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分类号：密级：UDC：学号：406520713433南昌大学硕士研究生学位论文外周血淋巴细胞多巴胺D3受体作为帕金森病患者生物标志物的可能性研究StudyonthePossibilityofDopamineReceptorD3inPeripheralBloodLymphocytesasaBiomarkerforPatientswithParkinson'sDisease黄丽娟培养单位（院、系）：南昌大学第二附属医院指导教师姓名、职称：王卫东副教授申请学位的学科门类：医学学科专业名称：神经病学论文答辩日期：2016年5月答辩委员会主席：潘秉兴评阅人：李辉华余小骊2016年5月 一、学位论文独创性声明本人声明所早．交的学位论文足本人在导师指导下进巧的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加Ｗ柄注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得虛县去堂或其他教育机＾构的学位或证书而使用过的材料。与我同．＿１；作的同志对本研究所做的任何页献均已在论文中作了明确的说明并发示谢意。学位论文作者籍名（手写）：籍字Ｍ期言前巧：）則年６月二、学位论文版权使用授权书本学位论文作者壳全了解商呂大学有关仅留、使用学位论文的规定，同意学校巧权保留并向园家有关部口或机构送交论文的复印件和化－／版，允许论义ｌ被杳阅和借阅ｌ。本人授权南昌大学ｆｗ将学位论文的令部或部分内容编入有关数据库进行检索■，可ｙ采用影印、縮印或扫描等复制手段保存、汇编本学位讫文。同时投权北京方方数据股份有限公刮和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学化论文全文数据库》和《中国优秀博硕＋学位论文全文数据库“》中全文发表，并通过网络向社会公众提供倩息服务，巧意按章程＂规定享受相关权益。（学位论文作者签名（手写）昕爾导师谣名手写）：签字期：：円期；抑告年ｋ月签字知／＾／卡月ｋ鬥—论文题口济同拉前色捆Ｐ－脱复舍床作马啼達益耗怎焉丰颗梳帮斯嚇巧巧需姓Ｉ片名葦兩学号枯论文级别博硕：ｔ咱靖化犯７ＩＡ中巧院／系／所屋弯朦＾评好稳审备Ｅ化ｍａｉｌ祖公：开□保密＂（向校学位如申请获批准为保密，年＾巧后公开）１ 摘要摘要目的通过检测帕金森病患者外周血淋巴细胞多巴胺D3受体（DRD3）的表达，探讨外周血淋巴细胞DRD3表达在帕金森病的诊断和疾病监测中作为生物标志物的可能性，从而为帕金森病诊断和临床监测提供可靠的指导信息。方法对符合条件的帕金森病患者20名、其他神经系统退行性疾病患者6名及健康对照组12名进行资料和血液样本的采集，分离外周血中的淋巴细胞，提取总RNA，逆转录为cDNA，构建含目的基因DRD3及内参GAPDH片段的质粒标准品，用实时荧光定量RT-PCR的方法对样品的目的基因和内参基因进行绝对定量，再经比较分析：1）帕金森病患者、其他神经系统退行性疾病患者和健康对照组间DRD3mRNA的表达差异，2）服用与未服用左旋多巴和多巴胺受体激动剂的帕金森病患者间DRD3mRNA的表达差异，3）帕金森病患者DRD3mRNA的表达与年龄、病程和疾病严重程度的相关性。结果1、健康人外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平与年龄、性别无关；2、帕金森病患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平低于健康对照组以及其他神经系统退行性疾病患者，其他神经系统退行性疾病患者与健康对照组间DRD3mRNA表达水平无明显统计学差异；3、服用与未服用左旋多巴及多巴胺受体激动剂的帕金森患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平无明显差异；4、帕金森病患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平与年龄、病程、UPDRS-I和UPDRS-IV评分均无明显相关，与Hoehn&Yahr分级、UPDRS-II评分和UPDRS-III评分存在负相关，与SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分存在正相关。结论1、外周血淋巴细胞DRD3可作为协助诊断帕金森病的外周生物标志物。2、通过检测外周血淋巴细胞DRD3mRNA的表达变化有助于判断帕金森病的病情程度及监测帕金森病的进展。3、帕金森病患者疾病进程中外周血淋巴细胞多巴胺受体表达变化的研究对中枢多巴胺能系统的改变可能具有外周指示作用。II 摘要关键词：帕金森病外周血淋巴细胞多巴胺D3受体生物标志物实时荧光定量RT-PCRIII AbstractAbstractObjective1)ToinvestigatetheexpressionofdopamineD3receptor(DRD3)intheperipheralbloodlymphocytesofParkinson'sdisease.2)ToevaluatethepossibilityofDRD3asabiomarkerintheprocessofdiagnosisanddiseaseprogressionofParkinson'sdisease.3)ToprovideguidanceforthediagnosisandsurveillanceofParkinson'sdiseaseintheclinicpractice.MaterialsandmethodsWestudied20patientswithidiopathicPD,6age-matchedpatientswithotherneurodegenerativedisordersand12age-matchedhealthycontrols.Wecollected5mlbloodsamplesbyantecubitalvenipunctureandisolatedlymphocytes.TotalRNAswereextractedfromlymphocytesandreversetranscribedintofirst-strandcDNA.Thenweconstructedthestandardrecombinantplasmids.AbsolutequantitativerealtimeRT-PCRmethodwasusedtodetectthelevelofdopamineD3receptorexpressioninperipheralbloodlymphocytesinpatientswithPDorotherneurodegenerativedisordersandhealthycontrols.Finally,weevaluatedthedifferencesinthemeanvalueoftheDRD3/GAPDHbetweenPDpatients,patientswithotherneurodegenerativedisordersandhealthycontrols,betweenPDpatientstreatedwithorwithoutL-dopaordopaminereceptoragonists,andbetweenmenandwomen.Spearman’scorrelationandPearson’scorrelationwasusedtocomparetheDRD3/GAPDHandclinicalfeatures,includingage，durationofthediseaseandtheseverityofPD.Results1.TherewasnostatisticallysignificantdifferenceintheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipherallymphocytesbetweenmenandwomeninhealthycontrols,nocorrelationexistedbetweentheexpressionlevelofDRD3mRNAandage.2.TherewasasignificantdecreaseintheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipheralbloodlymphocytesofPDpatientscomparedwiththoseinotherIV Abstractneurodegenerativedisordersandhealthycontrols.However,therewasnoapparentdifferenceintheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipheralbloodlymphocytesbetweenotherneurodegenerativedisordersandhealthycontrols.3.NostatisticallysignificantdifferencewasobservedintheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipheralbloodlymphocytesbetweenPDpatientstreatedwithorwithoutL-dopaordopaminereceptoragonist.4.NocorrelationexistedbetweentheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipheralbloodlymphocytesofPDpatientsandage,durationofdisease，UPDRS-Iscore,UPDRS-IVscore.ButtherewasanegativecorrelationbetweentheexpressionlevelofDRD3mRNAinperipheralbloodlymphocytesandtheHoehn&Yahrstage，UPDRS-IIscore,UPDRS-IIIscore.TherewasapositivecorrelationbetweentheexpressionlevelofDRD3mRNAandSCHWAB&ENGLANDscoreinpatientswithParkinson’sdisease.Conclusion1.TheDRD3mRNAexpressioninperipheralbloodlymphocytesmaytosomeextentbeusedasanaccessiblebiochemicalmarkerforPDdiagnosis.2.PeripheralbloodlymphocytesDRD3mRNAexpressionlevelsmayhelptoevaluatetheseverityofPDandmonitortheprogressionofPD.3.TheassayofdopaminereceptorsinperipheralbloodlymphocytesduringPDdevelopmentmayprovideaperipheralindicatorofaltereddopaminergicfunction.Keywords：Parkinson’sdisease,dopamineD3receptor,peripheralbloodlymphocyte,biochemical,RealtimeRT-PCRV 