我们首次在SFTSV毒株2011SDLZP07和2013NB38的S片段发现了重组事件。还有以下两点值得注意：一、毒株2011YSC60和2013NB32的L序列发生了多重重组事件；二、毒株2011YSC60,2013NB32,2011YPQ12和HNXY_31的L、M序列同时发生重组事件。多重重组事件及S序列首次发现的重组事件说明，基因重组在SFTSV的进化过程同样扮演着重要角色。42 泰山医学院硕士学位论文小结1、泰安地区SFTSV毒株以C3基因型为主，存在少量的C4基因型，与河南株亲缘关系最近。2、GenBank收录的SFTSV所属分支除了之前报道的C1-C5、J1-J3这8种亚型外，形成了两个潜在新亚型，暂时命名为C6和J4。3、在GenBank现有SFTSV中总计发现了26个重配毒株，以12种重配方式存在，其中16个重配毒株为新发现，且10株重配毒株形成了SFTSV新亚型C6，说明基因重配在SFTSV的遗传进化过程扮演着重要角色。4、总计在14条SFTSV序列上发现了20个重组事件，在多个SFTSV毒株的同一条序列和同一毒株的L、M序列上都发现了多重重组事件，且首次在S序列上发生了重组事件。43 泰山医学院硕士学位论文第三部分泰安地区SFTSV毒力及抗原性研究SFTSV基因组结构依据其序列大小分为大（L）、中（M）、小（S）3个节段，分别编码编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)、糖蛋白Gn/Gc以及核蛋白(NP)和非[1]结构蛋白(NSs)。SFTSV3个节段编码的4种蛋白各具有不同功能，其糖蛋白Gn/Gc[47,以及核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)可能和病毒致病机制和宿主相互作用密切相关48]。现有研究中发现，SFTSV在进入动物细胞过程中，可通过糖蛋白Gn/Gc与细胞的C型凝集素DC-SIGN受体结合而进行，也通过其糖蛋白Gn与细胞非肌肉肌球蛋[47,48]白结合进入细胞内进行生长繁殖。SFTSV在宿主细胞内生长繁殖过程中，其S片段编码的核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)对宿主细胞干扰素系统进行调节，从而逃[49]避宿主免疫检测。因而，SFTSV与宿主细胞识别和感染细胞致病过程中，不同亚型SFTSV可能因为编码糖蛋白Gn/Gc、核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)区域氨基酸位点的差异，致使病毒感染细胞能力、培养特性和抗原性存在差异。本部分实验选用对泰安地区主要流行SFTSV的C3基因型代表毒株和C4基因型毒株分离培养过程进行比较，利用Vero细胞测定两种基因型毒株的TCID50，分析不同亚型SFTSV的毒力水平。然后用C3基因型代表株免疫小鼠，制备抗体阳性血清，将C3基因型SFTSV和C4基因型毒株与血清孵育后接种Vero细胞，测定C3亚型毒株制备的小鼠免疫血清对母本毒株和C4基因型毒株反应性。然后通过比较选取两个毒株不同序列的氨基酸差异位点特征，初步探究泰安地区不同亚型SFTSV的抗原性特点及氨基酸差异位点对SFTSV抗原性的影响。44 泰山医学院硕士学位论文实验材料与方法1.实验材料1.1主要仪器和设备仪器名称仪器型号生产厂家或品牌生物安全柜1300SERIESA2ThermoFisher公司CO2培养箱371ThermoFisher公司普通冷冻冰箱BCD-241TMCN青岛海尔股份有限公司超声波细胞粉碎机SCIENTZ-IID宁波新芝生物科技有限公司台式高速离心机Pico21ThermoFisher公司SPF级独立通气笼EasyFlow泰尼百斯制冰机XB-70宁波新芝生物科技有限公司酶标仪16525BIO-RAD公司1.2实验试剂试剂名称试剂来源弗氏完全佐剂SIGMA,Cat.#SLBP4506V弗氏不完全佐剂SIGMA,Cat.#SLBQ2284VCountingKit-8（CCK-8）联科生物技术有限公司SolubleTMBKit20X北京康为世纪生物科技有限公司羊抗小鼠FITC-抗体索莱宝生物科技有限公司DifcoTMSkimMilk北京博奥拓达科技有限公司Tween-20索莱宝生物科技有限公司HRDAntibody索莱宝生物科技有限公司乙醚天津市凯通化学试剂有限公司1.3实验小鼠C57小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号：SCXK（京）2012-0001]。1.4毒株本实验室分离保存的C3基因型毒株MYD、C4基因型毒株ZCY。45 泰山医学院硕士学位论文1.5常用试剂配制1）ELISA洗涤液（PBST）：1L灭菌后的PBS和0.5ml的Tween-20混匀，每次实验前现配现用。2）ELISA封闭液：既5%的脱脂乳，称取5g脱脂奶粉，溶到100mlPBS中。3）固定液：配制10ml的固定液，按照丙酮和乙醇3:2比例配制，其中丙酮6ml，乙醇4ml。放到4℃保存。2.实验方法2.1病毒感染力的滴定21）将25cm细胞瓶中汇和度在95%以上的单层Vero细胞消化、重悬，转移至5一96孔板中，每孔100μl，使细胞量达到2~3×10个/孔，放入细胞培养箱中培养，待汇合度达到80%时，进行下一步实验。-12）在1.5ml离心管中用细胞维持液将病毒液作连续10倍的倍比稀释，从10-10到10。