《小麦矮缩病毒和大麦黄矮病毒PAV株系基于单克隆抗体的血清学检测技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
１４３２１单位代码：０３３５分类号：Ｓ．２１４１６０８５学号：硕士学位论文⑩中文论文题目：小麦矮缩病毒和大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系基于单克隆抗体的血清学检测技术－ｎｄｙｂａｓｅｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ英文论文题目：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｔｉｂｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅＰＡＹｓｔｒａｉｎｏｆＢａｒｉｅｖｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ申请人姓名：张明结指导教师：異建祥教授专业名称植物保护：研究方向：植物病理学所在学院：农业与生物技术学院论文提交日期：２０１７年３月 分类号：Ｓ４３２．１单位代码：１０３３５２４１６０学号：１８５硕士学位论文⑩中文论文题目：外麦矮继病毒和大麦黄矮病毒ＰＡＶ抶系基于单克隆抗体的Ａ清学楂测技术－英文论文题目：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｖｂａｓｅｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅＰＡＶｓｔｒａｉｎｏｆＢａｒｉｅｖｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ申请人姓名：张明皓指导教师：吴建祥教授专业名称：植物保护研究方向：植物病理学所在学院：农业与生物技术学院论文提交日期：２０１７年３月 小麦矮缩病毒和大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系基于单克隆抗休的血清学拾测技太⑩论文作者签名指导教师签名：论文评阅人１：双向隐名评阅评阅人２：评阅人３：评阅人４：评阅人５：答辩委员会主席：崔晓峰１委员：吴建祥委员２：李正和委员３：ｖｉｌ委员４：激趙答辩日期：２０１７年３月９日 －ｂａｓｅｄＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｖｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅＰＡＹｓｔｒａｉｎｏｆＢａｒｉｅｖｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ？Ａ＇ｕｔｈｏｒｓｓｉｎａｔｕｒｅ：ｇ’Ｓｕｅｒｖｉｓｏｒｓｓｉｎａｔｕｒｅ：ｐｇＥｘｔｅｒｎａｌＲｅｖｉｅｗｅｒｓ：Ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄＥｘａｍｉｎｉｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅＣｈａｉｒｅｒｓｏｎ：ｇｐＰｒｏｆ．ＸｉａｏｆｅｎｇＣｕｉ．ＥｘａｍｉｎｉｎｇＣｏｍｍｉｔｔｅｅＭｅｍｂｅｒｓ：Ｐｒｏｆ．ＪｉａｎｘｉａｎｇＷｕ．Ｐｒｏｆ．ＺｈｅｎｇｈｅＬｉ．Ｐｒｏｆ．ＪｉａｎＨｏｎｇ．Ａｓｓｏｃ．Ｐｒｏｆ．ＹａｎＸｉｅ．９ｔｈＤａｔｅｏｆｏｒａｌｄｅｆｅｎｃｅ：Ｍａｒ２０１７ 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表。与我示谢意。学位论文作者签名：签字日期：２０１７年３月９日学位论文版权使用授权书４本学位论文作者完全了解浙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被査阅和借阅。本人授权浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存。、汇编学位论文（保密的学位论文在解密后适用本授权书）＞学位论文作者签各：板＿爾■签名：签字日期：２０１７年３月９日签字日期：２０１７年３月９日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编： 致谢一个开始每，始终心怀期望。三年前我怀着对科学的敬畏和对美好未来的憧憬来到了浙江大学。这里是我人生新的起点，浙里满载着我对科研的期望。在这三年里：、，发生过很多事情，有些事我已忘记，但我现在还记得老师的叮嘱师……兄的关心、、、、师姐的爱护小伙伴的等待紧张的实验欢乐的生活时值毕业之际，我谨向所有关注、呵护我成长的师友深致感谢。首先，我要感谢我的导师吴建祥教授。从研究方向的确定、实验方案的设计、。实验技术的指导到实验数据的讨论，都离不开吴老师的帮助本论文的最终完成一丝也离不开吴老师逐字逐句的耐心修改与完善。吴老师严谨务实的治学态度，验可以顺利不苟的求是精神，精益求精的科研精神都让我受益匪浅，也让我的实的开展。吴老师每天准时来实验室工作的自律精神，对待工作认真的态度也值得一我终身学习。吴老师同长辈样关心我，在我迷茫时给我加油鼓劲，在我实验失败时帮我分析结果。吴老师的笑容也深深的印在我的脑海中，这种平易近人的人。格魅力对我影响深远，也将使我终生受益其次、、，我要感谢周雪平教授李正和老师谢艳老师、钱亚娟老师和王亚琴、良好的科研氛围老师为我们提供优秀的实验平台、领先的实验思路和完善的实验技术。、、另外我要感谢实验室的梅玉振师兄、胡涛师兄、傅帅师兄孙凯师兄许雄、、、彪师兄、仲雪婷师姐、钱莎莎师姐饶黎霞师姐马晓楠师姐党明青师姐、周昕师姐、李晨羊师兄、彭幸幸师姐等在实验技术的指导和在生活上的的帮助。同时感谢韩雪冬、肖茹元、王倩、赵丹阳、周婷婷等兄弟姐妹们在学习和生活上给予的关心和帮助。还要特别感谢卢莉娜师姐、陈浙师姐、宋革师姐，是她们让我可以更快的适应研究生生活，更好的融入病毒实验室；感谢孙朱元吉、张晓艳、、张天则的陪伴、王琦，是她们让我在沮丧难过时变得开心；感谢陈蕊师妹师弟黄德清师妹、，、黄悦师妹谢奕师弟对我实验的帮助。感谢让我在浙里遇见你们陪伴我度过人生中最好的两年半。最后，，我要感谢我的家人和朋友感谢他们给予我的鼓励与支持，让我鼓起Ｉ 勇气、扫清迷茫，让我更加坚定的走下去。每一个结束一一，终会如期而至，但这次的结束也是下次辉煌的起点。愿我们都能朝着我们的理想大步向前！张明皓２０１７年３月亍浙大紫金港ＩＩ 摘要小麦是世界上最主要的粮食作物一直饱受各种病原体侵染的影，但其生产却一响，其中之的病毒病原是影响小麦产量和质量的重要因素。目前已报道５０多种植物病毒可以侵染危害小麦，其中由小麦矮缩病毒（ｆｆ７ｉｅａｆｔ／ｗａｒ／Ｗｍｓ，ＷＤＶ）引起的小麦矮缩病和大麦黄矮病毒（５ａｒ／ｅ＿ｙ＿ｙｅ／／ｏｗｒｆｗａ／／ｖ／ｎｗｅｓ，ＢＹＤＶｓ引起的）小麦黄矮病在我国小麦种植区分布广泛，毎年均造成较大的产量损失。建立快速、准确、高通量的病毒检测技术是植物病毒流行病学研究、抗病育种及科学防控的关键。而以单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术操作简单、特异性好、灵敏度高，且适合大规模样品检测，因此被广泛应用于植物病毒的诊断和检测中，是目前植物病毒最主要的检测技术。但迄今为止，国内外未见以ＷＤＶ和ＢＹＤＶＰＡＶ株系单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术的应用报道。为此，本论文制备了多株分别抗ＷＤＶ和ＢＹＤＶＰＡＶ株系的单克隆抗体，并以单克隆抗体为核心分别建立了这两种病毒的高度特异和灵敏的血清学检测技术，从而为这两种病毒病的诊断与检测、预测预警和科学防控体系的建立提供技术支持。（１）抗ＷＤＶ单克隆抗体的制备及其检测应用：将ＷＤＶ的外壳蛋白（ＣＰ）基因克隆到原核表迗载体ＥＴ－３２ａ的多克隆位点中构建成重组原核表运载体ｐ＋２ＥＴ－３２３－ＣＰ－ｐ，并在大肠杆菌中成功表达。表达的重组蛋白通过ＮｉＮＴＡａｇａｒｏｓｅ纯化后作为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术获得了４株能够稳定传代并分泌抗ＷＤＶ单抗的杂交瘤细胞株（１８Ｇ１０、９Ｇ４、２３Ｆ４和２２Ａ１０）。４株杂交痛细胞株分泌的单抗的间接＂６ＥＬＩＳＡ效价均达到１０以上型及亚类均为，抗体类ＩｇＧｌ、ｋａｐｐａ轻链。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析发现，４株单抗均能与ＷＤＶ的ＣＰ发生特异性免疫反应，而不与任何小麦植物蛋白反应。根据血清学原理，以制备的单抗－ＥＬＳｄｏ－为核心建立了检测ＷＤＶ的ＡＣＰＩＡ和ｔＥＬＩＳＡ的血清学方法。其中，以２３Ｆ４２２Ａ０－ＥＬＳ１ＩＡ方法的灵敏度较高，检测ＷＤＶ病、单抗为核心建立的ＡＣＰ叶的灵敏度可以达到１：１６３８４０倍稀释々八，／〇＾）而以９０４、１８０１０单抗为核８，－ｗＥＬＩＳＡ１８１９２０／ｖ／心建立的ＡＣＰ方法的灵敏度也可达到：倍稀释（ｍＬ，ｇ）；以２３Ｆ４ｄｏ－ＥＬＩＳＡＤＶ单抗为核心建立的ｔ方法的灵敏度最高，检测Ｗ病叶的灵敏ＩＩＩ 度达到１：５１２０倍稀释（ｗ／ｖ，／ｍＬ）２２Ａ１０、１８Ｇ１０ｇ，以单抗为核心建立的ｄｏ－ＥＬＩＳＡ方法的１１２８０／／ｍＬ９Ｇ４ｔ灵敏度也可达到：倍稀释（ｗｖ，ｇ），而以单抗为ｄｏ－ＥＬＩＳＡ１核心建立的ｔ方法的灵敏度最低：６４０／ｖ／ｍＬ。用，为倍稀释（ｗ，ｇ）建立的血清学方法对采自陕西省和青海省的１２８个田间小麦样品进行检测，检测结果发现，有７９个样品感染ＷＤＶ，且血清学方法的检测结果与ＰＣＲ检测结果完全符合。ＰＣＲ产物测序和序列比对证明，血清学方法检测到的阳性样品确实感染ＷＤＶ。（２）抗ＢＹＤＶＰＡＶ单克隆抗体的制备及其检测应用：将ＢＹＤＶＰＡＶ病毒粗提液作为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术获得了６株能够分泌抗ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的杂交瘤细胞株（６Ｃ４、２４Ｇ４、２５Ｃ２、１５Ａ１２、１９Ｇ７和１８Ｃ２）。６株杂６交瘤细胞株分泌的单抗的间接ＥＬＩＳＡ效价均达到ＫＴ以上，抗体类型及亚类均－为ＩＧｌ、ｋａａ轻链ＹＤＶＰＡＶ的ＡＣＰＥＬＩＳＡｇｐｐ。以制备的单抗为核心建立了检测Ｂ和ｄｏ－－ｔＥＬＩＳＡ两种血清学方法。其中建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ／：１６３８４０倍稀释（＾＾１！＾８￥〇￥〇八￥小麦病叶的灵敏度最高可达到１，８），而与株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＷＤＶ、小麦黄花叶病毒ＷＹＭＶ）、大麦黄花叶病毒（５ａｒ／ｅ＿ｗ／／ｏｗｖ／ｍｙ，ＢａＹＭＶ）和中国小麦花叶病毒ｗＡｅａｉｍｏｒａｆｃｖｆｍｓ，ＣＷＭＶ）感染的小麦植物样品和健康小麦组织建立的ｄｏ－ＥＬＩＳＡＢＹＤＶＰＡＶ小呈阴性反应ｔ；方法检测感染麦病叶的灵敏度最高可达到１：２５６０倍稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ），而与检测的麦类其他病毒和健康小麦植物姐织呈阴性反应。用建立的两种方法对采自陕西省和青海省的１３５个田间小麦样品进行检测结果发现有８８品感ＢＹＤＶＰＡＶＲＴ－ＰＣＲ，且检，个样染测结果与的一致检测结果完全。ＰＣＲ产物测序和序列比对证明，两种血清学检测方法检测到的阳性样本中确实感染ＢＹＤＶＰＡＶ病毒。ＡＣＰ－关鍵词：小麦矮缩病毒ＰＡＶＥＬＩＳＡ；大麦黄矮病毒株系；单克隆抗体；；ｄｏ－ｔＥＬＩＳＡＩＶ ＡｂｓｔｒａｃｔＷｈｅａｔｉｓｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｏｄｃｒｏｐｉｎｔｈｅｗｏｒｌｄ，ｂｕｔｈａｓａｌｗａｙｓｂｅｅｎｉｎｖａｄｅｄｂｙｖａｒｉｏｕｓｅｐｉｄｅｍｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｓａｒｅｔｈｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｙｉｅｌｄａｎｄｑｕａｌｉｔｙｏｆｗｈｅａｔ．Ｉｔｈａｓｂｅｅｎｒｅｐｏｒｔｅｄｔｈａｔｍｏｒｅｔｈａｎ５０ｓｐｅｃｉｅｓｏｆｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ（ＷＤＶ）ａｎｄＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｅｓＢＹＤＶｓｃａｎｉｎｆｅｃｔｗｈｅａｔｌａｎｔｓ．ＷｈｅａｔｄｗａｒｆｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂＷＤＶａｎｄ，（）ｐｙｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙＢＹＤＶｓａｒｅｗｉｄｅｌｙｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎ－．ｗｈｅａｔｌａｎｔｉｎａｒｅａｓｉｎＣｈｉｎａｒｅｓｕｌｔｉｎｉｎａｓｅｒｉｏｕｓｉｅｌｄｌｏｓｓｅｖｅｒｅａｒｐｇ，ｇｙｙｙｖｅｄｈ－Ｄｅｌｏｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒａｉａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｉｈｔｈｒｏｕｈｕｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｉｓｐｐ，ｇｇｐｇｙ－ｃｒｕｃｉａｌｔｏｒｅｓｅａｒｃｈｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｉｄｅｍｉｏｌｏｂｒｅｅｄａｎｔｉｖｉｒｕｓｖａｒｉｅｔｉｅｓａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｐｐｇｙ，ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｌｔｌｉＣｔｄｉｉｃｒｅｖｅｎｔｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｓｓｅｍｏｆａｎｔｖｒｕｓｅｓ．ｏｍａｒｅｄｏｏｔｈｅｒｅｔｅｃｔｏｎｐｙｐｐｅｃｍｏｎｏｃｎａｎｄＭＡｂ－ｂａｓｅｄｅｒｏｓｒａｄｔｈｎｏｌｏｇｉｅｓｌｏｌａｔｉｂｏｓｌｏｉｃａｌａｓａｙｓａｒｅｓｉｍｌｅｉ，ｙ（）ｇｐ，ｐ，－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｅｃｉｆｉｃａｎｄｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｌａｒｅｓｃａｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｓｅｒｏｌｏｉｃａｌａｓｓａｙ，ｐｇ，ｇｈａｓｂｅｅｎｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｔｏｄｉａｇｎｏｓｅａｎｄｄｅｔｅｃｔｐｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄｎｏｗｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｏｒｔａｎｔｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒｓｏｆａｒｔｈｅｒｅａｒｅｎｏｒｅｏｒｔｓｐｐ，ｐ－ＷＤＶａ－ａｂｏｕｔｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｎｄＢＹＤＶＰＡＶＭＡｂｂａｓｅｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏ．ｌｏｉｅｓＦｏｒｔｈｉｓｕｒｏｓｅＭＡｂｓａａｉｎｓｔＷＤＶａｎｄＢＹＤＶＰＡＶｗｅｒｅｒｏｄｕｃｅｄｇｐｐ，ｇｐ，ａｎｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｏｒｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｖｉｒｕｓｄｅ．ｌｔｔｅｃｔｉｏｎｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓＴｈｏｓｅｒｅｓｅａｒｃｈａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔｓｗｉｌｒｏｖｉｄｅｔｅｃｈｎｉｃａｌｓｕｏｒｐｐｐｆｏｒｄｉａｎｏｓｉｓａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｆｏｒｅｃａｓｔａｎｄｆｏｒｅｗａｒｎｉｎａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｇ，ｇｒｅｖｅｎｏｎｄｃｏｎｓｓｆｈｓｅｗｏｈｅｉｒｕｄｉｅｓｐｔｉａｎｔｒｏｌｓｙｔｅｍｏｔｅｔｗａｔｖｓｓｅａｓ．（１）ＭＡｂｓａｇａｉｎｓｔＷＤＶａｎｄｉｔｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ（ＣＰ）ｏｆＷＤＶｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｍｕｌｔｉｌｅｃｌｏｎｉｎｓｉｔｅｓｏｆｒｏｋａｒｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｇｐｙｏｐ－ｔ－－ＥＴ３２ａｔｏｃｏｎｓｒｕｃｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｏｋａｒｏｔｉｃｅｘｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒＥＴ３２ａＣＰ．Ｔｈｅｐｐｙｐ，ｐｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒｏｔｅｉｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｔｈｅｎｕｒｉｆｉｅｄｐｙｐ，ｐ－ｔｈｈＮｉＮＴＡａｆｆ．ｒｏｕａａｒｏｓｅｉｎｉｔｃｏｌｕｍｎＴｈｅｕｒｉｆｉｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｅｉｎｗａｓｕｓｅｄｇｇｙｐｐｒｏｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅ，ａｎｄｆｏｕｒｈｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ１８Ｇ１０，９Ｇ４，２３Ｆ４ａｎｄｙ（ｖ ２２Ａ１０ｓｅｃｒｅｔｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｅｃｉｆｉｃＭＡｂｓａａｉｎｓｔＷＤＶｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｔｈｅ）ｇｐｇｙｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＴｈｅｔｉｔｅｒｓｏｆａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｓｏｆＭＡｂｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｆｏｕｒｈｂｒｉｄｏｍａｙ＇６ｃｅ－ｌｌｌｉｎｅｓｗｅｒｅｕｔｏ１０ｂｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ．ＡｌｌＭＡｂｓｗｅｒｅｉｓｏｔｅｄａｓＩｌｋａａｐｙｙｐｇＧ，ｐｐｌｉｈｔｃｈａｉｎ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔａｌｌｆｏｕｒＭＡｂｓｃｏｕｌｄｓｅｃｉｆｉｃａｌｌｒｅａｃｔｇｙｐｙｗｉｔｈｃｏａｔｒｏｔｅｉｎｏｆＷＤＶｂｕｔｎｏｔｗｉｔｈａｎｗｈｅａｔｌａｎｔｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｔｏｔｈｅｐ，ｙｐｐｇｆｔｌ－－ｎｃｉｌｅｏｓｅｒｏｌｏｗｏｓｅｒｏｏｉｃａｌａｓｓａｓａｎｔｉｅｎｃｏａｔｅｄｌａｔｅｅｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｐｒｉｐｇｙ，ｇｙ，ｇｐｙ－－ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙＡＣＰＥＬＩＳＡａｎｄｄｏｔｅｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａ（）ｙｙ－ｄｏｖ－（ｔＥＬＩＳＡ）ｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．Ａｍｏｎｇｔｈｅｍ，ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｉｔｙｏｆＡＣＰＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎＭＡｂｓ２３Ｆ４ａｎｄ２２Ａ１０ｗａｓｈｉｇｈｅｒ，ａｎｄｉｔｃｏｕｌｄｄｅｔｅｃｔｗｈｅａｔｌｅａｆｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｓ－ｄｉｌｕｔｅｄａｔ１：１６３８４０（ｗ／ｖ／ｍＬｗｈｉｌｅＡＣＰＥＬＩＳＡｂａｓｅｄｏｎＭＡｂｓ９Ｇ４ａｎｄ１８Ｇ１０，ｇ），ａｌｓｏｃｏｕｌｄｄｅｔｅｃｔｗｈｅａｔｌｅａｆｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｓｄｉｌｕｔｅｄａｔ１：８１９２０（ｗ／ｖ／ｍＬ．Ｔｈｅ，ｇ）ｄｏ－ｂａｄｏｎＭＡｂ２ｈｈｈｅｉｉｔＥＬＩＳＡｓｅ３Ｆ４ａｓｔｈｅｉｔｄｉｓｔｓｅｎｓｉｔｖｔａｎｄｓｅｔｅｃｔｉｏｎｇｙ，－－ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｆｏｒＷＤＶｉｎｆｅｃｔｅｄｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｕｔｏ１：５１２０ｗ／ｖ／ｍＬ．ＴｈｅｄｏｔＥＬＩＳＡｙｐ（，ｇ）ｂａｓｅｄｏｎＭＡｂｓ２２Ａ１０ａｎｄ１８Ｇ１０ｈａｓａｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆ１：１２８０（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ）ｆｏｒＷＤＶ－ｉｎｆｅｃｔｌｅａｖｅｓｉｌｅｔｈｅｅｄｗｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｏｆｔｈｅａｓｓａｂａｓｅｄｏｎＭＡｂ９Ｇ４ｗａｓ，ｙｙｌｏｗｅｒｕｓｔ１６４０／／ｍＬ．