目录目录第1章引言····················································································11.1PD患者外周血淋巴细胞生物标志物的研究···································11.2DRD3在PD发生发展中的作用·················································21.3实时荧光定量RT-PCR技术·······················································4第2章材料与方法···········································································52.1主要器材和试剂：·································································52.2样品采集·············································································62.2.1病史资料及外周血标本采集·············································62.3外周血淋巴细胞RNA的提取和cDNA的合成·······························72.3.1外周血淋巴细胞分离·······················································72.3.2外周血淋巴细胞RNA提取··············································72.3.3RNA浓度及纯度测定·····················································82.3.4cDNA的合成································································82.4引物设计与合成····································································92.5DRD3和GAPDH标准品质粒的构建··········································92.5.1PCR分别扩增DRD3和GAPDH长片段·······························92.5.2DRD3和GAPDHPCR产物胶回收····································102.5.3胶回收后PCR产物进行测序···········································102.5.4胶回收后的PCR产物及载体的连接··································102.5.5连接产物转化感受态细胞DH5α·······································102.5.6重组质粒的提取···························································112.6标准曲线的构建和绝对定量荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化·····························································································112.6.1标准品拷贝数的测定······················································112.6.2荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化·························112.7样品进行荧光定量PCR检测···················································13VI 目录2.8计算··················································································132.9数据的统计学处理································································13第3章结果··················································································143.1RNA纯度鉴定·····································································143.2荧光定量PCR方法可行性判断················································143.2.1扩增曲线····································································143.2.2荧光定量PCR产物的鉴定··············································153.2.3标准曲线····································································173.3数据统计结果······································································18第4章讨论··················································································224.1PD外周血淋巴细胞DRD3表达水平的变化及其意义····················224.2左旋多巴及多巴胺受体激动剂对DRD3的影响及意义····················234.3DRD3与各量表评分的关系及意义············································234.4DRD3与运动并发症的关系及意义············································244.5外周血淋巴细胞对研究PD的意义············································25第5章结论与展望·········································································265.1结论··················································································265.2不足与展望·········································································26致谢···························································································27参考文献·······················································································28附录···························································································32攻读学位期间的研究成果··································································43综述···························································································44VII 中英文对照表中英文对照表缩写词英文全称中文全称PDParkinson’sdisease帕金森氏病DRD3dopamineD3receptor多巴胺D3受体reversetranscriptionandpolymeraseRT-PCR逆转录PCRchainreaction1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyri（1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-MPTPdine四氢吡啶）UPDRSunifiedparkinson’sdiseaseratingscale统一帕金森病评定量表bpbasepair碱基对RNaseRibonuclease核糖核酸酶AmpAmpicillin氨苄青霉素VIII 第1章引言第1章引言帕金森病（Parkinson’sdisease，PD）是一种慢性进展性神经变性疾病，其确切病因尚未完全阐明。该疾病主要表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态障碍。近年来，随着我国人口老龄化进程的加剧，PD的发病率和患病人数呈现出逐年上升的态势。迄今为止，对该病的诊断以及病情的评估仍然有赖于临床症状以及对左旋多巴药物的疗效的观察。然而在疾病早期,PD的临床表现并不是很明显。当PD患者出现明显或典型临床症状时，绝大多数患者纹状体多巴胺浓度一般已较正常水平降低80%以上，因此PD的早期诊断是提高治疗效果及改善患者生活质量的关键，也是神经病学领域亟待解决的一个重要问题。明确与帕金森病相关的特异性生物标志物，将有助于帕金森病的诊断与治疗效果的监测。1.1PD患者外周血淋巴细胞生物标志物的研究受限于经济、技术以及文化等多种因素，直接检测PD患者颅内的多巴胺能系统的变化比较困难。而外周血容易获取，可以进行长期随访观察，且淋巴细胞往往表达多种神经递质受体。外周血淋巴细胞和黑质致密细胞有着相同的能够赋予多巴胺能细胞相应功能的分子体系，因此它们有可能表达诠释PD发病机制及并成为病情监测的灵敏指标[1,2]。这些都为外周血淋巴细胞中可能存在帕金森病生物标记物提供了理论依据。ButtarelliFR等在其发表的综述中也表达了自己的观点，他们认为外周血淋巴细胞能够成为研究神经精神疾病多巴胺能系统紊乱的细胞工具[3]。目前对PD患者外周血淋巴细胞上可能表达的生物标志物的研究主要包括多巴胺系统、胆碱受体、腺苷受体等[4-13]，对多巴胺系统的研究中，以对多巴胺转运体的表达水平和功能的研究最多。除前述相关生物分子外，人们还在外周血淋巴细胞上发现许多其他可能与PD有关的的外周生物分子，如苯二氮卓受体[14]、参与细胞凋亡的物质[15]和可能与PD发生有关的基因[16]等等，这些研究提示外周血淋巴细胞上可能存在能够诊断或监测PD的外周生物标志物。对于PD患者外周血淋巴细胞上DRD3表达量的变化的研究，Nagai等与1 第1章引言Barbanti等有过结果不一致的报道：Nagai等人用RT-PCR的方法发现PD患者外周血淋巴细胞上DRD3mRNA的表达水平低于健康人，且其表达水平与PD严重程度相关，服用与未服用左旋多巴的PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平无明显差异；而PieroBarbanti等用放射配体结合技术，得到与Nagai不同的结果，他们发现未服用左旋多巴的PD患者的外周血淋巴细胞DRD3表达水平增加，而服用左旋多巴后外周血而淋巴细胞DRD3表达水平较正常人低，DRD3的表达量与疾病严重程度无明显关系[17,18]。两者研究结果不同可能是检测方法差异所致，他们所用的检测方法均存在一定的缺点。Nagai所用的RT-PCR进行定量的方法是对样品PCR后的终产物进行定量，样品目的基因经数十次循环扩增后，微小误差会呈指数放大，这时用最终的定量结果来反映样品初始的目的基因量可能会有较大误差。在GalinaP.Kirillova等的实验研究中认为，因外周血淋巴细胞中多巴胺受体表达量低且不恒定，所以使用放射配体结合试技术检测其多巴胺受体的结果与荧光定量PCR结果并不一致，他认为利用放射配体结合技术检测外周血淋巴细胞中表达量低且表达不恒定的多巴胺受体是不合适的[19]。这也可能解释了Nagai和Barbanti等人用不同方法检测PD患者外周血淋巴细胞DRD3表达变化结果不一致的现象。1.2DRD3在PD发生发展中的作用PD的发生与黑质致密区多巴胺能神经元大量变性、丢失有关。在中枢神经系统内，多巴胺需通过作用于多巴胺受体来发挥作用。根据对腺苷酸环化酶作用的不同，将多巴胺受体分为多巴胺D1样受体和多巴胺D2样受体，多巴胺D1样受体包括多巴胺D1受体和多巴胺D5受体两种亚型，它们主要与与腺苷酸环化酶正性偶联，激活腺苷酸环化酶，使细胞内环化腺苷酸水平升高；多巴胺D2样受体又分为多巴胺D2、D3、D4三种亚型，主要与腺苷酸环化酶负性偶联，抑制腺苷酸环化酶，使细胞内环化腺苷酸水平降低[20,21]；这两种受体的相互协调作用维持着机体内源性神经递质网络的稳定和平衡，调控着机体的相关生理活动[22]。正常情况下，脑内DRD3主要表达于腹侧纹状体（伏隔核，Calleja岛，嗅结节）[23,24]，而少量表达于背外侧纹状体，它与情绪、认知、精神、运动控制等关系密切。2 第1章引言两个独立的研究表明，DRD1和DRD3能够形成二聚体[25,26]，DRD1和DRD3的协同作用也通过行为学实验得到了证实，DRD1的激活可刺激运动行为，而DRD3所扮演的角色目前并不明确[27]。