3）吸去96孔培养板中营养液，用1640基础培养基润洗两遍，然后将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种300µl。4）设置正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排，每孔300μl维持液。5）逐日观察并记录每一天出现CPE的孔数目，一般需要观察8-10d。6）TCID50结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法。2.2制备小鼠免疫血清61）1ml1×10TCID50/0.1ml毒株MYD的病毒液和1ml弗氏完全佐剂在4ml离心管中混匀，放置在冰块上，采用超声波细胞粉碎机进行乳化5-10min。2）检查乳化剂质量，吸取适量乳化后的抗原佐剂复合物滴加到水面上，如果乳化剂在水面上呈现集中的白色的液滴状，该复合物稳定可用于小鼠免疫。如果滴到水面上后迅速散开，则需要继续超声乳化，直至滴到水面上可以聚集成滴状。3）随机挑选5只C57小鼠，每只小鼠腹腔注射200μl乳化后的病毒液与弗氏佐剂复合液。剩下3只小鼠注射等量的生理盐水作为阴性对照。64）在第2周和第4周时，分两次用1ml1×10TCID50/0.1ml毒株MYD的病毒液和1ml弗氏不完全佐剂，按照上述步骤制备病毒液与弗氏不完全佐剂复合液，给小鼠加强免疫。5）3次免疫完后，在第4-5d时用采血针从眼眶静脉丛取200μl小鼠血液，350046 泰山医学院硕士学位论文rpm/min，离心20min，析出血清。6）通过ELISA测定血清抗体效价。7）若抗体阳性，当天对小鼠进行心脏采血，分离血清，分装至200μl离心管中，-20℃冰箱冻存，备用；若抗体水平较低，则加强免疫。2.3ELISA测定免疫小鼠血清效价1）抗原包被:将毒株MYD的病毒液用包被液按照1:100倍稀释。每个浓度包被6孔，100μl/孔，4℃包被过夜。2）将过夜后的包被液吸出，用PBST洗涤3次，每次5min，然后拍干。3）每孔加入5%脱脂乳配置的封闭液后，放置到温箱中，37℃孵育1h。4）吸出封闭液，用PBST洗涤3，每次5min，拍干。5）用封闭液，将小鼠血清（一抗）按照1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000十倍倍比稀释，同时将阴性小鼠血清做相同的稀释度，作为阴性对照，分别对应到加的酶标孔中，100μl/孔，每个稀释度设置6个复孔，放置到37℃恒温箱中，孵育1h。6）吸出酶标板孔中的血清，用PBST洗涤3次，每次5min，然后拍干。7）每孔都加入酶标二抗，将HRP标记的羊抗鼠做1:2000稀释，100μl/孔，然后放置到37℃温箱中，孵育1h。8）将孵育后的二抗吸出，用PBST洗涤3次，每次5min，拍干。9）每孔中，滴加100μlTMB显色液，37℃下，避光，显色30min。10）显色完后，每孔加入50μl2mol/L的硫酸终止反应，用酶标仪测定OD450nm值，记录实验数据，计算抗体浓度。2.4采集免疫小鼠抗体阳性血清1）将小鼠通过乙醚麻醉，然后心脏取血。2）普通离心机下，3500rpm/min离心20min,分离血清。3）将析出的血清分装至200μl离心管中，迅速转移至-20℃冰箱冻存，备用。2.5细胞活力测定（CCK-8测定）21）将25cm细胞瓶中汇和度在95%以上的单层Vero细胞消化、重悬，转移至两个96孔板中，每孔100μl，使每孔细胞量达到5000-6000个，放入细胞培养箱中培养，待汇合度达到70%时，进行下一步实验。2）用细胞维持液将C3基因型毒株MYD和C4基因型毒株ZCY都稀释至-51×10TCID50/0.1ml。47 泰山医学院硕士学位论文-3-4-5-6-7-8-93）将小鼠血清用细胞维持液按照1:2，1:2，1:2，1:1:2，1:1:2，1:2，1:2，-10-11-121:2，1:2，1:2进行2倍倍比稀释，然后分别和等量的毒株MYD病毒液和毒株ZCY病毒液混匀，放置4℃孵育4-6h。4）将2个96孔板中的细胞营养液都弃掉，用PBS润洗两遍，吸干。5）每孔滴加200μl孵育后的病毒-血清混合液，按照血清稀释度由高到低，从左边第二列开始，向右依次加入，每一列设置4个复孔。同时选取横向两行细胞，分别加入等量的细胞维持液和病毒液，作为空白对照和阳性对照，各设置8个复孔，然后放入细胞培养箱，每隔12h观察一次。6）当70%接毒组细胞出现病变时，且空白对照没有出现病变，弃去细胞维持液，采用PBS润洗两遍，除去死亡、脱落的细胞。7）每孔加入100μl含有10%CCK-8的细胞维持液，避光，放入细胞培养箱中孵育2h。8）用酶标仪测定孵育后的细胞在OD450nm值，记录实验数据，然后使用graphpadprism软件分析数据。2.6C3亚型毒株和C4亚型毒株间氨基酸位点差异分析1）将C3亚型毒株MYD的4个编码区和C4毒株ZCY的4个编码区分别整合成一个文件夹。2）通过MEGA5.0翻译两个毒株编码区的氨基酸序列。3）统计两个毒株不同编码区差异氨基酸所位点。48 泰山医学院硕士学位论文结果1、C3毒株MYD和C4毒株ZCY滴度测定分别将毒株MYD、ZCY传至6代、5代，通过96孔板法感染Vero细胞后测定其滴度，依据第8天时记录的结果，如表3-1中数据分析，C3毒株和C4毒株的滴度7.55分别为1×10TCID50/0.1ml、1×10TCID50/0.1ml。