Ａｔｌ１２８ｔｓｌｆｒＳｈｉｉｈａｉ：ｗｖｔｏａｏｆｗｈｅａａｍｅｓｏｍａｎｘａｎｄｎ，ｊ（，ｇ）ｐＱｇｒｏｖｉｎｃｅｓｉｎＣｈｉｎａｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅｏｆＷＤＶｕｓｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｅｄｐｐｇｐａｓｓａｓａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ７９ｏｆｔｈｅ１２８ｗｈｅａｔｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｙ，ｐｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＷＤＶ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｗａｓｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｗｉｔｈ＊ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲ．ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｐｒｏｖｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓｔｅｓｔｅｄｂｙｔｈｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙｓｗｅｒｅｒｅａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｂｙＷＤＶ．２ＭＡｂｓａａｉｎｓｔＢＹＤＶＰＡＶｓｔｒａｉｎａｎｄｉｔｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｌｉｃａｔｉｏｎ：ＴｈｅＢＹＤＶ（）ｇｐｐ－ｆｅｃｄＰＡＶｉｎｔｅｗｈｅａｔｌｅａｆｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｍｍｕｎｉｚｅＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅａｎｄｓｉｘ，ｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓ（６Ｃ４，２４Ｇ４，２５Ｃ２，１５Ａ１２，１９Ｇ７ａｎｄ１８Ｃ２）ｓｅｃｒｅｔｉｎｇｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃＭＡｂｓａｇａｉｎｓｔＢＹＤＶＰＡＶｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＴｈｅｔｉｔｅｒｓｏｆａｓｃｉｔｉｃｆｌｕｉｄｓｏｆＭＡｂｓｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｓｉｘｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓｗｅｒｅｕｐｔｏ＂６－１０ｂｉｎｄｉｒｅｃｔＥＬＩＳＡ．ＡｌｌＭＡｂｓｗｅｒｅｉｓｏｔｅｄａｓＩＧｌｋａａｌｉｈｔｃｈａｉｎ．Ｂａｓｅｄｙｙｐｇ，ｐｐｇＶＩ ｈＭＡｂＡＣＰ－Ｓｄｄｏ－ＥＬＩＳＡｔｅｒｅａｒｅｄｓＥＬＩＡａｎｔｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｅｄｆｏｒＢＹＤＶＰＡＶｐｐ，ｐｄｅｉｉｉｉｉｆｉｉｌｌｄｈａｈｄｌｄｔｅｃｔｏｎ．ＴｈｅｓｅｎｓｔｖｔｙａｎｄｓｐｅｃｃｔｙａｎａｙｓｅｓｒｅｖｅａｅｔｔｔｅｅｖｅｏｐｅＡＣＰ－ＥＬ－ＩＳＡｃｏｕｌｄｄｅｔｅｃｔｍｉｎｉｍｕｓｖｉｒｕｓｉｎＢＹＤＶＰＡＶｉｎｆｅｃｔｅｄｗｈｅａｔｌｅａｆｃｒｕｄｅｅｘｔｒａｃｔｓｄｉｌｕｔｅｄａｔ１：１６３８４０ｗ／ｖ／ｍＬａｎｄｔｈｉｓａｓｓａｈａｓａｎｅａｔｉｖｅｒｅａｃｔｉｏｎｗｉｔｈ（，ｇ），ｙｇｈｅａｌｔｈｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓａｎｄｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｉｎｆｅｃｔｅｄｂＹＤＶＧＡＶ，ＢＹＤＶｙｙｙＢＧＰＶ，ＷＤＶ，Ｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ（ＷＹＭＶ），ＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＢａＹＭＶａｎｄＣｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｏｆｔｈｅ（）（ＣＷＭＶ）ｙｄｅｖｅ－ｆｏ－ｄｗｈｅａｌｏｅｄｄｏｔＥＬＩＳＡｒＢＹＤＶＰＡＶｉｎｆｅｃｔｅｔｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｕｔｏ１：１２５６０ｗ／ｖｐｐ（，／ｍＬ），ａｎｄｔｈｉｓａｓｓａｈａｓａｎｅａｔｉｖｅｒｅａｔｉｏｎｗｉｔｈｈｅａｌｔｈｗｈｅａｔｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｏｔｈｅｒｇｙｇｗｈｅａｔｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｔｏｔａｌｏｆ１３５ｗｈｅａｔｐｌａｎｔｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＳｈａｎｘｉａｎｄＱｉｎｇｈａｉｐｒｏｖｉｎｃｅｓｉｎＣｈｉｎａｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆＢＹＤＶＰＡＶｗｉｔｈｔｗｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｓａｙｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ８８ｏｆｔｈｅ１３５ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｉｎｆｅｃｔｅｄｂＢＹＤＶ－ＰＡＶ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲＴＰＣＲｏｆｔｈｅｆｉｅｌｄｓａｍｌｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｙｐｗｉｔｈｔｈｅｓｅｒｏｌｏｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ．ＳｅｕｅｎｃｉｎａｎｄｓｅｕｅｎｃｅｃｏｍａｒａｔｉｖｅａｎａｌｓｅｓｇｑｇｑｐｙｏｆｔｈｅＰＣＲｒｏｄｕｃｔｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＢＹＤＶＰＡＶｉｎｄｅｅｄｅｘｉｓｔｅｄｉｎｔｈｅｏｓｉｔｉｖｅｐｐｓａｍｌｅｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｔｈｅｔｗｏｓｅｒｏｌｏｉｃａｌａｓｓａｓ．ｐｙｇｙ＇ＭＫｅｗｏｒｄｓ：ＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓＰＡＶｓｔｒａｉｎｏｎｏｃｌｏｎａｌｙ，ｙｙｆ；－－ａｎｉｂＡＣＰＥＬＩＳＡＤＥＬＩＳＡｔｏｄｏｔｙ；；ＶＩＩ 目录ＩＭＩｌｌ磐ＡｂｓｔｒａｃｔＶ＠ｔＶＩＩ第一章文献综述１１小麦矮縮病毒的研究进展１１．１寄主范围与侵染症状２．２３１发生与分布１．３传播介体３１．４发病规律５１．５病５毒粒子形态和株系划分１．６病毒的分子生物学特征６１．７小麦矮缩病毒检测技术７１７１７．．生物学检测方法１．７２电子显微镜检测方法７．１．７．３分子生物学检测方法７１７４血８．．清学检测方法１．８防治措施９．１８．１选育推广抗病品种９１８２农业与生态防治９．．．１８．３物理与化学防治９９２大麦黄矮病毒的研究进展２１０．１症状特点、寄主范围及传播方式２．２病毒分类地位与株系划分１１２．３病毒粒子形态和生化特性１３２４发生与分布１３．２．５基因组结构与功能１５２．６传播介体１７２．７大麦黄矮病毒的检测方法１８２１．７．生物学检测方法１８２．７．２电镜检测方法１９ＶＩＩＩ ２．３１９．７分子生物学检测方法２７４血１９．．清学检测方法２．８防治措施２０２８１２０．．筛选、培育和鉴定抗病品种２．８．２农业防治２０２．８．３化学防治２１３单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用２１３．１抗体的结构及特性２２３．２单克隆抗体技术２３３．２．１杂交瘤技术基本原理２３３．２．２杂交瘤技术基本流程２４３．３单克隆抗体在植物病毒学中的应用２５３．３．１病毒病害的诊断与监测２５３．３．２病毒株系鉴定及分离物分型３０３３０．３．３病毒蛋白抗原表位分析３．３．４其他应用３１４研究ｇ的和意义３１第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用３３１材料与方法３３１．１病毒材料３３、菌株和质粒１．２培养基、抗体及实验材料３３１．３ＷＤＶＣＰ的原核表迗３４１．３．１ＣＴＡＢ法提取感染ＷＤＶ小麦植物的总ＤＮＡ３４１．３．２ＷＤＶＣＰ基因的扩增３５３３ＰＣＲ３６１．．产物的纯化１３４ＰＣＲ产物Ｔ载体连接３７．．与１．３．５热击法转化和重组子筛选３７３６３８１．．重组质粒的提取－－１３７ＥＴ３２ａＣＰ３８．．ｐ重组载体的构建及转化１４ＷＤＶＣＰ蛋白的表达及纯化３９．１．４．１ＷＤＶＣＰ的诱导表迗３９１４２３９．．重组蛋白的纯化ＩＸ １．４．３蛋白的透析及复性４０－１．４．４ＳＤＳＰＡＧＥｔｂ和Ｗｅｓｅｒｎｌｏｔ４０１．５单克隆抗体的制备４２１．５．１纯化蛋白免疫小鼠４２．．１５２细胞融合及培养４３１．５．３杂交瘤细胞的单克隆化及扩增４３１．５．４杂交瘤细胞的冻存和复苏４４１．５．５腹水抗体的制备及纯化４４１．５．６腹水抗体效价的测定４５．１．５７单克隆抗体类型及亚类鉴定４５１－６血清学方法的建立及特性分析４６１－．６．１ＡＣＰＥＬＩＳＡ４６方法的建立及其特异性和灵敏度分析－１．６．２ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异性和灵敏度分析４７１．７血清学方法的田间应用４８２结果与分析４８．２１ＷＤＶＣＰ的原核表达和纯化４８２．２细胞的融合５０、筛选和克隆２．３腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定５０２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＷＤＶ单抗的特异性５１２－．５ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法的建立及其特性分析５２２－．５．１检测植物中ＷＤＶ的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法的建立５２２－．５．２ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的特异性分析５２２－．５．３ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ５３单抗的灵敏度分析－２．６ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立及其特性分析５３－２．６．１检测植物中ＷＤＶ的ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立５３ｄ－２ＥＬＳ．６．２ｏｔＩＡ方法和ＷＤＶ单抗的的特异性分析５４－２．６．３ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的的灵敏度分析５５２．７血清学方法的田间应用５５３Ｈｉｔ５７第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用５９１９材料与方法５１．１病毒材料５９１２．培养基、抗体及实验材料５９Ｘ １．３免疫原的制备６０１４６０．单克隆抗体的制备１．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｏｔ分析单抗的特性６０ｌ６０１．６血清学方法的建立及特性分析－１．ＣＰＥＬＩＳＡ６０．６１Ａ方法的建立及其特异性和灵敏度分析－１２ｄｏｔＥＬＩＳＡ方６１．６．法的建立及其特异性和灵敏度分析－１７ＲＴＰＣＲ６１．方法检测ＢＹＤＶＰＡＶ１．７．１ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡ的方法６１－６２１．７．２ＲＴＰＣＲ反应１．８血清学方法的田间应用６３２６３２．１细胞的融合、杂交瘤的筛选和克隆６３６４２．２腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性６４－２４ＡＣＰＥＬＳＡ６５．Ｉ方法的建立２４１－ＥＬＩＳＡ方法的建立检测植物中ＢＹＤＶ６５．．ＰＡＶ的ＡＣＰ－２．６５．４２ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性分析－２６６．４．３ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的灵敏度分析２ｔ－６７．５ｄｏＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异性和灵敏度分析－２．１ＢＹＤＶＰＡＶ的ｄｔＥＬＩＳＡ６７．５检测植物中ｏ方法的建立２－．５．２ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性分析６８２－６９．５．３ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的灵敏度分析２．６血清学方法的田间应用６９３Ｈ７１ｉｔ全文总结７３参考文献７５附录Ａ本论文中所用病毒缩写及中英文对照９１附录Ｂ常用生化及分子生物学试剂与仪器９３附录Ｃ常用缓冲液及培养基配方９４ＸＩ ：：；：浙丨：九７硕１７位论文第一章文献综述一小麦是小麦属（７Ｗ／／ｃ？ｗ）植物的统称，是种在世界各地广泛种植的禾本科Ｐｏａｃｅａｅ植物。目前种植最为广泛的是普通小麦（７１？ｅｓ７／ｒ＂ｗ，其产量约占全部（））９５一ａｅ小麦的％，是世界第大粮食作物Ｍｒｅｔａｌ．２０１４。（ｙ，）据联合国粮农组织ＦＡ０２０．统计１５，７３４，，截至年小麦产量已达到亿吨中国为小麦产量最高的（）国家。小麦在中国种植十分广泛、、，北至黑龙江吉林，西至新疆西藏，南至广东、云南等省，是中国第二大粮食作物。由植物病毒引起的植物病害种类很多，５０到目前为止，世界上已经报道至少有多种病毒可以感染小麦。在中国，病毒一严重病害也是危害小麦比较严重的类病害（王锡锋等２０１０。近年来我国危害、，）分布广泛的小麦病毒病害既包括小麦黄花叶病和中国小麦花叶病等土传小麦病毒病，也有经蚜虫传播的小麦黄矮病和经叶蝉传播的小麦矮缩病等（燕飞等，２０１３）。由于小麦病毒病的发生具有爆发性和间隙性的特点，加之缺乏抗病品种和有效的控制药剂，常导致小麦产量大幅降低，从而威胁我国的粮食安全。１小麦矮缩病毒的研究进展一小麦矮缩病ｈｅａｔｄｗａｒｆｄｉｓｅａｓｅ。＜Ｗ）是目前危害小麦生产的主要病毒病害之１９６１年Ｖａｃｋｅ在捷克斯洛伐克发现小麦出现了矮化观象，其认为该病害是由叶＇＇－一禅传播的种病毒引起的，并将病原命名为小麦矮缩病毒（ｃ／ｍ＂ｒ／／７／．ｓ／，ａｃｋｅ、ＷＤＶＶ丨９６。丨９８０ｎｓｔｅｎ＞（１年Ｌｉｄ等珣过提纯病毒粒子确认了ＷＤＶ是」，羑）一矮缩病的病原Ｌｔ．。ｉｎｄｓｅｎｅｔａｌ丨９８０步分析了ＷＤＶ的形态学特怔后（，在进，）Ｌｎｄ’ｓｔｅｎ等发ＤＶＨａｏｎｓｉ现Ｗ与之前ｒｒｉｓ等报道的玉米线条病毒（Ｍ，／ｒｅｖ／ｍ，ＭＳＶ）（Ｈａｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．，１９７７）有相同的形态学特点。１９１２、１９１５、１９１８和１９４２年，瑞典的冬小麦曾爆发过一种与小麦矮缩病症状相同的黄化病（被称为“”ｓｌｉｄｓｕｋａ能确认这祌黄化病是否是由ＷＤＶ引起ｊ，虽然不，）但这可能表明ＷＤＶ在瑞典存在了１００多年Ｌｉｎｄｓｔｅｎｅｔａｌ．７０Ｌｉｓｔｅｎａｎｔｅ】。（１９ｎｄｄＬｉｎｄｓｎ９９９，；，）经过几十年的研究，现已对ＷＤＶ的寄主范围、侵染症状、发生分市、传播体和发病规律等有了更加深入的认识。１ 第？章义献综述１．１寄主范围与侵染症状ＷＤＶ主要侵染禾本科植物，如小麦（７Ｗ减？ｗｗ）、大麦（／／ｗｚ／ｅｗｍｖｗ／ｇｏｒｅ）、ｆｃａ／ｅｃ：黑麦（Ｓ＜？ｍ／／ｅ和燕麦（ｄｖｅｍ／ｍ／Ａｗ｝等禾本科作物和黑麦草Ｌｏ／／＂／ｗ）（ｅｒｅｎｎｅ，多Ｌ．燕麦草ＡｉＰｖｃ／ｐ）花黑麦草、＂＂“、草地早熟禾＜（（＋／）（．．’ｓ／．．ｓ和洋狗尾草ｃｒ／．ｓ／？／＂ｖ等多种杂草（Ｒａｍｓｅｌｅｔａ．２００９Ｒｉｍ／ｍｌｌｌｐ）），；ｐａｎｄＫｕｎｄｕ，２０１５）〇小麦矮缩病病株在田间常呈块状出现，其典型症状是植株严重矮缩、黄化、条斑、分蘖增多、抽穗减少或不抽穗等，使小麦产量大幅度降低，最高可减产８０％以上（ＬｉｎｄｂｌａｄａｎｄＳｉｇｖａｌｄ，２００４；王江飞等，２００８）。小麦在拔节前受到ＷＤＶ２０ｃｍ１０浸染会造成植株矮缩，轻者株高，重者仅ｃｍ，且植株不再增高；拔节后的小麦受到侵染会造成分蘖长短不一部产生众多的小分蘖（囹１．丨。，根＞受小麦品种、生长期等多种因素的影响，感染ＷＤＶ的小麦叶片可以呈现出多种不同症状：有些叶片严重黄化，有些保持浓绿；有些叶片出现槌绿斑晕圈，有些则出现不规则的樋绿斑块；还有的叶片叶尖呈现紫褐色，叶脉黄绿相间，心叶失绿变黄。发病严重的植株在拔节前即死亡，发病较轻的楦株虽能拔节，但多不抽穗，即使抽德，籽粒也不实（Ｋｖａｍｈｅｄｅｎｅｔａｌ．，２００２）。■Ｈ图１．１小麦感染ＷＤＶ后的发病症状（引自庞俊兰２０１２；Ｎｒｃｎ．２０１６），ｙｇＡ，感染ＷＤＶ的小麦田Ｂ，矮化的小；Ｃ矮化、黄萎Ｄ矮；麦植株，、褪绿的的冬小麦；，化、黄萎的小麦；Ｅ，２０１０年瑞典感染ＷＤＶ的冬小麦田。Ｆ１１ＳｗｈｅａｔｗａｒｆｉｅａｓｅｏｎｗｈｅａｔｌａｎｔｓＤｅｒｉｖｅｒｏｍＰａｎ２０１２Ｎｒｃｎｉ．ｍｔｏｍｓｏｆｄｄｓｐｄｆ，；ｇｙｐ（ｇｙｇ，２０１６）－ｄｗｈｅａｆｌｄｆｗｈｅａｌＣｈｅａｌｉｈｉｋＡ．ＷＤＶｉｎｆｃｃｔｃｔｉｅ．Ｂ．ｄｗａｒｔｐａｎｔｓ．．ｗｔａｎｔｓｗｔｓｔｕｎｔｅｄｓｅａｎｄｐｐｗａｒｆ－ｃｈｌｏｒｏｔｉｃａｎｄｄｉｓｃｏｌｏｒｅｄｌｅａｖｅｓ．Ｄｗｈｅａｔｌａｎｔｓｗｔｈｃｈｌｏｒｏｔｉｃｌｅａｖｅｓ．ＥＷＤＶｉｎｃｔｃ，ｄｐｉ，ｆｅｄｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｆｉｅｌｉｎｗｅｄｅｎｉｎ２０１０．ｔｄＳ＊） ‘：ｉ：尺学颀１：７位浙；ｉｔｉ１．２发生与分布小麦矮缩病最早发现于欧洲１１，且大部分欧洲国家如捷克（Ｖａｃｋｅ９６、，）芬＾－兰１１１１１１１６？＾１１（１１１１１１１８６匕＼＾丨８１〇１３，２００５）、法国８６１１（１３１１１１１３１１６１９９５、德国出１１＾１（｝（，），２０００ｔｔ．ｔ．１Ｌｉｎｄ、匈牙利（Ｂｉｓｚｒａｅａｌ１９８９、ａｓｅａｌ２０１、ｓｔｅｎ）ｙ，）乌克兰（Ｔｏｂｉ，）瑞典（ａｎｄＬｉｎｄｓｔｅｎ１９９９ａｋａｒｄｔａ．２００４Ｒｕｂｉｔ、保ｉｅｖａｅｌ、ｅｓＡｕｏｎｅｌｌ，）加利亚（Ｂｊ，）意大利（ｅｔａｌ．，１９９５）、罗马尼亚（ＪｉｌａｖｅａｎｕａｎｄＶａｃｋｅ，１９９５）、波兰Ｊｅｚｅｗｓｋａ，２００１、西（）班牙（Ｂｕｋｖａｙｏｖａｅｔａｌ＿，２００６）、斯洛伐克（Ｂｕｋｖａｙｏｖａｅｔａｌ．，２００６）和土耳其Ｋ６ｋｅｔａ．ｌＵｌ２００７等都已报道过小麦矮缩病的发生。除此之外，非洲和亚洲的赞（，）２０比亚ＫａｏｏｒｉａａｎｄＮｄｕｎｕｒｕ０４、ａａｒｅｔａｌ２００７、叙（ｐｇ，）突尼斯（Ｎｊ．利亚，）Ｅｋｚａｅｚｅｔａ．、ｅａｔｎａｅｔａ２０１１（ｌ２０１０伊朗（Ｂｈｉｌ．和中国（Ｘｉｅｅｔａｌ．２００７ｙ，）ｊ，），）等国京也报道了小麦矮缩病的发生。２００７１在中国，小麦矮缩病最早于年在陝西韩城发现，当时发病面积达到万亩，发病田平均病株率高迗８０％，严重矮缩病株约占２０％，＋麦产量平均减５０％－８０％２００８２００８少，有些田块甚至绝产绝收（王江飞等。而，陝西，）在年韩域小麦矮缩病发生更为严重１０，发病面枳超过万亩，病株率２０％以上的重病田达到１万亩（稻羑重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究课题组２０１１。目，，）前该病毒病在、．河北、云南、山西、甘肃、河南等我国的１３１主要小麦生产畜份也相继发生。１．３传播介体、一ＷＤＶ的主要传播＂丫十轉／＾“臟７他川Ｄａｈｌｂ的项｜体是异汗（）。最近研？￡表明＜，与异沙叶蝉同属的戶？ｒｏｖ／／７ｃ７：／／／：ｙ同样可以传播ＷＤＶＥｋｚａｅｚｅｔａｌ．／，（ｙ＇ｐ２０１０。异；少什蝉属于同翅目Ｈｏｍｏｔｅｒａ十蝉科Ｃｃａｅａｅ沙叶禅属（）（ｉｄｌｌｉｄ））ｐＡ？广泛分市于欧洲讀／？Ｗｅ／／／．Ｙ（，、北，Ｎｉｅｌｓｏｎ）美洲另外非洲和亚洲也有分布（，１９６８。异沙叶蝉成虫体长４４．３ｍｍ），全体灰黄色，头部呈純角突出，头冠近端、处具浅褐色斑纹丨对，后与黑褐色中线连接１，两侧中部各有彳不规则的大型斑块纟形纹，近后ｆ处又各生逗点２个，额面两侧有黑褐色横纹ｕｒｕｎｅｔａｌ．（Ｍａｎｇ、３ 第ｉ献沒述２００４）。复眼黑褐色，１对單眼，前胸背板有５条浅黄色至灰白色条纹纵贯前胸背板，且与４条灰黄色至褐色较宽纵带相间排列。小盾板两侧角有暗褐色斑，中间２有明显的褐色点个，横刻纹褐黑色，前翅浅灰色、半透明、翅脉黄白色、，胸部腹部黑色，足浅黄色。卵浅黄色，长卵形，长０．９３ｍｍ。若虫共５龄，５龄时背一（１）〒部可見深褐色纵带，苦虫汄３５天。龄发育到五龄需要１３（１３２００４丨．２０（：山１１北１１〇＾乂３１么图。成虫，冬，也＞（）财低温季时麦田仍可见其成活°８Ｃ时活动受５：＿夏季气温髙于２：扪奉：。成虫善跳，趋光性较弱，遇惊扰可飞行３５ｍ，？－Ｗ每干１４１６多在麦丛基部Ｌｉｎｄｂ时活动最盛，及天或夜间蜚伏（ｌａｄａｎｄａｅｍ，２００２５－。代、３４，以成若虫在麦田越冬。北方冬麦区年发生）长江流域年发生２０代，春麦区３代，以卵在麦茬叶鞘内壁或怙枝落叶上越冬（王锡锋等１０，）ｍ８ｃ１ｊＶ图１．２ＷＤＶ的传播介体异沙叶蝉Ａ和Ｃ，异沙叶蝉成虫；Ｂ，异沙叶蝉若虫。Ｆ１．ｉｅｓｔｖｅｃｔｉｇ２ＰｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘａｌｎｕＤａｈｌｂ．ｈｅｏｒｏｆＷＤＶＡａｎｄＣ，ａｄｕｌｔ．Ｂ．ｎｙｍｐｈ．异沙叶蝉以剌吸式口器吸ｔ含有ＷＤＶ的叶片韧皮部汁液时而带毒，但是病毒不能在异沙叶蝉体内增殖。ＷＤＶ可能通过细胞吞吐作用突破中肠屏障，并存一ＤＶ储于异沙叶蝉的中肠：第祌途径是Ｗ。病毒在异沙叶蝉体内有两种循环途泾由食道逬入滤室一，滤室内的部分病毒扩散到滤室肌肉层并释放到血淋巴，经血－５ｉ二淋巴到达唾液腺ｌＯｎｉｎ，这祌途径发生在饲毒后，并且只能维持数小时；第种途径是滤室中部分病毒随着ｔ物到达中肠，经前中肠和中中肠释放到血淋巴，４ 浙江大学硕士学位论文５－２０ｍ最后到达唾液腺ｉｎ，但２０１３，这种途径发生在饲毒后１能维持数周（王亚娇，；Ｗ一ａｎｅｔａｌ．２０１４。在，ｇ，）下次的取食时异沙叶蝉将与唾液混合的ＷＤＶ病毒粒子注入寄主植物内部。成虫和若虫皆可传播ＷＤＶ，但随着龄期的增加，传毒效率有所降低。１．４发病规律由于ＷＤＶ由异沙叶蝉以持久性非增殖方式在田间传播，因此小麦矮缩病的发生规律受到异沙叶蝉的生物学特点和发生分布的显著影响。异沙叶蝉秋季时在多种秋作作物和杂草上产卵以越冬，卵在春季开始孵化。初春时小麦返青，带毒的异沙叶蝉在麦田危害并传播ＷＤＶ。夏季小麦收割后，成虫迁至秋季作物及杂草上。此时，田间杂草和多种作物既是ＷＤＶ的寄主，也是异沙叶蝉生息的场所，为ＷＤＶ的传播提供了毒源。秋季杂草枯萎，异沙叶蝉转移到新出苗的小麦田，小麦出苗越早，叶蝉对其危害越重，若此时叶蝉带毒，小麦发病会较重（稻麦重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究课题组２０１１。