在利血平治疗的小鼠模型中，DRD3激动剂能使DRD1的激动作用增强，而D2受体激动剂并无此作用，使用DRD3拮抗剂后DRD3激动剂的增强作用有被抵消，而DRD3基因敲除小鼠并无此反应[28]，这进一步证实D1-D3二聚体的存在，且该二聚体的形成使DRD3能与DRD1共同协调机体的运动行为。目前认为，D1-D3二聚体的协同作用与药物成瘾和PD患者长期服用左旋多巴诱导的异动症进程有关[29]。在对DRD3基因敲除的小鼠的研究中发现DRD3基因敲除并不影响多巴胺的基本功能，但影响多巴胺功能的调节[30-32]，因此我们认为DRD3是脑内多巴胺功能的辅助调节器。且多个研究均发现DRD3与运动有着密切的联系[33]。对于PD患者颅内DRD3的表达变化，1996年MichielJ.Hurley等研究发现PD患者基底节DRD3表达水平与健康人无明显区别[34]，然而1998年HanL.Ryoo等发现PD患者纹状体内DRD3表达水平比健康人低[35]。2003年，ErwanBézard利用MPTP毁损的猕猴PD模型对其脑内DRD3的表达进行研究，发现出现PD样症状的猕猴颅内尾状核中DRD3受体表达水平较正常猕猴低，但在服用左旋多巴后该部位的DRD3的表达出现代偿性增加，该研究结果与先前对出现PD样症状的大鼠的研究[36,37]及MPTP损毁的猕猴的研究[38,39]结果一致；对于长期服用左旋多巴出现异动症的猕猴，其颅内豆状核和苍白球内侧DRD3表达水平明显增加，甚至高于正常猕猴。综上所述，对大鼠、小鼠、猕猴和人的研究均表明，DRD3与PD的发生和发展密切相关，且可能在PD异动症的产生中起着重要作用。GalinaP.Kirillova等将大脑与外周血淋巴细胞中的各种多巴胺受体的表达量分别进行比较，发现外周血淋巴细胞并不表达DRD1受体，外周血淋巴细胞中的DRD3与DRD4的表达量与大脑中的表达量相当，而外周血淋巴细胞DRD5的表达量比大脑低10-200倍，外周血淋巴细胞DRD2则比大脑中低100-1000倍[19]。由此可见，对于表达量变化的研究，与DRD2和DRD5相比，外周血淋巴细胞DRD3与DRD4或许更能体现大脑中多巴胺受体表达水平的变化。对于PD患者外周血淋巴细胞上DRD3表达量的变化的研究，Nagai等和PieroBarbanti分别用RT-PCR和放射配体结合分析的方法进行研究分析，结果并不一致[17,18]。GalinaP.Kirillova等[19]认为，对于低表达的多巴胺受体的检测，使3 第1章引言用real-timeRT-PCR方法更为合适。因此，为了进一步明确外周血淋巴细胞DRD3作为诊断及监测PD的外周生物标志物的可能性及意义，我们此次实验使用更加准确可靠的检测方法——绝对定量的实时荧光定量RT-PCR技术对其进行研究。1.3实时荧光定量RT-PCR技术实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加，通过对PCR扩增反应中每一次循环产物荧光信号的实时监测，实现对起始模板的定性和定量分析。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物的对数与起始模板量之间存在线性关系，在这个阶段设置一个值，一般为3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍为荧光阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光阈值时所经历的循环数称为Ct值。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板的起始拷贝数越高，其Ct值越小。利用实时荧光定量PCR的方法对样品进行定量分析的方法有两种，相对定量和绝对定量。相对定量是指检测出样本中目的基因相对于另一样本的含量，而不知道目的基因在每个样本中的拷贝数，此方法可作标准曲线，也可不作。绝对定量荧光定量PCR就是利用已知起始拷贝数的标准品进行等倍比梯度稀释，与未知样品同时进行荧光定量PCR反应，用标准品的Ct值为纵坐标，标准品起始拷贝数的对数为横坐标作出标准曲线，将未知样品的Ct值代入标准曲线中，即可获得未知样品目的基因的起始拷贝数。实时荧光定量RT-PCR是指RNA在反转录成cDNA后进行的实时荧光定量PCR反应。因此，我们在本实验中采用绝对定量的实时荧光定量RT-PCR的方法对PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA进行绝对定量，以更准确的分析出PD患者外周血淋巴细胞DRD3的表达变化，及其与疾病严重程度的关系，评估PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的水平与其他神经系统退行性疾病和健康人的差异，并进一步探索PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的水平，以指导PD的诊断和病情的监测。4 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1主要器材和试剂：主要器材：仪器厂家低温高速离心机美国ThermoScietiFIC微量离心机QILINBEIERABI7900HT荧光定量PCR仪AppliedBiosystems净化工作台上海智城振荡器其林贝尔Milliporemilli-QIntegralSC-3616超纯法国Millipore水系统低速离心机安徽中科中佳无核酶EP管、枪头Axygen荧光定量96孔板及封膜ThermoFisherNanoDrop2000紫外微量分光光度计Thermo普通PCR仪Mycycler公司主要试剂：试剂厂家TRIzolInvitrogen，美国RealltimePCRMasterMix(SYBR®TaKaRaPremixExTaq™II）氯仿南京化试，中国异丙醇南京化试，中国75%乙醇南京凯基，中国逆转录试剂TakaraDNALoadingBufferTakaradl1000DNAMarkerTakara胶回收试剂盒OMEGA5 第2章材料与方法pGEM-TEasyVectorSystemsPromega质粒提取试剂盒OMEGApGEMX-TEasy载体连接试剂盒Promega2.2样品采集2.2.1病史资料及外周血标本采集此次研究对象为2015年3月至2015年12月至我院门诊或住院治疗的帕金森病患者20名，其他神经系统退行性疾病患者6名，以及健康志愿者12名。每组均符合相应的入选和排除标准。PD组入选标准：符合英国帕金森病协会脑库诊断标准的帕金森病患者，尚未接受任何抗PD药物的治疗或连续服用左旋多巴制剂或多巴胺受体激动剂时间大于3月。PD组排除标准：1、曾经接受手术或γ刀治疗的原发性PD；2、伴其他神经系统疾病；3、伴严重的心、肝、肾等脏器器质性损害者；4、合并精神分裂症或其他重症精神病患者。其他神经系统退行性疾病组入选和排除标准：1、年龄、性别与PD组匹配；2、有PD外的其他神经系统退行性疾病；3、未服用左旋多巴、多巴胺受体激动剂；4、无严重精神疾病及内科严重疾病的健康成人。健康对照组入选和排除标准：1、年龄、性别与PD组匹配；2、无神经系统疾病、严重精神疾病及内科严重疾病的健康成人；3、无帕金森病家族史。对符合标准的受试者进行基本情况的采集，并采集PD组的起病情况、病程、临床症状、用药等临床资料。20位PD患者均进行统一帕金森病评定量表(UPDRS)评分、SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表和Hoehn-Yahr分级，Hoehn-Yahr分级为1级的PD患者1名，1.5级的PD患者5名，2级的PD患者5名，2.5级的PD患者3名，3级的PD患者2名，4级的PD患者4名，5级的PD患者0名。其他神经系统退行性疾病组包括1名进行核上性麻痹患者，1名多系统萎缩患者，1名肝豆状核变性患者，1名橄榄脑桥小脑萎缩患者，2名阿尔茨海默病患者。受试者性别和年龄信息见表1。采集符合条件的受试者清晨空腹时的外周静脉血5ml至抗凝真空采血管中。6 第2章材料与方法表2.1受试者性别和年龄信息组别例数性别（男/女）年龄（均数±标准差）PD组2011/969.1±7.90其他神经系统退行性疾病64/260.3±14.1健康对照组127/565.5±9.172.3外周血淋巴细胞RNA的提取和cDNA的合成2.3.1外周血淋巴细胞分离对采集的外周血及时进行如下外周血淋巴细胞分离步骤：1、向15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液。2、将血液混匀，将采血管倾斜约45度，缓慢加入装有淋巴细胞分离液的离心管中，使血液悬浮于淋巴细胞分离液之上。3、将离心管置于离心机中离心，2500转/分，离心30分钟。4、离心后离心管内由上至下细胞分四层。第一层为血浆，第二层为白色淋巴细胞层，第三层为透明的淋巴细胞分离液层，第四层为红细胞层。小心提取中间白色薄层于另一离心管中。5、用4000转/分，离心5分钟，弃上清留底部。如底部有可见红色沉淀，加入5ml红细胞裂解液，吹打混匀，于冰上静置10分钟，置于离心机中离心，4000转/分，离心5分钟。6、弃上清留底部沉淀，即淋巴细胞。2.3.2外周血淋巴细胞RNA提取RNA的提取在超净台中进行，所有无核酶枪头、试管在使用前均经高温高压和烘干处理。在操作过程中戴口罩、帽子和手套，并且勤换手套，避免RNA被RNA酶降解。外周血淋巴细胞RNA提取步骤如下：1、向淋巴细胞沉淀中加入1mltrizol反复吹打混匀。2、将混合液置于1.5mlEP管中，加入200ul氯仿，盖紧EP管，反复用力摇晃，静置5分钟，置于低温高速离心机中，4℃，13000g/分,离心15分钟，EP管内分三层。7 第2章材料与方法3、小心吸取上层水相约500ul至另一EP管中。加入等体积异丙醇，混匀后于4℃冰箱静置30min，后置于低温高速离心机中4℃，13000g/分，离心10分钟。离心后可见EP管底有少量白色沉淀。4、小心倒掉上清，留取沉淀。加入1ml的75%乙醇（预冷），震荡、洗涤RNA沉淀一次，后4℃，13000g/分,离心5分钟。5、小心倒掉上清，留取沉淀。加入1ml的无水乙醇（预冷），后4℃，13000g/分离心5分钟。小心倒掉上清，将沉淀置于超净台开风机风干，约10分钟。6、根据沉淀的量再在管中加入5-20ul的RNA溶解水将沉淀完全溶解。2.3.3RNA浓度及纯度测定取2μlRNA样品用紫外微量分光光度计检测所提取的RNA的A260/280值及浓度。2.3.4cDNA的合成2.3.4.1去除基因组DNA反应此步骤在冰上操作，并按如下成分配制反应混合液于200ulEP管中。试剂使用量5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA1.0μlRNaseFreedH2Oupto10μl反应条件：42℃，2min（或者室温5min*2），后4℃静置。2.3.4.2反转录反应此步骤在冰上操作，并按如下成分配制反应混合液于已去除基因组DNA的反应混合液中，轻轻离心混匀后立即进行反转录反应。试剂使用量步骤1的反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μlRTPrimerMix1.0μl5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）4.0μlRNaseFreedH2O4.0μlTotal20μl8 第2章材料与方法反应条件：37℃，15min，后85℃，5sec，最后4℃静置。将逆转录后的cDNA分装后-80℃保存。2.4引物设计与合成根据DRD3和GAPDH的mRNA序列设计2对长片段扩增序列，分别扩增DRD3和GAPDH序列，用于制备质粒标准品。引物具体序列见表1-1。表1-1普通PCR引物序列及扩增片段核苷酸数引物引物序列扩增长度（bp)DRD3上游5’-CGGAATTCCAGGAGCCGAAGTGGTAAAC-3’599DRD3下游5’-CCGCTCGAGCACAGCAAAGGCCAGTACCC-3’GAPDH上游5’-CGGAATTCAATTCCATGGCACCGTCAAG-3’543GAPDH下游5’-CCGCTCGAGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’根据DRD3及GAPDH的普通PCR扩增序列设计定量PCR引物，定量PCR扩增产物为普通PCR扩增长片段产物中的一段，且定量PCR扩增产物完全包含在普通PCR扩增产物中。荧光定量PCR引物设计表1-2.表1-2实时荧光定量PCR引物序列及扩增片段核苷酸数引物引物序列扩增长度（bp)DRD3上游5’-AGTCTGGAATTTCAGCCGCA-3’132DRD3下游5’-TAGTGAACGGGCATGACCAC-3’GAPDH上游5’-TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3’122GAPDH下游5’-GCCCAATACGACCAAATCCGTTGA-3’以上引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。