表3-1毒株MYD、ZCY第八天时出现CPE孔数病毒液稀释倍数阴性毒株1234567891010101010101010101010对照MYD66666433200ZCY666521111002、ELISA测定免疫小鼠血清抗体效价在小鼠第3次免疫后的第4天，通过眼眶静脉丛采血，分离血清，通过ELISA测得血清效价，当小鼠免疫后血清与病毒特异性抗原反应的A值（P）与阴性对照血清与病毒的特异性抗原反应性的A值（N）比较大于2.1，既P/N>2.1时，抗体阳性，结果如表2-3,所示，抗体效价>1：10000，可以用来进行下一步实验。表2-3ELISA方法测定小鼠血清效价阳性血清稀释倍数抗原种类PBS123451:101:101:101:101:10P2.32.00.640.160.120N0.0840.0740.0750.0720.0760P/N27.3827.038.532.221.5803、抗体对C3、C4亚型毒株致细胞的保护作用通过C3亚型毒株MYD、C4亚型毒株ZCY与倍比稀释的小鼠血清孵育后，接种96孔板细胞，每12h观察一次，C3亚型毒株MYD在接到细胞24h时，阳性对照-3-4-5组60%以上细胞发生病变，阴性对照细胞状态良好，实验组中，1:2，1:2，1:2稀-6-7-8释度下细胞状态良好，无明显病变，1:1:2开始，细胞出现明显病变，1:1:2，1:2，-9-10-11-121:2稀释度下，细胞CPE数逐渐增多，1:2，1:2，1:2稀释度下，细胞CPE数目和阳性对照相似，通过CCK-8测定细胞活力，结果如图3-1，横坐标为小鼠血清稀释度，纵坐标为C3亚型毒株MYD测定的吸光度（Abs）。C4亚型毒株ZCY在接到-6细胞48h时，出现了和MYD类似的细胞变化，同样是在1:1:2开始，细胞出现了明49 泰山医学院硕士学位论文显病变，其结果如图3-2。4、泰安地区C3亚型C4亚型毒株基因氨基酸位点差异在C3亚型毒株MYD和C4亚型毒株ZCY的M基因序列编码糖蛋白Gn/Gc区域上，总计发现了25个位点存在氨基酸差异，占糖蛋白Gn/Gc氨基酸位点的2.4%；S基因序列上，核蛋白（NP）氨基酸组成相同，无差异位点，但在非结构蛋白(NSs)上，总计发现了6个位点存在氨基酸差异，且占非结构蛋白NSs氨基酸位点的2.0%；L片段上编码RNA依赖的RNA聚合酶的区域总计发现了202个氨基酸差异位点，占RNA依赖的RNA聚合酶氨基酸组成的9.6%。50 泰山医学院硕士学位论文讨论在临床感染SFTSV病例中，不同病人临床症状及预后存在不同特征，除去自身因素和治疗手段外，也有可能和感染不同基因型SFTSV有关。相比于同一基因型毒株，不同基因型SFTSV序列差异性更显著，有可能因为糖蛋白Gn/Gc以及核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)上氨基酸位点差异导致SFTSV在分离培养过程中，感染细胞能力、致病变能力和抗原性存在差异。C3和C4基因型SFTSV在初代培养时致细胞病变能力差异不显著，采用相同传代方法时，传至5-6代时能够使感染的Vero细胞稳定在3-7.5天左右出现明显CPE，病毒滴度能够升高到1×10TCID50/0.1ml，细胞出现病变的速度都明显加快。在C3亚型毒株MYD和C4亚型毒株ZCY的M和S基因序列编码糖蛋白Gn/Gc和非结构蛋白(NSs)上区域上，分别发现的差异氨基酸位点各占了其蛋白质全部氨基酸序列的2.4%和2.0%，核蛋白（NP）氨基酸组成相同，无差异位点，这些差异位点的改变并没有引起病毒在感染细胞过程中，病毒毒力、生长特性明显区别，这可能和差异位点较少不足以改变病毒生长特性有关，但关于所选取的分离自泰安地区的C3基因型和C4基因型SFTSV的特异性有待研究。采用泰安地区主要流行SFTSV的C3基因型代表毒株免疫小鼠制备免疫血清，如果不同基因型毒株抗原性存在差异，那么通过C3基因型制备的抗体阳性血清可能对C3基因型毒株感染细胞保护作用更强。在和不同稀释度下的血清共同接种细胞后，测定C3亚型毒株制备的小鼠免疫血清对母本毒株和C4基因型毒株反应性无显著差别，C3亚型毒株制备的小鼠免疫血清在适量浓度时可对选取的C3、C4基因型毒株同时具有抑制作用，初步说明选取的泰安地区的C3亚型与C4亚型毒株间可能不存在抗原性变化。结合所选取的C3和C4基因型SFTSV的糖蛋白Gn/Gc以及核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)上氨基酸位点差异分析，糖蛋白Gn/Gc和非结构蛋白(NSs)上氨基酸位点没有引起SFTSV抗原性显著的改变，但核蛋白(NP)上的氨基酸差异位点是否对不同基因型SFTSV抗原性差异产生影响还不明确，但本部分实验仅筛选了C3亚型毒株和C4亚型毒株间的抗原抗体保护性，关于其它亚型SFTSV毒株间的抗原的差异性需要进一步研究。51 泰山医学院硕士学位论文小结51、SFTSV在传至5-6代时病毒滴度能够达到1×10TCID50/0.1ml至1×7.510TCID50/0.1ml。2、C3亚型的毒株制备的小鼠免疫血清同时对C4亚型毒株具有生长抑制作用，C3亚型毒株和C4亚型毒株间，基因组特征的不同尚没有形成SFTSV抗原位点明显的差异特征。3、分离自泰安地区的C3亚型SFTSV毒株和C4亚型毒株间氨基酸序列位点差异尚不能引起病毒抗原性差异。