温度等环境因素是影响异，）°１５Ｃ秋季沙叶蝉的关键性因素，异；。当温度超过时沙叶蝉群体数量显著增加低温可以降低叶蝉的传毒能力。１．５病毒粒子形态和株系划分小麦矮缩病毒属于双生病毒科（Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ）玉米线条病毒属直径为．Ｍａｗｒｃｖ／ｒｔｗ）。ＷＤＶ病１８ｎｍ２０面体对１３，（毒粒子孪生颗粒状，，称图＞（由蛋白质和核酸组成，核酸重量为粒子重量的２０％，蛋白衣壳呈六边形。Ｈｉ图１．３ＷＤＶ病毒粒子的电镜照片Ｆｉｇ１．３ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆＷＤＶｇｅｍｉｎａｔｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ５ 第一章文献综述ＷＤＶ可分为两种株系一一根据寄主的不同，，种株系可以侵染小麦，另种株系可以侵染大麦。但关于在自然条件下小麦株系能否侵染大麦和大麦株系能否侵染小麦的问题还没有定论。虽然有报道认为小麦株系和大麦株系可以分别侵染一大麦和小麦。序列测定发现ＷＤＶ小麦株，但般认为大麦对小麦株系具有抗性６９．８％系和大麦株系差异很大，全基因组同源性仅在左右。基于从田间调查获得的ＷＤＶ分离物的ＤＮＡ序列，Ｓｃｈｕｂｅｒｔ等提出应该将ＷＤＶ分成三个种，即ＷＤＶ、大麦矮缩病毒ｔ／ｎｗ／ｖ／ｍｓ，ＢＤＶ）和燕麦矮缩病毒（ＯａｆＯＤＶ）Ｓｃｈｕｂｅｒｔｅｔａｌ”２００７）。（Ｍｕｈ一２０１３年，ｉｒｅ等提出了套基于全基因组两两相似性比对的玉米线条病０ＤＶ分离出来一个单独的种毒属病毒分类标准提案，并将ＷＤＶ，建议将作为一－ＩＣＴＶＭ分为ＡＥ五个株系，这提案也已被认可并在网站上公开（ｕｈｉｒｅｅｔａｌ．，２０１３。）１．６痏毒的分子生物学特征ＷＤＶ基因组是由２７３９－２７５０个核苷酸组成的环状单链ＤＮＡ４，由个编码区和２个非编码区组成。ＷＤＶ的病毒链含有ＶＩ和Ｖ２两个开放阅读框，分别编码运动蛋白（ＭＰ）和衣壳蛋白（ＣＰ）；反义链含有Ｃ１和Ｃ２两个开放阅读框，分别编码两个复制酶相关蛋白酶（Ｒｅｐ和ＲｅｐＡ）（Ｋｖａｒｎｈｅｄｅｎｅｔａｌ．，２００２）。非编码区由短非编码区（Ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｒｅｇｉｏｎ，ＳＩＲ）和长非编码区（Ｌｏｎｇｉｎｔｅｒｇｅｎｉｅｒｅｇｉｏｎ，ＬＩＲ组成。）ＷＤＶ的Ｒ一８６工后产生ｅｐ基因含有个由个碱基组成的内含子，经剪接加’的ＲＮＡ转译产物为４１ｋＤａ的多功能融合蛋白。ＭＰ基因的３端是ＣＰ基因的启动位点。ＬＩＲ含有双生病毒复制起始所需的ＴＡＡＴＡＴＴＡＣ碱基保守序列和其它作用元件（Ｗｕｅｔａｌ．，２０１５）。ＳＩＲ含有转录终止信号，病毒链和互补链的转录均在ＳＩＲ终止。ＷＤＶ的基因组结构如图１．４所示。６ 浙江大学硕士学位论文ｉｔ＼ＲｅｐＡｌｌｌＲｅｐＩ／－ｍｉ７ｉ７２ｓｉｉｎｔＭｉｍＩＪｔｒｏｎ－ｉｎｑｍｊｊｊｊｌｌｌ９Ｋｌ．６９ｎｔ２０１２图．４，）１小麦矮缩病毒的基因组结构图（引自庞俊兰ｉｆｒｏｍＰａｎ２０１２ＦｉｉｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓＤｅｒｖｅｄ，ｉｇ１．４Ｔｈｅｅｎｏｍｃｏｒａｎｚａｆ（ｇ）ｇｇ１．７小麦矮缩病毒检测技术目前主要有四种方法用于检测ＷＤＶ，即生物学检测方法、电子显微镜检测。方法、分子生物学检测方法和血清学检测方法１７１．．生物学检测方法ＷＤＶ在田间发生时常呈块状出现、黄化、条斑、，小麦病株呈现严重矮缩分蘖增多、抽穗减少或不抽穗等症状，可根据这些特点在田间进行初步判定。１．．７２电子显微镜检测方法ＷＤＶ病毒粒子呈２０面体，颗粒直径ＩＳｎｍ，可以根据待检测样品在电子显由ＷＤＶ侵染（Ｌｉｎｄｓｔｅｎｅｔａｌ．１９８０。徽镜下的形态和大小确定植株是否，）１．７．３分子生物学检测方法１技术（）核酸斑点杂交ＳＨＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＮＡ指将待测的核酸斑点杂交技术ｐ，）是（７ 第一章文献综述ＤＮＡ变性后点在尼龙膜上，用已标记的探针进行杂交，洗膜后通过放射自显影来判断样品中是否有病毒核酸。金文等制备了基于地高辛标记的ＤＮＡ探针，将ＮＡＳＨ检测技术用于ＷＤＶ的快速诊断和鉴定中（金文等，２０１５）。该方法可以区分与ＷＤＶ症状相似的小麦其他病毒，如ＢＹＤＶＧＰＶ／ＧＡＶ／ＰＡＶ株系；其检测灵敏度迖到１．３３ｎ／，正确率在９９％以上。但其缺点为操作复杂ｇｎＬ、成本高。２ＰＣＲ检测方法（）王江飞等根据ＷＤＶ不同地区分离物基因组中的保守序列设计了４对引物，利用ＰＣＲ方法鉴定陕西韩城新发现的小麦病毒病害样品，证实该样品确实是ＷＤＶ侵染所致王江飞等２００Ｍａｎ探针方法建立了一８。（，）张珣等基于Ｔａｑ套可ｅａ－以定量检测小麦和异沙叶蝉体内ＷＤＶ小麦株系的ＲｌｔｉｍｅＰＣＲ方法（张珣，２００８；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．，２０１０）。王亮等建立了ＷＤＶ田间样品ＬＮＡ探针实时荧光定量ＰＣＲ检测方法２０－－王亮等１６。５１ａ、（，）尚晓楠等首次将小麦的个持家基因ＴＥＦＧＡＰＤＨ、１８ＳｒＲＮＡ、ＵＢＣ和２８ＳｒＲＮＡ作为内参基因，建立了小麦寄主中检测ＷＤＶ病毒基因相对表迗量的Ｒｅａ－ｌｔｉｍｅＰＣＲ体系，并分析了ＷＤＶＣＰ基因在小麦茎－ＰＣＲ相对定量、叶两种组织中的相对表迗量。除此之外，其还构建了ＲＴｑ体系－ＣＰ基因在异沙叶蝉中表达量的趋势尚晓，分析了不同取食时间点ＷＤＶ（楠，２０１５。）１．７．４血清学检测方法王亚娇等以ＷＤＶＣＰ重组蛋白为抗原，通过免疫新西兰大白兔制备得到了针对ＷＤＶＣＰ的多克隆抗体。该多抗的灵敏度较高：５０００倍时，当多抗稀释到１，仍可与ＷＤＶＣＰ重组蛋白、感病小麦和带毒异沙叶蝉的组织有特异性反应，而不与健康小麦反应（王亚娇等，２０１３）。利用该抗体和免疫荧光技术，Ｗａｎｇ等发现ＷＤＶ主要分布在异沙叶蝉的前中肠和中中肠部位，良好的荧光信号为探究ＷＤＶ在异沙叶蝉体内的循环途径和储存位置提供了绝佳的技术准备，也为ＷＤＶ的预测预报奠定了基础ａｎｅｔａｌ．２０１４。（Ｗｇ，）但目前未见该抗体在田间应用的报道。８ 浙江大学硕士学位论文１．８防治措施１．８．１选育推广抗病品种一选育抗病品种是防治小麦病毒病的重要措施之。在匈牙利已有两个小麦栽培品种可以对ＷＤＶ产生抗病性（Ｂｅｎｋｏｖｉｃｓｅｔａｌ．，２０１０）。我国作为小麦的发源中心，小麦品种和遗传资源丰富，可以不断从中选育抗ＷＤＶ的优良品种。我国现有的抗ＷＤＶ的品种包括小偃２２、西安２１８３和早丰９０２等（稻麦重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究课题组，２０１１）。１．８．２农业与生态防治异沙叶蝉是ＷＤＶ的传播介体，控制住叶蝉的繁殖与扩散也就控制了ＷＤＶ的传播：，因此可以在麦田进行农业防治实行农作物大区种植，科学安排禾谷类早秋谷地、小麦地，及时清除禾本科杂草，控制越冬基地，减少虫源；掌握好播种期，适时晚播，减轻ＷＤＶ的危害。在麦田进行生态防治：合理密植，增施基肥、种肥，合理灌溉，改变麦田小气候，增强小麦长势。１．８．３物理与化学防治３３ｃｍ３０－１０２０用直径的捕虫网捕捉叶蝉成、若虫，当毎单次网捕头时，应及°时使用４０％氧乐果乳剂、４０％丙溴磷乳剂或吡虫啉等药剂杀虫；或混合喷施０．１５／。天然芸苔素、５％高校氯氰菊酯、病毒立克、尿素和磷酸二氢钾等。药剂拌种，播种前选用５０％辛硫磷或４８％毒死蜱乳油拌种４－６，拌后堆闷小时即可播种。２大麦黄矮病毒的研究进展小麦黄矮病（Ｗｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｄｉｓｅａｓｅ）是由大麦黄矮病毒ｙＺ／ｏｗＢＹＤＶ起的一ｓ类小麦病毒病害该病害最早由Ｏｓｗａｌｄ）引和Ｈｏｕｓｔｏｎ于１９５１年在美国加利福尼亚州的大麦上发现（ＯｓｗａｌｄａｎｄＨｏｕｓｔｏｎ，１９５３。目，）前小麦黄矮病在世界各地均有发生，是世界上分布最广泛的植物病一品质和产董毒病害之。ＢＹＤＶｓ可以侵染多种谷类作物。，并严重降低谷物的９ 第一章文献综述１９６０年，ＢＹＤＶｓ首次出现在我国西北地区（裘维藩，１９７３），受到ＢＹＤＶｓ侵染“”的小麦一０％可达７０％般减产４，因此ＢＹＤＶｓ又小麦癌症、，严重的以上被称为“”２０６０－８０黄色瘟疫。自首次发现以来，小麦黄矮病在世纪年代又大规模发１９９１流行了数次，给我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁（郭向东。，）２．１症状特点、寄主范围及传播方式ＢＹＤＶｓ在小麦秋苗期和春季返青后均可侵染植株，典型症状是新叶从叶尖－１／３１／２开始发黄，，，植株变矮叶片颜色为金黄色到鲜黄色黄化部分约占全叶的ＭｉｌｌｅｒａｎｄＲａｓｏｃｈｏｖｄ１９９７１．５。，（，）（图）秋苗期感病的植株矮化明显分蘖减少，一一一般不能安全越冬。即使能越冬存活，般也不能抽穗。穗期感病的植株般只旗叶发黄，，，呈鲜黄色植株矮化不明显，能抽穗但千粒重减少，根系浅，易拔起（徐琼芳等，２００５）。ＢＹＤＶｓ寄主范围较广目前已知至少可以侵染１５０，多种禾本科作物和杂草ＷａｔｓｏｎａｎｄＭｕｌｌｉａｎ，１９６０，其主要寄主作物既包括小麦、玉米和水稻世界三大（ｇ）粮食作物，也包括大麦、燕麦和黑麦等具有较高经济价值的粮食作物（Ｒｏｃｈｏｗ，１９６０）。狗尾草ＢＹＤＶｓ的寄主，、雀麦、野燕麦和山羊草等田间杂草也可以作为＇但有些寄主并不表现任何症状（钱幼亭和周广和１９８６ＤｏｍｉｅｒａｎｄＤＡｒｃ２００８。，；ｙ，）冰草属、赖草属、偃麦草属、披碱草属和鹅观草属的个别种作为ＢＹＤＶｓ的寄主还为抗黄矮病小麦育种提供了大量的抗病基因（Ｒｏｃｈｏｗ，１９７９；李经略等，１９８５）。虽然ＢＹＤＶｓ寄主范围广泛，但都集中在单子叶植物内，在自然条件下尚未发现能够被ＢＹＤＶｓ侵染的双子叶植物。ＢＹＤＶｓ是由蚜虫以循徊型持久方式传毒，不能通过汁液摩擦接种，也不能经种子传播（王锡锋和周广和，２００３）。１０ 浙江大ｉｍ】：学位论义蠢麵’１．５ＢＹＤＶｓ的ＡｒｃｙａｎｄＤｏｍｒ图典型症状ｉｃ，２０００）（引自Ｄ＇Ａ燕麦的叶片水浸状Ｂ麦的Ｙ：Ｃ，外：紫色叶缘Ｅ，，；，大燕羑红叶；Ｄ，玉：小麦的黄化症状；Ｆ，水稻的黄化症状。Ｆｍ＇ｉ１．５ＴｉｃａｌｓｔｏｍｓｏｆＢＹＤＶｓＤｅｒｉｖｅｄｒｏｍＡｒｃａｎＤｏｍｃｒ００ｇｙｐｙｐ（ｆＤｙｄｉ，２０）ＡｅｒｏｉｎｍｍｏｎｏｌａＢ．ｌｌｉｍｂｌｌｆ．ｗａｔｓａｋｇｓｖｐｉｏａｔｎｔｓ．ｅｏｗｎｓｔｏｍｓｏｎａｒｅａｎｔｓ．Ｃ．ｒｅｄｌｅａｐｙｇｙｐｙｐｓｍｉｔｏｍｓｏｎｏａｔｌａｎｔｓ．Ｄ．ｕｒｌｅｌｅａｆｍａｒｎｓｏｎｍａｉｚｅｌａｎｔｓ．Ｅｅｌｌｏｗｉｎｓｍｔｏｍｓｏｎｗｈｅａｔｙｐｐｐｐｇｐ，ｙｇｙｐａｎｔｓ．Ｆ．ｅｗｎｓｍｔｏｓｏｎｒｃｅｔｓ．ｐｌｙｌｌｏｉｇｙｐｍｉｌａｎｐ２．２病毒分类地位与株系划分黄症病毒科（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｃ）的多种病毒均可侵染小麦造成小麦黄矮病，随着对病毒认识的不断加深，ＢＹ［）Ｖｓ的ｔ类地丨４也随之不断令；．ＢＹＤＶｓ的划分依据为寄主范围、对寄主的毒性、蚜虫传播特异性与血潰学砭应类型等，＇１■ｉｉｔｌｉｔ其以蚜虫传播特异性最为重要。根据：，Ｒｏｃｎｍ＼１ｕｌｌｃ「：ＢＹＤＶｓ分为ＭＡＶ、ＰＡＶ、ＲＰＶ、ＲＭＶ和ＳＧＶ５个株系（Ｒｏｃｈｏｗ，１９６９；Ｒｏｃｈｏｗ、，ａｎｄＭｕ９７１ＭＡＶ的传播（，ｌｌｅｒ１。体是麦长管蚜（５／７／＂＞＂（￡化ＰＶ的，其中丨〇？山《），Ｒ）、传播介体是禾谷溢管树〈虫／？．，ＲＭＶ的传播１体是玉米牙（ｍａ／ｔｆｏ），ＳＧＶ的传播爷体是麦二又料（■Ｓｃ／Ｙ／ｚＯ／Ｗ．ＳｇＡＹ／ｆｌ？／讀７７），ＰＡＶ的传播介体是、卡谷缢管蚜和麦长管蚜。这五１株系可以通过血清学反应鉴定并区分（ＲｏｃｈｏｗａｎｄＣａｒｍｃｈａｅ１ｃｈｏｗＢＹＤＶ丨）３ｉｌ９７９Ｒｏ１９８２。此，ｓ，；，）时被定性为种并厲于黄症病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓｇｒｏｕｐ）。在中国，周广和等根据传播介体和血清学反应类型的不同鉴定出４ｈＢＹＤＶｓＩＩ 笫？孕义献泣述ＲＭＶＶ和ＧＡＶＰＡＶ株系，即ＰＡＶ、、ＧＰ株系（周广和等，１９８７）。株系由禾谷缢管蚜和麦长管蚜传播，也可由麦二叉蚜传播，但传毒效率低，且其与美国的ＰＡＶ株系存在血清学关系；ＧＰＶ株系由麦二叉蚜和禾谷缢管蚜传播，与美国的五祌株系不存在任何血清学关系，是我国的特有株系；ＧＡＶ株系由麦二叉蚜和麦长管蚜传播，和美国的ＭＡＶ株系存在血清学关系，但美国ＭＡＶ株系不能通过麦二又蚜传播；ＲＭＶ株系由玉米蚜传播，与美国ＲＭＶ株系有相同的血清学关系和传播介体。丨１９９９年国际病毒分类委员会ＣＴＶｓ，在第七次报告中将ＢＹＤＶ分在了黄（）＇ＰＶｅａ／Ｖ－ＲＰＶ症病毒科的两个属中，其中原Ｒ株系被升级为Ｃｅｒｅ／ｍｒ而？／广ｖ／ｍｖｙ；－ＲＰＶＣＹＤＶ，ｏ／ｅｒｏｖ／ｍｖ中。Ｍｉｌｌｅｒ等依据（）并被划分到马铃薯卷叶病毒属（Ｐ）－ＰＡＶ１２９与其他ＰＡＶ株系存在显著的序列差异将其升级为黄症病毒属一－ＰＡＳ个新种ＢＹＤＶ２００２Ｍｉ的Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．ｌｌｅｒ等（，）；同样依据侵染症－－ＲＰＶ的ＭｅｘＲＰＳ状和序列差异将原ＣＹＤＶ１升吸为马钤薯卷叶病毒新种ＣＹＤＶ丨ＣＴＶ２２００５Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．２００２。在２００年的病毒分类系统和年的第＼次报告中（，）２０－１３年ＫｒｕｅｅｒＲＭＶ株系的亲缘关系接受了这两个建议。，ｇ等报道了原ＢＹＤＶ与马铃薯卷叶病毒属更为接近－ＲＭＶ，将原ＢＹＤＶ株系归＼马铃薯卷叶病毒属，ＹＤＶ－ＲＭ并因其主要侵染玉米，因此将原ＢＶ株系更名为ｔ／ｕｗ／－－ＲＭＶＭＹＤＶ－ＲＭＶＫｒｕｅｅｒＷｍｖｅｔａｌ．，２０１３。ＳｖａｎｅｌｌａＤｕｍａｓ等在印度洋南部（）（ｇ）ＢＹＤＶ－Ｋｅｒｕｅｅｎｃｏｄ／／的ｓ新种ｋｅｒ丨丨和ｇｌ群岛上发现了可以侵染Ｐｏｏ两令ＢＹＤＶＢＹＤＶ－ｋｅｒ１丨丨，并将其归入黄症病毒属，但这两个新种的传播介体还未确定－ｅｌａＤｕｍａｓｅｔａｌ＿２０３。Ｓｖａｎｌ，根，１）同年丨ＣＴＶ分类系统采纳了这四个新种。目前（据国际病毒分类委员会关于病毒的分类，ＢＹＤＶｓ分布于黄症病毒科的２个属８－２１－ＰＡＶ、ＢＹＤＶＰＡＳ、个种，且还有个种未被划分到厲。在０个种中，ＢＹＤＶ－／－－＾８丫口乂８丫０￥１＾１丨和８丫０￥丨丨１这５个０丫０孓１＾￥、１＼１八￥、１种属于黄症病毒属；－－－ＲＰＳ和ＭＹＤＶＲＭＶ这３个种属于马铃薯卷叶病毒属ＢＹＤＶＣＹＤＶ，ＧＰＶ；另外和ＢＹＤＶ－ＳＧＶ这２个种未归类。１２ 浙江大学硕士学位论文２．３病毒粒子形态和生化特性ＢＹＤＶ一＋ＮＡｓ属黄症病毒科，是祌ＳＳＲＮＡ病毒。病毒粒子由正单链Ｒ和外二十＝壳蛋白组成，呈正面体（Ｔ３），无包膜，电镜观察投影下粒体直径约３０ｎｍ（图１．６，组织２４ｎｍ。ＢＹＤＶｓ的病）切片中粒体直径约毒粒子比较稳定，适宜的繁殖°－－－温度为Ｉ５２０Ｃ死温度为６５７ＣＴＣ２（ＴＣ，致，可以在条件下长期保存，有机溶剂一ｈｏｗ９７０的处理般不会降低其侵染力（Ｒｏｃ１２００９。，；任向辉病毒粒子的，）３Ａ２／Ａ２肋－－６０为１．７２１．９２．４／，浮力密度约为ｃｍ，沉１５１１８Ｓ，稀１ｇ降系数为１释限点为１１０００２００１：（许雷。，）ｍ＇ｒｃ．Ａ图ｌ６ＢＹＤＶｓ病毒粒子的电镜照片（引自ＤａｎｄＤｏｍｉｅｒ２〇００ｙ．）＇Ｆ．ｌｉ１６ＥｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｒａｈｏｆｕｒｉｆｉｅｄＢＹＤＶｓｖｉｒｉｏｎｓＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＤＡｒｃａｎｄＤｏｍｉｅｒ２０００ｇｇｐ（，）ｐｙ２．４发生与分布一大麦黄矮病毒是世界上分布最为广泛的植物病毒之，最早在美国加利福尼亚州的大麦上发现，随后在各国陆续发生，现已遍及除南极洲之外的所有大洲Ｔｔ．（ｏｒｒａｎｃｅｅａｌ１９８６１９９０。２０７０，周广和和陈剑波在世纪，；，）年代英国小麦黄矮病连年大规模流行，约９０％的冬小麦被感染。７０年代末小麦黄矮病在美国大－８规模爆发流行ｉ０，使小麦产量降低６０％０％Ｇｌｌ１９８。８０年代初，小（，）麦黄矮病一｝在德国第次大规模流行，造成了４０％的产量损失（Ｂｏｒｅｍｅｉｓｔｅｒａｎｄ丨ｏｅｈｌｉｎ，ｇｇ１３ 第一章文献综述１９９１）。同时在欧洲的意大利和西班牙、非洲的埃及和几内亚、南美洲的智利和秘鲁、大洋洲的澳大利亚和新西兰以及亚洲的土耳其和中国等国也都有过小麦黄－ｆ矮病的大规模流行，造成的小麦产量损失约为０％３０％ＤｕｆＵｓ１９７７Ｌａｒｋｉｎｅｔ１（，；ａｌ．１９９０。，）在中国，１９６０年在陕西省首次发现小麦黄矮病，随后迅速蔓延。目前，西北、东北、西南、华北及华东等大部分冬、春麦区及冬春麦混种区均有该病发生９６６－９８７的记录或报道。在１１年的２２年间，该病曾７次大规模爆发流行，流行年份发病率普遍高于３０％，造成了严重的产量和经济损失于锁英等，２０００。如（）一１９６６年陕西和甘肃省分别有２７０和１００万亩小麦受到ＢＹＤＶｓ感染，仅甘肃省造成的产量损失就高迖０．７亿公斤７００００；１９年陕西省因小麦黄矮病造成１余万亩小麦受害，产量损失约５亿公斤刘艳等，２００４１９８７年（）；陕西和甘肃两省再次爆发流行的小麦黄矮病导致小麦减产５亿多公斤。２０世纪９０年代，甘肃、陕西和河北等省又多次爆发了小麦黄矮病，其中山西省仅在１９９９年就有７０９．９万亩小麦受灾（李晋梅，１９９９）。目前，小麦黄矮病的流行区主要集中在黄河流域的各省市，其中，冬小麦的大麦黄矮病毒流行区主要分布在豫西、关中、陇东、晋南及华东和西南地区、；春小麦流行区主要分布在东北地区、宁夏、内蒙古、晋北冀北等地；冬春麦混种的流行区主要分布在陕北、甘肃河西走廊等地（稻麦重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究课题组，２０１１）。但是伴随着全球变暖和农业生态条件的改变等原因，小麦黄矮病有逐年向南扩展的趋势。中国目前已鉴定出的４种ＢＹＤＶｓ株系中，ＧＡＶ是侵染我国小麦的主要株系，其主要分布在我国陕西、山西、甘肃和河南等省，江苏、河北、北京、东北等地也有发生（周广和和陈剑波１９９０１９９８ＧＰＶ，；苗洪芹和李秀明。中国的特有株，）系株系广泛分布于陕西陕北、渭北、关中和陕南，甘肃陇南和陇东及山西晋南、晋中和雁北等春、冬麦区（张秦凤和朱象三，１９９１），这是由于ＧＰＶ传毒介体麦二叉蚜可进行远距离迁飞且带毒率高造成的（周广和等１９８７。，）在针对陕西省的小麦黄矮病调查中，杨洋等发现ＰＡＶ是该省小麦黄矮病的主要流行株系，ＧＰＶ和ＧＡＶ次之，且混合侵染比较严重（杨洋等，２０１１）。刘楠等调查了青海省小麦黄矮病的发生情况，结果表明ＧＡＶ是青海省的流行株系，少数是ＧＡＶ与ＰＡＶ混合１４ ‘：ｉｎ大学硕：位论文浙〗７２０５。侵染（刘楠，１；刻楠等，２０１６）２．５基因组结构与功能？一５＋ＲＮＡ因组全长约．７ｋｂ５，ＢＹＤＶｓ是ＳＳ，其端没有帽子结构种病毒，基？ＲＮＡ的结构Ｍｉ．１９８８ＵｅｎｅｔＰｏＡ（ｌｌｅｒｅｔａｌ；３，ｇ端无ｌｙ（）尾巴，也不折叠成类似于ｔ９９２１９９６ａＭｉｅｌｅｒｒａｆｆ，。ｌ．丨ａｏａｎｄＺ属卞黄症病毒科黄症病毒属和马ｂ署卷叶，；ｙｇｇ）病毒属的ＢＹＤＶｓ的基因组存在类似的结构：均含有７个开故式阅读框＜〇ｐｅｎＯＲＦＯＲＦ３ａ的末端和ＯＲＦ３有部分重叠ＲＦ４包ＲＦ３ｒｅａｄ：Ｏ含在Ｏｉｎｆｒａｍｅ，）：ｇ＋’、－一铝存‘．ＲＮＡＯＲ：（ｓＩ５ｈＯＲＦ３之间由１终止密码子隔开ｆｇ：＇ＲＮＡ，且ＯＲＦ３ＯＲ卜４、ＯＲＦ５以及ＯＲＦ３ａ者Ｐ是以ｓＲＮＡｌ为模板进行翻译、ｇ）ｔｌ９９４Ｍｉｌｔａ１５Ｓｍｉｒｎｏｖａｅｔａｌ１９９１ｅｌｌｅｔａ．１ｌｅｒｅｌ２０；”图１．７Ｖｉｎｃｅｎｔｅａｌ”Ｋ，”；ｙ；（）（２０１５）。但这两个属的基因组结构也存在显著的差异：黄症病毒属的ＢＹＤＶ含有’ｉｉＰ６ＯＲＦ６３ｓＲＮＡ症病毒属基因组的３末端存在可以表蛋白的，其前个ｇ；黄后均为非翻译区（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎ，ＵＴＲ），且不与任何ＯＲＦ重叠，但在马铃薯ＲＦ陶烨２０１６。ＹＤＶ／ＭＹＤＶ含卷叶病毒厲中却无此Ｏ（，）马铃薯卷叶病毒厲的Ｃ’一Ｐ０ＲＮＡ５卜和ＯＲＦＩ有部分重叠的、可以表运有１个ｓｇ，基因组末端存在Ｋ０，丨．７Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．，１９９０；蛋白的ＯＲ但在黄症病毒属中却无此阅读框（图）（Ｐａｚｈｏｕｈａｎｄｅｈｅｌ．ｔａ，２００６）ＲＮＡ３＂ｓｇ５３ｓｇＲＮＡ２ｆ３ｓｇＲＮＡｌ５ｙＲＦ２〇ＲＦ４〇ＲＮＡ０ＬＪ＾ｌ＿ＴＩＳ．。响—■３５Ｗｔｆｉ—ｍ３ａＵ＇〇ＲＰＶＩｓ，ｏｐｃｏｄｏｎ？ｎＵｒａｍ她丨，丨ｌｅａｋｙｌ＾ｎｍｎ〇ＲＮＡ＇＊ｓｇｌ５３ｌｅａｋｓｃａｎｎｙｉｎｇ？９ＲＬ＊２＾０ＲＦ４，＾￣Ｆ３？１５＂ｉＯＲＦｌ〇ｆｔＰＯＲ５３２Ｂｙ３Ｉ—＾１２－ＯＲＦＯｊＯＲＦＪ］Ｉｓｏｐｃｏｄｏｎｓｏｍａｔｎｂｏｌ〇ＲＦ３ａｒｅａｄｔｈｒｏｕｈ－ｇ１ｆｓｈｉｆｔｒａｍｅ．２０１５图ｍｉｍｏｖａｃｔａｌ，）１．７ＢＹＤＶ和ＣＹＤＶ的基因组结构（引自Ｓ上图，５．７ｋｂ的ＢＹＤＶ基因组结构示意图；下图，５．５ｋｂ的ＣＹＤＶ基因组结构示意图Ｆｉ１．７ＣｉｃｎｏｍｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆＢＹＤＶａｎｄＣＹＤＶ（ＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＳｍｉｒｎｏｖａｃｔａｌ．．２０１５）ｇＶｗｅｒｈｅｔｕｒｅ．ＴｈｅｕｒｅｉａｒａｍｏｆｔＴｈｅｒｆｒ，ａｒｔ．７ｋｂＢＹＤｅｎｏｍｅｓｔｒｕｃｌｏｆｉ，ｄｅｕｐｐｉｇｕｅｄｉｇａｍｏｆｈｅ５ｇｇｇ５．．５ｋｂＣＹＤＶｇｅｎｏｍｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１５ 第义献沒．述一ＯＲＦ０只存在于马铃薯卷叶病毒属中２７－．３．Ｄ，编码个大小为３０８ｋａ的Ｐ０蛋白，可能是病毒的沉默抑制子（Ｌｉｕ，Ｙｅｔａｌ．，２０１２）。但是ＰＯ的氨基酸序列同源－７３２０丨丨ＲＦ１的末性较低，仅为丨３％％（吴兴泉等，）。Ｏ端与ＯＲＦ２有部分重叠，一、ＯＲＦ１可以单独表达形成３９ｋＤａ的Ｐ彳大小约为１蛋白Ｐ１，但单独表达的蛋白是否具有解旋酶的功能还存在争议（ＨａｂｉｌｉａｎｄＳｙｍｏｎｓ，１９８９；ＫｏｏｎｉｎａｎｄＤｏｌａ１ｓＰ２ＲＮＡＲＮＡ－９９３Ｇｉｂｂ１９９５〇依ＲＮＡｄｅｅｎｄｅｎｔＲＮＡｊ，；，）包含赖的聚合酶（ｐｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲｄＲｐ）活性区域，然而没有证据表明Ｐ２能单独表达，其只能与Ｐ１融合表达来发挥功能，但ＯＲＦ１和ＯＲＦ２都是病毒复制不可或缺的（ＲｅｕｔｅｎａｕｅｒｅｔＭ一ａｌ．１９９３ｏｈａｎｅｔａｌ５１＾个大小约为２＾）３的？３蛋白，．１９９。０３编码２１，；，）其是一－ＢＹＤＶｓ的外Ｚｅｅｒａｆｆｅｔａ．１ＲＦ５壳蛋白（ｉｌＧｒｌ９９６。Ｏ５０ａｇ，）编码个大小约为ｋＤ通读区域（Ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈｄｏｍａｉｎ，ＲＴＤ），与外壳蛋白融合表达形成分子量约７０ｋＤａ的融合蛋白ＣＰ－ＲＴＤＣｈａｅ（ｙｔａｌ．１９９６。外壳蛋白和融合蛋白共同构成了病毒粒，）子的外壳－ＲＴＤ并不是病毒粒子狙装所必需的。ＣＰ，其可能作为蚜传蛋白，与蚜虫传播的专化性有关（Ｍｏｈａｎｅｔａｌ．，１９９５；ＭｉｌｌｅｒＡｎｄａｎｄＲａｓｏｃｈｏｖ含，１９９７；Ｗａｎｇ一、一ｅａ１ＲＦａ－ｔｌ．９９８。