2.5DRD3和GAPDH标准品质粒的构建（该部分送公司完成）2.5.1PCR分别扩增DRD3和GAPDH长片段PCR体系与条件：25μLPCR体系如下，F(10μmol/L)1μlR(10μmol/L)1μl2×PremixEX-Taq12.5μlcDNA2μl9 第2章材料与方法dH2O8.5μlPCR扩增条件如下，98℃2min98℃10s55℃30s30Cycles72℃45s72℃5min2.5.2DRD3和GAPDHPCR产物胶回收先将PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在紫外灯下找出目的条带后将其切下并切碎，置于1.5ml离心管中，称取凝胶重量（1g/ml）然后按照胶回收试剂盒操作说明进行胶回收。将回收后的PCR产物及载体pGEM-TEasy以紫外微量分光光度计测定浓度，标记后-20℃冻存备用。2.5.3胶回收后PCR产物进行测序PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，测序结果跟各自目的基因mRNA比对后没有缺失和突变位点，可以进行后续实验。2.5.4胶回收后的PCR产物及载体的连接10µL连接体系如下，DRD3和GAPDHPCR胶回收产物2µlpGEM-TEasy0.3µlT4DNAligase1µlT4DNAligaseBuffer1µldH2O5.7µl上述体系于16℃连接（6-8h），转化感受态细胞DH5α。2.5.5连接产物转化感受态细胞DH5α将10µl连接产物加入到刚融化的DH5α感受态细胞中，用枪轻轻吹打混匀，置于冰上放置30min；再42℃水浴热敷90s；然后置于冰上冷刺激3min，将37℃预热的无抗性LB液体培养基900µL加入混合管内，将离心管封口，置于10 第2章材料与方法37℃摇床振荡培养1h。4℃，4000r/min离心5min，弃上清900µl，留100µl左右培养基在离心管中，轻轻吹打重悬细菌，将其滴加于含有Amp+的LB平板中，用三角棒将其涂布均匀，最后将平板置于37℃温箱中培养过夜。2.5.6重组质粒的提取从培养过夜的LB平板中挑取单个菌落，将其接种于5ml含有Amp+的LB液体培养基中，使用37℃摇床振荡培养基培养过夜。再在超净台内将培养基中的菌液分装两份，加甘油保存备用，其余菌液离心，然后根据质粒提取试剂盒说明步骤提取质粒DNA。将提取的重组质粒以紫外微量分光光度计测定浓度，取一部分进行PCR及测序鉴定，测序结果跟各自目的基因mRNA比对后没有缺失和突变位点，表明构建的重组质粒没有缺失和突变，可以作为定量PCR标准品使用。2.6标准曲线的构建和绝对定量荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化2.6.1标准品拷贝数的测定测得提取的DRD3质粒浓度为150ng/uL，GAPDH质粒浓度为120ng/µl；DRD3阳性质粒的总长度为：3015+599=3614bp，GAPDH阳性质粒的总长度为：3015+543=3558bp。根据阳性重组质粒拷贝数的计算公式：拷贝数=质粒浓度（ng/µl)×阿伏伽德罗常数×10-9/(一个碱基对的平均分子量×质粒的总长度)，阿伏伽德罗常数为6.02×1023，一个碱基对的平均分子量为660，算出DRD3和GAPDH阳性质粒的拷贝数分别为3.8×1010copies/µl，3.1×1010copies/µl，分别将两种质粒用去离子水稀释至40ng/µ（lDRD3）和40ng/µ（lGAPDH），即均为1×1010copies/µl。2.6.2荧光定量PCR反应体系及反应条件的优化将制备好的DRD3及GAPDH标准品质粒进行10倍比梯度稀释，分别稀释为稀释为1×107-102，1×108-103copies/μl(6个梯度)，使用SYBR®PremixExTaq™II进行RealTimeRT-PCR反应。将两种标准品质粒和试剂加入96孔板内，每个浓度梯度的标准品及阴性对照均做3个重复样。将96孔板置于荧光定量PCR仪内，设定反应条件开始反应。定量PCR仪会以标准品拷贝数的对数为横坐标，标准品的Ct值为纵坐标自11 第2章材料与方法动生成标准曲线，由此可获得反应的扩增效率；通过观察扩增产物溶解曲线的Tm值及起峰情况，并将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，来判断扩增反应的特异性。增加引物浓度，降低退火温度，增加延伸时间可以增加反应的扩增效率，但会降低扩增特异性，反之则增加扩增的特异性，但降低反应的扩增效率。所以应对反应体系及反应条件进行优化，找出最佳的反应条件及反应个体系。2.6.2.120μl反应体系优化在试剂推荐的反应体系2×SYBREX-Taq10μL，ROX（50×）0.4μl，Template质粒2μl，RNaseFreedH2O加至20μl的前提下优化引物上下游的浓度，分别尝试0.4μl、0.6μl、0.8μl三个梯度的引物上下游加入量。2.6.2.2反应条件的优化在试剂推荐的预变性95℃，30s，变性95℃，5s的基础上优化退火延伸的温度及时间。分别尝试58.5℃、59℃、60℃、61℃四种退火温度，以及30s、45s、60s、65s四种退火延伸时间。通过观察扩增反应的扩增曲线、扩增产物的溶解曲线及仪器自动生成的标准曲线，在保证反应产物特异性的基础上，最终选择两者扩增效率均较高的反应体系及反应条件。确定的最佳反应体系及反应条件如下：（1）最佳反应体系为2×SYBREX-Taq10μlQF(10μmol/L)0.4μlQR(10μmol/L)0.4μlROX（50×）0.4μlTemplate质粒2μlRNaseFreedH2O6.8μl（2）最佳反应条件为：预变性95℃30sPCR反应（40个循环）变性95℃5s退火延伸59℃60s为进一步明确扩增产物，将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳鉴定。首先制备琼脂糖凝胶。准确称取琼脂糖干粉1.0g放入三角烧瓶中，量取12 第2章材料与方法5×TBE10ml，倒入三角烧瓶。倒入三蒸水40ml，在微波炉中加热使琼脂糖融化，直至液体中无胶粒存在，将三角烧瓶取出微波炉冷却。待融化的凝胶冷却至60℃左右，加入溴化乙锭2μl，轻轻晃动三角烧瓶以充分混匀凝胶溶液，倒入凝胶灌制平台，插上样品梳。约半小时后琼脂糖凝胶凝固，拔出梳子，将凝胶置于电泳槽内，向电泳槽内倒入电泳缓冲液，使缓冲液高出凝胶表面约1mm。取9μl荧光定量的扩增产物，加入1μlDNAloadingbuffer混匀，与DNAloadingbuffer一同加入2%琼脂糖凝胶中，调节电压110V，电流300mA，通电40分钟，将凝胶置于紫外灯下观察DNA电泳结果。2.7样品进行荧光定量PCR检测根据摸索出的最佳反应体系及反应条件，将未知样品、标准品及阴性对照同时进行荧光定量PCR反应，每个反应重复三次，荧光定量PCR仪自动把未知样品的Ct值代入标准曲线中，获得未知样品目的基因及内参的初始模板的拷贝数。2.8计算DRD3及GAPDH最终的拷贝数均取三次重复实验的平均值。由于各个样品加样量的不同，各样品间的目的基因的初始拷贝数不能直接进行比较，这就需要用内参纠正各样品加样量的差异，获得目的基因相对于内参的表达量，计算方法为：DRD3初始模板拷贝数/GAPDH初始模板拷贝数，简写为DRD3/GAPDH。本实验中，该值代表了外周血淋巴细胞DRD3mRNA的表达水平。2.9数据的统计学处理实验数据表达为均数±标准差，用SPSS17.0软件进行统计学处理。多样本间均数比较采用单因素方差分析，方差齐性检验用Levene检验，方差齐时多个样本间的多重比较用LSD-t检验；两独立样本均数比较先用正态性检验，服从正态分布的两独立样本均数比较用独立样本t检验；连续计量资料之间的相关性采用Pearson相关分析，连续计量资料与分级量表之间的相关性采用Spearman等级相关。取P值≤0.05表示有统计学差异。13 第3章结果第3章结果3.1RNA纯度鉴定所提取的RNA测得OD260/280均在1.8～2.0之间，提示RNA纯度高，无明显蛋白质等污染，且无明显降解。后续实验所测目的基因和内参基因的mRNA表达量能够真实的反映目的基因和内参的表达水平。3.2荧光定量PCR方法可行性判断3.2.1扩增曲线在最佳反应条件及反应体系时反应的扩增曲线平行性好，说明标准品PCR扩增良好。如图3.1和3.2。图3.1DRD3标准品的扩增曲线14 第3章结果图3.2GAPDH标准品的扩增曲线3.2.2荧光定量PCR产物的鉴定对于实时荧光定量PCR产物的鉴定，包括观察扩增产物溶解曲线及观察扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果两种方法。3.2.2.1DRD3和GAPDH的扩增产物溶解曲线如图3.3和3.4，扩增产物溶解曲线峰值单一，无杂峰，DRD3的熔解温度（Tm）值约为83.7℃，GAPDH的Tm值约为86.5℃，Tm值均在80-90℃之间。说明该扩增为特异性扩增。15 第3章结果图3.3DRD3扩增产物溶解曲线图3.4GAPDH扩增产物溶解曲线16 第3章结果3.2.2.2扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果荧光定量PCR的扩增产物行琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶置于紫外灯下可见单一的条带，目的基因和内参基因的扩增片段的长度与预计的DNA片段长度一致（如图3.5）。图3.5扩增产物琼脂糖凝胶电泳图由扩增产物溶解曲线及琼脂糖凝胶电泳可知，实时荧光定量PCR扩增产物为目的基因，无非特异性扩增产物。因此本实验所得出的扩增曲线是有效的。3.2.3标准曲线实时荧光定量PCR仪自动以标准品拷贝数的对数为横坐标，标准品的Ct值为纵坐标生成标准曲线，梯度稀释的DRD3和GAPDH标准品扩增生成标准曲线如图3.6和3.7。所得DRD3和GAPDH的标准曲线R2分别为为0.997、0.993，表明操作误差小，所得标准曲线线性程度好，目的基因和内参基因的Ct值与拷贝数的对数之间的线性关系方程式分别为：Y=-3.54lgX+36.03，Y=-3.90lgX+43.55，其中Y为Ct值，X为拷贝数。扩增效率可由斜率计算出，其计算公式为：E%=[10（-1/slope）-1]×100%。由此计算出目的基因和内参基因的扩增效率分别为91.8%，80.5%，两者的扩增效率均较高。由此可见，将未知样品的目的及内参基因的Ct值代入标准曲线中获得它们的初始拷贝数是准确可行的。17 第3章结果图3.6DRD3标准曲线图3.7GAPDH标准曲线3.3数据统计结果1、健康对照组中7名男性与5名女性患者的外周血淋巴细胞DRD3/GAPDH值无明显统计学差异（P＞0.05），且其表达量与年龄无明显相关（r=0.222，P＞0.05）。18 第3章结果2、男性与女性PD患者间DRD3/GAPDH值均无明显统计学差异（P=0.518＞0.05）(见表3.2)。表3.2不同性别PD患者DRD3mRNA表达情况性别例数DRD3/GAPDH值（均数±标准差）男11（1.97±0.86）E-05女9（1.75±0.57）E-053、帕金森病患者外周血淋巴细胞DRD3/GAPDH值低于健康对照组（P=0.004＜0.01）；帕金森病患者外周血淋巴细胞DRD3/GAPDH值低于其他神经系统退行性疾病患者（P=0.013＜0.05）；其他神经系统退行性疾病患者与健康对照组间DRD3/GAPDH值无明显统计学差异（P=0.864＞0.05）。各组外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达情况如表3.1和图3.8。表3.1各组外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达情况组别例数DRD3/GAPDH值（均数±标准差）PD组20（1.87±0.73）E-05其他神经系统退行性疾病6（3.02±0.67）E-05健康对照组12（2.94±1.29）E-05注：*P＜0.05，**P＜0.01。图3.8各组外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达情况4、服用左旋多巴或多巴胺受体激动剂的患者与未服用左旋多巴和多巴胺受19 第3章结果体激动剂的PD患者间DRD3/GAPDH值均无明显统计学差异（P=0.721＞0.05），服用与未服这两类药物的PD患者与健康对照组的外周血淋巴细胞DRD3表达量均有明显统计学差异（两者P值分别为0.013,0.030，P值均小于0.05）（见表3.3和图3.9）。