52 泰山医学院硕士学位论文附录发热伴血小板减少综合征（SFTS）疑似病人调查表一、基本信息1.患者姓名：_________（如患者年龄<14岁，则家长姓名：_______）2.性别：1男，2女□3.年龄：_____岁4.民族：1汉族，2回族，3维吾尔族，4其他少数民族□5.职业：____________________6．所在单位：_____________________；联系电话：_________________7．家庭住址：泰安市____区（县）_____乡（镇/居委会）____村（街道）二、发病情况1.发病日期：_______年______月_______日2.就诊日期：_______年______月_______日3.住院医院：___________；科室：__________；住院号：____________4.住院日期：_______年______月_______日5.出院日期：_______年______月_______日6.转归：1痊愈，2好转，3死亡（日期：____年____月____日）□三、症状和体征及一般实验室检查1发热：1有，0无；入院体温：____℃；最高体温：____℃□2.关节痛：1有，2无□3肌痛：1有，2无□4.消化道症状（腹泻、便秘、恶心、呕吐）：1有，2无□5.黄疸：1有，2无□6.少尿或无尿：1有，2无□7.白细胞计数：1正常，2增多，3减少，4未做此项检查□8.血小板减少：1有，2无，3未做此项检查□9IgG增高：1有，2无，3未做此项检查□10IgM增高：1有，2无，3未做此项检查□11.尿蛋白：1阳性，2阴性，3未做此项检查，4不详□53 泰山医学院硕士学位论文参考文献[1]YuXJ,MFLiang,SYZhang,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirusinChina[J].NEnglJMed,2011，364（16）：1523-1532.[2]LiD.AhighlypathogenicnewbunyavirusemergedinChina[J].EmergMicrobesInfect，2013,2(1):el.[3]LiuS,CChai,CWang,etal.Systematicreviewofseverefeverwiththrombocytopeniasyndrome:virology,epidemiology,andclinicalcharacteristics[J].RevMedVirol,2014,24(2):90-102.[4]GuuTS,WZheng,YJTao.Bunyavirus:structureandreplication[J].AdvExpMedBiol,2012,726:245-266.[5]卢静,李川,张福顺,等.发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒结构和非结构蛋白表达研究[J].病毒学报,2011,(6):515-520.[6]李昱,周航,牟笛,等.中国2011-2014年发热伴血小板减少综合征流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2015,36(6):598-602.[7]McMullanLK,SMFolk,AJKelly,etal.AnewphlebovirusassociatedwithseverefebrileillnessinMissouri[J].NEnglJMed,2012,367(9):834-841.[8]TakahashiT,KMaeda,TSuzuki,etal.ThefirstidentificationandretrospectivestudyofSevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeinJapan[J].JInfectDis,2014,209(6):816-827.[9]KimKH,JYi,GKim,etal.Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome,SouthKorea,2012[J].EmergInfectDis,2013,19(11):1892-1894.[10]刘力,官旭华,邢学森,等.2010年湖北省发热伴血小板减少综合征的流行病学分析[J].中华流行病学杂志,2012,33(2):168-172.[11]LiuK,HZhou,RXSun,etal.Anationalassessmentoftheepidemiologyofseverefeverwiththrombocytopeniasyndrome,China[J].SciRep,2015,5:9679.[12]ParkSW,BGSong,EHShin,etal.PrevalenceofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirusinHaemaphysalislongicornisticksinSouthKorea[J].TicksTickBorneDis,2014,5(6):975-977.[13]YasukawaM.[Severefeverwiththrombocytopeniasyndrome,anemerginginfectiousdiseaseforhematologists][J].RinshoKetsueki,2015,56(1):3-8.