Ｏ３是彳起始密码子非ＡＵＧ的特殊ＯＲＦ，编码个由４５５０，）个氨基酸组成的Ｐ３ａ蛋白，其定位于高尔基体和胞间连丝，可能与病毒在植物体内的长距离运输有关，且Ｐ３ａ蛋白缺失不影响病毒的复制Ｓｍｉｒｎｏｖａｅｔａｌ２０１５．。（，）一ＯＲＦ４编码■个约为１７ｋＤａ的Ｐ４蛋白，其可能作为病毒的运动蛋白发挥作用，与病毒在寄主植物体内的胞间运动有关Ｔａｃｋｅｅｔａ．１Ｔａｃｋｅｅｔａ（ｌ９９１；ｌ．１９９３Ｘｉａ，，；ｅｔａ２００８ａｅｔａ１Ｐ４蛋白是病毒在植物中ｌ．Ｘｉｌ．２０２。，该，；，）同时扩散所必需的蛋白的缺失会导致病毒不能系统侵染寄主植物Ｃｈａｅｔａｌ．１９９６。（ｙ，）根据基因组序列信ＲＦ６４－７ｋＤａＰ６Ｍｉｌ息推测Ｏ编码大小为．３６．的蛋白ｌｅｒｅｔａｌ．１９８８Ｕｅｎｅｔａｌ．（，；ｇ，１９９２），但该蛋白至今未能在植物体内被发现（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，２０１５）。Ｐ６蛋白的功能目前还不是特别清楚，但有可能是作为抵抗寄主基因沉默作用的抑制子发挥作用Ｌｉｕｅｔａｌ１ＢＹＤＶ１．１．２０２。ｓ的。（，）基因组结构和功能概括在表６１ 浙江尺７：硕卜７：位论ｉ表１１．大麦黄矮病毒基因组的结构与功能Ｔａｂｉｃ１．１ＯｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＢＹＤＶｓｇｅｎｏｍｅ开放阅读框编码蛋白（分子量）蛋白功能ＯＲＦＯ３０ｋＤａ未知ＯＲＦ１约３９ｋＤａ未知０ＲＦ２＾６０ｋＤａＲｄＲＰＯＲＦ３２２ｋＤａ外壳蛋白ＯＲＦ３ａ５．１ｋＤａ未刼ＯＲＦ４１７ｋＤａ运动蛋白ＯＲＦ５５０ｋＤａ蚜传蛋白－ＯＲＦ６４．３６．７ｋＤａ未矣口２．６传播介体据统计，全世界至少有２５种蚜虫可以传播ＢＹＤＶｓ。而在中国，禾谷缢管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜和玉米蚜是ＢＹＤＶｓ的主要传播介体周广和等，１９８７）（图（１８。．）二又麦长管蚜和麦蚜合称为麦蚜。羑蚜繁殖速嗖较快，孤雌生殖，适宜的条件为中温高迓。麦蚜为刼二型昆虫，有翊型扣无翊型常混合发生，有翅蚜可以远距离ｉｆ飞大范围麦田造成危害殖速度快以在短时间内爆，容爵对；无翅蚜繁，可发（张华伟，２０１４）。ＢＹＤＶｓ在蚜虫体内以循回型非增殖方式传播（吴云峰等，１９９６云锋１９９９。：ｓ：吴，）大麦黄矮病毒在麦蚜沐内传毒Ｈ程麦蚜在感染ＢＹＤＶ的植株上取食，口针穿刺到韧皮部，病毒便以完整的粒子状态逬＞ｖ食窦中，然后经过前肠、中肠，最终到达后旸，经过细咆间的运输进＼血腔，通过唾附腺的专化型相互作用被释故到导管腔中，最终病毒会随着唾液的分泌被转运到植株中刘楠，２０１５。（）１７＼ 第－孝献绽述图１．８ＢＹＤＶｓ在中国的主要传播介体Ａ．，千谷缢管蚜雌性成虫和无杞苦虫：Ｂ，麦长营蚜雌性有窃成虫和无苟若虫：Ｃ，玉米蚜；Ｄ，麦二叉蚜有翅成虫。Ｆｉｇ１．８ＴｈｅｍａｉｎｖｅｃｔｏｒｓｏｆＢＹＤＶｓｉｎＣｈｉｎａＡ．ｆｅｍａｌｅａｄｕｌｔａｎｄｗｉｎｇｌｃｓｓｎｍｈｏｆＲ／ｗａｌｏｓｉ／ｎｔｍａｄｉ．Ｂ．ａｗｉｎｅｄｆｅｍａｌｅａｄｕｌｔａｎｄａｙｐｐｐｐｇｌｅｓｓｎｍｈｏｆＳｉｔｏｈｉｏｎａｖｅｎｕｅ．Ｃ．Ｒ．ｍａｉｃ／ｉｓ．Ｄ．ａｗｉｎｅｄａｄｕｌｔｏｆＳｃｈｉｚａｈｉｓｒａｍｉｎｕｍｗｉｎｇｙｐｇｐ．ｇ２．７大麦黄矮病毒的检测方法２．７．１生物学检测方法一般是通过ＢＹＤＶ生物学检测方法ｓ在小麦上引起的症状和其传播介体进行的。小麦感染ＢＹＤＶｓ的典型症状是新叶从叶尖开始发黄，植株变矮，还常呈现节间缩短，叶片中下部呈黄绿相间的纵纹等症状特点。这些症状特点可以作为判断小麦是否感染ＢＹＤＶｓ的依据。但相比于真菌病害和细菌病害，病毒病的症状特点并不明显，常与其他病毒病害混淆，出现错误诊断的情况，而且通过症状并不能判断病毒具体属于哪一个株系。ＢＹＤＶｓ的传播介体是蚜虫，其传播特性差异非常显著，比如有的株系是由一ｓ蚜虫专化性传播的，因此可以利用这特点ｆｅ测与鉴定小麦是Ｓ抟ＢＹＤＶ浸染ｃｈｏｗ１９田间及被何种株系侵染，７０。但这种，如在（Ｒｏ）方法也有其局限性常出现多个株系混合浸染和异源装配的现象，这种现象会导致传播类型的改变，使辱检１８ 断江大学硕士学位论文测和鉴定结果往往不够准确（刘艳等，２００５）。总之，生物学检测方法不能准确检测和鉴定ＢＹＤＶｓ，只能将其作为检测的辅助手段。２．７．２电镜检测方法一电镜检测方法是种可以观察到ＢＹＤＶｓ病毒粒子的方法，但多种原因增加了利用电镜技术检测和鉴定ＢＹＤＶｓ的难度，如电镜设备昂贵和对操作技术的高要求导致检测的实用性低，ＢＹＤＶｓ局哏于楦株的韧皮部且病毒含量极低（Ｒｏｃｈｏｗ，１９６０），使得利用电镜技术快速准确的检测和鉴定ＢＹＤＶｓ并不现实。２．７．３分子生物学检测方法目前检测ＢＹＤＶｓ的分子生物学方法主要包括多重ＰＣＲ－ＰＣＲＲＴ－ＬＡＭＰ、ＲＴ、和核酸斑点杂交等方法。岳红妮等建立并优化了一种可以同时检测ＢＹＤＶ、ＷＹＭＶ、大麦条纹花叶病毒ｍｏｓａｉｃＷｍｓ，ＢＳＭＶ）和小麦蓝矮植原体（ｆＦ／ｚｅａｆＭｅＡｖａｒ／ＷＢＤ）的多重ＰＣＲ技术体系，极大地提高了检测效率，降低了检一２００８２００９－环介导测成本（岳红妮等；岳红，妮，＼赵琨等建立了套基于反转录ＲＴ－ＬＡＭＰ的检测体系用该体系可以快速检测ＢＹＤＶ－ＧＡＶ等温扩增技术（），，利－ＰＣＲ的０００ｈａｏＧＰＶ和ＰＡＶ三个株系ｌ．２００，而且其灵敏度是ＲＴ１倍。（Ｚｅｔａ１赵，；琨，２０１０）。温孚江以ｃＤＮＡ为探针利用核酸斑点杂交技术来特异性检测ＢＹＤＶ－ＲＰＶＰＡＶ－１９９４。ＰＣＲ和、和ＭＡＶ三种株系（溫孚江，）王阳利用ＲＴ核酸２００７－２００９斑点杂交技术检测调查了年我国小麦黄矮病的发生情况，结果表明ＧＡＶ株系是我国的流行株系，而ＰＡＶ和ＧＰＶ分别在特定区域发生（王阳，２０１０）。２．７．４血清学检测方法血清学方法主要是通过病毒抗原与抗体形成的的抗原抗体复合物所呈现的沉淀现象或显色反应来检测鉴定病毒。常用的技术有酶联免疫吸附测定－ＥｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａＥＬＩＳＡ、（ｙｙ，）、斑点免疫检测技术免疫荧光技术及免疫胶体金技术等。在检测ＢＹＤＶｓ的血清学方法中最常用的是ＥＬＩＳＡ技术。９１ 第一章文献综述Ｒｏｃｈｏｗ和Ｍｕｌｌｅｒ利用制备的抗血清将纽约的大麦黄矮病毒分为５个株系（ＲｏｃｈｏｗａｎｄＭｕｌｌｅｒ，１９７１；Ｒｏｃｈｏｗ，１９７９）。出１１等研制了针对ＢＹＤＶＭＡＶ和ＲＰＶ株系的特异性单抗，用于划分ＢＹＤＶｓ的不同株系（Ｈｓｕｅｔａｌ．，１９８４）。１９８９年Ｆｏｒｄｅ等利用ＢＹＤＶ３个株系的特异性单抗建立免疫电镜技术来诊断大麦黄矮病毒（Ｆｏｒｄｅ，１９８９）。１９９４年Ｍａｋｋｏｕｋ和Ｃｏｍｅａｕ利用免疫组织印迹技术来检测植物组织中的大麦黄矮病毒（ＭａｋｋｏｕｋａｎｄＣｏｍｅａｕ，１９９４）。在国内，李永丽在大肠杆菌中表迗ＧＰＶ株系的ＯＲＦ４编码的１７ｋＤａ蛋白，并制备其特异性抗血清（李永丽，２００４）。谢家建等通过原核表达ＧＡＶ株系的运动蛋白，并以此作为抗原免疫小鼠获得抗血清（谢家建等，２００７）。本实验室的李娜等将ＢＹＤＶＧＡＶ株系的病毒粒子作为免疫原，利用杂交瘤细胞技术获得了８株能分泌抗ＢＹＤＶＧＡＶ单克隆抗－体的杂交瘤细胞株，并以此为基础建立了ＢＹＤＶＧＡＶ株系的ＡＣＰＥＬＩＳＡ和ｄｏ－８０ｔＥＬＩＳＡ检测方法检测小麦病叶的灵敏度分别迖到了１：１９２０和１：５１２倍，稀释（ｗ／ｖ／ｍＬＬｉｅｔａｌ．２０１５２０１５，，ｇ）（，；李娜，）为该株系的检测和诊断奠定了技术和物质基础。２．８防治措施２．８．１筛选、培育和鉴定抗病品种一抗病品种是防治小麦黄矮病最有效的手段之。目前抗ＢＹＤＶｓ的基因主要来源于偃麦草属、冰草属、赖草属、披碱草属、鹅冠草属等小麦近缘属中对ＢＹＤＶｓ有较高抗性的植物，其中以中间偃麦草沿ｗ／ｎ）在小麦抗ＢＹＤＶｓ育种中应用最多，研究最为深入（Ｂａｎｋｓｅｔａｌ．，１９９５；Ｆｒｉｅｂｅｅｔａｌ．，１９９６；Ｃｒａｓｔａｅｔａｌ．，２０００）。目前已经成功培育出的抗病品种有ＴＡＦ４６、中５等。２．８．２农业防治田间防治小麦黄矮病的农业措施主要包括清除田间杂草以减少蚜虫生息场所和ＢＹＤＶｓ的寄主植物、追施肥料提高小麦抗性、适时晚播冬小麦和早播春小麦以避开蚜虫迁入高峰、灭茬深耕、越冬期冬灌和地膜覆盖等方法。２０ 浙江大学硕士学位论文２．８．３化学防治小麦黄矮病的化学防治主要以种子处理和对媒介昆虫的防治为主。种子处理一般是在小麦播种前用甲基异柳磷和辛硫磷等药剂进行小麦拌种；对煤介昆虫防口治的关键时期主要在冬小麦返青后，根据虫密度进行田间喷雾，主要化学药剂包括吡虫啉、蚜螨清和抗蚜威等。在此基础上，田间化学防治还可以喷施宁南霉素、病毒必克。、云芝葡聚糖和病毒Ａ等病毒抑制剂等３单克隆抗体技术及其在植物病毒学中的应用抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）是人或动物对进入体内的抗原物质发生免疫应答后由浆细Ｂ细一胞（效应胞Ｉ。抗体能够与相应的抗原进行特异）产生的种免疫球蛋白（ｇ）。性结合，是机体防御系统的重要组成部分抗体分为单克隆抗体（简称单抗，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＭＡｂ）和多克隆抗体（简称多抗，Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，ＰＡｂ）。两者的区别是抗体针对的抗原决定簇（即抗原表位）的个数，单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的抗体一，而针对某抗原的多个抗原决定簇的抗体即为多克隆抗体。１９７５年，Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ将小鼠骨髄瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合，，形成了可以产生抗红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞该细胞不仅能产生抗体，而且可以无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术（Ｋｏｈｌｅｒａｎｄ一Ｍｉｌｓｔｅｉｎ１９７５。次革命２０世纪，是最为重要的生，）该技术被誉为免疫学领域的一生命科学物学成果之，为突破、食品科学的基础研究和应用研究开创了新纪元何忠效，２００４。（）单克隆抗体技术开创后却在临床应用方面遇到诸多困难，其主要原因是：（１）单克隆抗体多为鼠源性的，而鼠源单抗在人体治疗时常不能有效激活补体和Ｆｃ受体相关的效应系统（Ｈｕｇｈｅｓ，１９９８）；（２）鼠源单抗易被人体的免疫系统识别，产生人抗鼠抗体（Ｗｅｉｎｅｒ２００６３，）；（）传统杂交瘤技术还存在耗时长、成本高、杂交瘤细胞稳定性差等缺陷。近年来，随着分子生物学的发展，基因工程抗体技术的出现为解决传统杂交瘤技术提供了新的思路。目前比较成熟的基因工程抗体制备２１ 第一章文献综述－方法有以下几祌：人鼠嵌合抗体制备技术Ｍｏｒｒｉｓｏｎｅｔａｌ．１９８４菌体展示技（，）、嗟术获得的抗原特异性人源性抗体（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍｅｔａｌ．，１９９１；王志文，２０１５）、转基因小鼠制备的人ＭＡｂｓ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ１９９５、ｏｏｔｈｕｉｓａｎｄ，）核糖体展示技术（ＧｒＮｉｓｈｉｄａ，２００２；刘萍等，２０１２）。这些技术的出现为单克隆抗体的发展提供了更为广阔的空间，促进了生物学的发展。３．１抗体的结构及特性抗体是由４条多肽链组成，４条链中两两相同，其中两条分子质量约为５０ｋＤａ，被称为重链（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ，Ｈ链）；两条分子质量约为２５ｋＤａ，被称为轻链（ｌｉｈｔｇｃｈａｉｎＬ链链和重链之间通过二硫键连接．９。２１４，），轻（图１）轻链约由个氨基酸残基组成，分为Ｋａｐｐａ（Ｋ）链与Ｌａｍｂｄａ（１）链两种类型，不同物种中ｋ链与入链的比例有所区别－，小鼠中的比例是２０：１，而人抗体中为２：１。重链由４５０５７０个氨基酸残基组成，根据其抗原性的差异分成５种类型，即ｈ链、Ｓ链、Ｙ链、ａ链、ｓ链。由不同类型的重链组成的免疫球蛋白分型为ＩＭ、ＩＧ、ＩＡ、ＩＤ和ｇｇｇｇＩｇＥ（吴建祥，２００８）。ＩｇＡ和ＩｇＧ在不同种类动物中又可分为不同的亚类例如在，人体中ＩｇＧ分为ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３和ＩｇＧ４四个亚类，ＩｇＡ有两个亚类即ＩｇＡｌ和ＩｇＡ２，而在小鼠中ＩｇＧ分为ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ和ＩｇＧ３四个亚类（陈素华等，２０１５。）抗体一Ｉｇ单体两端分别称为氨基端（Ｎ端）和羧基端（Ｃ端）。在Ｎ端有个区域（即１／２的轻链和１／４的重链）的氨基酸排列顺序因抗体特性而发生改变，这个区域被称为可变区（Ｖａｒｉａｂｌｅｒｅｇｉｏｎ，Ｖ区），由ＶＨ和ＶＬ表示，决定抗体的特异性。Ｃ端部分由于氨基酸数量、种类、排列顺序及含糖量比较稳定而称之为恒定区（Ｃｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎ，Ｃ区），由ＣＨ和ＣＬ表示，恒定区与免疫应答有关。每条重链上有个１可变区（ＶＨ）和３个恒定区（ＣＨ），而轻链上有１个可变区（ＶＬ）和１个恒定区（ＣＬ）（Ｎｉｓｏｎｏｆｆｅｔａｌ．，１９７５）。２２ ＊：７硕：浙江九１学位论ｉＡｎｔｉｇｅｎｂｉｎｃｌｉｎｇｓｉｔｅｓＶａｒｉａｂｌｅｒｅｉｏｎｇ＇ｈｅａ＼ｃｈａｉｎｙ＾—ＢＩ＼＾Ｃｏｎｓｔａｎ＾ｔｉｅｓｉｏｎｏｎｒｘｅｍｔ＾ｃｈａｎＨｉｊ＼ｊ■■ＣｏｎｓｔａｎｔｒｅｇｉｏｎｏｎＨｆｌ＂ｈｅａ＼＼ｃｈｎｍ｜｜图１．９抗体的基本绾构（引自Ｓａｄａｖａｃｔａ．０丨４丨．２＞Ｆ１．９ＦｏｌｓｔｒｕｒｅｏｆｎｉｂＤｅｒｉｖＳａｄｌ．．０４ｉｕｎｄａｍｃｎｔａｃｔｕａｔｏｄｅｄｆｒｏｍａ＼ａｃｔａ２１）ｇｙ（３．２单克隆抗体技术３．２．１杂交瘤技术基本原理■，．小鼠骨髓瘤细脃能栘杵厂ｒ，：彻＃：具有产生抗体的能力，但不能无限增殖。为了得到既能无限增殖又能分泌抗体的细胞－：，需要将者融合在起ＩＭ（－，因１（）：细抱融合成杂交瘤细咆一、一。由于毎个淋巴细狍只能对某１＿的抗原决定簇产生－特异性抗体，因而在将其单兖隆化后，就能够产生黎的完全同质的抗体，即单＇？、？ｄＨ（细咆，后，除了形呋？义哙细收．：诜合的以及同种细胞融合后的产物，虽然未经融合的淋巴细胞及淋巴细胞间形成的融合细咆在体外不能长期存活，但骨髓瘤细咆却能快速的增殖。为了将杂交瘤细胞筛选出来，我们需要使用ＨＡＴ选择性培养基，该培养基可以杀死未融合的骨骸ｆ细胞及骨髋瘤细胞间形成的融合细咆，只有骨髓瘤细咆与Ｂ淋巴细咆融合形成的杂交瘤细胞才能长久存活（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，丨％４；尚海丽，２０丨１），ＨＡＴ培养基筛选：条交瘤细胞的原理如下：细雅．ＤＮＡ的合成泠Ｋ２３ 第－章义献综述性途径是ＤＮＡ合成的主要途径，即利用谷氨酰胺与汞嘧啶核苷单磷酸合ＤＮＡ成，但该途径可以被叶氨基喋吟（Ａ）阻断；ＤＮＡ的外源性生物合成途径包括：纟日咆通过鸟嘌呤磷酸核糖转栘酶（ＨＧＰＲＴ）利用次黄嘌呤（Ｈ）合成嘌呤核苷酸，通过胸腺嘧啶激酶（ＴＫ）利用胸腺嘧啶核苷（Ｔ）合成嘧啶梭苷酸，进而合成ＤＮＡＡＡＴ培养基中Ｈ代表次黄嘌呤，Ａ代表氨基喋呤，Ｔ代表胸腺嘧啶。ＨＡＴ培养基是在常规培养基内加了氨基喋呤（Ａ＞，阻断了ＤＮＡ的内源性生物合成途径，并提供核苷酸合成的前体次黄嘌呤（Ｈ）和胸腺嘧啶核苷（Ｔ），供细胞利用外源途径合ＮＡ成Ｄ：由于骨髓瘤细胞是经过处理的缺陷型细胞只能通过具内源性途径合，成ＤＮＡ，因而在ＨＡＴ培养基中骨髓瘤细抱以及彼此之间融合的骨髓瘤细胞均被．杀死丨１０１９９（图）刘秀梵，４）。（小鼠牌淋巴细胞聚乙二醉骨髄瘤细胞＋＋ＨＧＰＲＴＴＫ？－（，）＜ＨＧＰＲＴ或ＴＫ）＇ｉｙｆ未融合的相互融合的相互融合的未融合的骨｜｜教￥＃｜淋巴细胞淋巴细胞Ｉ丨丨Ｉ骨髄３细胞细胞Ｉ髄痛ＨＡＴ筛这ＨＡＴ筛选ＨＡＴ筛选＋＋＋ＨＧＰＲＴＴＫＨＣＰＲＴ＋ＨＧ－－，ＴＫ，ＰＲＴ或ＴＫ细胞代谢正常细胞代谢正常细胞代，谢缺失但不能连续培养且能连续培荞在ＨＡＴ中死亡图１．１０ＨＡＴ培养基筛选杂交瘤细胞的原理Ｆ１．１０ＰｒｉｌｉｉｇｉｎｃｅｏｆｈｂｒｄｒｏｍａｓｅｌｅｃｔｏｎｗｉｈＨＡＴｍｅｄｉｐｙｉｔｕｍ３．２．２杂交瘤技术基本流程常规杂交瘤技术制备单兖隆抗体的基本流程包括：动物免疫、骨髓瘤细胞培养、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、抗体检测、杂交瘤细胞的克隆、杂交瘤细胞的扩繁和冻存、腹水的制备及单克隆抗体的纯化和鉴定等（图２４ 浙江大学硕士学位论文Ｉ麵威养Ｉ１￥１丁—Ｉ脾细艉？合ｈ１醬鳙＾鎗廪Ｉ厂■ＨＡＴＡ掩》募基麵女瘇麵ＡＩ＾１休ＩｆｉＭ技ｒｒｒｒｊＩ＊＃（＾ｊ｜——ｈＩ瓮醯化１？Ｉ冻存醃Ｉｌ￣－—体Ｉ？抗Ｉ，ｒ＿＿￣—１￣．，所选克￥的鍫定Ｉｊ＜ｌａｍ１Ｉ－ｎ焙养基中注射小鼠艘舷胃ｉ丄Ｉ产系统１Ｉ体丼生；＾统１休＾＼￣１抗侔卜２０１６图１．１１杂交瘤技术制备单克隆抗体的流程（引自宋革，）ＦＭＡｂｗｉｈｈｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｏｌｏＤｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍＳｏｎｉ１．１１Ｔｈｅｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｇｙ（ｇ，ｇｐｐｙ２０１６）３．３单克隆抗体在植物病毒学中的应用一ｓｔｅｎ４０，从１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｉ制备出第个单克隆抗体至今的余年里单克隆抗体在农业科学、食品科学、环境科学和医学等众多领域发挥着重要作用，尤其在生命科学的基础研究，人类、动物与植物的病害诊断与鉴定，环境与食品安全检测与监测和人类疾病的预防与治疗等方面发挥着无法取代的作用。作为植物病理学和病毒学最重要的组成部分一植物病毒学的快速发展和深度进展也离中在病不开单克隆抗体的大规模应用。单克隆抗体在植物病毒学中的应用主要集亚毒病害的诊断与监测、病毒蛋白抗原表位分析和、病毒株系鉴定及分离物分型细胞定位等方面。３．３．１病毒病害的诊断与监测植物病毒是仅次于真菌的第二大植物病原物，可以造成农作物产量大幅降低和品质严重下降，每年造成的损失高迗２００亿美元（邱并生和王敏，２００４；李大２５ 第一章文献综述伟，２０１０）。而对植物病毒的监测可以进行提前预防和综合防治，降低因植物病毒流行造成的损失。但是由于缺乏典型和独有的症状，在田间很难通过生物学特点确认植物被何种病毒所侵染。单克隆抗体所拥有的特异性和高准确度为诊断和监测病毒提供了条件，诸如ＥＬＩＳＡ和免疫胶体金技术等多种血清学技术为田间快速检测植物病毒提供了快速便捷的方法。Ｄｉｅｔｚｅｎ等制备出了针对烟草花叶病毒７ｂ６ａｃｃｏＷｍｓＴＭＶ的单克ｇ（，）一Ｄ隆抗体ｉｅｔｚｅｎａｎｄＳａｎｄｅｒ１９８２。，这也是世界上第个植物病毒单克隆抗体（ｇ，）随后针对植物病毒的单克隆抗体不断被制备出来，到目前己经至少存在上百种植物病毒的单克隆抗体。据不完全统计，中国目前已经制备出了至少４０余种针对９８４植物病毒的单克隆抗体（表１．２）。１年由农业部植检所等多家单位联合研发制备的能分泌抗ＴＭＶ单克隆抗体的鼠淋巴细胞杂交瘤株Ｔ７３是中国第一株能分泌植物病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株（张成良等，１９８５）。表１．２我国己制备的植物病毒单克隆抗体Ｔａｂｌｅ１．２ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａａｉｎｓｔａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｒｏｄｕｃｅｄｉｎＣｈｉｎａｇｐｌｐ病毒缩写属名参考文献百合无症病毒ＩＳＶＣａｒｌａｖｉｒｕｓ（吴建祥等，２００５）（吴建祥等１９９９青玲等ａｂａｖ，；，蚕豆萎蔫病毒ＢＢＷＶＦｉｒｕｓ２０００）郭景荣和陈永萱１９９０张（，，大豆花叶病毒ＳＭＶＰｏ／ｙＷｍｓ淋淋等２０１６，）Ｌｉｅｔａｌ２０１５ＧＡＶＢＹＤＶＧＡＶＬ（，）大麦黄矮病毒株系ｕｔｅｏｖｉｒｕｓ大麦黄花叶病毒ＢａＹＭＶ办ｍｏｖｉｎｇ（赵小立等，１９９７）张普和于善谦，１９９０大麦条纹花叶病毒ＢＳＭＶＨｏｆｄｅｉｖｉｒｕｓ（）（林壁润等１９８９番木瓜环斑病毒ＰＲＳＶ，）．２００８Ｔ（吴建祥，）番茄斑萎病毒ＳＷＶＴｏｓｐｏｖｉｒｕｓ于翠等２００２ｏＭＶＴ（，）番苗花叶病毒Ｔｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ陈京等１９９４洁等（，；曹，番茄环斑病毒Ｔ：ｏＲＳＶＮｅｐｏｖｉｒｕｓ２００７；李桂芬等，２００９）丽２０１１番茄黄化曲叶病毒ＴＹＬＣＶＢ（尚海，）ｅｇｏｎｔｏｖｉｒｕｓ（Ｊｉａｎｅｔａ１．２００３甘蔗花叶病毒ＳＣＭＶｇ，）２６ 浙江大学硕士学位论文刘震，２０１６柑橘黄化脉明病毒ＣＹＶＣＶＭａｎｄａｒｓ（）ｉｖｉｒｕ柑橘衰退病毒ＣＴＷＣｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ（郑光宇和赵荣乐，２００５；王彩霞等，２００６；Ｌｉｕｅｔａｌ．，２０１６）２０宋西娇１４柑橘碎叶病毒ＣＴＬＶＣａｌｌ（，）ｐｉｏｖｉｒｕｓ（于善谦等１９８５谷登峰黄瓜花叶病毒ＣＭＶ，；等１９８７文启等１９８９，；蔡，）．２００９Ｓｈａｎｅ李桂芬等ｔ，黄瓜绿斑驳花叶病毒ＣＧＭＭＶ７＾ａ／ｎｏｗｍｙ（；ｇａｌ２０１１．，）（孟春梅等，２００７＞建兰花叶病毒ＣｙｍＭＶＰｏｔｅｒｖ／ｎｗ马洁等２０１２李痘病毒ＰＰＶＰｏ（，）ｔｙｖｉｒｕｓ宋革２０１６（，马铃薯Ｓ病毒ＰＶＳＣａｒｌａｖ）ｉｒｕｓ？小文等１９８，８；郭柰华（肖马铃薯Ｘ病毒ＰＶＸＰｏｔｅｘｖｉｒｕｓ等１９９０祥２００８，；吴建，）姚康生等１９８５郭军等ｏ（，；，马铃薯Ｙ病毒ＷＹＰｔｙｖｉｒｕｓ１９９０２０１６；宋革等，）郭素华等，１９９１）马铃薯卷叶病毒ＰＬＲＶＬ（ｕｔｅｏｖｉｒｕｓ宋激敏等，１９９１ＳＢＭＶＳｏ６ｅ（）南方菜豆花叶病毒／？ｏｗＶ？ｓ刘欢等，２０１３南方水稻黑条矮缩病毒ＳＲＢＤＶ（）Ｓ桂芬等２０１１（李，）南亦菜花叶病毒ＡｉＭＶＮｅｐｏｖｉｒｕｓ１Ｗ６天晓雁（杨峰等，，，苹果签沟病毒ＡＳＰＶＣａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ２０１３）水稻矮缩病毒（吉栩等，２００９；Ｗｕｅｔａｌ”ＲＤＶ２０１４）静云２０１２ＳＶＯ（董，）水稻齿叶矮缩病毒ＲＲｒｙｚａｖｉｒｕｓＷｕｅｔａｌ２０１３＜－）水稻黑条矮缩病毒ＲＢＳＤＶＦｉｉｖｉｒｕｓｊ刘海建２００５Ｒ（，）水稻条纹病毒ＳＶ甜菜坏死黄脉病毒ＢＮＹＶＶ（刘志昕等，１９９０）杨峰等丨９９２叶荣等ｕＭＶＰｖ（，，，宪菁花叶病毒Ｔｏ／ｙ／ｍｓ１９９６２００４；施曼玲等，）（梁新苗等，２０１３）西瓜花叶病毒ｍＡＶＰｏｔｙｖｉｒｕｓ孙茂林等１９９２宋西娇香蕉束顶病毒ＢＢＴＶ５ａ細（，；等２０１６，）天建祥等，２００５香石竹斑驭病毒ＣａｒＭＶ（）李挪，２０１５（）小麦黄花叶病毒ＷｍＶＢｙｍｏｖｔｒｕａ２７ 第一章文献综述１９８５吕琦等（张成良等，，ＴＭＶ７ｂｆｔａｍｏｖ；烟草花叶病毒／ｍｓ２０１３）桂芬等２０１４（李，）玉米概绿斑驳病毒ＭＣＭＶＭａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓ（张永平等１９８６正金和ＲＭＶ７ｂ６ａｍｏｖ，；涂长叶车前花叶病毒ｉｍｓ于善谦，１９８９）Ｙｅｅｔａｌ．