表3.3不同服药情况的PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达情况服药情况例数DRD3/GAPDH值（均数±标准差）未服用左旋多巴和多巴胺受5（1.74±0.92）E-05体激动剂已服用左旋多巴或多巴胺受15（1.92±0.69）E-05体激动剂注：*P＜0.05。图3.9各组外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达情况5、PD组外周血淋巴细胞的DRD3/GAPDH值与病程无明显相关（r=0.034，P=0.886＞0.05），与年龄也无明显相关（r=-0.091,P=0.702＞0.05）。6、PD患者外周血淋巴细胞DRD3/GAPDH值与Hoehn&Yahr分级之间存在负相关（P＜0.05)，与UPDRS评分量表中的UPDRS-I评分无明显相关（P＞0.05)，与UPDRS-II评分负相关（P＜0.01)，与UPDRS-III评分负相关（P＜0.05)，与UPDRS-IV评分无明显相关（P＞0.05)，与SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分存在正相关（P＜0.01)（见表3.4和图3.10）。20 第3章结果表3.4PD患者DRD3/GAPDH值与各项评分指标的相关性分析评分指标rPHoehn&Yahr分级-0.5640.010UPDRS-I评分-0.2750.240UPDRS-II评分-0.6010.005UPDRS-III评分-0.4890.029UPDRS-IV评分-0.2960.205SCHWAB&ENGLAND日常0.6030.005活动能力量表评分注：A为DRD3/GAPDH与Hoehn&Yahr分级的散点图，B为DRD3/GAPDH与UPDRS-II评分的散点图，C为DRD3/GAPDH与UPDRS-III评分的散点图，D为DRD3/GAPDH与SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分的散点图。图3.10PD患者DRD3/GAPDH与各量表评分的散点图21 第4章讨论第4章讨论4.1PD外周血淋巴细胞DRD3表达水平的变化及其意义既往对PD患者外周血淋巴细胞DRD3表达变化的研究，Nagai和Barbanti分别用RT-PCR和放射配给结合分析技术所得结果并不一致[17,18]。GalinaP.Kirillova等认为，对于低表达量且不恒定的外周血淋巴细胞多巴胺受体，使用放射配体结合分析技术并不合适，使用real-timeRT-PCR方法进行检测更为准确[19]。这也解释了Nagai和Barbanti研究结果不一致的现象。本实验使用实时荧光定量RT-PCR技术对外周血淋巴细胞DRD3mRNA水平进行检测发现PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的水平较健康对照组和其他神经系统退行性疾病组低，而其他神经系统退行性疾病与健康对照组间DRD3mRNA水平无明显统计学差异。此次结果与Nagai的研究结果相同，而与Barbanti的研究结果并不一致。PD患者的多巴胺分泌长期减少，使多巴胺对DRD3的作用减弱，这可能是PD患者外周血淋巴细胞DRD3表达水平减少的原因。用MPTP毁损的猕猴模型是PD的经典动物模型之一，它能够很好地模拟PD患者长期使用左旋多巴后的疗效改变及LID副作用的出现，并能够检测其颅内多巴胺受体的变化。2003年，ErwanBézard等用MPTP毁损出现PD样症状的猕猴制成猕猴帕金森病模型，对其脑内DRD3的表达进行研究，发现出现PD样症状的猕猴颅内尾状核的DRD3表达量较正常猕猴低[33]。而本次实验发现PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA水平较正常组低，这与MPTP毁损的出现PD样症状的猕猴模型的颅内尾状核DRD3表达水平变化一致，这表明外周血淋巴细胞DRD3可能可以作为探索中枢神经系统DRD3表达变化的外周标志物。本次研究发现PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA水平较健康对照组和其他神经系统退行性疾病低，而其他神经系统疾病与健康对照组无明显差异；然而本次实验数据显示各组的DRD3mRNA表达水平波动范围较大，各组表达水平的波动范围存在较多重合部分，因此，我们无法对该指标设定一个分界值，也无法通过该单一指标将PD组与其他两组进行明确区别。但是当PD早期诊断不明确，尤其是不能与其他神经系统退行性疾病鉴别时，可以将外周血淋巴细22 第4章讨论胞DRD3mRNA水平与临床表现相结合，或与其他可靠生物标志物相结合，以提高早期诊断的准确率，使更多的PD患者能够早期明确诊断，尽早进行神经保护等干预治疗措施，以延缓疾病的进展。4.2左旋多巴及多巴胺受体激动剂对DRD3的影响及意义本实验研究未发现服用左旋多巴或多巴胺受体激动剂与未服用这两类药物的PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA有明显差异，这可能表明这两类药物对外周血淋巴细胞DRD3无明显影响。当然，本实验存在一定不足之处，本实验收集的未服用左旋多巴和多巴胺受体激动剂的PD患者例数少，未服用药物的患者比服用药物的患者病程短，病情轻，且未分析单独服用左旋多巴和单独服用多巴胺受体激动剂的PD患者外周血淋巴细胞DRD3受体的表达变化。因此，为了获得准确可靠的结果，明确左旋多巴和多巴胺受体激动剂对外周血淋巴细胞DRD3表达的影响，应增加未服用药物组的样本数，并分开分析单独服用左旋多巴和单独服用多巴胺受体激动剂及两类药物同时服用的情况，并保证服药组与未服药组的疾病严重程度相匹配。4.3DRD3与各量表评分的关系及意义临床医师常根据PD患者的临床症状及体征进行Hoehn&Yahr分级、UPDRS评分及SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分，由此判断患者的病情，神经功能缺失情况及患者的生活质量。本实验发现PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA水平与年龄和病程并无明显相关，而与Hoehn&Yahr分级呈负相关，相关强度为中度相关，即随着PD严重程度的增加，外周血淋巴细胞DRD3mRNA水平逐渐减少，这表明DRD3在PD的发生发展中发挥着一定的生物学功能。因此，我们可能可以通过检测PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的表达变化来监测疾病的进展。UPDRS量表包括四部分：I部分，精神、行为和情绪；II部分，日常生活能力；III部分，运动检查；IV部分，治疗的并发症。PD患者外周血的淋巴细胞DRD3mRNA表达水平与UPDRS-I、IV均无明显相关，但与UPDRS-II和UPDRS-III评分均呈负相关，与SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分23 第4章讨论存在正相关，即PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平越低，其日常生活能力与运动功能越差，这表明DRD3很可能与机体运动功能有关。与另外几种受体亚型相比，内源性多巴胺与DRD3的结合力最强[40]，而左旋多巴作用的减少与PD的发生和进展有关，这表明DRD3与PD的发生发展可能有密切的联系。然而目前对于DRD3影响PD严重程度、运动功能的机制并不清楚，因此，相关的机制还有待更深入的探索。PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平与Hoehn&Yahr分级、UPDRS-II、UPDRS-III和SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表评分之间的相关性表明，外周血淋巴细胞DRD3可能可以作为监测PD进展的外周标志物，有助于临床上PD进展的监测。4.4DRD3与运动并发症的关系及意义2003年，ErwanBézard用MPTP制成的猕猴PD模型很好地模拟出了PD患者长期使用左旋多巴后的疗效改变及异动症的出现。该实验发现，对于长期服用左旋多巴制剂诱导出异动症的猕猴脑内豆状核、苍白球内侧部DRD3受体表达量明显高于未出现异动症的猕猴，甚至高于正常的猕猴，并且豆状核上DRD3的表达量与异动症的严重程度有关。他们进一步的实验表明DRD3部分激动剂可以减轻异动症，且不影响左旋多巴改善帕金森病症状的作用，左旋多巴与DRD3部分激动剂结合是治疗长期服用左旋多巴并出现了异动症的PD的新方法。然而本研究中长期服用左旋多巴并出现异动症的病人只有1例，不足以对其与DRD3表达量的相关性进行分析，故可增加长期服用左旋多巴并出现异动症的PD患者的样本量，进一步实验，以获得明确的结果。如果进一步的研究发现伴异动症的PD患者颅内或外周血淋巴细胞DRD3的表达比不伴异动症的PD患者高，则其表达变化与ErwanBézard在猕猴的PD模型脑内测得的表达变化相一致，由此可进一步研究DRD3部分激动剂对于治疗PD患者长期服用左旋多巴后出现的异动症的可行性。因此对伴异动症的PD患者进行颅内和外周血淋巴细胞DRD3表达变化的研究具有非常大的意义。24 第4章讨论4.5外周血淋巴细胞对研究PD的意义当然，我们必须承认，利用外周血淋巴细胞来研究中枢神经系统多巴胺能系统的变化存在一定的局限性[41]，淋巴细胞与颅内细胞所处的内环境不同，内环境的变化对细胞内蛋白质的表达会有所影响。然而有研究显示，在一些疾病状况下，外周血淋巴细胞上某些神经递质受体的表达水平与中枢神经系统中该递质受体水平的变化情况相同，如以往研究发现阿尔茨海默病患者外周血淋巴细胞胆碱能受体表达水平减低，而他们颅内的胆碱能受体也减低[42]。本研究发现PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的表达水平比健康对照组低，这与ErwanBézard对MPTP制成的猕猴PD模型颅脑尾状核中DRD3表达水平变化的研究结果一致，并且外周血淋巴细胞中DRD3mRNA的表达水平与PD的严重程度相关，这些都进一步表明外周血淋巴细胞DRD3mRNA表达水平的变化可能体现颅内DRD3表达水平的变化情况。外周血淋巴细胞和黑质致密细胞有着相同的能够赋予多巴胺能细胞相应功能的分子体系，因此它们有可能反映PD在中枢水平的发病机制，并可能表达诠释PD发病机制及PD进展的指标[1,2]。由此可见，PD患者疾病进程中外周血淋巴细胞多巴胺受体表达变化的研究对中枢多巴胺能系统的改变可能具有外周指示作用。由于直接对PD患者的颅脑进行研究较为困难，容易获取的外周血可能会成为研究颅内神经递质表达变化的有效工具。25 第5章结论与展望第5章结论与展望5.1结论1、外周血淋巴细胞DRD3可作为协助诊断PD的外周生物标志物。2、通过检测外周血淋巴细胞DRD3的表达变化有助于判断PD的病情程度和监测PD的进展。3、PD患者疾病进程中外周血淋巴细胞多巴胺受体表达变化的研究对中枢多巴胺能系统的改变可能具有外周指示作用。5.2不足与展望1、本实验未区别研究单独服用左旋多巴，单独服用多巴胺受体激动剂和两类药物同时服用的情况，如果左旋多巴及多巴胺受体激动剂对DRD3表达的影响不相同，则应把这几类患者分开研究并进行相互对比。2、由于样本含量少，长期服用左旋多巴并出现异动症的PD病人仅1例，不足以对伴异动症的PD患者外周血淋巴细胞DRD3的表达变化情况进行分析，因此，大样本的研究值得进一步进行。3、其他神经系统退行性疾病组样本量少，且未对其他神经系统退行性疾病进行分类。故应加大样本量，对分组进行细化。3、既往有研究发现，偏头痛和精神分裂症等患者外周血淋巴细胞DRD3受体的表达与健康对照组不同，故本次研究所收集的样本均排除偏头疼及精神系统疾病。然而，影响外周血淋巴细胞DRD3表达的其他因素尚不明确，因此，本次试验未考虑其他影响外周血淋巴细胞DRD3表达变化的因素。4、本实验对PD患者外周血淋巴细胞DRD3mRNA的表达及与临床特点的相关性进行了研究，然而，迄今为止，DRD3在帕金森病的发生发展中的具体作用，以及外周血淋巴细胞上多巴胺系统与中枢多巴胺系统的具体联系均不明确，这些都值得进一步的探索。26 致谢致谢研究生生活即将落下帷幕，我最需要感谢的是我的导师王卫东老师，近三年来不仅传授知识，指导课题，还给予生活上的关心。在临床学习中，还要感谢科室各位老师，注重教学，给我们提供了良好的学习环境。感谢所有给予课题及论文写作指导的各位老师和师姐。此外，还要谢谢实验室和检验科的老师与同学，给予了我实验技术方面的耐心指导。最后，我要感谢一直默默支持和鼓励我的父母。