[14]姜晓林,王显军,李建东,等.家养动物体表蜱中发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离及鉴定[J].病毒学报,2012,(3):252-257.[15]刘洋,黄学勇,杜燕华,等.河南发热伴血小板减少综合征流行区蜱类分布及媒54 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泰山医学院硕士学位论文综述发热伴血小板减少综合征病毒流行病学及检测方法的最新研究进展吕强综述史卫峰审校摘要：2006年以来，在我国中东部农村地区报道了一种不明原因的以发热、血小板减少综合征、白细胞减少综合征为主要临床表现的发热伴血小板减少综合征病(severe[1,2]feverwiththrombocytopeniasyndrome,SFTS)。直到2010年，由我国学者在上述病人体内分离出一种新型布尼亚病毒，命名为发热伴血小板减少综合征病毒(severe[1]feverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus)。SFTSV感染病人后无明确潜伏期，一般认为在1周到2周时间内，急性发病，主要症状为发热、胃肠道症状、肌肉酸痛，查体可见浅表淋巴及肿大，实验室检查结果中，最常见血小板降低、白细胞降低、肝功能异常、肾功能异常，少数重症患者可因为多器官功能衰竭而死亡，报告病[3]死率为2.5%～30%，平均为10%。该病毒在我国首次发现后，随后在我国的山东省、江苏省、安徽省等10余个省份实验室确诊发现，韩国、日本也分别发现该病毒流行，[4-7]美国也出现该病类似病例。根据疾病的流行病学研究提示，该病毒可能因为蜱虫叮咬而进行传播，长角血蜱为最可能的传播媒介，也有报道，部分病例可因为接触感[8,9]染病人血液感染病毒。目前尚没有针对该病毒有效的治疗药物和手段，疫苗研发也有待展开。为了提高针对该病毒的防控意识、了解SFTSV的致病特性及防控手段，本研究总结分析了SFTSV的病原学特征、流行病学规律、传播途径和检测手段等方面研究进展。关键词：发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)；流行病学；检测方法1SFTSV的病原学特征SFTSV属于布尼亚病毒科、白蛉病毒属，与布尼亚病毒科其它成员类似，该病[1]毒为分节段的单股负链RNA病毒。电子显微镜下，病毒大小在80-120nm之间，病毒呈现颗粒球形，表面具有糖蛋白凸起（Gn和Gc组成），位于双层脂质包膜内。病毒基因组结构根据其片段大小分为大（L）、中（M）、小（S）3个片段，序列[1,10]末端具有反向互补特性，在氢键连接下呈现"锅柄状"的双链结构，形成环状RNA。病毒基因组3个片段具有不同功能，能够编码4种蛋白，L片段编码RNA依赖的RNA58 泰山医学院硕士学位论文聚合酶(RNA-dependentRNApol-ymerase,RdRp)，M片段编码C端糖蛋白(glycoprotein，Gc)和N端糖蛋白(glycoprotein，Gn)的前体蛋白，S节段为双义RNA链，分别编码N端正向编码核蛋白(nucleoprotein，NP)和C端反向编码非结构蛋白[1,11](non-structureSprotein，NSs)。SFTSV与其它布尼亚病毒科成员相比，其基因组序列和氨基酸高度不同，L片段和M片段氨基酸同源性位于21％~36％之间，S片段[1]最为保守，氨基酸同源性最高41％左右。2SFTSV的流行病学特征2.1时间分布SFTS病例发病多在春夏两季，具有明显的季节性，一般3月份开始有病例报道，随后病例数逐渐增多，一般在在5-7月份达到高峰，随后病例下降，在9月到10月份又重新增多，10月份又新成一个新的高峰期，随后下降，一直持续到当年至11月[4,12,13]份，12月份到次年2月份为该疾病静息期。全国各地发病高峰期略有差异，随[14]纬度增高流行趋势后移。韩国地区的流行高峰期为6月份，流行时间在5月到10[6]月。2.2人群分布在对2011年到2014年期间，我国23个省份的5352例SFTS病例报告中，病例主要为中老年人，年龄主要介于50~70岁，男女性别比为1:1.15，差异没有统计学意[4]义，但是部分地区在性别分布上女性多与男性，如浙江和河南省。发病病例大部分[4,8]常年居住多山地丘陵的农村地区，以农业和畜牧业为主要劳动收入。在韩国地区，其SFTS病例人群分布与我国相似，有80%病例年龄超过80岁，其年龄中位数M=69，[15]大部分病例居住在农村地区，以农业和畜牧业为主要劳动收入。2.3地区分布SFTSV首次在我国河南地区报道，随后在我国多个省市确诊了该病例存在，在2011年到2014年期间，我国有23个省份病例报告5352例SFTS病例，其中16个省份地区的实验室确诊了2750例，病例主要的集中地区，以河南省最多，比例达到[4]41.2%，其次分别为山东省、湖北省、安徽省、辽宁省、浙江省和江苏省。报告病例大部分分布在居住在山地丘陵的农村地区，当地气候湿润，植被茂密丰盛，适合多种媒介生物的生长繁殖活动，野生动物和家养动物身上常有蜱虫寄生，提示病毒感染[16]与生活环境密切相关。日本在2013年首次确诊了SFTS，其研究人员对日本地区病例回溯性调查中发59 泰山医学院硕士学位论文[5,17]现，日本最早SFTS病例可追溯至2005年。