２０００刘欢等（，；，中国小麦花叶病毒ＣＷＭＮＦｕｒｏｖｉｒｕｓ２０１５）对于危害水稻生产的病毒，目前已经制备了针对南方水稻黑条矮缩病毒’ｒｚｅｅＪｈｗ／Ｗｍｓ，ＳＲＢＳＤＶ）、水稻矮缩病毒’＿ｖｚｓＲＤＶ稻齿叶矮缩病ｉ？／ｃｅｒａ＜ｉｆｖ／ｍ，）、水（ｇｇｅ５ｔｏ？ｍｓ，ＲＲＳＶ）、水稻黑条矮缩病毒６／ａｄｓｆｒｅａＡ：ｅｄＪｗａ／／Ｗｒｗｓ，ＲＢＳＤＶ）和水稻条纹病毒Ｗｎｗ，ＲＳＶ）等病毒的单克隆抗体。２０１３年，倪跃群等以粗提纯的ＲＢＳＤＶ病毒粒子作为免疫原，获得了３株能分泌抗ＲＢＳＤＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以此建－－立了用于快速检测ＲＢＳＤＶ的ＡＣＰＥＬＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ的血清学方法Ｗｕｅｔａｌ．（，－ｗ２０１３２０１３。，ＡＣＰＥＬＩＳＡ的灵敏度最高可达１：８１９２０／ｖ／ｍＬ，；倪跃群，）其中（，ｇ）－ｗｄｏｔＥＬＩＳＡ的灵敏度最高可迖１：３２０（／ｖ／ｍＬ倍稀释。刘欢等以人工合成的，ｇ）一ＳＲＢＳＤＶ衣壳蛋白多肽作为免疫原，获得了株能分泌抗ＳＲＢＳＤＶ和ＲＢＳＤＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株分泌的单抗腹水的间接ＥＬＩＳＡ效价高达－１０＇并以此为基础开发了ＳＲＢＳＤＶ的ｄｏｔＥＬＩＳＡ检测试剂盒，检测水稻的灵敏度达到：３２〇２〇１３２〇１３。１（刘欢等，；刘欢，）对于危害小麦生产的病毒，目前已经制备了针对大麦黄矮病毒、小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒等病毒的单克隆抗体。李娜等将ＢＹＤＶＧＡＶ株系的病毒粒子作为免疫原，利用杂交瘤细胞技术获得了８株能分泌抗ＢＹＤＶＧＡＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这８株细胞株分泌的腹水单抗的间接ＥＬＩＳＡ效价均达６Ｔ－－到Ｈ以上ＧＡＶ株系的ＡＣＰＥＬＩＳＡｄｏｔＥＬＩＳＡ，并以此为基础建立了ＢＹＤＶ和检测方法，检测小麦病叶的灵敏度分别达到了１：８１９２０和１：５１２０倍稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ）（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１５；李娜，２０１５）。刘欢等用提纯的ＣＷＭＶ病毒粒子免疫小鼠，经过细胞融合与筛选后获得４株能分泌抗ＣＷＭＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体均可以特异性识别ＣＷＭＶ，以这４个细胞株为核心建立的２８ 浙江大学硕士学位论文ＡＣＰ－ＥＬ－ＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ检测方法的最高灵敏度分别迗到了１：８１９２０和１：２５６０倍稀释（ｗ／ｖ／ｍＬ２０１３。，ｇ刘欢，）（）ｚｅ对于危害玉米生产的病毒，目前已经制备了针对玉米褪绿斑驳病毒（Ｍｊ／ｃ／ｊ／ｏｒｏｒｉｃＷｎｗ，ＭＣＭＶ）和甘庶花吟病毒ｗｏｓａ／ｃＷｍｓ，ＳＣＭＶ）等病毒的单克隆抗体。Ｊｉａｎｇ等以侵染玉米的ＳＣＭＶ浙江分离物作为抗原获得了３株能分泌抗ＳＣＭＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体均可特异性识别一ＳＣＭＶ田间检测结果与－－ＩＣＲＴＰＣＲ相ａｎｅｔａｌ．２００３。，且其致（Ｊｉｇ，）对于危害马铃薯生产的病毒，目前已经制备了针对马铃薯Ｓ病毒（ＰｗａｔｅＳ，ＰＶＳ）、马铃薯Ｘ病毒（Ｐｏ加〇ｖ／ｎｗｉ：，ＰＶＸ）、马铃薯Ｙ病毒（ＰｏｔａｔｏＷｎｗｙＰＶＹ和马铃薯卷叶病毒（Ｐｏ如ｏ／ｅａｒｏ／／ｖ／ｎ？，ＰＬＲＶ等病毒的单克隆抗体。多，）／）ＰＶＸ的单１９８８１９９０个课题组分别制备了针对克隆抗体（肖小文等；郭素华等，；，＿６２００８２０吴建样，）。吴建祥制备的株单克隆抗体腹水间接效价均在以１以上，而－ＥＬＩＳＡ检测方法在病毒浓度为２ｎ以此为基础建立的ＡＣＰｇ／ｍＬ时仍可检测到病毒（吴建祥２００８。而针对ＰＶＹ的单克隆抗体也分别被多个实验室制备，并建，）立了血清学检测技术（姚康生等，丨９８５；郭军等，１９９０；宋革等，２０１６）。对于危害主要经济作物生产的病毒，目前已经制备了针对烟草花叶病毒和西瓜花叶病毒ｖ／ｎｗ，ＷＭＶ）等病毒的单克隆抗体。西瓜花叶病毒是严重危害瓜类作物的马铃薯Ｙ病毒属病毒（Ａｉｓａｎｅｔａｌ．，２０１２），有两个课题５组各自制备了针对ＷＭＶ的单克隆抗体。梁新苗等筛选出分泌肢水效价为ＨＴ的杂交瘤细胞株以此单克隆抗体制备了ＴＡＳ－ＥＵＳＡ检测试剤盒梁新苗等，，丼（２０１３）；陈浙等筛选出了７株能分泌ＷＭＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其单克６隆抗体腹水的间接ＥＬＩＳＡ效价均迖到１（Ｔ以上，并以此单克隆抗体建立了检测－ＡＳ－－－－－ＷＭＶ的ＡＣＰＥＬＩＳＡ、ＤＥＬＩＳＡ、ｄｏｔＥＬＩＳＡ、ＴｉｓｓｕｅｂｌｏｔＥＬＩＳＡ和ＩＣＲＴＰＣＲ．方法１：１６３８４０、１：３２７６８０、１：５１２０和１：１３１０７２０ｗ／ｖ，其灵敏度最高分别迗到了（，／ｍＬ陈浙等２０１６。ｇ）（，）对于危害果树的病毒７ｍ？ｅ／／〇ｗ，目前已经制备了针对柑橘黄化脉明病毒（Ｃ＿ｙ’■■ｖｄ？ｃ／ｅａ／７《ｖ／ｎ？Ｃ７／ｍｆｒ／ｚａＷｈａｓＣＴＶＣＹＶＣＶ、相ｙＷｅ、相ｇ，橘衰退病毒（，橘碎））＿＾ｌｚ＞Ｍ５ｅｒ／ｅａｖ／ｒｌ？ＣＴＬＶ、？／ｅ你／？ｒｏｏｗＨｖ／ｎ＜ｙ叶病毒（Ｃ加／／．，）苹果垄沟病毒（々ｐｇｇ，２９ 第一章文献综述ＡＳＰＶ）和香蒸束顶病毒（５ａｎａｒａａ６ｍｈｃ／＾ｔｏｐｖ／ｎ？，ＢＢＴＶ）等病毒的单克隆抗体，并在生产中进行应用。３．３．２病毒株系鉴定及分离物分型一病毒株系和分型很难通过病毒粒子形状等特性进步划分。而单抗能特异性识别单个抗原决定簇，因此可以将其用于病毒的株系鉴定及分离物分型。Ｈｓｕ等利用抗血清将ＢＹＤＶ分成了ＭＡＶ、ＰＡＶ、ＲＰＶ、ＲＭＶ和ＳＧＶ５个株系（Ｈｓｕｅｔａｌ．１９８４周广和等同样利用抗血清将ＢＹＤＶ分成了４个株系，其中ＧＰＶ株系，）；是中国特有的株系（周广和等１９８７。ＢｒｉａｎｄＴＭＶ两个兰，）等利用单克隆抗体将花株系从普通株系中区分出来（Ｂｒｉａｎｄｅｔａｌ．，１９８３）。Ｃａｎｄｒｅｓｓｅｅｔａｌ等分别利用能’特异性识别李坏死环斑病毒ＣＰｎ＜ｎｔ＜ｓｎｅｃｒｏｔｉｃｎｗｇｓｐｏｆｖｉｒａｓ，ＰＮＲＳＶ）和苹果花＿ＡＭＶＷＶ株系区病毒⑷７７／ｅｗｏ灿ｃｖｚ＞ｗ的单克隆抗体将２１个ＰＮＲＳＶ和Ａ／，ｐ）ｐ分成５个ＡＰＭＶ血清型和３个ＰＮＲＳＶ血清型（Ｃａｎｄｒｅｓｓｅｅｔａｌ．，１９９８）。姚康生等制备了ＰＶＹ株系特异性的单克隆抗体，将其分为３个株系，即Ｃ株系、Ｎ株系和０株系（姚康生等１９８５。ＣＭＶ株系众多，有着不同的寄主反应和差异较大，）１９９４Ｐａｓｉｎｉｅｔａｌ．１９９８的核酸序列（李华平等；ｖｔ，，徐平东等根据制备出的单克，ｑ）隆抗体将ＣＭＶ分成了性质不同的两个亚组（徐平东等，１９９７）。３．３．３病毒蛋白抗原表位分析Ｅｉ表位（ｐｔｏｐｅ）又称抗原决定簇，是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团一。单克隆抗体仅可以特异性识别个抗原决定簇，因此可将其应用到病毒蛋白的抗原表位分析。刘栩平等根据制备出的１６株ＴｕＭＶ单克隆抗体鉴定出６个抗原决定簇（刘栩平等，１９９０）。张成良等利用制备的１０个ＴＭＶ单克隆抗体从１４８１９８６株ＴＭＶ分离物中鉴定到种抗原决定簇（张成良等，＼单克隆抗体还可以用来确定病毒蛋白抗原表位的定位。Ｃｏｍｍａｎｄｅｕｒ等综合利用多抗、单抗定位了３个对ＳＤＳ稳定的抗原表位（ＣｏｍｍａｎｄｅｕｒｅｔａＬ，１９９２）。Ｍｏｕｄａｌｌａｌ等利用针对完整病毒的单抗将部分不连续的抗原决定簇定位在病毒颗粒表面（Ｍｏｕｄａｌｌａｌｅｔａｌ．，１９８２。）３０ 浙江大学硕士学位论文３．３．４其他应用单克隆抗体可以作为探针分析病毒基因产物的亚细胞定位及其功能和致病机制－－ＨＣ－Ｐｒｏ。ＲｏｕｄｅＴａｖｅｒｔ等利用莴苣花叶病毒ＨＣＰｒｏ的单克隆抗体研究发现，ｄｅ－Ｔ可能参与病毒的短或长距离运动（Ｒｏｕｔａｖｅｒｔｅｔａｌ．ｊＣＫ＾Ｂａｍｕｎｕｓｉｎｈｅ等将ｏｇｗｏｓａｆｃｖ／ｒｔ？ＢＭＶ多种细胞标记蛋白和雀麦草花叶病毒，）的单抗应用到免疫荧光共聚焦技术中，成功确定了ＢＭＶＣＰ在本氏烟中的亚细胞定位（Ｂａｍｕｎｕｓｉｎｇｈｅ，Ｄｅｔａｌ．，２０１１）。姜慕将制备的针对中国番痴黄化曲叶病毒＇’？ｍｅ／／ｏｗ／ｅａｃｍ＂／ｖｉｓＴＹＬＣＣＮＶｃｃｏｃ？ｒ／＞，）和烟草曲垄病毒（７ｂ６ａｙ／＿ｄｏｏ；ｖｉ＞ｉ＾，ＴｂＣＳＶ）ｐＣｌ蛋白的单克隆抗体应用到免疫胶体金标记技术中，确定ＰＣ１蛋白定位于烟草细胞的细胞核和叶绿体上（姜碁，２００７）。Ｌｉ等将ＲＳＶ的单ａｒ－Ｗ克隆抗体应用到Ｆｅｓｔｅｍｂｌｏｔ和斑点免疫结合试验中，并结合质谱分析等技术ｉａＷａｅ，从其传播介体灰飞風Ｚａｏ＜／ｅ／／；ｃｓｆｆ／／Ｍ１ｓ中筛选出５个具有体外结合ＲＳＶ（ｊｐ）病毒粒子能力的毘虫蛋白因子（ＬｉＳｅｔａｌ．２０１１。，，）４研究目的和意义二十世纪六十年代以来，世界粮食产量不断增高，但２０１５年全球饥饿人口７９３１／３口以数仍有．亿。而小麦作为人类最重要的食物来源，全球有超过的人小麦为主粮，因此小麦的安全生产是维护粮食安全、降低饥饿人口的重要保陣。一病毒病是小麦上的类严重影响小麦产量的重要病害，目前已报道能侵染小麦的植物病毒种类高达五十多种。由ＷＤＶ引起的小麦矮缩病造成小麦植株严重矮缩、黄化，８０％以上。、抽穂减少或不抽穗使小麦产量大幅度降低，最高可减产ＢＹＤＶｓ引起的小麦黄矮病造成小麦植株矮化、叶片黄化，严重时可使小麦减产７０％，且该病在我国的西北、华北、东北、华中、西南和华东等小麦产区均有发生，且已多次大规模爆发流行。因此，建立上述两种小麦病毒病害的有效防控体系是我国小麦丰产、稳产的保障，而病毒病原的检测技术是建立防控体系的关键。以单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术具有操作简单、特异性好、灵敏度高且适于大规模样品检测等优点，因此被广泛应用于植物病毒的诊断和检测中，３１ 第一章文献综述成为目前植物病毒最主要的检测技术。但迄今为止，国内外未见以ＷＤＶ和ＢＹＤＶＰＡＶ株系单克隆抗体为核心建立的血清学检测技术的报道和应用。为此，本论文旨在制备ＷＤＶ和ＢＹＤＶＰＡＶ株系的单克隆抗体，并以单克隆抗体为核心分别、灵敏的血清学检测技术建立了高度特异，从而为这两种病毒病的诊断与检测、预测预警和科学防控体系的建立提供技术支持和物质保障，进而为我国小麦生产保驾护航。３２ 浙江大学硕士学位论文第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用小麦矮缩病毒（ＷＤＶ）侵染引起的小麦矮缩病是目前世界上危害小麦生产的一主要病毒病害之。该病毒于１９６１年在捷克斯洛伐克首次发现（Ｖａｃｋｅ１９６１，，）随后在芬兰、法国、德国等欧洲大部分国家和亚洲、非洲等多个国家造成了严重的经济损失２００７５０％－８０％。年小麦矮缩病在我国陕西韩城严重发生，小麦产量减少王江飞等２００８。目、山西、甘、３个主（，）前，该病在河北、云南肃河南等我国１要小麦生产省份都有发生－－－。由于小麦矮缩病的发生涉及寄主病毒介体环境等多种复杂因素并缺乏抗性品种导致防控困难，每年均造成严重的经济损失。而建立有效的ＷＤＶ快速检测和预测预警体系是该病毒病防控的关键。为此，本研究通ＣＰ－Ｓ过杂交瘤技术制备了抗ＷＤＶ的单克隆抗体，并以单抗为核心建立了ＡＥＬＩＡｄｏ－和ｔＥＬＩＳＡ的检测方法，并有效应用于田间检测，为我国小麦矮缩病的检测、诊断。、预测预警及科学防控提供物质支撑和技术支持１材料与方法１．１病毒材料、菌株和质粒感染ＷＤＶ的小麦病叶采自陕西韩城和青海西宁市－ＰＣＲ方法和核酸，泾ＲＴ°－８０Ｃ冰箱中测序鉴定后保存于。感染大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系、大麦黄矮病毒ＧＡＶ株系、大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系、中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒的病叶均由中国农科院王锡锋和刘艳老师提供，感染小麦黄花叶病毒的病叶采自山东济宁，并由本实验室鉴定，健康小麦组织由本实验室鉴定保存。ＭＤ－大肠杆菌ＤＨ５ａ、ＢＬ２１３菌株由本实验室保存，克隆载体１８Ｔ载（ＤＥ）ｐａｋａＥＴ－３２＋Ｎ体购自Ｔｒａ公司，原核表达载体ｐａ（）为ｏｖａｇｅｎ公司产品。１．２培养基、抗体及实验材料ＲＰＭ－Ｉ１６４０培养基、ＨＴ、ＨＡＴ、抗体类型及亚类鉴定试剂盒、碱性磷酸酶ａｌｋａｌｉｎｅｈｏｓｈａｔａｓｅ，ＡＰ标记的羊抗鼠ＩＧ二抗、辣根过氣化物酶ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ（ｐｐ）ｇ（ｅｒｏｘｉｄａｓｅＨＲＰ记的羊抗鼠ＩＧ二抗和ＩＰＴＧ均购〒Ｓｉｍａ公司。硝酸纤维素膜ｐ，）标ｇｇ３３ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用（ＮＣ膜）购自ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ公司。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ底物及ＴＭＢ显色底物为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品。ＢａｍＨＩ和Ｈｉｎｄｌｌｌ限制性内切酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶和ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ高保真ＤＮＡ聚合酶均购自Ｔａｋａｒａ公司。ｌｋｂＤＮＡＭａｒｋｅｒ、中等分子量标准蛋白Ｍａｒｋｅｒ购自．ＦｅｒｍｅｎｔａｓＭＢＩ公。氨节青霉素司（Ａｍｐ）、卡那２＋－ＮＴＡ亲和层析柱购自Ｑ霉素（Ｋｍ）为上海生工生物工程公司产品。Ｎｉｉａｇｅｎ公司。ＰＣＲ凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自ＡｘｙＧＥＮ公司。其它试剂均为国产分析纯试剂。１．３ＷＤＶＣＰ的原核表达１．３．１ＣＴＡＢ法提取感染ＷＤＶ小麦植物的总ＤＮＡ°ｘ１）将２ＣＴＡＢ抽提液６５Ｃ预热；２）称取除去主脉的新鲜叶片，加液氮研磨；３一入）最后次加液氮磨样后，立即加入预热的ＣＴＡＢ抽提液，每克叶片加８ｍＬ抽提液－－ｖ／ｖＡＢ，再加入１６０２巯基乙醇２Ｍｅ至终浓度为２％ｐＬ（）（）。ＣＴ抽提液稍溶化后，用研棒将ＣＴＡＢ抽提液与磨碎的样品混勻，转入５０ｍＬ离心管中；°一４６５Ｃｈ－）水浴加热ｌ，期间每１０２０ｍｉｎ播动次离心管；５）加入等体积（约８ｍＬ）２４：１的氯仿／异戊醇抽提液上下混匀，４Ｘ：１０ＯＯＯｒｍｐ离心５ｍｉｎ；６将上清小心地转入另一０ｍＬ离心管中ｍＬ）５（约８）；°７）加入Ｕ１０体积（８００ｇＬ）６５Ｃ预热的ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ，混匀；８）加入等体积（８ｍＬ）氣仿／异戊醇第二次抽提，４Ｘ；ｌＯＯＯＯｒｐｍ离心５ｍｉｎ；９回收水相，将上清小心地转入另＾５０ｍＬ离心管中８ｍＬ）（约）；０１）加入Ｕ１０体积（８０〇ｎＬ）３ＭＮａＡｃ混句；，°°－－１１）加入等体积８ｍＬ２０Ｃ预冷的异丙醇２０Ｃ放置ｌｈ（），之后４丨１２０００ｒｍ，ｐ离心５ｍｉｎ１；一１２）弃上清，用２ｍＬ７５％乙醇洗涤沉淀次；３４ 浙江大学硕士学位论文１３）用干净的枪头将块状ＤＮＡ从５０ｍＬ离心管转移至１．５ｍＬ离心管；１４）１２０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，轻轻倒出７５％乙醇，将１．５ｍＬ离心管反扣在干净的吸水纸上将乙醇吸干；°３７Ｃ１０－１５ｉｎ１５）烘干ｍ。ＤＮＡ烘干过程中应注意观察，以ＤＮＡ较饱满且四周见不到明显的水滴为宜，如ＤＮＡ呈纸状贴在管壁上，则烘干过分，会造成ＤＮＡ难以溶解；°－Ｍ１６加入２００５００ｉｌ丨ｉＱＨ２〇溶解。如ＤＮＡ难溶，可３７Ｃ水浴中助溶）叫灭菌的；－Ｘ１７加入３４ＮＡａｓｅ１０／Ｌｉ，混勻，３７：水浴消化３０ｍｎ；）ｐＬＲ（ｇ）〇Ｌ１８取２ＤＮＡ样品跑琼脂糖凝肢电泳，检测ＤＮＡ的分子大小。同时取ｌ）ｐＬｎ°－样品稀释２０倍／〇Ｄ检测ＤＮＡ含量及质量。剩余的８０Ｃ贮，测定ＯＤ２６〇２８〇，存备用。１．３．２ＷＤＶＣＰ基因的扩增根据ＮＣＢＩ上已报道的ＷＤＶ编码外壳蛋白基因序列（登录号：ＪＱ８３６５６８）一－－设计对特异引物：ＷＤＶＣＰＦ，，－－３ＢＨ５ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＣＧＡ，划线部分为ａｍＩ酶切（，’－－－－３位点和ＷＤＶＣＰＲ５ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＧＡＡＴＣＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＧＡ部）（，划线分为Ｈｉｎｄｌｌｌ酶切位点），并由杭州擎科生物技术有限公司合成。０．５ｍＬＰＣＲＴＯＹＯＢＯ公司的说明ＰＣＲＷＤＶ取薄壁管，参照书进行反应扩增ＣＰ基因反应体系如下：，ＭＳ０４２５ｍＭ３＾ｉＬｇ（）ｄＮＴＰ２ｍＭ５（）＾ＬｌＯｘＫＯＤＢｕｆｆｅｒ５＾ＬＷＤＶ－－ＲＬＣＰＰｒｉｍｅｒ１．５＾－－ｒ１ＷＤＶＣＰＦＰｒｉｍｅ．５ｐ．ＬＤＮＡ模板ｌｆｉＬｆｅｒＬＫＯＤｌｕｓＮｅｏＢｕｆ１ｉｐ（双蒸无菌水３２ｉＬｊ３５ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用总体积５０卟参数设置：°９４Ｃ预变性２ｍｉｎ后开始以下循环：°－９８ＣｌＯｓｅｃ＾５５Ｖ３０ｓｅｃ３０个循环°－６８Ｃ３０ｓｅｃ°°循环结束后６８Ｃ继续延伸ｌＯｍｉｎ１６Ｃ５ｍｉｎ结束ＰＣＲ反应。，然后１．３．３ＰＣＲ产物的纯化从琼脂糖凝肢中回收目的ＤＮＡ片段ｘｅｎＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ，根据Ａｙｇ说明书进行：，步骤如下一１）在紫外灯下用刀片从凝肢中割取目的ＤＮＡ片段，记录重量，该重量作为个凝胶体积；°２３ｅｒ－Ａ加入个凝肢体积的ＢｕｆＤＥ７５Ｃ加热，直至凝肢块完），混合均匀后于一全融化２－３ｍｉｎ混，期间每隔合次；－－３．５ｆｅｒＡ体积Ｂｕｆｆｅ个ＢｕＤＥｒＤＥＢ，上下颠倒混句）加入０；４将混合液转至ＤＮＡ制备管中（置于２ｍＬ离心管）中００ｒｍ离心ｌｍｉｎ），１２０ｐ，弃滤液；５）将制备管置回２ｍＬ离心管，加入５００＾ＬＢｕｆｅｒＷｌ，１２０００ｒｐｍ离心３０ｓｅｃ，弃滤液；６）将制备管置回２ｍＬ离心管，加入７０〇ｎＬＢｕｆｆｅｒＷ２（已加无水乙醇），一１２０００ｒｍ离心３０ｓｅｃ，弃滤液的方法再用７００ｉＬＢｕｆｅｒＷ２ｐ；以同样洗漆｜次，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ；７）将制备管置回２ｍＬ离心管，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ；８）将制备管置于１．５ｍＬ离心管中，在制备膜中央加入３０叫Ｅｌｕｅｎｔ，室温静置ｌｍｉｎ。１２０００ｒｍ离心ｌｍｉｎ洗脱ＤＮＡ心液即为ＤＮＡ溶液。ｐ，得到的离３６ 浙江大学硕士学位论文１．３．４ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接ＰＣＲ产物与Ｔ载体连接之前要先在末端进行加Ａ反应，体系如下：￣￣２＋ｌＯｘＰＣＲＢｕｆｅｒ含Ｍ３（ｇ）＾ＬｄＮＴＰ１Ｏｍｍｏｌ／Ｌ１Ｌ（）ｐ°卜７２Ｃ，反应３０ｍｉｎＴａＰ＿ｑｌｕｓＤＮＡ聚合酶０５叫回收模板（ＰＣＲ纯化产物）２５．５吣＞ＭＤ－与ｐ１８Ｖｅｃｔｏｒ连接体系如下：Ｌ—外源ＤＮＡ片段７．５ｇＭＤ－１８Ｔ载体０．５ｐＬＰ°１６Ｃ过夜，反应、＋？卜ｘｌ〇连接缓冲液ｌｇＬＴ４ＤＮＡ连接酶１叫＿１．３．５热击法转化和重组子筛选°一－１取管８０Ｃ保存的感受态细胞置冰上融化；）２）加入ｌ〇ｎＬ连接产物，混句后冰上放置３０ｍｉｎ；°３４２Ｃ４５２－５ｍｓｅｃｉｎ；）热击后立即置冰浴°４加入８００ＬＬＢ，３７Ｃ振荡培养ｌｈ）ｐ培养基；５８０００ｒｍ离心ｌｍｉｎ，用２００）ｐ吐培养液悬浮沉淀后涂布于麦康凯培养基（含°ｌＯＯｇｇ／ｍＬ氨节青霉素）上，３７Ｃ倒置培养；－－－６菌落长出后用牙签挑取单菌落进ＣＰＦ和ＷＤＶＣＰ－Ｒ引物进行菌），用ＷＤＶ°°°落ＰＣＲ筛斑反应程序为：９４Ｃ预变性２ｍｉｎ９４Ｃ变性３０ｓｅｃ５３Ｃ退火；，，°°３０ｓｅｃ，７２Ｃ延伸ｌｍｉｎ，循环３０次；循环结束后７２Ｃ继续延伸ｌＯｍｉｎ，然°后１６Ｃ５ｍｉｎ；反应结束后取ｌ〇ｎＬ扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶电泳检测；７）将检测结果为阳性的菌落接种到含氨苄青霉素的液体培养基中３７Ｘ：振荡培养至对数生长期；吸取７０〇ｈＬ菌液加入３００ｐＬ已灭菌的７０％甘油后冰箱保３７ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用存备用，另外吸取ｌｍＬ菌液送测序公司测序如果结果正确，则可提取重，组质粒。１．３．６重组质粒的提取质粒提取方法如下（ＡｘｙｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ）：１－４ｍＬ在ＬＢ培养基中培养过夜的菌液１２ＯＯＯｒｍ离心ｌｍｉｎ取ｌ，弃尽上），ｐ清；２）用２５０ｐＬ已加入ＲＮａｓｅＡ的ＢｕｆｆｅｒＳｌ悬浮细菌沉淀，悬浮应均匀；３加入２５０ａＬＢｕｆｆｅｒ４－６）Ｓ２，温和但充分地上下颠倒混合次使菌体充分裂解，｜直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过５ｍｉｎ；４３５０ｎＬ－８２ＯＯＯｍ离心）加入ＢｕｆｆｅｒＳ３，温和并充分地上下颠倒混合６次，１ｒ｜ｐｌＯｍｉｎ；５）吸取上清转移至制备管（置于２ｍＬ离心管中），１２ＯＯＯｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；６）将制备管置回离心管，加５００叫ＢｕｆｆｅｒＷ１，１２ＯＯＯｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，弃滤液；７心管７００ＢｕｆｆｅｒＷ２１２ＯＯＯｒｍ离心ｌｍｉｎ，弃滤液将制备管置回离，加叫，ｐ；）７〇〇Ｂ一用同样的方法再用卟ｕｆｆｅｒＷ２洗涤次；８）将制备管置回离心管中，１２ＯＯＯｒｐｍ离心ｌｍｉｎ；°一Ｌ９）将制备管置于另洁净的１．５ｍ离心管中，在膜中央加６０ｐＬ６５Ｃ预热的Ｅｌｕｅｎｔ或灭菌去离子水，室温静置ｌｍｉｎ，１２ＯＯＯｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，收集洗脱液。－１－．３．７ｐＥＴ３２ａＣＰ重组载体的构建及转化？ＥＴ－３２ａＭＤ－－１８ＴＣＰ５ｉＬｐ质粒或ｐｊＢａｍＨＩ限制性内切酶０軍°Ｈｉｎｄｌｌｌ限制性内切酶０．５（ａＬ３７Ｃ酶切１．５ｈ＾ｌ〇ｘ酶反应缓冲液３叫去离子水２１＾Ｌ—３８ 浙江大学硕士学位论文酶切结束后用１％的琼脂糖凝肢电泳检测结果，将酶切的质粒ＤＮＡ和ＷＤＶＣＰ分别割胶回收后用Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅ连接，连接产物并转化ＤＨ５ｏｔ。转化后的重组质粒经过菌落ＰＣＲ、酶切及测序鉴定，结果正确的重组表达ＥＴ－３２ａ－ＣＰ用热击法转化表迗菌株载体ｐ。１．４ＷＤＶＣＰ蛋白的表达及纯化１．４．