黄丽娟2016年5月11日27 参考文献参考文献[1]FasanoM,AlberioT,ColapintoM,etal.Proteomicsasatooltoinvestigatecellmodelsfordopaminetoxicity[J].Parkinsonism&relateddisorders,2008,14:S135～S138.[2]FasanoM,AlberioT,LopianoL.PeripheralbiomarkersofParkinson'sdiseaseasearlyreportersofcentralneurodegeneration.[J].BiomarkersinMedicine,2008,2(5):465～478.[3]ButtarelliFR,FanciulliA,PellicanoC,etal.Thedopaminergicsysteminperipheralbloodlymphocytes:fromphysiologytopharmacologyandpotentialapplicationstoneuropsychiatricdisorders.[J].DnaResearchAnInternationalJournalforRapidPublicationofReportsonGenes&Genomes,2011,9(2):278～288.[4]AlessandraF,RobertaM,DarioC,etal.Dopaminergicdrug-inducedmodulationoftheexpressionofthedopaminetransporterinperipheralbloodlymphocytesinParkinson'sdisease.[J].PharmacologicalReportsPr,2011,63(4):1056～1060.[5]AdemA,NordbergA,BuchtG,etal.ExtraneuralcholinergicmarkersinAlzheimer'sandParkinson'sdisease[J].ProgressinNeuro-PsychopharmacologyandBiologicalPsychiatry,1986,10(3–5):247～257.[6]KatiaV,FabrizioV,AliceT,etal.A2Aadenosinereceptoroverexpressionandfunctionality,aswellasTNF-alphalevels,correlatewithmotorsymptomsinParkinson'sdisease.[J].FasebJournal,2010,24(2):587～598.[7]FurGL,MeiningerV,PhanT,etal.Decreaseinlymphocyte[3H]spiroperidolbindingsitesinParkinsonism.[J].LifeSciences,1980,27(17):1587～1591.[8]InnisRB,SeibylJP,ScanleyBE,etal.InnisRB,SeibylJP,ScanleyBE,LaruelleM,Abi-DarghamA,WallaceEetal.SinglephotonemissioncomputedtomographicimagingdemonstrateslossofstriataldopaminetransportersinParkinsondisease.ProcNatlAcadSciUSA90:11965-11969[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1994,90(24):11965～11969.[9]CarontiB,AntoniniG,CalderaroC,etal.DopaminetransporterimmunoreactivityinperipheralbloodlymphocytesinParkinson'sdisease[J].JournalofNeuralTransmission,2001,108(7):803～807.[10]PellicanoC,ButtarelliFR,CircellaA,etal.DopaminetransporterimmunoreactivityinperipheralbloodlymphocytesdiscriminatesParkinson'sdiseasefromessentialtremor.[J].JournalofNeuralTransmission,2007,114(7):935～938.[11]AmentaF,BronzettiE.Identificationofdopamineplasmamembraneandvesiculartransportersinhumanperipheralbloodlymphocytes[J].JournalofNeuroimmunology,2001,117(1-2):133～142.[12]ButtarelliFR,CapriottiG,PellicanoC,etal.CentralandperipheraldopaminetransporterreductioninParkinson'sdisease.[J].NeurologicalResearch,2009,31(7):687～691.28 参考文献[13]AlessandraF,RobertaM,DarioC,etal.Dopaminergicdrug-inducedmodulationoftheexpressionofthedopaminetransporterinperipheralbloodlymphocytesinParkinson'sdisease.[J].PharmacologicalReportsPr,2011,63(4):1056～1060.[14]BongioanniP,GemignaniF,RonatoM,etal.T-lymphocyteperipheral-typebenzodiazepinebindinginparkinsonianpatients[J].Parkinsonism&relateddisorders,1997,3(1):37～42.[15]BlandiniF,MangiagalliA,CosentinoM,etal.PeripheralMarkersofApoptosisinParkinson'sDisease[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2003,1010(1):675～678.[16]LeW,PanT,HuangM,etal.DecreasedNURR1geneexpressioninpatientswithParkinson'sdisease.[J].JournaloftheNeurologicalSciences,2008,273(1-2):29～33.[17]NagaiY,UenoS,SaekiY,etal.DecreaseoftheD3dopaminereceptormRNAexpressioninlymphocytesfrompatientswithParkinson'sdisease.[J].Neurology,1996,46(3):791～795.[18]BarbantiP,FabbriniG,RicciA,etal.IncreasedexpressionofdopaminereceptorsonlymphocytesinParkinson'sdisease.[J].MovementDisordersOfficialJournaloftheMovementDisorderSociety,1999,14(5):764～771.[19]KirillovaGP,HrutkayRJ,ShurinMR,etal.Dopaminereceptorsinhumanlymphocytes:radioligandbindingandquantitativeRT-PCRassays.[J].JournalofNeuroscienceMethods,2008,174(2):272～280.[20]KebabianJW.Multipleclassesofdopaminereceptorsinmammaliancentralnervoussystem:theinvolvementofdopamine-sensitiveadenylylcyclase.[J].LifeSciences,1978,23(5):479～483.[21]SpanoPF,GovoniS,TrabucchiM.Studiesonthepharmacologicalpropertiesofdopaminereceptorsinvariousareasofthecentralnervoussystem.[J].AdvancesinBiochemicalPsychopharmacology,1978,19:155～165.[22]ChiaraGD,MorelliM,ConsoloS.Modulatoryfunctionsofneurotransmittersinthestriatum:ACh/dopamine/NMDAinteractions.[J].TrendsinNeurosciences,1994,17(6):228～233.[23]KandelER,SchwartzJH,JessellTM.PrinciplesofNeuralScience4thEd[J].McGraw-Hill.xli,2000,50(6):823～839.[24]StrangePG.Newinsightsintodopaminereceptorsinthecentralnervoussystem[J].NeurochemistryInternational,1993,22(3):223～236.[25]FiorentiniC,BusiCE,GottiC,etal.ReciprocalregulationofdopamineD1andD3receptorfunctionandtraffickingbyheterodimerization.[J].OralSurgeryOralMedicineOralPathologyOralRadiology&Endodontics,2008,74(1):336～345.[26]MarcellinoD,FerreS,CasadoV,etal.IdentificationofdopamineD-1-D-3receptorheteromers-IndicationsforaroleofsynergisticD-1-D-3receptorinteractionsinthestriatum[J].JournalofBiologicalChemistry,2008,283(38):26016～26025.[27]BeaulieuJM,EspinozaS,GainetdinovRR.Dopaminereceptors–IUPHARReview13[J].BritishJournalofPharmacology,2015,172(1):1～23.[28]MarcellinoD,FerreS,CasadoV,etal.IdentificationofdopamineD-1-D-3receptor29 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参考文献bindinginneurologicalpatients[J].Brain,1991,114(4):1759～1770.31 附录附录A英国脑库帕金森病诊断标准第一步：诊断帕金森综合征运动减少：随意运动在始动时缓慢，重复性动作的运动速度及幅度逐渐降低同时至少具有以下一个症状：1、肌肉强直2、静止性震颤（4－6Hz）3、直立不稳（非原发性视觉，前庭功能，小脑及本体感觉功能障碍造成）第二步：帕金森病排除标准1、反复的脑卒中病史，伴阶梯式进展的帕金森症状2、反复的脑损伤史3、确切的脑炎病史4、动眼危象5、在症状出现时，正在接受神经安定剂治疗6、1个以上的亲属患病7、病情持续性缓解8、发病三年后，仍是严格的单侧受累9、核上性凝视麻痹10、小脑征11、早期即有严重的自主神经受累12、早期即有严重的痴呆，伴有记忆力，语言和行为障碍13、锥体束征阳性（Babinski征+）14、CT扫描可见颅内肿瘤或交通性脑积水15、用大剂量左旋多巴治疗无效（除外吸收障碍）16、MPTP接触史，一种阿片类镇痛剂的衍生物第三步：帕金森病的支持诊断标准。具有三个或以上者可确诊帕金森病1、单侧起病2、存在静止性震颤3、疾病逐渐进展4、症状持续的不对称，首发侧较重32 附录5、对左旋多巴的治疗反应非常好（70-100%）6、应用左旋多巴导致的严重异动症7、左旋多巴的治疗效果持续5年以上（含5年）8、临床病程10年以上（含10年）符合第一步帕金森综合征诊断标准的患者，若不具备第二步中的任何一项，同时满足第三步中三项及以上者即可临床确诊为帕金森病。