截止到2016年，在日本的四个主要[18]岛屿地区都有报道SFTS病例，发病例数达到170人。韩国在2012年首次报道SFTS[6]病例，随后病例数在韩国呈现增多趋势，大部分病例居住在相对温暖的南方地区。[7]此外，在美国的密苏里州也发现的Heartland病毒与SFTSV高度相似。3SFTSV的传播3.1传播媒介布尼亚病毒一般在节肢动物体内生长繁殖，脊髓动物为扩大宿主，多种节肢动物可能为该病毒的自然宿主，SFTSV最有可能的传播媒介为蜱虫，尤其以长角血蜱为[19,20]主。在中国的部分SFTSV流行地区，有研究人员在蜱虫体内检测到病毒核酸阳性，并且分离出SFTSV毒株，在SFTSV流行韩国和日本的部分地区的蜱虫体内，也[22-24]有检测到SFTSV的核酸阳性报道。分离自蜱虫体内的毒株与人源毒株同源性能[1,25]够达到99%以上，从而在分子流行病学角度阐明病毒感染与蜱虫关系密切。蜱虫多生长繁殖于温暖湿润的山地丘陵地区，主要在林木草地上活动，其活动性和生长密度与SFTS病例数的时间增减一致，且部分病例有明确的蜱虫叮咬史，从而提示了蜱[4,8]虫为SFTSV最有可能的传播媒介。除了蜱虫外，有研究者在江苏地区野外脊椎动物身上的螨虫体内检测到了SFTSV核酸阳性，河南地区的虻体内也检测到病毒核酸[1,8,21]阳性，目前尚没有在蚊子等体内检测到SFTSV核酸。另外，在我国的山东省、江苏省、河南省多省地区报道了SFTS病例间的人际接触传播，通过接触确诊SFTS[9,26,27]病例的血液或者血性分泌物等可以导致人与人之间传播。3.2宿主动物SFTSV通过其在媒介生物和动物宿主中循环传播机制在自然界中生长繁殖，人类可能为该病毒传播过程中的偶然宿主。SFTSV可以感染蜱虫生长的各个阶段，且可以通过蜱虫的卵传播，携带有SFTSV的蜱虫可以在叮咬脊椎动物后引起动物病毒血症，无SFTSV的蜱虫又通过叮咬感染SFTSV动物后携带病毒，如此循环，使病毒[20]在自然界中传播。在我国湖北、山东、河南等省份SFTS流行地区，对家养动物进行血清流行病学调查研究显示，多种家养动物体内抗体阳性，阳性率最高的为羊，部分地区山羊抗体[12,阳性率能够达到70%，此外，常见的抗体阳性家养动物还包括，牛、豪猪、狗和鸡28-30]。在上述研究中，通过对动物血清检测SFTSV核酸，阳性率很低，仅有1.%～5.3%的动物血清中检测出，然而从动物血清中分离出的SFTSV的S片段与人源毒株的S60 泰山医学院硕士学位论文[30]片段比对后发现，其序列高度同源，能够达到95%以上。因此，家养动物很有可能为SFTSV的中间宿主，并扩大了病毒的传播范围。此外，有研究发现，在中国、韩国、日本的毒株基因组序列高度同源，各个地区的SFTS病例分布与长角血蜱的活动空间、鸟类的迁徙途径高度相关，因此认为，鸟类也有可能为病毒的扩大宿主，并[24]使病毒可以进行长距离的跨地域传播。4检测手段4.1临床确诊当临床病人以不明原因的发热伴随血小板减少综合征、白细胞减少综合征，实验室检测有肝功能、肾功能损害时，少数病例会出现肌痛、关节疼痛和浅表淋巴结肿大等症状。当临床遇见疑似病例时，需要结合病人的居住环境是否多植被分布和是否有蜱虫叮咬史来进行初步诊断，当满足以下三点中任何一个条件时，可以确诊病例感染SFTSV：一、通过分子实验手段检测到病人血清中SFTSV核酸阳性；二、病人血清[2,31]中检测到SFTSV抗体阳性；三、在实验室成功从病人血清中分离出病毒。4.2病毒分离SFTSV可通过非洲绿猴肾细胞（Vero）进行分离，该细胞在感染早期阶段不产生明显变化，但随着病毒生长繁殖滴度的提高，病毒感染细胞细胞使其出现明显病变的时间逐渐加快，细胞由胞质饱满、轮廓清晰的椭圆形变成瘦长、柳叶刀形改变，部[1,32]分细胞胞核皱缩、变圆、脱落、死亡。该病毒还可以通过DH82细胞进行分离培[1]养，病毒感染细胞后早期便能够引起细胞病变。通过细胞对病毒进行分离培养，准确性高但是分离周期长，实验条件要求高，通常适应于高校科研院所研究培养。4.3血清学检测现有检测手段中，免疫荧光技术（IFA）可用于SFTS病人阳性抗体阳性血清鉴定。将SFTSV接种于Vero细胞培养后，制备成抗原片，二抗采用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗人IgG抗体，建立IFA方法。IFA方法灵敏度高，特异性在70%以[33]上。也有研究人员，通过建立的双抗原夹心ELISA法，包被和标记自制的NP蛋[29]白，检测SFTSV总抗体，灵敏度100%，特异性高。4.4核酸检测在现有的临床诊断SFTSV过程中，核酸检测为最常用的手段，其优点特异性强，时间短，实验要求相对较低。目前，检测手段主要是针对SFTSV的L、M、S序列进行普通PCR和荧光定量PCR检测。有研究人员采用荧光定量PCR方法，检测其检61 泰山医学院硕士学位论文测病毒核酸下限，其结果相对于普通RT-PCR方法，实时荧光定量PCR灵敏度更高，[34]特异性更好。也有研究人员，针对病毒的L、M、S序列设计巢式PCR引物后，分析不同引物的扩增效率，并检测了血清采集时间与与病毒检测率的相关性，结果分析后，病毒的S片段扩增效率更高，没有扩增出M片段。在采集病人血清时间点上，[35]第7天时和7到14天检测率相似。除此之外，还有反转录环介导的等温扩增技术用来检测病毒核酸，该技术检出时间短，30min内就可以通过颜色变化来确定是否有[36]病毒核酸分子。