１ＷＤＶＣＰ的诱导表达将含重组载体的表达菌接种于含氨苄青霉素抗生素（ｌ〇〇Ｈｇ／ｍＬ）的ＬＢ液体°培养基中，３７Ｃ培养过夜过夜培养菌液以１：１００的比例转接于５００ｍＬ新鲜，将＝－的含氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７Ｘ：继续培养至ＯＤ６〇（）０．６０．８时加入２５〇ＬＩＰＴＧ３７Ｘ：４ｈｌｘＳＤＳｋｉ诱导剂，诱导表达。取ｍＬ菌液离心收集菌体，加入２样品缓冲液１００ｊＬ悬浮并置于沸水中煮５ｍｉｎ１２ＯＯＯｒｍ离心后取上清进行，｜ｐＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析蛋白的表迖情况，如有蛋白表迗则进行蛋白的纯化。１．４．２重组蛋白的纯化ＴＧ８０００ｉ１）将３００ｍＬ经丨Ｐ诱导的菌液ｒｐｍ离心２０ｍｎ，弃去上清；２细菌沉淀用１５ｍＬ左右的缓冲液Ｂ悬浮后于室温摇床摇动ｌｈ，用超声波破）°碎２〇ｍｉｎ使菌体充分裂解，４Ｃ８０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ；２＋°３－取上清液加入０．５ｍＬＮｉＮＴＡＡａｒｏｓｅ４２ｈ）ｇ，混匀后于Ｃ水平摇床上振摇约；４）将混合液装入小柱，室温下让其缓慢下流，所接液体为Ｂ洗液；５待液体流尽后用９ｍＬＣ３３ｍＬ一，，起为）缓冲液洗柱次每次所接液体可放Ｃ洗液；６用４ｍＬ缓冲液Ｄ洗柱４次，毎次ｌｍＬ，分４管收集，分别为Ｄｌ、Ｄ２、Ｄ３、）Ｄ４洗液；７最后用４ｍＬ缓冲液Ｅ洗柱４次，毎次ｌｍＬ，分４管收集，分别为Ｅｌ、Ｅ２、）Ｅ３Ｅ４、洗液；８－将Ｂ、ＣｌＤ２Ｄ３Ｄ４、ＥｌＥ２Ｅ３Ｅ４ＳＤＳＰＡＧＥ）、Ｄ、、、、、、洗液进行电泳及３９ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检查蛋白纯化情况。１．４．３蛋白的透析及复性由于纯化的蛋白液中含有高浓度的尿素，需要透析逐步除去尿素并使蛋白复性。透析时将大烧杯中放满透析液，透析袋中放入纯化的蛋白溶液，两头夹紧放在５００ｍＬ透析液中，４Ｘ：冰箱中透析。透析液依次为含６Ｍ尿素的ＰＢＳ、５Ｍ尿素的ＰＢＳ、４Ｍ尿素的ＰＢＳ、３Ｍ尿素的ＰＢＳ、２Ｍ尿素的ＰＢＳ、１Ｍ尿素的ＰＢＳ、一０－Ｘ：．５Ｍ尿素的ＰＢＳ、ＰＢＳ５小，８０，时换次透析液透析复性后可放冰箱保存备用。－１．４．４ＳＤＳＰＡＧＥＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和（ｌＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶的制备）ａ）分离敗的制备分离胶的浓度应该根据目的蛋白质的分子量大小选择，不同浓度的凝胶制备２一．１。该配方可配制块１．５ｍｍ厚〇Ｃｍｘ７ｃｉｎ的所需的试剂配制方法可参考表、ｌ凝胶。按照表中比例先配置分离胶混合液，混合均匀后缓慢地注入两层坡璃板之间，再用去离子水轻轻注满分离胶上的空隙，使液面压平并阻止氧气进入凝胶溶３０－６０ｍｉｎ此时水相和凝胶的交界处有，使分离胶聚合完全液中。室温下静置，一明显的亮线。然后将上层水相倒掉并用吸水纸吸干，准备制备浓缩肢。表２．１不同浓度变性聚丙烯酰胺凝胶的配方Ｔａｌｅ２ｌｂ．１Ｃｏｍｏｎｅｎｔｓｏｆｄｉｆｉｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｄｅｎａｔｕｒｉｎｏｌａｃｒａｍｉｄｅｅｌｓｐｇｐｙｙｇ不同浓度所需的储备液体积成分８５％１０％１２％１％１７５％．．５５．Ｈ２Ｏ３．５ｍＬ３．１ｍＬ２．５ｍＬ１．８ｍＬ１．２ｍＬ３０％Ａｃ和Ｂ．ｒｉｓ２０ｍＬ２．４ｍＬ３．０ｍＬ３．７ｍＬ４．３ｍＬｘ分离胶４缓冲液１．９ｍＬ１．９ｍＬ１．９ｍＬ１．９ｍＬ１．９ｍＬ１０％１１２ｉＬ１１２Ｌ１１２ｉＬＵ２ｘＬ１１２ｉＬ过硫酸铵｜＾＾ｉｊＴＥＭＥＤ５ｌａＬ５Ｌ５ｘＬ５ｉＬ５ｘＬ｜＾＼ｊ｜￣４０ 浙江大学硕士学位论文ｂ浓缩胶的制备）将上层水相倒掉并用吸水纸吸干剩余水分，然后将２ｍＬ水、０．６ｍＬ３０％丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液８８８ｉＬ浓缩肢缓冲液、４８１０％过硫酸铵、、ｊ叫ＴＥＭＥＤ８ｇＬ混合均勻，注入在分离胶上层直至加满，然后立刻插入梳子，并注意不得在齿尖留有气泡，（如果有气泡可上下轻轻拉动梳子除去小气泡）静置３０ｍｉｎ以上以保证完全聚合。（２）样品的制备反电泳品变性２０ｘ在上样前应将先将蛋白质样：取叫蛋白样品并加入等量２上样缓ｌ〇ｉ３ｍｉｎ冲液后混合均匀，然后置于沸水中加热煮沸ｍｎ左右立即置于冰上冷却，后离心，离心后的上清液即可上样电泳。先将梳子从肢中水平拔出，并组装后放入电泳槽，然后在槽中加满电泳缓冲液。根据实验的需要上样、电泳，通常使用一８０－恒压的方式进行电泳，电压般为１２０Ｖ，待溴酚蓝指示带移至凝胶末端处即－可结束电泳１．５２ｈ。，约需３凝胶的考马斯亮蓝染色和脱色处理（）电泳结束后取出夹心槽，将凝胶小心取出，浸泡在考马斯亮蓝染色液中，水平摇床上摇动过夜。染色完毕后，用少量水淋洗凝胶后放入脱色液中进行脱色，－２－３次，约１．５２ｈ。脱色过程中换脱色液，脱色至蓝色背景消失为止需（４＞潘法转膜电泳结束后取下凝胶，切除浓缩胶，用蒸馏水稍作淋洗后置于转膜缓冲液中。取与ＰＡＧＥ胶相同大小的ＮＣ膜和２张Ｗｈａｔｍａｎ滤纸，置于转膜缓冲液中浸湿，Ｃ２．１然后将凝胶，间隙之间不能留、Ｎ膜、滤纸及海绵依次叠放在支架上（图）有气泡。插入转移槽中，凝胶接卜）极，ＮＣ膜接（＋）极，１００Ｖ转移６５ｍｉｎ。４１ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用滤纸海绵…？＇－１１１ｌ１１ｆｐ凝収硝酸賺膜ｆｌＰ２．图１蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜示意图Ｆｉ２．１Ｄｉａｒａｍｓｈｏｗｉｎｒｏｅｉｎａｎｓｆｅｒｆｒｏｍｌｇｇｇｔｔｒｅｔｏａｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｍｅｍｂｒａｎｅｐｇ（５）Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析单抗的特性１）取出电转移后的ＮＣ膜用ＰＢＳＴ缓冲液５ｍ洗ｉｎ，以除去膜上的转移缓冲液和碎胶；°。２含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ封闭液）将膜浸于中于４Ｃ过夜或者３７（：ｌｈ，以封闭膜上非特异性蛋白结合位点；入含ＷＤＶＣ。３Ｐ单克隆抗体稀释液）将膜放中（１：５０００倍稀释，３７（：１１１）孵育；４弃去反应液后用ＰＢＳＴ在水平摇床上轻轻摇晃清洗３次），每次约５ｍｉｎ；５）将膜转移至含ＡＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗（１：８０００倍稀释）的５％脱脂奶粉稀释液中°３７Ｃｈ，孵育ｌ；６弃去反应液后用ＰＢＳＴ５５ｉ）在水平摇床上轻轻摇晃清洗次，每次约ｍｎ，最后一Ｓ短暂淋次用ＰＢ洗，以去除膜表面的吐温；７）取ｌＯｍＬＡＰ显色缓冲液，加入６６ｐＬＮＢＴ和３３＾ＬＢＣＩＰ底物后配成显色液；８吸干后浸入显色液中，室温下避光反应１５ｍｉｎ左右）将膜；９显色反应完全后将膜放入水中漂洗以终止反应），并拍照记录结杲。１．５单克隆抗体的制备１．５．１纯化蛋白免疫小鼠将纯化得到的蛋白透析后作为免疫原，免疫６周龄左右的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。初次免疫时，用含适量青霉素和链霉素的生理盐水将ｌＯＯ＾Ｌ蛋白加以稀释，用等４２ 浙江大学硕士学位论文体积的弗氏完全佐剂进行乳化，形成油包水状态的乳剂，对小鼠进行皮下及腹腔注射免疫。２ｌ１ｄ后进行二免，１００ｉＬ的重组蛋白用生理盐水稀释后，与等量的弗｜氏不完全佐剂乳化成油包水乳剂后进行皮下和腹腔注射免疫。之后每隔２１ｄ用不一加佐剂的抗原注射腹腔加强免疫一次。在融合的３ｄ前进行次抗原剂量加倍的２．２２０１末免（图倪跃群１３娜２０５。，；李，））（初免二免三免四免加强融合ＩｉＩ！「了２１ｄ２１ｄ２１ｄ２１ｄ３ｄｉ＾ＦＣＡＦＩＡ图２．２ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠免疫程序Ｆｉ２．２ＴｈｅｉｍｍｕｎｅｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｇｐ１．５．２细胞融合及培养参考刘秀梵和Ｗｕ等的方法进行细胞融合、培养、筛选（刘秀梵，１９９４；Ｗｕｅｔ一ａ－ｌ．２０１１。即最后次免疫后３天取出小鼠脾脏ＲＰＭＩ１６４０培３次并，用养基洗涤，）６ＰＭ－１－ｘ将其捣碎Ｉ６４０稀丨２ｌ〇个脾细胞。，离心除去脂肪和碎片，用Ｒ释至每ｍＬ含同时收集培养的小鼠骨髄瘤细胞ＳＰ２／０），离心后将脾细胞与鼠骨髄瘤细胞按（５－１０：１的比例混合于锥型塑料离心管中３０ｍＬ１５００ｒｍ，加入无血清基础培养液，ｐ°°５１离心１１１丨１１后弃上清，加入３７（：预热的５０％＾〇于３７（：水浴中融合２１１１丨１１，然后加入无血清培养液终止反应，１５００ｒｐｍ离心５ｍｉｎ，弃上清。用适量ＨＡＴ培养基悬浮沉°淀，将细胞悬浮液分装入９６孔细胞培养板中，然后在５％Ｃ０２、３７Ｃ细胞培养箱一—中培养１０１４天，中间用ＨＡＴ培养基进行次换液，当细胞生长至占孔底四分之一以上时Ｓ，用间接ＥＬＩＡ方法检测细胞上清是否含有特异性抗体李娜２０１５。（，）１．５．３杂交瘤细胞的单克隆化及扩增一经过阳性检测后需要再用ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法检测次特异性，将筛选到的较好的细胞用ＨＴ培养基吹打混勻后吸出部分细胞进行梯度稀释，在显微镜下选出约４３ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用１００个细胞并加入适量ＨＴ培养基混匀９６，然后分装于孔细胞板中培养培养，１２ｄ左右后挑选单克隆细胞孔的上清进行抗体检测和抗体特异性、灵敏度分析。２－３次细胞克隆将特异性好、灵敏度高的杂交瘤细胞再经过，便可得到分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞。１．５．４杂交痏细胞的冻存和复苏（１）杂交痛细胞的冻存将筛选到的特异性好、能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞转移至２４孔细胞培养板中培养，等细胞长满至整个孔的时候用冻存液悬浮后移至冻存管二甲，并滴加－ＳＯ至终浓度为８－基亚砜（ＤＭ）１０％，立刻放入细胞程序性冻存盒中于８（ＴＣ冰箱放置２４ｈ，后置于液氮罐中永久保存（刘欢，２０１３）。（２）杂交痛细胞的复苏。细胞复苏时直接从液氮罐内取出冻存管一，立即投入３７＜：水浴锅中解冻，经溶解立即取出冻存管１５００ｒｍ离心５ｍｉｎ后去除上清Ｔ，ｐ液，用Ｈ完全培养基悬浮细胞后，转移至新的细胞培养板，置于５％Ｃ０２的３７Ｘ：培养箱内培养，定时换液。１．５．５腹水抗体的制备及纯化（１）廋水抗体的制备８周龄ＢＡＬＢ／ｃ健康的雌性小鼠每只小鼠腹腔内注射〇３ｍＬ取．，降植烷。７－１０ｄ后收集对数生长期的杂交瘤细胞２ＯＯＯｒｍ离心ｌｍｉｎ后用生理盐水，ｐ悬浮，６使细胞浓度约为每ｍＬｌＯ个，每只小鼠的腹腔内注射〇．２ｍＬ杂交瘤细胞悬液。７－注射１０ｄ后观察小鼠，当小鼠腹部明显膨大，用采血针头刺入小鼠腹部收集，肢水。８ＯＯＯｒｐｍ离心３ｍｉｎ，上清液即为腹水单抗（悅跃群，２０１３）。（２）腹水抗体的纯化一方法：饱和硫酸铵盐析法４４ 浙江大学硕士学位论文１）取适量腹水室温融化后１２０００ｒｐｍ离心３ｍｉｎ，上清加入等体积的生理盐水混２４：匀后，边搅拌边缓慢滴加倍腹水体积的饱和硫酸铵溶液，混匀均匀后Ｘ放置３ｈ，待其充分沉淀后１２０００ｒｐｍ离心１５ｍｉｎ；２）弃去上清，用生理盐水悬浮沉淀，然后移入处理好的透析袋中，加入０．０１Ｍ°ＰＢＳ缓冲液一ＰＢ，４Ｃ下缓慢搅拌透析，每隔２ｈ换次Ｓ缓冲液；３）将取ｌｊｉＬ透析好的抗体用ＮａｎｏＤｒｏｐ紫外分光仪测定其ＩｇＧ的含量，分装于离心－８０Ｘ管后于：超低温冰箱待用。方法二：ＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＡＨＰ柱子１注射器吸取ｌＯｍＬｂｉｎｄｉｎｂｕｆｆｅｒ２０ｍＭｓｏｄｉｕｍｈｏｓｈａｔｅ７．０）用ｇ（ｐｐ，ｐＨ）清洗ＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＡＨＰ柱子；２）将所需纯化的抗体注射进柱子后缓慢滴出；３）用ｌＯｍＬｂｉｎｄｉｎｇｂｕｆｅｒ清洗柱子，以除去未被结合的杂蛋白；４－与抗体等体积的ｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｅｒ０．１ＭＧｌｃｉｎｅＨＣｌＨ２．７）吸取，用（ｙ，ｐ）以洗脱被柱－．至７子结合的ＩｇＧ，并将收集的液体用ｌＭＴｒｉｓＨＣｌＨ９０调．５，即为纯（ｐ）ｐＨ化后的抗体，取１叫用ＮａｎｏＤｒｏｐ紫外分光仪测定其ＩｇＧ含量，后分装于小管中并于－８０１冰箱冻存待用；°５）用２０％乙醇清洗柱子后，保存于４Ｃ冰箱。１．５．６肢水抗体效价的测定用感病植物组织粗提液：３０ｗ／ｖ／ｍＬ，１（，ｇ）倍稀释后包被酶标板将单抗腹水作一ＳＡ为抗进行倍比稀释后加入到包被好的ＥＬＩ板孔中，然后用ＡＰ标记的羊抗鼠ＩＧ为二抗进行间接ＥＵＳＡ方法，测定抗体的效价。ｇ１．５．７单克隆抗体类型及亚类鉴定利用ＤＡＳ－ＥＬＩＳＡ免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒Ｓｉｍａ公司定单抗的（ｇ）鉴抗体类型及亚类，具体步骤为：〇１Ｃ包１）用包被液将羊抗鼠抗体进行１：５０００稀释，每孔１０吣，４被过夜；２ＰＢＳＴ３加入含３％脱脂奶粉的ＰＢＳ弃去包被液，用洗涤酶标板次后，每孔）４５ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用°封闭液２５０叫，于３７Ｃ封闭０．５ｈ；°３将封闭液弃去后，加入ｌＯＯｉＬ杂交瘤细胞株上清液，３７Ｃ孵育ｌｈ）；ｊ４）弃去酶标板中的细胞上清液并用ＰＢＳＴ洗涤３次，然后分别加入１００队１：５０００倍稀释的ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、Ｋ、入°检测抗体３７Ｃ孵ｌｈ，；５）弃去抗体后用ＰＢＳＴ洗涤５次，加入ＴＭＢ底物显色，记录显色结果。１．６血清学方法的建立及特性分析１－ＥＬＩＳＡ方法的建立．６．１ＡＣＰ及其特异性和灵敏度分析⑴ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法的步藿１ＣＰ蛋白０．０５Ｍ）包被：将纯化的ＷＤＶ或植物组织粗提液用包被缓冲液（碳酸°盐缓冲液，ＰＨ９．６）适当稀释后加入到ＥＬＩＳＡ板孔中（１００叫／孔），置４Ｃ过夜后用ＰＢＳＴ洗涤３次，每次３ｍｉｎ；２）封闭：加入含３％脱脂奶粉的ＰＢＳ封闭液（２５０叫／孔），３７１封闭０．５ｈ；一ＷＤＶ单３）加抗：弃去封闭液后将酶标板拍干，加入用封闭液适当稀释的抗°腹水或杂交瘤细胞培养上清液（ＩＯＯ＾ｉＬ／孔），３７Ｃ孵育ｌｈ；４二一入用封闭液稀加抗：弃抗液后用ＰＢＳＴ洗涤３次，每次３ｍｉｎ），拍干后加Ａ°释的Ｐ标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗稀释液（１０〇ｈＬ／孔），３７Ｃ孵育ｌｈ；５）显色：弃二抗液后，用ＰＢＳＴ洗涤４次，每次３ｍｉｎ，拍干后加入显色底物液（１００＾１７孔），置室温下待其充分显色；－６－检测：显色３０５０ｍｉｎ后，用２Ｍ氢氧化钠终止反应ｏＲａｄ），将酶标板置于Ｂｉ６８０酶标仪上测ＯＤ４０值，以Ｐ／Ｎ＞３．１作为阳性判断标准。５２检测植物榉品中ＷＤＶ的ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法的建立（）通过方阵实验来确定ＷＤＶ单抗和酶标二抗的最适工作浓度，即ＷＤＶ单抗二从１：２００倍至１：２５６００倍倍比稀释，ＡＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ抗从：１０００倍１至２０００Ｖ的植１２０１：５１倍倍比稀释，用感染ＷＤ物粗提液：倍稀释后作为检测抗原，４６ 浙江大学硕士学位论文ＡＣＰ－ＥＬ健康小麦组织粗提液作为阴性对照，确定ＩＳＡ的最适抗体工作浓度，建立检测小麦样品中ＷＤＶ的ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法。３析ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单（）分抗的特异性用感染ＷＹＭＶ、ＢＹＤＶＰＡＶ株系ＢＹＤＶＧＡＶ、ＢＹＤＶＧＰＶ、、株系株系ＢａＹＭＶ和ＣＷＭＶ的小麦植物组织粗提液作为检测抗原，以感染ＷＤＶ的小麦植物组织粗提液为阳性对照，以健康小麦粗提液作为阴性对照，所有样品粗提液００５Ｍ１２０／／ＳＡ均用包被液（．碳酸盐缓冲液）按：倍稀释（ｗｖｍＬ后包被ＥＬＩ板，ｇ），ＤＶＣＰ－ＥＬ分析Ｗ单抗及建立的ＡＩＳＡ方法的特异性。４－ＥＬ＜）分析ＡＣＰＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的灵敏度将感染ＷＤＶ的小麦病叶和健康小麦组织用液氮充分研磨，匀浆离心后分别ｗＳ用包被液从１：１６０倍至１：６５５３６０倍／ｖ／ｍＬ进行倍比稀释，依次包被ＥＬＩＡ（，ｇ）－板，用建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法分析单抗的灵敏度。１－．６．２ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异性和灵敏度分析ｌｄｏ－ｔＥＬＩＳＡ方法的步骤：（＞／０１点样：将植物样品用液氮充分研磨后，按ｌ：２０ｗｖ，／ｍＬ的比例加入０．１Ｍ）．（ｇ）ｍ离心３ｍ．ＰＢＳＨ７．４５０００ｒｉｎ后得到的上清即为病毒粗提液。取２５（ｐ），ｐｐＬ上清液点到ＮＣ膜上，在室温下干燥ｌＯｍｉｎ；°２ＮＣ５％ＰＢＳＴ３７Ｃ封闭３０ｍ－ｉｎｌｈ）封闭：将膜浸入到含有脱脂奶粉的封闭液中，；一３？ＷＤＶ单）加抗．将克隆抗体１：５０００倍稀释到含５％脱脂奶粉的ＰＢＳＴ中，Ｎ°放入Ｃ膜，３７Ｃ孵育ｌｈ；一４）加二抗：弃去抗反应液，ＮＣ膜用ＰＢＳＴ于摇床上洗涤３次，每次５ｍｉｎ，二°３７（：１然后置于１：８０００倍稀释的处标记的羊抗鼠每０抗中１，孵育１；５显色：弃去二抗反应液，用ＰＢＳＴ洗涤４次，毎次５ｍｉｎ，最后用ＰＢＳ洗涤１）－２０１０ｍＬ次以去除膜表面的吐温。用吸水纸将膜吸干，在的底物缓冲液中加入６６ｈＬＮＢＴ和３３ｎＬＢＣＩＰ的显色底物（Ｐｒｏｍｅｇａ），混句后将膜浸入其中显色，肉眼观察显色结果，直至阳性对照显紫色，而阴性对照为无色或绿色时在自来水中漂洗膜终止反应，拍照并记录结果。４７ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用２检测椬物样品中ＷＤＶ的ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法的建立（）根据方阵实验确定ＷＤＶ单抗和酶标二抗的最适工作浓度，根据最适浓度建ｄｏ－立以ＷＤＶ单抗为核心的检测植物中ＷＤＶ的ｔＥＬＩＳＡ方法。３分析ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的特异性（）用感染ＷＹＭＶ、ＣＷＭＶ、ＢＹＤＶＧＡＶ株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢＹＤＶＰＡＶ株系和ＢａＹＭＶ的植物样品粗提液作为检测抗原，以感染ＷＤＶ的小麦样品和ＷＤＶＣＰ重组蛋白为阳性对照，以健康小麦为阴性对照，所有植物样品均用ＰＢＳｍＬ缓冲液按１：２０比例稀释：２００ｖ／，．５品点到，蛋白按１倍稀释（ｗ／，ｇ）取２成样ＮＣ膜上ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法分析ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的特，然后用建立的异性。４ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡＷＤＶ单（）分析方法和抗的灵敏度４０／将感染ＷＤＶ的小麦病毒粗提液从１：２０倍至１：１０２ｖ倍进行倍比稀释（ｗ，／ｍＬ组织为阴性对照２．５ｉＬｇ），以对应稀释度的健康小麦，每个稀释梯度分别取ｆＣ膜上－ＥＬ点到Ｎ分析ｄｏｔＩＳＡ方法和制备。，单抗的检测灵敏度１．７血潸学方法的田间应用用以ＷＤＶ单抗为核心建立的ＡＣＰ－ＥＬ－ＳＩＳＡ、ｄｏｔＥＬＩＡ血清学方法和ＰＣＲ２一方法检测采自中国陕西省和青海省的１８株小麦样品，统计发病率，并抽选些阳性样品进行核酸测序验证。２结果与分析２．１ＷＤＶＣＰ的原核表达和纯化采用ＣＴＡＢ法提取感染ＷＤＶ的小麦病叶组织的总ＤＮＡ，用设计的引物进７８２ｂ－行ＰＣＲ扩增，得到ｐ的ＣＰ基因，将割肢回收后的产物插入ｐＭＤ１８Ｔ载体－上得到－－－ＰＭＤ１８ＴＣＰ重组子。将ｐＭＤ１８ＴＣＰ中的ＣＰ基因经ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄｌｌｌＥＴ－３２ａ连接限制性内切酶双酶切后与用相同酶酶切的表迗载体ｐ，构建原核重组ＥＴ－３２ａ－ＣＰ表达载体ｐ，经过酶切、ＰＣＲ、测序验证表明重组载体中ＣＰ基因ＯＲＦ４８ 浙江尺学硕上学位论之ＥＴ－３２ａ－Ｌ２１ＤＩ￡３，且碱基未发生突变。将重组质粒ｐＣＰ转化大旸杆菌Ｂ），正确（ＴＧ－ＰＡＧＥ挑取单菌落于ＬＢ培养液中培养，经０．５ｍＭＩＰ诱导表达和ＳＤＳ电泳发ＥＴ－３２ａ－２丨ＤＥ３ｉ现，ＣＰ的大肠杆菌ＢＬ（秀导，与未诱导的对照相比含重组质粒ｐ）５０ｋＤ—３－后约在ａ处ｔ各弓显蛋白务带（图２．３Ａ），与預期的重ｍ融；蛋曰乂Ｖ一－致３２ａ空ＩＰＴＧ诱导后在１９ｋＤａ处条明显的硫氧辽蛋，而含ｐＥＴ载体的菌液有２ｘＨｓｅｓｔｅｒｎｏｔ白标签条带图．３Ａ）。利用抗６ｉ标签单吏隆抗体进行Ｗｂｌ分析鉴定，（９ｋ＞＜ｉ结果表明表迗的该重组蛋白和１Ｄａ空载体蛋白都能与抗６Ｈｓ标签单克隆杭２ＪＢＤＶ的外ＢＬ２１ＤＥ３体发生特异性反应，（）（图）表明Ｗ壳蛋白已在大肠杆菌Ｎｒ－ＮＴＡ亲和层析柱纯化可得到高纯度的重沮ＣＰ蛋白（图２．３、中融合表达，用２４．。）４３２１ＭＭ１２３４ＫＤａ，ＩＭｂ１００；７０Ｉｗｆｔ５５Ｍｌ？４０丨＿３５ｔｋｆ２ｓ霸：Ｂ－４ＡｅＩＳ？２－图．３重组采白的ＳＤＳＰＡＧＥＡａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｔＢ）ｖ（）ｌｏ析（‘＇＇Ｍ？－■，中ＶＶ子舉ｔＩ．Ｕ．５ｍＭｉ秀导含有ｐｌ：Ｔ３２ａ找２＾卜隹４白；彳Ｍ勺人柯忏儿＇＇＇．ｆｔ导含－－２［，未ＫＩ３２ｉ卜ａＭｔ体的太旸杆保１Ｌ２１Ｄｌ：３３，（丨ＩＨ（ｉ译ｆｌ：Ｔ３２从ｐ（＞：ｋｐ载体大肠杆菌ＢＬ２１（Ｄｆｉ３）：４，吨化的重组蛋白，Ｆ－ｉ２．３ＳＤＳＰＡＧＨＡａｎＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔＢａｎａｌｓｅｓｏｆｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｒｉｎｇ）ｄ（ｈｅｔｏｔｅ（）ｙｐ＇ＬａＭ－．ｒｏｉｎｍｏｌａｒｗｅｈｍａｋＬａｎ１ＥｃｌＢＬ２１１３ｉｎ３２ａｎｅｐｔｅｌｅｃｕｉｔｒｅｒ．ｅ．．ｏｉＤｈａｒｂｏｒＥＴｇ（）ｇｐ－－－ｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈ０５ｍＭＩＰＴ．Ｌａｎｅ２ｎｄｕｃｅｄＥ．ｃｏｌＢＬ２１ＥｒｒｎＰ．．ＧＮｏｎｉｉ（Ｄ３）ｈａｂｏｉＥＴ３２ａＣ，ｇｐＬａｎｅ－－．Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２Ｉ０１：３ｈａｒｂｏｉＥＴ３２ａＰｉｄｉｈ（）．５Ｍ１ＰＴＧＬＰｉｉ３（）ｒｎｇｐＣｎｕｃｅｄｗｔｍ．ａｎｅ４．ｕｒｆｅｄｒｃｃｏｍｈｉｎａｎｔｒｏｔｃｉｎ．