33 附录附录B统一帕金森病评分量表（UPDRS）I.精神、行为和情绪1.智能损害0=正常1=轻度记忆力下降，无其他智能障碍。2=中度记忆力下降，伴有定向障碍。中等程度的处理复杂问题的能力下降。轻度自理能力下降，有时需别人提示。3=严重记忆力下降，伴时间和地点定向障碍，处理问题的能力严重受损。4=严重记忆力损害，仅保留对自身的判断能力。不能自行判断和处理问题。个人生活需他人照料，不能单独生活。2.思维障碍(痴呆和药物中毒)0=无思维障碍。1=有生动的梦境。2=有不严重的幻觉，但洞察力保留。3=幻觉或妄想，缺乏洞察力，可能影响日常生活。4=持续性的幻觉、妄想或明显精神障碍，不能自理。3.抑郁0=无抑郁。1=经常悲伤或内疚，但持续时间短。2=持续性抑郁，可持续一周或更长时间。3=持续性的抑郁和自主神经症状(失眠、厌食、体重下降、缺乏兴趣)4=持续性的抑郁和自主神经症状，有自杀意图或倾向。4.主动性0=正常。1=与正常比缺乏主见，显得被动。2=缺乏主动性，对某些活动缺乏兴趣。3=缺乏主动性，对日常活动缺乏兴趣。4=完全没有兴趣，退缩。II．日常生活能力（“关”和“开”期）34 附录5.语言0=正常；1=轻度受影响，但理解无困难。2=中度受影响，有时需要重复表达。3=严重受影响，经常需要重复表达。4=大多数时候听不懂。6.流涎0=正常。1=轻度，口水多，可能有夜间流涎。2=中度，口水多，少量流涎。3=明显，口水很多，中量流涎。4=严重流涎，需不断用纸或手帕揩拭。7.吞咽0=正常。1=很少呛咳。2=有时呛咳。3=需要进软食。4=需留置胃管或胃造瘘喂食。8.书写和笔迹0=正常。1=轻度缓慢或字迹变小。2=中度缓慢或字迹变小，但各字均可辨认。3=严重影响，字迹中并非所有字都可辨认。4=大多数字不能辨认。9.刀切食物和使用餐具0=正常。1=有点缓慢和笨拙，但不需帮助。2=虽然缓慢而笨拙，但能切大多数食物，需一些帮助。3=需别人切食物、挟莱，但能缓慢进食。4=需要喂食。10.穿衣35 附录0=正常。1=有些缓慢，但不需要帮助。2=偶尔需要帮助其系钮扣或将手臂放入衣袖。3=需要相当多的帮助，仅能单独完成少数动作。4=完全需要帮助。11.卫生0=正常。1=有些慢，但不需帮助。2=淋浴或坐浴需人帮助，或在帮助下缓慢完成。3=洗面、刷牙、梳头或去洗手间均需人帮助。4=需用导尿管及其他便器。12.床上翻身和盖被褥0=正常。1=有些缓慢和笨拙，但不需要帮助。2=能独自翻身或盖好被褥，但有很大困难。3=有翻身和盖被褥的动作，但不能独立完成。4=完全不能。13.跌倒(与僵住无关)0=无。1=偶尔跌倒。2=有时跌倒，少于1次/天。3=平均每天跌倒1次。4=平均每天跌倒1次以上。14.行走时被僵住0=无。1=偶尔出现步行中僵住，仅在起步时呈犹豫状态(起步难或十分缓慢)。2=偶尔行走中出现僵住，每天少于1次。3=常有僵住，偶尔因僵住而跌倒。4=经常因僵住而跌倒。15.步行0=正常。36 附录1=轻度困难，无手臂摆动或拖步。2=中度困难，很少需要帮助或不需要支撑物。3=严重行走困难，需支撑物。4=即使有支撑物也不能步行。16.震颤（身体任何部位的震颤）0=无。1=轻度，不经常出现。2=中度，给病人造成麻烦。3=重度，干扰很多活动。4=极显著，大多数活动受干扰。17.与帕金森综合征有关的感觉诉主诉0=无。1=偶尔有麻、刺或轻度疼痛。2=常有麻、刺或痛，病人不觉痛苦。3=频繁疼痛。4=剧烈疼痛。III.运动检查18.言语0=正常。1=轻度的语言表达障碍，发音或声调异常。2=中度障碍，语音单调，含糊不清，能被理解。3=重度障碍，难于听懂。4=根本不能理解。19.面部表情0=正常。1=极轻微的表情异常。2=轻度而肯定的表情呆板。3=中度的面部表情损害，仍能张口。4=呈面具脸，面部表情严重或完全消失，张口时双唇仅分开0.5cm左右。20.静止性震颤（头、上肢、下肢）0=无。37 附录1=偶尔有轻度震颤。2=持久存在较小振幅的震颤或间断出现中等振幅的震颤.3=经常出现中等振幅的震颤。4=持续的大幅度震颤。21.双手动作性或位置性震颤0=无。1=轻度动作性震颤。2=中等幅度的动作性震颤。3=中等幅度的震颤，做某个动作和特定姿势时均出现。4=重度震颤，影响进食。22.僵硬(坐位放松状态下检查肢体大关节的被动动作，不注重齿轮样感觉)0=无。1=轻微僵硬。2=轻到中度增高。3=明显增高，但最大关节活动可以容易的完成。4=严重增高，最大关节活动完成很困难。23.手指捏合（拇指和食指最大幅度、最快频率的捏合）0=正常(≥15次／5秒)。1=11-14次／5秒；速度轻度减慢，幅度轻度变小。2=7-10次／5秒，中度损害，幅度越来越小，偶尔可有停顿。3=3-6次／5秒，严重损害，运动开始时犹豫或动作进行中有暂停现象。4=0-2次／5秒，几乎不能完成上述动作。24.手部运动(单手最大幅度快速握拳、张开交替运动)0=正常。1=动作轻度减慢，幅度轻度减小。2=中度损害，幅度越来越小，似疲劳状，运动中偶尔有暂停。3=严重损害，动作开始时犹豫，动作进行中有暂停现象。4=几乎不能完成测试。25.双手快速轮替动作(双手同时旋前-旋后、垂直-水平运动，幅度尽可能大)0=正常。1=轻度减慢或幅度轻度变小。38 附录2=明显受累。幅度越来越小，偶尔有停顿状态。3=严重受累。动作开始时犹豫或动作进行中有暂停现象。4=几乎不能完成测试。26.下肢灵活度（快速反复踮起足跟使腿抬起，足跟抬高至少6cm)0=正常。1=动作轻度减慢或幅度轻度变小。2=中度损害。幅度减小，易于疲劳，动作中偶尔有暂停。3=严重损害。动作开始时犹豫，动作进行中有暂停现象。4=几乎不能完成测试。27.坐椅起立(双手交叉抱在胸前，从靠背椅中起立)0=正常1=缓慢，可能需尝试1次以上才完成。2=需撑椅子把手才起立。3=易跌回椅中；需尝试1次以上，没有他人帮助时，努力撑才能站起。4=无他人帮助不能站起。28.姿势0=正常。1=不完全立直，轻度前倾，犹如通常老年人状态。2=中度前倾姿势，显得异常；也可轻微向一侧倾斜。3=严重前倾、弯背，也可中度向一侧歪斜。4=躯体明显弯曲，姿势极度异常。29.步态0=正常。1=行走缓慢，可小步曳行，但无慌张或前冲步态。2=行走困难，但很少或不需扶持，可有一定程度的慌张、小步或前冲。3=严重步态障碍，需扶助。4=无法行走，甚至扶助时也无法行走。30.姿势平衡(睁眼直立、双足稍分开，做好准备。检查者自身后突然拉动肩部)0=正常。1=后仰，但不需要帮助而恢复直立位。39 附录2=姿势反应消失。如检查者不扶住病人可跌倒。3=非常不稳，有自发失去平衡的倾向。4=无人扶助不能站立。31.身体运动迟缓和减少(包括协同缓慢、犹豫状态、手臂摆动减少，全身运动幅度小而慢)0=无。1=动作轻微减慢，可能伴摆动幅度减小。对某些人来说可能属正常。2=动作轻度减慢，肯定的动作减少，可有动作幅度减小。3=动作中度减慢，动作幅度减小。4=动作明显减慢，动作幅度减小或消失。IV.治疗的并发症（记录过去1周的情况）a.异动症32.持续时间：异动症状占一日觉醒时间的比率?0=无。1=1％-25％。2=26％-50％。3=51％-75％。4=76％-100％。33.功能障碍：异动症所致的功能障碍的程度?0=无功能障碍。1=轻度功能障碍。2=中度功能障碍。3=重度功能障碍。4=功能完全丧失。34.痛性异动症：异动症的疼痛程度?0=无痛性异动症。1=轻度。2=中度。3=重度。4=极重。35.清晨出现的肌张力障碍40 附录0=无。1=有。b.症状波动36.“关”期是否可以根据服药时间来预测?0=不可预测。1=可以预测。37.“关”期是否不能根据服药时间来预测?0=可预测。1=不可预测。38.“关”期是否均突然发生(几秒钟内)0=不是。1=是。39.“关”期所占一日觉醒时间的比率?0=无。1=1％-25％。2=26％～50％。3=51％一75％。4=76％～100％。c.其他并发症40.厌食、恶心或呕吐0=无1=有41.是否存在睡眠障碍，如失眠或嗜睡？0=无1=有42.站立时是否有低血压或感觉头晕？0=无1=有V.修订的HOEHN&YAHR分级0级=无疾病体征。1级=单侧肢体症状。41 附录1.5级=单侧肢体＋躯干症状。2级=双侧肢体症状，无平衡障碍。2.5级=轻度双侧肢体症状，后拉试验可恢复。3级=轻至中度双侧肢体症状，平衡障碍，保留独立能力。4级=严重障碍，在无协助的情况下仍能行走或站立。5级=病人限制在轮椅或床上，需人照料。VI.SCHWAB&ENGLAND日常活动能力量表100％=完全独立，能做各种家务，速度不慢，毫无困难。90％=完全独立，能做各种家务，速度稍慢、感觉有些困难。80％=能独立完成大部分家务，感到吃力、速度缓慢。70％=不能完全独立，做某些家务较困难，需3～4倍的时间，需用1天的大部分时间完成家务。60％=轻度依赖，能做大部分家务，但极为缓慢和费力，出错误，某些家务不能完成。50％=更多地依赖他人，半数活动需要帮助，任何事情均感困难。40％=极需依赖他人，在帮助下做各种家务，但很少能独立完成。30％=费力，偶尔一些家务可独立完成或只能完成开始一部分，需要更多的帮助。20％=不能独立完成任何事情，对少数家务能帮些忙，严重残疾。10％=完全依赖他人，不能自理，完全残疾0％=吞咽障碍，大小便失禁，卧床不起。42 攻读学位期间的研究成果攻读学位期间的研究成果黄丽娟，王卫东.中国老年学杂志[J].帕金森病相关外周血淋巴细胞生物标志物的研究进展，2014（已录用）.43 综述综述帕金森病相关外周血淋巴细胞生物标志物的研究进展摘要：帕金森病是一种慢性进展性神经变性疾病，其确切病因尚未完全阐明。迄今为止，对该病的诊断以及病情的评估仍然有赖于对症状的临床观察，如果能明确与帕金森病相关的特异性的生物标志物，这将有助于帕金森病的诊断与治疗效果的监测。在研究者们的努力下，他们发现较易获取的外周血淋巴细胞提供了可能与帕金森病的发生、发展有关的生物标志物，对这些标志物的动态变化的检测，可能不仅有助于疾病的诊断，还可监测疾病的进展，指导治疗。关键词：帕金森病；外周血淋巴细胞；生物标志物帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统退行性疾病。近年来，随着我国人口老龄化进程的加剧，PD的发病率和患病人数呈现出逐年上升的态势。目前临床中主要依据临床症状以及对左旋多巴治疗的反应对帕金森病患者进行诊断，然而当帕金森病患者出现明显或典型临床症状时，绝大多数患者纹状体多巴胺浓度一般已较正常水平降低80%以上，因此帕金森病的早期诊断是提高治疗效果及改善患者生活质量的关键，也是神经病学领域亟待解决的一个重要问题，如果能从患者外周血中获取可以对PD诊断和治疗效果进行判断的有效生物标志物，这将会对PD的诊断及治疗产生重要意义，但至今尚无肯定的临床生物标志物。外周血容易获取，并可进行长期随访观察，且淋巴细胞上往往表达有多种神经递质，这使得人们开始在外周血淋巴细胞（peripheralbloodlymphocytes，PBL）上寻找诊断PD的新途径。众所周知，淋巴细胞不仅能够透过血脑屏障，而且其细胞膜表面表达有多种神经递质，这些神经递质不仅可以介导免疫细胞间的联系，还能参与免疫系统与神经系统之间的双向沟通[1]。实际上，免疫系统能够较灵敏的反应PD在中枢水平的特殊发病机制，外周血淋巴细胞和黑质致密细胞有着相同的能够赋予多巴胺能细胞相应功能的分子体系，因此它们有可能表达诠释PD发病机制及病情程度的灵敏指标[2,3]。近年来对PBL上可能表达的生物标志物的研究有很多，尽管相关的研究存在方法和理论上的局限性，但许多研究结果均显示PD患者44 综述PBL上神经递质的表达水平与中枢神经系统中神经递质水平的变化呈一致。这就为寻找外周血中的帕金森病生物标记物提供了可能[3]。有鉴于此，本文对即往针对PD患者PBL中多巴胺系统、胆碱受体、腺苷受体的相关文献进行综述如下，旨在为为尝试将这些分子作为诊断PD的外周生物标志物提供依据和帮助。1多巴胺能递质相关生物分子多巴胺是一种中枢神经系统的重要递质，它参与运动、认知及行为的控制和内分泌的调节[4]。酪氨酸羟化酶是酪氨酸合成多巴胺的限速酶。多巴胺作用的发挥与是通过作用于靶细胞上的多巴胺受体，多巴胺受体均为含七个跨膜区域的G蛋白偶联受体[4,5]，根据其药理作用及生化特点，多巴胺受体可分为D1和D2样受体，D1样受体分为D1和D5受体两种亚型，它们能促进细胞内环磷酸腺苷的激活。D2样受体分为D2、D3和D4受体三种亚型，它们抑制细胞内环磷酸腺苷的激活[4,6]。多巴胺转运体（DAT）是由12个跨膜区构成的蛋白质，DAT的主要功能为再摄取突触间隙的多巴胺，以限制多巴胺能受体激活的时间、程度和范围,中止神经细胞间的信息传递，还能维持多巴胺在神经元中的稳定。1.1多巴胺Caronti等人[7]研究发现未接受药物治疗及接受多巴胺受体激动剂治疗的临床早期的PD患者PBL多巴胺含量比健康对照组低，而这两组患者PBL多巴胺含量之间无明显差别，此外，经左旋多巴治疗后的PD患者PBL内多巴胺含量明显增加，早期PD患者PBL多巴胺含量减少提示细胞内多巴胺合成的途径可能受损。