随着当前SFTSV流行范围的扩大，检测方式的成熟化，积极加强SFTSV的致病机制、治疗药物筛选及疫苗研发等工作，提高临床治疗手段，对于SFTS防控和治疗有着重要的意义。参考文献[1]YuXJ,LiangMF,ZhangSY,etal.FeverwiththrombocytopeniaassociatedwithanovelbunyavirusinChina[J].NEnglJMed,2011,364(16):1523-1532.[2]LiD.AhighlypathogenicnewbunyavirusemergedinChina[J].EmergMicrobesInfect,2013,2(1):e1.[3]LiuS,CChai,CWang,etal.Systematicreviewofseverefeverwiththrombocytopeniasyndrome:virology,epidemiology,andclinicalcharacteristics[J].RevMedVirol,2014,24(2):90-102.[4]李昱,周航,牟笛,等.中国2011-2014年发热伴血小板减少综合征流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2015,36(6):598-602.[5]TakahashiT,MaedaK,SuzukiT,etal.ThefirstidentificationandretrospectivestudyofSevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeinJapan[J].JInfectDis,2014,209(6):816-827.[6]ParkSW,HanMG,YunSM,etal.Severefeverwiththrombocytopeniasyndromevirus,SouthKorea,2013[J].EmergInfectDis,2014,20(11):1880-1882.[7]McMullanLK,FolkSM,AJKelly,etal.AnewphlebovirusassociatedwithseverefebrileillnessinMissouri[J].NEnglJMed,2012,367(9):834-841.[8]刘洋,黄学勇,杜燕华,等.河南发热伴血小板减少综合征流行区蜱类分布及媒介携带新布尼亚病毒状况调查[J].中华预防医学杂志,2012,46(6):500-504.[9]GaiZ,LiangM,ZhangY,etal.Person-to-persontransmissionofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirusthroughbloodcontact[J].ClinInfectDis,2012,54(2):249-252.62 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泰山医学院硕士学位论文[24]YunY,STHeo,GKim,etal.PhylogeneticAnalysisofSevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeVirusinSouthKoreaandMigratoryBirdRoutesBetweenChina,SouthKorea,andJapan[J].AmJTropMedHyg,2015,93(3):468-474.[25]姜晓林,王显军,李建东,等.家养动物体表蜱中发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒分离及鉴定[J].病毒学报,2012,(3):252-257.[26]JiangXL,SZhang,MJiang,etal.Aclusterofperson-to-persontransmissioncasescausedbySFTSvirusinPenglai,China[J].ClinMicrobiolInfect,2015,21(3):274-279.[27]TangX,WWu,HWang,etal.Human-to-humantransmissionofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirusthroughcontactwithinfectiousblood[J].JInfectDis,2013,207(5):736-739.[28]张文帅,曾晓燕,周明浩,等.江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒血清流行病学调查[J].疾病监测,2011,26(9):676-678.[29]JiaoY,XZeng,XGuo,etal.Preparationandevaluationofrecombinantseverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirusnucleocapsidproteinfordetectionoftotalantibodiesinhumanandanimalserabydouble-antigensandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay[J].JClinMicrobiol,2012,50(2):372-377.