ｐ ．第二ｆ：小麦矮缩娲屯中克降抗体的制备及其应ｍＫＤａＭ１２３４５６ｎ：：：２－图．４纯化的ＷＤＶ重沮ＣＰ蛋白的ＳＤＳＰＡＧＥ分析Ｍ－Ｄ４，中等分子董标准蛋白；Ｌａｎｅｓ１６ＤＤＤＥｌＥ２，ｌ，２，３，，，洗脱液。＇Ｆ－ｉ２．４ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｓｇｉｓｏｉｕｒｉｆｉｃｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣＰｒｏｅｉｎｏｆｙｐｐｔＷＤＶＬ－ａｎｅＭｌｌ．ｒｏｔｅｉｎｍｏｅｃｕａｒｗｅｉｈｔｍａｒｋｅｒ．Ｌａｎｃｓ１６．ＤｌＤ２．Ｄ３Ｄｐｇ．，４，ＥｌａｎｄＥ２ｅｌｕｔｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｒｅｓｅｃｔｉｖｅ．ｐｌｙ２．２细胞的融合、筛选和克隆＇将纯化、复性后得到的ＷＤＶＣＰ重组蛋白作为免疫原免疫６同龄左右的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，四次免疫后取出小鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）进行融合，经ＨＡＴ培养基筛选培养１０ｄ，２５块９６孔细胞板的融合率为９５％。当杂交瘤细咆１／４Ｓ生长至覆盖孔底时，用间接ＥＵＡ方法检测细胞上清中的抗体。检测结果发现，共有２４８ｆ孔呈阳性反应，阳性率为１０．３％。经过特异性和灵敏度检测，并进行３次细胞有限稀释法克隱，最终获得４株（１８Ｇ１０、９Ｇ４、２３Ｆ４２２Ａ１０和）能够稳定分泌抗ＷＤＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。２．３腹水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定选取８周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔内注射降植烷０－．３ｍＬ７ＩＯｄ，后向小鼠的腹腔内注射ＷＤＶ杂交瘤细胞７－ｌ（）ｄ，约后小鼠腹部明显膨大，用采血针采集腹水，４株杂交瘤细胞分别获－１丨５ｍＬ单抗腹水。将腹水纯化后测其得０ｌｇＧ含量为５－．８７１０．ｌ４ｍ／ｍＬ２。．２ｇ（表）杭体类型及亚类鉴定结果表明，４个单抗的类型均为＿ｆｌ７－ＩＧ重链、ｋ轻链表２．２。间接ＥＬＩＳＡ方４ｇ１０ｌ（Ｔ！（）法测得株单抗腹水效价均在之间（表２．２。）５０ ：浙ｎ：戈：丨７位论义表２．２小麦矮缩病毒单ｔ；隆抗体的特性Ｔａｂｃ２．２ＰｒｏｅｒｔｉｅｓｏｆＭＡｓａａｉｎｓｔＷＤＶｉｐｂｇＧ含量单抗类型及亚类效价丨ｇＭＡｂｓＩｓｏｔｙｐｅｓＡｓｃｉｔｅｓｔｉｔｅｒＩｇＧｙｉｅｌｄ（ｍｇ／ｍＬ）＇７１８Ｇ１０ＩＧｋｇ１０７．４３ｉ＂６９Ｇ４ＩＧ１０５８ｇ，ｋ．７＂＇２３Ｆ４ＩＧｋ１０１０．１４ｇｉ７２２Ａ１０ＩｇＧｉｋ１０８．５８２．４Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＷＤＶ单抗的特异性、利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ的方法分析ＷＤＶ单杭的特异性，结果表明，４彳单兖隆一抗体均能与感染ＷＤＶ的小麦病叶粗提液杂到条约３（）ｋＤａ的特异性条带，与ＷＤＶ外壳蛋白大小相同、；同时４彳抗体也都能与纯化的约５０ｋＤａ的重组ＷＤＶＣＰ蛋白专生特异性免疫反应，而与徤康的小麦组织没有任阿夂应（图２．５），说明４个单杭均可以特异性地识别ＷＤＶ的外壳蛋白。ＫＤａＭ１２３１２３１２３１２３７０５５ｍｍｍｍ４０３５—＾＾２５１５１８Ｇ１０９Ｇ４２２Ａ１０２３Ｆ４图２．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分忻ＷＤＶ单抗的特异蚀Ｍ，中等分子量标准蛋白；１，丨建康小麦组织；２，愨染ＷＤＶ的小麦组识；３，ＷＤＶＣＰ吨化蛋白。－Ｆｉ２ＷＤＶＭＡｂＷ．５ＳｅｃｉｆｉｃｔａｎａｌｓｅｏｆａｎｔｂｌｔｇｐｉｙｙｓｉｓｅｓｔｅｒｎｂｕｙＬａｎｅＭ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｍａｒｋｅｒ．ＬａｎｅＩ．ｈｅａｌｔｈｙｕｌｉｃａｌｐｌａｎｔ（ｉｓｓｕｅｓ，［．ｕｎｃ２．－＊ＷＤＶｉｎｆｃｃｔｃｄｗｈｅａｌａｉｅｔｐｎｔｔｓｓｕｓ．Ｌａｎｅ３．ｉｉｒｉＵｃｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣｌｒｏｔｅｉｎｏｆ＼＼Ｉ）＼ｐｐ．５１ ．第：申小麦矮缩病办中免降抗沐的制备屣其应用．２－．５ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法的建立及其特性分析２ＷＤＶ的ＡＣＰ－．５．ＥＬＩＳＡ１检测植物中方法的建立通过方阵实验确定ＡＣＰ－ＥＬ吳畏明单抗ＩＳＡ方法杭体的最适工作浓ｆ，结２２Ａ１０、２３Ｆ４的最适工作浓度为１：６０００倍稀释，单抗１８Ｇ１０和９Ｇ４以１：５０００倍稀释为宜。ＡＰ标记的羊抗鼠ＩｇＧ二抗均以１：８０００倍稀释为最适工作浓度。Ｐ－ＥＬ根据以上抗体的最适工作浓度建立检测植物中ＷＤＶ的ＡＣＩＳＡ方法，并分析该方法和制备的ＷＤＶ单抗的特异性和灵敏度。２－．５．２ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的特异性分析－ＥＬＷＤＶ单抗的特异性进行分析用建立的ＡＣＰＩＳＡ方法４对，结果表明，个ＷＤＶ单兗隆杭体都对感染ＷＤＶ的小麦植物组织有很强的特异性免疫反应，ＰＢＹＤＶＧＡＶ而对感染ＷＹＭＶ、ＢＹＤＶＡＶ株系、株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢａＹＭＶ和ＣＷＭＶ的小麦植物组织和健康的小麦沮织呈阴性反应，且ＯＤ值差异极显著图２－（．６这４令ＷＤＶ单抗及以其为梭心建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法具有很好），说明的特异性。Ｖ－ＤＶｗｔ＾ｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａ２．５－ｗＨＢＹＤＶｔ＾ＰＡＶｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａ□－ｗＢＹＤＹＧＡＹｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａｔ２ＩｎＶ－□ＢＹＤＧＰＶｉｎｆｅｃｔｅｄｗｈｅａｔｒ？Ｐ＝□Ｂ－ｗｔｔａＹＭ＼ｉｎｆｅｃｅｄｈｅａ＼｜＊１５１ＩＩＩＩ＞Ｉ－ｗｇＥ３ＷＹＭＶｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａｔ｜ｏ５－ｒ＠□ＣＷＭＶｉｎｆｅｃｗｈｔｔｅｄｅａａ１□ｗＨｅａｌｔｈｙｈｅａｔ圓｜｜｜０．５９Ｇ４１８Ｇ１０２３Ｆ４２２Ａ１０ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ＇２－图．６建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的特异性Ｆ２Ｓ－－ＷＤＶＭＡｂｉｆｉｌｈｌＡＣＰＥＬＩＳＡｉｉｇ．６ｅｃｉｃｔａｎａｓｅｓｏｆｔｅｄｅｖｅｏｅｄａｎｄａｎｔｓｐｙｙｐ５２ 断江九学硕丨：学位论ｉ２５３ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的灵敏度分析．．、Ｃ－ＥＬＷＤＶ的单克隆抗体的灵敏度，结果通过建立的ＡＰＩＳＡ方法分析４１－２３Ｆ４１０ＰＥＬ１ＳＡ方法的灵敏度最高，测表明以单抗、２２Ａ为核心建立的ＡＣ６３ｗ／ｖ／ｍＬ以９Ｇ４、１８Ｇ１０单丨：丨８４０倍稀释，而ＷＤＶ病叶的灵敏度可述到（，ｇ）－ｗ／ｖＳ８丨９２０，ＡＣＰＥＬ，丨：（抗为核心建立的ＩＡ方法的灵敏度略低但也到达倍稀释－２ＩＳ／ｍＬ．７ＡＣＰＥＬＡ方法和制备的单抗具有很好的检测灵敏，）图说明建立的ｇ（）度。－？－１８Ｇ１０＂＊－Ｂ－２３Ｆ４２．５＾－＾—９０４卜°＾Ｌｅａｆｄｉｌｕｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ２－图．７建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡｔ法和ＷＤＶ单恍的灵敏度分析ＣＫ－，徤康的小麦植物组织。＇－－ＷＤＶＭＡｂｌＡ（Ｐ１：ＬＩＳＡａｎｔｉｓｌｉ２．７Ｓｃｎｓｉｉｘｉｔａｎａｌｓｅｓｏｆｔｈｅｄｅｖｅｏｐｅｄｄａｎｇｔｙｙ＇－ｈｅａＣＫｈｅａｌａｎｉｓｓｕｅｓ．ｌｔｈｗｔｔｔ，ｙｐ－２．６ｄｏｔＦ丄丨ＳＡ方法的建立及其特性分析－ＥＬ２ＷＤＶ的ｄｏｔＩＳＡ方法的建立．６．１检测植物中用方阵试验确定ＷＤＶ单杭和酶标二抗的最适工作浓度，结果表明在检测植物样品时，单杭２３Ｆ４、２２Ａ１０、９Ｇ４和丨８Ｇ１０的最适浓度都为１：５０００倍稀释，而－１０２０ｍｉｎＡＰ标记的羊抗鼠丨ｇＧ二抗均以１：８０００倍稀释为佳，显色后拍照记录结果。５３ ？应ｆ第：小麦矮缩病海令纪隆抗体的制备及Ｋｆｌ工作ＷＤＶ的ｄｏ－ＥＬＳＡ根据杭体的最适浓度建立丨测小麦植物沮织中ｔ丨方法，并分析该方法反ＷＤＶ单杭的特异性和灵敏度。２６２ｄｏｔ－ＥＬＷＤＶＩＳＡ．．方法和单抗的的特异性分析＇建立的ｄｏｔ－ＥＵＳＡ方法的特异丨生分析结果表明彳ｉ，其测感染ＷＤＶ的小麦病叶及重组ＷＤＶＣＰ蛋白时呈紫色的阳性反应，而与感染ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢＹＤＶＧＡＶ侏系、ＢＹＤＶＰＡＶ株系、ＷＹＭＶ、ＣＷＭＶ和ＢａＹＭＶ的＋麦组织以及健康Ａ、－２．８明这４彳单抗和以其为核々建立的ｄｏｔＥＬ麦沮织呈阴性芡应（图）ＩＳＡ方法，表具有很好的特异性。１２３４５６７８９？？２３Ｆ４？９＃？２２Ａ１０赢ｒ癱？？１８Ｇ１０？？＿９Ｇ４？：為２－图．８建立的ｄｏｔＥＬｌＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的的特异性分析１，２，ＷＤＶＣＰ３ＷＹＭＶ的小麦病叶４，碜染ＷＤＶ的小麦病叶；纯化蛋白；，感染；感染ＣＷＭＶ的小麦病叶；５染ＢＹＤＶＧＡＶ株爷的小麦病叶；６，感染ＢＹＤＶＧＰＶ株系的小，感麦病叶；７，感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶；８，感染ＢａＹＭＶ的小麦组织；９，徤康小麦沮织；上下两个点为同一祥品的重筻。－－ＦｌｉＷＤＶＭＡｂｓｉｇ２．８Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｄｃ＼ｅｏｅｄｄｏｌＥＬＩＳＡａｎｄａｎｔｙｐ＇－－１．ＷＤＶｉｎｆｃｃｔｃｄｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓ．２．ｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＣＰｒｏｔｅｉｎｏｆＷＤＶ．３．ＷＹＭＶｉｎｆｃｃｔｃｄｐｐｅａＷＭＶ－－ｌｅａｖｓ．４ｉｎｃｄｗｈｅａｌｓ．５ＢＹＤＶＡＶｉｎｔｃｄｗｈｅａｔｌ．６ＢＹＤＶｗｈｔｅ，Ｃｆｃｃｔｔｅａｖｅ．Ｇｆｅｃｅａｖｅｓ，－－ＰＶ－ＶＰＡＶＧ．７ｉｎｔｅａｔｅａｖｅ．８ＢａＹＭＶｎｆｃｃｔｃｄｗｈｅａｔｉｎｆｅｃｔｃｄｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓ，ＢＹＤｆｅｃｄｗｈｅｌｓ，ｉｌｅａｖｅｓｈｌｈｌ．．９．ｅａｔｙｗｈｅａｔｅａｖｅｓＵａｎｄｏｗｎｏｌｐｄｄｔｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｒｅｓｅｎｔｅｄｒｅｅａｔｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｓａｍｅ．ｐｐｐ５４ ‘７：硕浙ｉｌ：人丨位论ｉ２－．６．３ｄｏｔＥＬ丨ＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的的灵敏度分析ＤＶ的１将感染Ｗ病叶和徤康小麦组织分别从：２０倍开始进行倍比稀释，直＇、０２－到１：丨０２４倍￣八／１１化，稀释度各点样．５１１匕加已１１５八方法的灵，８）每１，分析）２３Ｆ４ｄｏｔ－ＥＬｌＳＡ方法敏度。结果表明，以单抗为核心建立的的灵敏度最高，拾１，测ＷＤＶ病叶的灵敏度可以达ｆ１：１２０／ｖ／ｎｉＬ２２Ａ丨０丨８１０：５咅稀释（ｗ，ｇ，乂和Ｇ）１－１＾心建立的丨５八１丨２８０止单杭为核（〇１方法的灵敏度达到：倍稀释￣／１／丨１）２，而以９Ｇ４单抗为梭心建立的ｄｏｔ－ＥＬｌＳＡ方法的灵敏度最低，但也达到１：６４０倍稀释ｗ／ｖ／ｍＬ２．９（，ｇ）（图）１：４０１８０１１６０１：３２０１：６４０１：１２８１０１５１２０１１０２：２０１：：０：２５６：：４０？？ｖ°２３Ｆ４ＣＫ－ｅＫ４擊鲁—癱響鲁—＃＿胃ｗ３＿２２Ａ１０ＣＫ－？？ｏ１８Ｇ１０ＣＫ－９Ｇ４ＣＫ－－、图２．９ＤｏｔＥＬＩＳＡ方法和ＷＤＶ单抗的＜丰斤敏度勿－ＣＩＣ＋Ｖ的小麦病叶组织，感染ＷＤＣＫ徤康的小麦沮织。；，；ｆ－－ｉ２．９ＳｃｎｓｉｔｉｘｉｔａｎａｓｓｏｌｔｈｃｄｅｌｅｄＩ；ＬＩＳＡｄｉＷＤＶＭＡｂｇｙｌｙｉｖｅｏｐｄｏｔａｎａｎｔｓ－－ＣＫａｎｄＣＫｗ－ｅｒｅＷｆｃｃｄｗｈｅａｌｅａｆｕＤＹｉｎｔｃｌａｎｄｈｅａｌｔｈｈｃａｔｅａｆｔｉｓｓｕｅｓ．ｒｓｃｃｔ＼ｃ．ｙｌｅｐｉｌｙ２．７血清学方法的田间应用利用以抗ＷＤＶ２３Ｆ４－ＥＵＡ－单抗为梭心建立的ＡＣＰＳ、ｄｏｔＥＬＩＳＡ以及ＰＣＲ方法对采自陕西省韩域市和青海省西宁市的田间样品进行检测。共采策疑似病株 第：．Ｖ小麦矮缩病５每叩克降抗体的制备及其应丨Ｈ°－－１２８味丨．７ＥＵＳＡＡＣＰＥＬ丨ＳＡ，经检测有７９株含有ＷＤＶ，发病率６／０。其中ｄｏｔ、和ＰＣＲ方法的代表性检测结果如图２．１０Ａ、Ｂ、Ｃ所示。２种血清学方法与ＰＣＲ：全符合Ｐ俭测，将ＣＲ产物ｔ今测序并进行序列比对结吴畏明Ｈ，－ＥＬ－样品确实感染ＷＤＶ１ＳＡ和ｄｏＥＬＩＳＡ，证明以ＷＤＶ单抗为核心建立的ＡＣＰｔ方法能准确、有效地用于田间样品的检测。１２３４５Ａ＿鲁＃Ｂ眷＃？°？？？Ｄ＃鬱鲁ＣＫ＋ＣＫ－？？ＡＩＩ１ｌｌ．ｌｉＵａ＾ｍｓｍｍ＆＠ｓ＿酋〇Ａ－１ＡＡＡ４Ａ１４？４４ｌ：３５ＢＢ：Ｂ３ＢＢＣｌＣ２Ｃ３ＣＣ５Ｄ１Ｄ：Ｄ３ＤＤ５ＥＥ：ＣＫＣＫＰｌａｎｔｓａｍｐｌｅｓＢＣｌＣ２Ｃ３Ｃ４Ｃ５Ｄ１Ｄ２Ｄ３ＣＫ－ＭＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ａ５Ｂ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５Ｄ４Ｄ５ＥｌＥ２ＣＫ＋：Ｈ：。齡輕參§窥囊凝賴德邊德縫濟遽滴－－图２．】０ＤｏｔＥＬｌＳＡＡＡＣＰＥＬＩＳＡＢ、和ＰＣＲ方法Ｃ检测田间样品的代表性结果（＞（）（）＇、ＣＫ＋ＢＰ－照织。，阳性对照，感染ＷＤＶ的：麦病叶；ＣＫ，阴性对，即健衆小麦沮ｉ－－ｉｌｆｌｄｌｂＥＬＳＡＡＣＰＥＬ１ＳＦｉ２．１０Ｒｅｒｅｓｅｎｔａｔｖｅｄｅｔｅｃｔｏｎｒｅｓｕｔｓｏｆｉｅｓｃｉｍｃｓｄｏｔｌ（Ａ．Ａ（Ｂｇｐｐｙ））ａｎｄＰＣＲＣ（）＋ａｎｄ－－ＣＫＣＫｗｅｒｅＷＤＶｉｎｆｃｃｃｄｎｄｈｅａｌｔｈｗｈｅａｔｌｅａｖｅｓｕｓｅｄａｓａｏｓｉｔｉｖｅａｎｄｎｅａｔｉｖｅｔａｙｐｇｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．５６ 浙江大学硕士学位论文３讨论小麦作为我国第二大粮食作物，其产量直接关乎民生。小麦病毒病属于侵染性病害，在苗期和成株期均能侵染，目前已知的危害小麦的病毒病就有５０多种，造成巨大的经济损失一的小麦矮缩病毒近年来危害严重。作为麦类主要病毒病之，造成麦类严重减产。目前常根据症状观察判断田间小麦矮缩病的发生情况，但是由于多种病毒病造成的症状极为相似，而且田间植物常受多种病毒复合侵染，因此仅依靠症状观察得到的结果缺乏准确度。电镜观察病毒粒子需要昂贵的仪器，且病毒粒子大小和形态有相似性一，往往只作为种辅助检测手段。基于ＰＣＲ的分子检测方法虽然灵敏，血、、，但仅适用于实验室内应用。相对而言清学方法简单易操作快速灵敏、成本低，且能够应用于田间样品的大规模检测，是目前较为理想的植物病毒检测手段。目前血清学技术检测ＷＤＶ多数是通过制备抗ＷＤＶ多抗建立的。王亚娇等以ＷＤＶＣＰ重组蛋白为免疫原，通过免疫新西兰大白兔制备了针对ＷＤＶＣＰ的一０００ｔｌｔＷＤＶ多克隆抗体：５ｅｓｅｒｎｂｏ，以１稀释的该多抗作为抗进行Ｗ分析时仍与ＣＰ重组蛋白、感病小麦和带毒异沙叶蝉组织有特应性免疫反应（王亚娇等，２０１３）。利用该抗体和免疫荧光技术，Ｗａｎｇ等发现ＷＤＶ主要分布在异沙叶蝉的前中肠和中中肠部位，良好的免疫荧光信号为探究ＷＤＶ在异沙叶蝉体内的循环途径和－ａｎｅｔａ．储存位置提供了方便（Ｗｌ２０１４。３２ａｇ，）本论文将ＷＤＶＣＰ与表迗载体ｐＥＴ连接，构建成重组表达载体并转化表达菌株，将诱导纯化后得到的融合蛋白作为免疫原，通过杂交瘤技术获得４株（１８Ｇ１０、９Ｇ４、２３Ｆ４和２２Ａ１０）能够稳定分泌抗ＷＤＶ单克隆抗体的细胞株，并分别制备腹水单抗。利用单抗为核心建立了检－ＥＬｄｏ－－测小麦样品中ＷＤＶ的ＡＣＰＩＳＡ和ｔＥＬＩＳＡ方法，其中ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法检ｖ丨：丨６３８４０倍稀释（ｗ／／ｍＬ，测小麦病叶的灵敏度最高可迗到，ｇ）而且只与感染ＷＤＶ的小麦植物组织呈很强的特异性免疫阳性反应，而与麦类其他常见病毒和健康小麦组织均呈阴性反应ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ方法检；测小麦病叶的灵敏度最高可达到１５１２０／／染ＷＤＶ的小麦植物组织呈很强的特：倍稀释（ｗｖｍＬ，同样也只与感，ｇ）５７ 第二章小麦矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用异性阳性反应，与麦类其他常见病毒和健康小麦組织均呈阴性反应，说明建立的－ＥＬ－检测ＷＤＶ的ＡＣＰＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法均具有很好的特异性和灵敏度，可以为该病毒的准确判断和检测提供技术支持。田间调查结果表明，２种血清学方法的检测结果与ＰＣＲ方法完全一致分ＰＣＲ产物进行核酸测序和序列比，并将部一对，结果显示阳性样品确实感染ＷＤＶ，进步说明以单抗为核心建立的２种血清学方法可以用于田间样品的大规模检测，从而为小麦矮缩病的诊断、预测预报、抗病育种和科学防控提供技术支持和物质支撑。５８ 浙江大学硕士学位论文第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用小麦黄矮病是由大麦黄矮病毒（ＢＹＤＶｓ）引起的小麦病毒病害，最早在美国加利福尼亚州的大麦上发现，随后在各国陆续发生，是目前世界上分布最广泛的一植物病毒之。１９６０年ＢＹＤＶｓ首次出现在我国西北地区，随后迅速蔓延，在２０６０－８０年代大规模爆发流行数次世纪，给我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁。Ｒｏｃｈｏｗ和Ｍｕｌｌｅｒ将美国的ＢＹＤＶｓ分为ＭＡＶ、ＰＡＶ、ＲＰＶ、ＲＭＶ和ＳＧＶ共５个株系（Ｒｏｃｈｏｗ，１９６９；ＲｏｃｈｏｗａｎｄＭｕｌｌｅｒ，１９７１）。在中国周广和等鉴定出了４个ＢＹＤＶｓ、、株系，即ＰＡＶＲＭＶＧＰＶ和ＧＡＶ用广和等１９８７，其中ＰＡＶ株（，）系是部分省份的流行株系。由于目前我国常用的分子生物学方法仅局限于实验室一使用，因此急需建立种灵敏、快速的血清学检测技术。为此，本研究利用ＢＹＤＶＰＡＶ株系的病毒粗提液作为免疫原，通过杂交瘤技术制备了抗ＢＹＤＶＰＡＶ的单ＣＰ－ＥＬ－克隆抗体ＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ检，并以单抗为核心建立了Ａ测方法，并有效应用于田间样品检测，从而为我国小麦黄矮病的检测、诊断及科学防控提供有力的物质支撑和技术支持。１材料与方法１．１病毒材料感染大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系的小麦病叶由中国农科院王锡锋和刘艳老师提ＲＴ－ＰＣＲ－８０供Ｘ：，经过方法和核酸测序鉴定后保存于冰箱中。同时感染大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系、大麦黄矮病毒ＧＡＶ株系、中国小麦花叶病毒、大麦黄花叶病毒的病叶也由中国农科院王锡锋和刘艳老师提供，感染小麦黄花叶病毒的病叶采自山东济宁，感染小麦矮缩病毒的病叶采自陕西韩城市和青海西宁市，健康小麦组织由本实验室鉴定保存。１．２培养基、抗体及实验材料参照第二章１．２的培养基、抗体及实验材料的内容。５９ 第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用１．３免疫原的制备由于ＢＹＤＶＰＡＶ病毒粒子提纯难度较大，因此将病毒粗提液直接作为免疫：取２感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶用液氮研磨后用０原．７５％生理，方法如下ｇ，盐水匀浆８０００ｒｍ离心５ｍｉｎ后取上清作为免疫原。，ｐ１．４单克隆抗体的制备将病毒粗提液作为免疫原，免疫６周龄的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠５只，每只２００ｍＬ。参照本论文第二章１．５的方法进行细胞融合、杂交瘤细胞的克隆、抗体的制备和纯化、腹水效价和类型鉴定。１．５Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析单抗的特性二参照第章１．４．４的方法通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＢＹＤＶＰＡＶ单克隆抗体的特异性。１．６血潸学方法的建立及特性分析－１．６．１ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异性和灵敏度分析二参照本论文第章材料与方法中１．６．１的方法建立检测小麦样品中ＢＹＤＶＰＡＶ的ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法法和单抗的特异性和灵敏度。，并分析该方在进行特异性分析时，用感染ＷＹＭＶＡＶ、ＷＤＶ、ＢＹＤＶＧ株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢａＹＭＶ和ＣＷＭＶ的小麦样品粗提液作为检测抗原，以感染ＢＹＤＶＰＡＶ株系的小麦样品作为阳性对照，以健康小麦作为阴性对照，所有样品均用包被液（Ｏ．０５Ｍ碳酸盐缓冲液）按１：２０倍稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ，离心后得到上清即）为病毒粗提ＳＡ－液，用粗提液包被ＥＬＩ板，分析ＢＹＤＶＰＡＶ单抗及建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法的特异性。在进行灵敏度分析时，将感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶和健康小麦组织用液氮充分研磨：１６０倍：６５５３６０／ｍＬ，匀浆液离心后分别用包被液从１至１倍（ｗ／ｖ，ｇ）６０ 浙江大学硕士学位论文进行倍比稀释－，依次包被ＥＬＩＳＡ板，分析ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和单抗的灵敏度。１－．６．２ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异拴和灵敏度分析二１参照本论文第章材料与方法中．６．