Rajdad等人[8]发现高剂量左旋多巴治疗的PD患者PBL内多巴胺含量比低剂量左旋多巴治疗的PD患者及健康对照组更高，这说明细胞内多巴胺水平是有左旋多巴剂量依赖的。临床早期的PD患者PBL内多巴胺含量的减少可能有助于PD的早期诊断，PBL内多巴胺的含量可作为患者对左旋多巴治疗反应的一项指标。1.2多巴胺受体LeFur等[9]利用放射配体结合技术，对15位PD患者与15位年龄相匹配的健康志愿者组成的对照组进行研究，发现PD患者的PBL上的[3H]螺环哌啶的结合比健康组少，且该结合位点的减少与帕金森的症状的严重程度呈线性相关，而另一组患有其他神经系统紊乱疾病（血管性偏瘫、阿尔茨海默病、橄榄体脑桥小脑变性和亨廷顿病）的患者中并没有观察到该结合的减少。这可以表明PBL45 综述上多巴胺受体在PD患者中的改变具有特异性。Nagai等人[10]使用RT-PCR技术对受试者的外周血多巴胺mRNA表达进行定量分析，发现PD患者PBL上D3RmRNA的表达量比健康人低，且其表达量与是否接受左旋多巴治疗及性别无关，D3RmRNA表达的减少与帕金森患者临床症状的严重程度相关，然而，他们发现这两组受试者间的D5RmRNA的表达无明显差异。Barbanti等人[11]也对此进行了进一步的研究，对50位原发性帕金森病患者，36位神经系统疾病对照组（包括多系统萎缩、特发性震颤和其他神经变性病）及26位健康对照组，利用放射配体结合技术，用[3H]-SCH23390和[3H]-7OH-DPAT分别标记D5R和D3R，发现PD患者PBL多巴胺D1样和D2样受体的最大结合量（Bmax）比患有其他神经变性病的患者或健康对照受试者更高，而患有其他的神经系统疾病的患者和健康对照组之间无差别。其中25位帕金森患者在接受3个月的左旋多巴或溴隐亭治疗后，与对照组相比，其PBL多巴胺D1样和D2样受体的最大结合量减少，左旋多巴或溴隐亭的治疗导致了受体的下调。另外他们的研究还表明PD患者D1样和D2样受体与临床特点（病程、严重程度和临床表现）均无关，他们认为PBL多巴胺D1样和D2样受体的表达增加可能是种代偿机制，可能是PD患者多巴胺能系统弥漫性损害的标志。上述研究明确显示PBL上多巴胺受体与帕金森病有关，它的变化有可能用于PD的特异性诊断，并可能与其它神经系统疾病相鉴别。此外PBL上多巴胺受体还有可能用于监测PD的进展，指导治疗。然而以前的研究结果并不完全一致，这就需要更合适的技术及更加完善的实验设计，以得出更为准确的结果。1.3多巴胺转运体早在1993年Innis等[12]就已经用单光子发射计算机断层成像证明了帕金森病患者纹状体DAT减少，并表明这可能有助于早期诊断PD，甚至监测疾病的进展。但该技术既复杂又昂贵，寻找简单又经济的方法成了许多研究者探索的目标。对外周血DAT的研究可对其表达密度及功能两方面进行。2001年Caronti等人[13]用免疫化学技术发现，在PD临床早期阶段，PBL上DAT的免疫活性就已经低于健康对照组，且不受多巴胺受体激动剂的影响。2007年Pellicano等[14]的研究结果相似，他们发现未使用多巴胺能药物的PD患者PBL上DAT免疫活性减低，而特发性震颤患者无明显变化。2001年Amenta等人[15]发现纹状体及PBL上的DAT是相同的，它们间主要的区别在于表达的密度不同，并确定PBL46 综述上的DAT能够吸收3H-DA，表明这些DAT是有功能活性的。2009年Buttarelli等人[16]对PD患者PBL上的DAT使用免疫细胞化学技术，并用SPECT对相同患者的纹状体DAT进行分析，发现PBL与纹状体上的DAT的水平无明显相关。然而，Pontieri等人[17]发现在接受左旋多巴或多巴胺受体激动剂治疗的PD患者PBL与纹状体上的DAT的表达高度相关。2011年Fanciulli等人[18]对药物对DAT表达的调节作用进行研究，发现多巴胺受体激动剂能使PD患者PBL上DAT表达减少,而左旋多巴并没有这种效果。以前的研究表明，虽然PBL与中枢DAT表达的病理生理调节机制可能并不相同，且目前还没有针对PBL上DAT的表达量或活性程度与帕金森病严重程度的关系的研究，但PBL上的DAT仍可能作为早期诊断PD的敏感指标，并能与其它疾病如特发性震颤相鉴别。1.4酪氨酸羟化酶Caronti等人[7]研究发现临床早期PD患者PBL上酪氨酸羟化酶免疫活性比健康对照组低，且该活性与是否接受多巴胺受体激动剂或左旋多巴治疗无关。此外，他们发现在大多数早期PD患者中，酪氨酸羟化酶免疫活性在少数淋巴细胞中还是正常的，在大部分淋巴细胞内是减低的，这提示PD患者PBL内酪氨酸羟化酶免疫活性的减低是慢性进展性的过程，它在疾病的进展过程中逐渐加重。这提示PBL酪氨酸羟化酶可能不仅能用于诊断PD，还能监测疾病的进展。2胆碱能递质相关生物分子纹状体中多巴胺与乙酰胆碱两大类递质系统的功能相互抵抗，两者之间的平衡对基底节运动功能起着重要的调节作用。PD患者纹状体多巴胺含量显著降低，造成乙酰胆碱系统功能相对亢进，这种递质失衡与肌张力增高、动作减少等运动症状的产生密切相关。乙酰胆碱通过作用于胆碱受体，维持胆碱能神经系统的生理功能。胆碱受体分为烟碱型受体和毒蕈碱型受体两大类，它们分别属于离子通道型受体和G蛋白偶联受体。胆碱能神经元几乎存在于脑内各处,它经突触前膜释放后,被胆碱酯酶水解失活。通过尸检黑质纹状体和中脑皮质边缘系统，发现PD病人额叶和尾状核的毒蕈碱型受体增加，但只有额叶的毒蕈碱型受体增加有统计学意义，而脑桥被盖背外侧核、伏隔核、黑质无明显改变[19]。PD病人的额叶、颞叶、顶叶、枕叶、海马、尾状核、壳核的烟碱型受体水平明显降低[20]。47 综述Adem等人[21]发现PD患者PBL上的毒蕈碱型受体与健康者相比没有明显不同，而PBL上的烟碱型受体较健康人少，后者与尸检大脑结果一致。但PBL上的烟碱型受体是否能够代表中枢该类受体水平，仍需进一步的研究证实，进一步的研究还应分析该类受体的含量与疾病的严重程度是否有关。3腺苷受体腺苷受体共有四种亚型，A[22]1、A2A、A2B和A3受体，均为G蛋白偶联受体。A1与A3受体对环磷酸腺苷的产生起抑制作用，而A2A和A2B受体能刺激腺苷酸环化酶，并引起环磷酸腺苷产生的增加。四种腺苷受体中A2A与帕金森病的发生发展最为密切。腺苷A2受体主要分布于纹状体，与多巴胺D2受体共表达，形成异源二聚体[23]。刺激腺苷A2A受体能降低多巴胺与D2受体的亲和力，并引起与D2受体相反的作用效果[24]。有学者认为A2A受体拮抗剂是治疗PD的另一种方法[25]。2009年Varani等人[26]对PD及无神经系统紊乱性疾病的死者进行豆状核壳A2A受体的测定，发现PD患者豆状核壳A2A受体密度显著增加，此外，他们还发现PD患者PBL膜上A2A受体表达量明显比对照组高，且PBL上A2A受体的数量和功能与UPDRS运动评分显著相关，这表明疾病的严重程度与A2A受体的增加有关。PD患者豆状核壳与PBL上的A2A受体均出现上调，这可能表明PBL可以反映中枢神经系统A[27]2A受体的变化情况。2013年Casetta等人也发现PD患者淋巴细胞膜上A2A受体上调，且患者该受体在淋巴细胞膜上的密度越高，就越有可能出现运并发症。由此可见，检测外周血淋巴细胞A2A受体的表达可能有助于PD的诊断，还能判断疾病的严重程度。4小结除前述相关生物分子外，人们还在PBL上发现许多可能与PD有关的的外周生物分子，如苯二氮卓受体[28]、参与细胞凋亡的物质[29]和可能与PD的发生有关的基因[30]等等，这些外周标志物也都可能为PD的诊断提供有效信息。以上多种证据表明PBL上多种分子物质可能作为生物标志物，用于早期诊断PD、监测疾病的进展和判断药物的疗效，以便指导PD的治疗，如果对多项特异性较高的指标进行综合分析，还可能提高诊断的灵敏度及准确性。然而目前的研究结48 综述果间还有较多的不一致，所以需要更加完善的试验以得出更为准确的结果，以尽早将该方法应用于临床。此外，还可以将这些标志物作为药物干预的靶点进行深入的研究，以改进PD的治疗。PBL也可能作为研究神经退行性疾病的良好的外周模型，用于探索人类尚未发现的奥秘。参考文献：[1].PachecoR,PradoCE,BarrientosMJ,etal.RoleofdopamineinthephysiologyofT-cellsanddendriticcells[J].JNeuroimmunol,2009；216(1-2):8-19.[2].FasanoM,AlberioT,ColapintoM,etal.Proteomicsasatooltoinvestigatecellmodelsfordopaminetoxicity[J].ParkinsonismRelatDisord，2008；14:S135-8.[3].FasanoM,AlberioT,LopianoL.PeripheralbiomarkersofParkinson'sdiseaseasearlyreportersofcentralneurodegeneration[J].BiomarkMed,2008；2(5):465-78.[4].KandelER,SchwartzJH,JessellTM.Principlesofneuralscience[M].4thed.NewYork:McGraw-Hill,2000:1227-46.[5].SibleyDR,MonsmaJrFJ.Molecularbiologyofdopaminereceptors[J].TrendsPharmacolSci,1992；13(2):61-9.[6].CivelliO,BunzowJR,GrandyDK,etal.Molecularbiologyofthedopaminereceptors[J].EurJPharmacol,1991；207(4):277-86.[7].CarontiB,TandaG,ColosimoC,etal.ReduceddopamineinperipheralbloodlymphocytesinParkinson'sdisease[J].Neuroreport,1999；10(14):2907-10.[8].RajdaC,DibóG,VécseiL,etal.Increaseddopaminecontentinlymphocytesfromhigh-doseL-Dopa-treatedParkinson’sdiseasepatients[J].Neuroimmunomodulation,2005；12(2):81-4.[9].LeFurG,MeiningerV,PhanT,etal.Decreaseinlymphocyte[3H]spiroperidolbindingsitesinparkinsonism[J].LifeSci,1980；27(17):1587-91.[10].NagaiY,UenoS,SaekiY,etal.DecreaseoftheD3dopaminereceptormRNAexpressioninlymphocytesfrompatientswithParkinson'sdisease[J].Neurology,1996；46(3):791-5.[11].BarbantiP,FabbriniG,RicciA,etal.IncreasedexpressionofdopaminereceptorsonlymphocytesinParkinson'sdisease[J].MovDisord,1999；14(5):764-71.[12].InnisRB,SeibylJP,ScanleyBE,etal.SinglephotonemissioncomputedtomographicimagingdemonstrateslossofstriataldopaminetransportersinParkinsondisease[J].ProcNatlAcadSciUSA,1993，90(24):11965-9.[13].CarontiB,AntoniniG,CalderaroC,etal.DopaminetransporterimmunoreactivityinperipheralbloodlymphocytesinParkinson'sdisease[J].JNeuralTransm,2001；108(7):803-7.[14].PellicanoC,ButtarelliFR,CircellaA,etal.DopaminetransporterimmunoreactivityinperipheralbloodlymphocytesdiscriminatesParkinson’sdiseasefromessentialtremor[J].JNeuralTransm,2007；114(7):935-8.49 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