[30]宫连凤,姜梅,刘娟,等.山东省烟台市人与动物新型布尼亚病毒感染调查及同源性分析[J].中华流行病学杂志,2014,35(5):524-527.[31]中华人民共和国卫生部.发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)[J].中华临床感染病杂志,2011,04(4):193-194.[32]刘芸,姚文清,耿英芝,等.辽宁省首次发现的新布尼亚病毒其培养特性的研究[J].中国人兽共患病学报,2012,28(3):237-240.[33]黄学勇,杜燕华,李幸乐,等.新布尼亚病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立[J].中华预防医学杂志,2012,46(2):165-168.[34]SunY,MLiang,JQu,etal.EarlydiagnosisofnovelSFTSbunyavirusinfectionbyquantitativereal-timeRT-PCRassay[J].JClinVirol,2012,53(1):48-53.[35]迟媛媛,翟慎勇,温红玲,等.发热伴血小板减少综合征患者血清中新型布尼亚病毒RNA的检测[J].山东大学学报医学版,2012,50(11):118-121.[36]CuiL,YGe,XQi,etal.Detectionofseverefeverwiththrombocytopeniasyndromevirusbyreversetranscription-cross-primingamplificationcoupledwithverticalflowvisualization[J].JClinMicrobiol,2012,50(12):3881-3885.64 泰山医学院硕士学位论文致谢研究生三年的光阴转瞬即逝，在邻近毕业之前，在内心由衷的感谢陪我度过这最为充实、也最为快乐3年时间里，每一个帮助过我、指导过我的人。深深的感谢我的硕士研究生导师史卫峰教授，十分幸运在他的指导下开展了3年严谨的研究工作，让我在短期内极大地开阔了视野、领略了科研的魅力、形成了严谨认真的工作态度，导师高水平的自我要求和工作态度在潜移默化中深刻影响着我的成长。衷心的感谢病原生物所生物安全二级实验室张振杰老师、李娟老师、周宏老师和胡弢老师在我实验过程和课题进展中遇到困难时耐心细致的讲解和帮助，因为你们的帮助，使我在这3年里得以快速完成我的实验和论文工作。衷心的感谢病原生物研究所的张忠、赵英会、于广福、李晓霞和庄东明等老师在我这3年学习期间，给予我的帮助和关心。感谢我的师哥师姐们，李岩师兄、王海明、陈丹、刘婧、程颐师姐等在我初入实验室时对我实验和生活上的帮助和指导，成为我3年研究工作的领路人，更给我3年的研究生生活留下了温暖的回忆。感谢与我朝夕陪伴的同学董兆鹏在我学习和实验中给予的支持；感谢我的舍友李泰、刘家志、陈敏捷呈在生活上给与我的关心与照顾，让自己的研究生生活充满了乐趣。感谢我师弟师妹们，王敏、王倩、刘霞、张兴成、刘晓婷，你们的到来带给实验室更多的支持和帮助。最后，由衷的感谢我的家人和女朋友张伟伟在我读研期间一直给我的鼓励和支持，他们的希望和寄托，也会成为我一直努力向前最大的动力。65 泰山医学院硕士学位论文攻读学位期间发表的学术论文第一作者发表论文：[1]LvQ,ZhangH,TianL,etal.NovelSub-lineages,RecombinantsandReassortantsofSevereFeverwithThrombocytopeniaSyndromeVirus[J].TicksTickBorneDis,2017,8(3):385-390.（IF=2.87）参与作者发表论文：[1]王海明，陈占强，张振杰,等.l.2.3.2.1c家系H5N1禽流感病毒在我国持续传播与进化[J].中国病原生物学杂志,2016,(2):97-102.（第四作者）[2]LiuJ,YSun,WShi,etal.ThefirstimportedcaseofRiftValleyfeverinChinarevealsageneticreassortmentofdifferentvirallineages[J].EmergingMicrobes&Infections,2017,6(1):e4.（第十五位）[3]WangH,ZZhang,ZChen,etal.(2015).HighgeneticdiversityandfrequentgeneticreassortmentofinfluenzaA(H9N2)virusesalongtheEastAsia-Australianmigratoryflyway.[J]Infection,GeneticsandEvolution.39(2016)325–329.（第五位）参加会议：1、2014年10月上海首届全国病毒学青年学者学术研讨会,；2、2016年5月27日-6月03日深圳第一届国际媒介传染病会议；3、2016年12月09日-10日深圳第二届全国病毒学青年学者学术会议，口头报告;4、2016年12月26日北京面向精准医学的微生物组学及其应用高峰论坛。66