２的方法建立检测小麦样品中ＢＹＤＶＰＡＶ的ｄｏ－－ｔＥＬＩＳＡ方法，并分析单抗和建立的ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的特异性和灵敏度。在进行特异性分析时，用感染ＷＹＭＶ、ＷＤＶ、ＢＹＤＶＧＡＶ株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢａＹＭＶ和ＣＷＭＶ的植物样品粗提液作为检测抗原，以感染ＢＹＤＶＰＡＶ株系的小麦植物组织作为阳性对照，，以健康小麦植物组织作为阴性对照所有样品均用ＰＢＳ缓冲液按１：２０比例稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ），取２．５卟粗提液点到ＮＣ膜上，ＢＹＤＶＰＡＶｄｏ－ＥＬＩＳＡ分析单抗和ｔ方法的特异性。ＢＹＤＶＰＡＶ的小２０在进行灵敏度分析时：倍至，将感染麦病叶粗提液从１／１：１０２４０倍倍比稀释（ｗｖ，ｇ／ｍＬ），以对应稀释度的健康小麦植物组织粗提液为阴２Ｃｄｏ－Ｓ性对照，每个稀释梯度分别取．５ｉＬ点到Ｎ膜上ｔＥＬＩＡ方法和制备ｆ，分析单抗的检测灵敏度。１７ＲＴ－ＰＣＲＢＹＤＶＰＡＶ．方法检测１．７．１ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡ的方法１）器材的处理：将研钵、研棒、离心管等都１２１Ｘ：高压灭菌４０ｍｉｎ验过程中，实要避免讲话并注意要经常更换手套；２）称取Ｏ．ｌｇＢＹＤＶＰＡＶ病叶，用液氮研磨成粉状后迅速转入灭菌的离心管中，加入ｌｍＬ的ＴＲＩｚｏｌ试剂，盖紧离心管盖后剧烈摇动混勻，然后室温静置５ｍｉｎ；３Ｌ－２０〇１５２３ｍｉ加入氯仿，盖紧盖子ｓｅｃ，室温ｎ）ｎ，剧烈摇荡静置；４４Ｘ一：１２０００ｒｍ离心１５ｍｉｎ取上清液于新的离心管中，加入与上清等体积）ｐ，Ｏｍｉｎ的异丙醇，盖上离心管盖子，颠倒混匀后于室温静置ｌ（若蛋白质含量过一一高，可将上步骤重复次）；５）４Ｘ：１２０００ｒｐｍ离心ｌＯｍｉｎ，弃上清液；６１ 第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用加入°６ｌｍＬＤＥＰＣ水配制的７５％的乙醇后上下颠倒数次，轻洗ＲＮＡ沉淀４Ｃ），７ｍ一５００ｒｐ离心５ｒａｉｎ弃上清液（若盐含量过高可重复此步骤次）；，７５－）将离心管中的ＲＮＡ沉淀室温干燥１０ｍｉｎ，用３〇ＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ沉淀，ｎ°－８０Ｃ冰箱中保存备用。－１．７．２ＲＴＦＣＲ反应根据ＧｅｎＢａｎｋ中已报道的ＢＹＤＶＰＡＶ基因组的保守序列设计引物：ＢＹＤＶ’’ＰＡＶ－Ｆ－ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＡＧＧＣＣＧＴＡＧＧ－－：５３对应Ｃ尸基因１２１位）和ＢＹＤＶ（’’－Ｒ－－－ＰＡＶ：５ＣＴＡＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＴＧ３对应基因５８３６０３位，扩增片（）段大小为６０３ｂｐ，引物由杭州擎科生物技术有限公司合成。ＲＴ－ＰＣＲ反应ａ：）１０－．５ｍＬＲＮＡｆｒｅｅａｋａｒａＲＴａｎｒｉｔ）取的的离心管根据Ｔ公ｅｖｅｒｓｅｒｓｃａｅｓ，司的ｐＡＭＶ进行ＲＴ－ＰＣＲ反应（）说明书，反应体系总量为２０卟。反应体系如下：５ｘＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＢｕｆｅｒ４ＬｐｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅｌＯｍＭ２ｉＬ（）［ＲＮａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒｌｘＬ｜ＢＹＤＶ－ＰＡＶＲＰｒｉｍｅｒｌｉＬ［ＤＥＰＣＨ２０ＩＯｊｉＬＡＭＶＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｔａｓｅｌｉＬｐ＾模板ｌｐＬ２）混合均勻后，室温放置ｌＯｍｉｎ；°３４２Ｃ恒温反应ｌｈ）；４）冰上冷却２ｍｉｎ，所得到的产物可用于常规ＰＣＲ反应。ｂ）常规ＰＣＲ反应一１）取０．５ｍＬＰＣＲ薄壁管，ＰＣＲ反应体系如下：ｘ２Ｐ〇ｗｅｒＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ２５｜ｉＬＢＹＤＶＰＡＶ－ＲＰｒｉｍｅｒｌＬｉ＾－ＢＹＤＶＰＡＶＦＰｒｉｍｅｒｌｉＬ＾去离子水２１ｐＬ６２ 浙江大学硕士学位论文ＤＮＡ模板２ｐＬ反应总体积５０叫２ＰＣＲ反应程序如下：）°９４Ｃ预变性２ｍｉｎ°９４０—Ｃ３ｓｅｃ°５５Ｃ４５ｓｅｃ＾３２个循环．７２Ｃ４５ｓｅｃ－°°７２Ｃ继续延伸ｌＯｍｉｎ，１６Ｃ５ｍｉｎ后结束。３）反应完毕后，从ＰＣＲ产物中取１０ｐＬ用１％琼脂糖凝胶电泳检测，回收ＤＮＡ片段后构建到Ｔ载体上，并送杭州擎科生物技术有哏公司测序鉴定。１．８血清学方法的田间应用ＤＶＰＡＶＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ用以ＢＹ单抗为核心建立的两种血清学方法（、ｄｏ－品进－ｔＥＬＩＳＡ对采自中国青海和陕西省的１３５株小麦样行检测，并用ＲＴＰＣＲ）方法和核酸测序验证。２结果与分析２．１细胞的融合、杂交痏的筛选和克隆用病毒粗提液作为免疫原免疫６周龄左右的ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，四次免疫后取出小鼠的脾细胞与鼠骨髄瘤细胞（ＳＰ２／０）进行融合，经ＨＡＴ培养基筛选培养１０ｄ，２６块９６孔细胞板的融合率为９６％。当杂交瘤细胞生长至覆盖孔底１／４时，用间接ＥＬＩＳＡ方法检测细胞上清中的抗体。检测结果发现，共有３５２个孔呈阳性反４．３应，阳性率为１１％。经过特异性和灵敏度检测后，并进行次细胞有限稀释法６５Ａ１２、１９Ｇ７２５Ｃ２６Ｃ４２４Ｇ４８Ｃ２克隆，最终获得株（１、、、和１）能够稳定分泌抗ＢＹＤＶＰＡＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。６３ 第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用２．２胰水抗体制备、效价测定及抗体亚类鉴定８周龄的ＢＡＬＢ０３ｍＬ７－１０ｄ到选取／ｃ小鼠腹腔内注射降植烷．，后向小鼠的７－腹腔内注射ＢＹＤＶＰＡＶ杂交瘤细胞，约１０ｄ后小鼠腹部明显膨大，用采血针采集腹水６８－１５ｍＬＧ，株杂交瘤细胞分别获得单抗腹水。将腹水纯化后测其Ｉｇ５－／含量为．６７１０．１３ｍｇｍＬ表３．１。抗体类型及亚类鉴定结果表明，６个单抗的类（）＇７型均为ＩＧＫ轻链３．１。ＩＳＡ６ＯＨＴｇｉ、（表）间接ＥＬ方法测得株单抗腹水效价均在ｌ之间表３．１。（）表３．１大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的特性Ｔａｂｌｅ３．１ＰｒｏｅｒｉｅｓｏｆＭＡｂｓａａｉｎｓｔＢＹＤＶＰｐｔｇＡＶ类型及亚类ＭｒｉｇＧ含量ＭＡｂｓＩｓｏｔｙｐｅｓＡｓｃｉｔｅｓｔｉｔｅｒＩｇＧｙｉｅｌｄ（ｍｇ／ｍＬ）＇６１８Ｃ２Ｉｋ１０５．６７ｇＧｉ６１９Ｇ７ＩＧｋ１（Ｔ６．４５ｇｉＧ＇７１５Ａ１２Ｉｇｉｋ１０９．２６＇７６Ｃ４ＩＫ１０１０．１３ｇＧｉ＇７２４Ｇ４ＩＧＫ１０９．６５ｇｉ＂７２５Ｃ２Ｉｋ１０９．５８ｇＧｉ２．３Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法分析ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性，结果表明２５Ｃ２、６Ｃ４、，２４Ｇ４和１８Ｃ２单抗均能与感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶粗提液中大小约３９ｋＤａ的３蛋白发生特异性免疫反应．１。，而与健康小麦植物組织没有反应（图）根据分子量大小推测抗体针对的抗原决定簇可能是ＯＲＦ１编码的蛋白。１５Ａ１２和１９Ｇ７单抗与感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶粗提液以及健康小麦组织都不发生反应，结合５Ａ－－下面的以１１２和１９Ｇ７单抗为核心建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的特异性结果，分析认为１５Ａ１２和１９Ｇ７单抗针对ＢＹＤＶＰＡＶ构象型抗原决定簇。６４ 浙：欠学硕丨：学位论义；ＩＫＤａＭ１２１２１２１２１２１２１３０１００７０－與５５４０３５２５１５ｖ２４Ｇ４６Ｃ４１８Ｃ２２５Ｃ２１５Ａ１２１９Ｇ７ＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性图３．１Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析Ｂ＇２ＢＹＤＶＰＡＶ的等分子量标准蛋白１，，卜麦植物组织。Ｍ：健康＋羑植物组炽；感染，中－ｂＷｅｎｂｌｏＦｉ３ＳｉｆｉａｎａｌｓｅｓｏｆａｎｔｉＢＶＤＶＰＡＶＭＡｂｓｓｔｅｒｔｇ．１ｐｅｃｉｃｔｙｙｙｗｈｅａｌｉ．Ｌ．ＢＹＤＶＬａｎｒｏｌｈｒｒ．Ｌａｎｅ１ｈｅａｌｔｈｔａｎｔｔｓｓｕｅｓａｎｅ２ｅＭｔｅｉｎｍｏｌｅｃｕａｒｗｅｉｔｍａｋｅ．，ｐｇｙｐ－ＰＡＶｉｎｆｅｃｔｃｄｗｈｅａｔｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ．ｐＰ－ＥＬＩＳＡ２．４ＡＣ方法的建立２－ＥＬＩＳＡ方法的建立．４．ＢＹＤＶＰＡＶ的ＡＣＰ１检测植物中＇ＣＰ－ＥＬ通过方阵实验确定ＡＩＳＡ方法杭体的最适工作浓度，结果发现６Ｃ４单５Ａ１２１９７２、２４Ｇ４８Ｃ２抗的最适工作浓度为１：６０００倍稀释，１、Ｇ、５Ｃ２和１单坑Ｃ：ｉ１：８０００乂１５０００ＩＪ抗均以：倍稀释为宜。ＡＰ标记的羊抗鼠ｇ倍稀释为最适工’ＡＣＰ－ＥＬ７ＰＡＶ的ＩＳＡ作浓度；法，。根据以丄抗体的最适工作浓度瑋立检测ＢＹＤＶ＇－ＥＬ并分析ＡＣＰ１ＳＡ方法和制备单杭的４４异彳丨．和更敏专。２４２－ＥＬＰＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＡＶ单抗的特异性分析．．ＡＣＴＡＣＰ－ＥＬ６ＰＡＶ１ＳＡ方法的特异性分析结果表明，利用个ＢＹＤＶ单克隆抗体Ｃ－ＥＬ建立的ＡＰＩＳＡ方法检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦植物组织呈很强的特异性阳性反应，而测感染ＷＹＭＶ、ＷＤＶ、ＢＹＤＶＧＡＶ株系、ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢａＹＭＶＤ；３．２和ＣＷＭＶ的小麦和健康小麦组织时呈阴性反应，且０直差异校显著（图），、Ｐ－ＥＬ说明这６ＢＹＤＶＰＡＶ单抗及以其为核心建立的ＡＣ１ＳＡ方法具有很好的特１异性。６５ ？＊．：第：？大安涛矮病命ＰＡＶ株瘈申克隆抗体的制备及Ｋ应用＇ｗ□＼－ＢＹＤＰＡＶｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａｔ－ｗｅａＨＷＤＶｉｎｆｅｅｔｅｄｈｔ２５．ｗｅｔｍＢＹＤＶＧＡＶｉｎｆｅｃｔｅｄｈａｐ，－ｗ１ｍＢ＼Ｔ）ＶＧＰＶｉｎｆｅｃｔｅｄｈｅａｔｒｍＱＢ－ｉｆｗｈｔｔＴＩＩａＹＭＶｎｅｃｅｄｅａ２Ｈ－ＷＹＭＹｉｎｆｅｃｔｅｄｗｈｅａｔｔａ＼－ｗｈ＠ＣＶＭＶｉｎｆｅｃｔｅｄｅａｔｂＩＩＩＱＨｌｔｈｗｈｔｅａｙｅａｐ？１５ＩＩＩＩＩ＂Ｊ５Ｏ１０．５ｉＩＩ丨Ｉ０２４Ｇ４１８Ｃ２１５Ａ１２１９Ｇ７６Ｃ４２５Ｃ２ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’－图３．２ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性分析Ｆ３－－．２ＳｅｃｉｆｉｃｉｔａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｅｖｅｌｏｅｄＡＣＰＥＬＩＳＡａｎｄａｎｔｉＢＹＤＶＰＡＶＭＡｂｓｉｇｐｙｙｄｐ’’２－ＡＶ．４．３ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰ单抗的灵敏度分析ＡＣＰ－ＥＬ４心建立的ＩＳＡ方法的灵敏度分析结果表明，以６Ｃ单抗为核ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ方法的灵敏度最高检测ＢＹＤＶＰＡＶ病叶的灵敏度可以迗到，１：１６３８４０倍稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ），以丨９Ｇ７、２５Ｃ２、２４Ｇ４和丨５Ａ２单抗为核心建立Ｐ－ｔｉＬ的ＡＣＩＳＡ方法的灵敏度达到１８１９２０１８Ｃ２：倍稀释，以单抗为核心建立的Ｐ－ＥＬＡＣＩＳＡ方法的灵敏丨：４０９６ｗｖ／ｍＬ３．３Ａ、度略低，但也运到０倍稀释／，图（ｇ）（Ｂ）。６６ 浙ｎ：大学硕ｉ：学位论之－？－１９Ｇ７￣Ｌ２５Ｘ－＊－１８Ｃ２—２４Ｇ４Ｉ卜？＿＾ＸＸ—＾Ｘ．务※Ｘ０，、ｓＰＪ彳夕夕＿／沪／夕Ｌｅａｆｄｉｌｕｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ３．５ｒ－？－ｌｂＡ１２３卜－？－６Ｃ４一５０ｉ卜Ｌ＾Ｊ：ＢｎｗＫＫＭＫＭＫｗｗＫＫＫ■￣￣ｊｉｉｉｉｉ￣ｉｏｉｉ丨ｉｉ＿＂％（，／ｓ／／，ｖｖｙ，ｙ、Ｌｅａｆｄｉｌｕｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｒａｔｉｏｎｔ３－图．３ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的灵敏度Ｖ析ＣＫ－，鍵康的小麦植物组织。－－Ｉｉ３．３ＳｃｎｓｉｔｖｔａｎａｓｉｓｏｔｄｅｖｅｌｏｅｄｇｉｉｙｌｙｆｈｅｐＡＣＰＨＬＩＳＡａｎｄａｎｌＢＹＤＶＰＡＶＭＡｓｉｂ＇Ｋ－ｌｈｗｈｅａＣ．ｈｅａｔｔｌａｎｔｔｉｓｓｕｅ．ｙｐｓ－２．５ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的建立及其特异性和灵敏度分析＇２－．５．１检测植物中Ｂ＼ＤＶＰＡＶ的ｄｏｔＥＵＳＡ方法的建立用方阵试验确定ｄｏ－ＥＬＳＡｔＩ方法中抗体的最适工作浓度，结果表明在检测植物样品时，丨５Ａ１２、２５Ｃ２、２４Ｇ４、１８Ｃ２和１９Ｇ７单抗的最适工作浓度都为１５０：００倍稀释，６Ｃ４单杭的最适工作浓度为１：６０００倍稀释，而ＡＰ标记的羊抗鼠ＩＧｇ二－抗均以丨：８０００倍稀释为佳丨０２０ｍｉ，显色ｎ后拍照记录结果。６７ ＞第章＊麦黄矮病毒丨ＡＶ株系申ｔ隆抗体的制备及其应ｆｌ工作浓度建立检测小麦组织中ＢＹＤＶＰＡＶ的ｄｏ－ＥＬＳ根据抗体的最适ｔｌＡ方法，并用于分析ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的特异性和灵敏度。２５２ｄ？ｔ－ＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡＶ．．单抗的特异性分析ｄｏ－利用以单抗为核心建立的ｔＥＬｌＳＡ方法对ＢＹＤＶＰＡＶ单抗及建立的ｄ－ＥＬ－ｏＩＡ方法的特ｏｔＥＬｌＳＡ方法ｔＳ异性进行分析，结果发现，建立的ｄ检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶时呈紫色的强阳性反应，而检测感染ＢＹＤＶＧＰＶ株系、ＢＹＤＶＧＡＶ株系、ＷＤＶ、ＷＹＭＶ、ＣＷＭＶ和ＢａＹＭＶ的小麦以及健康小麦组图－织时呈阴性反应３．４这６个单抗和以其为核心建立的ｄｏｔＥＬＩＳＡ，表明（）方法具有很好的特异性。１２３４５６７８Ｉ５Ａ２Ｉ？％２５Ｃ２６Ｃ４２４０４＊＇１８Ｃ２１Ｉ９Ｇ７Ｗ／ｍｍ３－Ｖ单杭的特异性分析图．４建立的ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶＰＡ１，感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶；２，感染ＷＹＭＶ的小麦病叶组织；３，噚染ＣＷＭＶ小的４ＢＹＤＶＧＡＶ的小麦病叶组织５染ＢＹＤＶＧＰＶ的小麦病叶组织麦病叶组织；，感染；，感：６，感染ＷＤＶ的小麦病叶组织；７，感染ＢａＹＭＶ的小麦病叶组织；８，徤康小麦组织；上下两个点为同一样品的重复。３４Ｓ－－ＦｉｌｈｌＥＬＩＳＡａｎｄａｎｔｉＢＹＤＶＰＡＶＭＡｂｓｉｇ．ｅｃｉｆｉｃｔａｎａｓｉｓｏｆｔｅｄｅｖｅｏｅｄｄｏｔｐｙｙｐ－－－－Ｇ－－－ＬａｎｃｓＷＹＭＶＡＶ．Ｇ．Ｖ１７ｗｅｒｅＢＹＤＶＰＡＶＣＷＭＶＢＹＤＶＢＹＤＶＰＶＷＤ，，，，－ｈｗｈｅａｌｈｌｉｓｓｅ．ＢａＹＭＶｎｆｃｃｔｃｄｔｌｅａｖｅｓｔｉｓｓｕｅｓｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｌａｎｅ８ｗａｓａｅａｔｗｈｅａｔａｎｔｔｕｉ，ｐｙｙｐＵｏｆｌａｎｄｄｏｗｎｄｏｈｅｓａｍｅｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｒｅｓｅｎｔｅｄｒｅｅａｔｓｏｆｔｈｅｓａｍｅｓａｍｅ．ｐｔｓｔｐｐｐ６８ ＇浙；「．尺学码！２ｔ－ＰＡＶ．５ＪｄｏＥＬＩＳＡ方法和ＢＹＤＶ单抗的灵敏度分析？＂ＢＹＤＶＰＡＶ的病叶Ｉ羿拓将感染：麦植％ａ织泠别从１：２０倍汚行培土、／２－稀释至１：丨０２４０倍ｖｒｎＬ彳．５ｌｉＬ，彳ｄｏｔＥＬＩＳＡ（ｗ／．ｇ），每稀释度各点样分斤建立的｜－方法的灵敏度。结果表明ｔＥＵＳＡ方法的灵敏度，以６Ｃ４单抗为核心建立的ｄｏ最高，检测ＢＹＤＶＰＡＶ病叶的灵敏度可迗１：２５６０倍稀释（ｗ／ｖ，ｇ／ｍＬ），以２５Ｃ２、’－１５Ａ１２２４Ｇ４１９Ｇ７心分ｄｏｔＥＬＩＳＡ方法的灵敏、和单抗为核另立的：建度也达ｗＬ２－ＥＬＳＡ方１：１２８０愔稀释／ｖ，／ｍ），而以１８Ｃ单抗为核心建立的ｄｏｔＩ洼的灵（ｇ丨：６ｗｖｍＬ。敏度較低，但仍可达到４０倍稀释（／／３．５，ｇ＞（图）１０１：４０１：８０１：１６０１：３２０１：６４０１：１２８０１：２５６０１：５１２０１：１０２４０：２ＣＫ＋？？？〇罾雩？Ｕ—６Ｃ４ＣＫ－ＣＫ＋？？？２ＳＣ２ｃｋ－ＣＫ＋…—？卞‘、ｔＣＫ＋？？＃Ｃ１５Ａ１２ＣＫ－？？＊１９Ｃ７ＣＫ－｜ＣＫ＋鲁參籲？？Ｃ１８Ｃ２ＣＫ－＇－３、ｏｌ图ｌＳＡＰＡ．５建的ｄＥＬ方法和ＢＹＤＶＶ单抗的灵敏度冷析ＣＫ＋染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦病叶组织ＣＫ￣植物组织。，感；，徤康小麦７－－Ｆｉｉｇ３．５Ｓｃｎｓ（ｉ＼ｉｔｙａｎａｌｓｉｓｏｆｔｈｅｄｅｖｅｌｏｅｄｃｉｏｔＥＬｌＳＡａｎｄａｎｉｉＢＶＤＶＰＡＶＭＡｂｓｙｐ＋ａｎＫ－ｗｅｒｅＢＹＤＶＰＡＶ－ｎｆｃｃＣＫｄＣｔｃｄａｎａｔｗｈｅａｔａｎｔｔｉｓｓｕｅｓｒｅｃｔｖｅ．ｉｄｈｅｌｈｙｌ，ｅｓｉｌｐｐｙ２．６血清学方法的田间应用ＡＣＰ－ＥＬ－利用以６Ｃ４单抗为棱心建立的ＩＳＡ和ｄｏｔＥＬ丨ＳＡ方法对采自陝西和（＾） 第：莩大ｉ；黄矮病梅丨ｗ株系申克隆抗体的制备及。共采集疑似病株１３５８８ＢＹＤＶ青海省的田间样品进行检测株，经检测有株含有５２－ＥＬ－ＰＡＶ，发病率６．％。部分代表性的ｄｏｔＩＳＡ和ＡＣＰＥＬ１ＳＡ检测结果如图３．６听示。－２３．６Ａ．Ｂ与ＲＴＰＣＲ万种血清学方法（图）：云（图３．６Ｃ检测结果完全符合），ＰＣＲ产结果表明阳性样品确实感染ＢＹＤＶＰＡＶ将物进ｉ于梭酸测序和序列比对，，证明以ＢＹＤＶＰＡＶ单杭为核心建立的ＡＣＰ－ＥＬ－１ＳＡ和ｄｏＥＬＩＳＡ方法ｔ能有效用于田间样品的中ＢＹＤＶＰＡＶ的检测。１２３４５？鲁？〇？？？０°馨＃ＣＫ＞ＣＫ－息ｅ？？籲ａ２．５ｒｏ＾＾ｅＢｆｉｌＪＬＩＵＬＩｓ〇｜ＩＨｄｌｉｄｇｉＬＩＵｉｌＵ｜Ｕ１Ｂ４？Ａ１Ａ２Ａ３Ａ４Ａ５Ｂ１：Ｂ３Ｂ４Ｂ５ＣｌＣ：Ｃ３Ｃ４Ｃ５Ｄ１Ｄ：Ｄ３ＤＤ５ＥｌＥ２ＣＫＣＫＰｌａｎｔｓａｍｌｅｓｐｇ７０ 浙江大学硕士学位论文＋－ＭＡ１Ａ２Ａ３Ａ４Ａ５Ｂ１Ｂ２Ｂ３Ｂ４Ｂ５ＣｌＣ２Ｃ３Ｃ４Ｃ５Ｄ１Ｄ２Ｄ３Ｄ４Ｄ５ＥｌＥ２ＣＫＣＫＳ〇〇ｂｐ３－－－图．６ＤｏｔＥＬＩＳＡ（Ａ、ＡＣＰＥＬＩＳＡ（ＢＲＴＰＣＲ）和方法（Ｃ）检测田间样品代表性的结果）ＣＫ＋为阳性对照ＢＹＤＶＰＡＶ－，即感染的小麦病叶；ＣＫ为阴性对照，即健康小麦植物组织。Ｆ－－ｉ３．６ＲｅｒｅｓｅｎａｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｆｉｅｌｄｓａｍｌｅｓｂｄｏｔＥＬＩＳＡＡ）ＡＣＰＥＬＩＳＡＢ）ｇｐｔｔｐｙ（，（ａｎｄＲＴ－ＰＣＲＣ（）ＣＫ＋ａｓａＢＹＤＶＰ－－ｗＡＶｉｎｆｅｃｔｅｄｗｈｅａｔｌｅａｆｕｓｅｄａｓａｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌａｎｄＣＫｗａｓａｈｅａｌｈｔｐｙｗｈｅａｔｌｅａｆｕｓｅｄａｓａｎｅａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ．ｇ３讨论一大麦黄矮病毒可以侵染多种谷类作物，小麦受侵染后般减产４０％，严重时“”“”可达７０％以上，因此ＢＹＤＶｓ又被称为小麦癌症黄色瘟疫。１９６０年首次、后在２０世纪６０－８０在中国发现，随年代大规模爆发流行数次，绐我国小麦生产和粮食安全带来了重大威胁，。目前，小麦黄矮病主要集中在黄河流域的各省市但随着全球变暖和农业生态条件的改变等原因，小麦黄矮病有逐年向南扩展的趋势。目前根据症状观察判断小麦黄矮病的发生情况仍然是最常用的方法，但相比真菌病害和细菌病害，病毒病的症状特点并不明显，常与其他病毒病害相混淆，导致误诊，且通过症状并不能判断病毒病原具体是哪个株系。分子生物学方法虽然灵敏度高，但往往受仪器的哏制，仅适于实验室内应用。相比较而言，血清学方法是目前较为理想且实用的植物病毒检测手段。早在１９７１年Ｒｏｃｈｏｗ和Ｍｕｌｌｅｒ就利用抗血清将纽约的大麦黄矮病毒分为５个株系ＲｏｃｈｏｗａｎｄＭｕ丨ｌｅｒ，１９７１），１９８４年Ｈｓｕ等研制出了针对ＢＹＤＶ的ＭＡＶ（和ＲＰＶ株系的单克隆抗体，可用于划分ＢＹＤＶｓ株系（ＨｓｕｅｔａＬ，１９８４）。１９９４年Ｍａｋｋｏｕｋ利用免疫组织印迹技术检测植物组织中的大麦黄矮病毒（Ｍａｋｋｏｕｋａｎｄ９９４Ｃｏｍｅａｕ１。，）国内周广和等利用美国康奈尔大学提供的抗血清鉴定出中国的４７１ 第三章大麦黄矮病毒ＰＡＶ株系单克隆抗体的制备及其应用种株系（周广和等，１９８７）。谢家建等通过体外原核表达ＢＹＤＶＧＡＶ株系的运动蛋白，并以此作为免疫原免疫小鼠获得抗血清（谢家建等２００７。，）李永丽等在大肠杆菌中表达ＢＹＤＶＧＰＶ株系ＯＲＦ４基因编码的１７ｋＤａ蛋白，并制备其特异性抗血清（李永丽，２００４。李娜等将ＢＹＤＶＧＡＶ株系的病毒粒子作为免疫原获得）了８株抗ＢＹＤＶＧＡＶ单克隆抗体，这８株腹水单抗的间接ＥＬＩＳＡ效价均迖到＂６１０以上（Ｌｉｅｔａｌ．，２０１５；李娜，２０１５）。目前尚未有针对ＢＹＤＶＰＡＶ株系的单抗及其血清学检测技术的报道。本论文利用ＢＹＤＶＰＡＶ病毒粗提液作为免疫原，通过细胞融合、筛选等技术得到６株（６Ｃ４、２４Ｇ４、２５Ｃ２、１５Ａ１２、１９Ｇ７和１８Ｃ２）能够稳定分泌抗ＢＹＤＶＰＡＶ单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并分别制备腹水单抗。利用单抗为核心建立了检测小ＢＹＤＶＰＡＶ的ＡＣＰ－ＥＬＩＳＡ和ｄ－麦植物中ｏｔＥＬＩＳＡ两种血清学方法。其中ＡＣＰ－ＥＬＳ６３８４０ＩＡ方法检测小麦病叶的灵敏度最高可达到１：１倍稀释（ｗ／ｖ，／ｍＬ）且其检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦植物组织时呈很强的阳性反应，而与其ｇ，他麦类常见病毒和健康小麦植物组织呈阴性反应，同时证明６个单抗都具有灵敏ｏ－度高、特异性好的特点；ｄｔＥＬＩＳＡ方法检测小麦病叶的灵敏度最高可达到１２５６０／／ｎＬ且其检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ的小麦植物组织时呈很强：倍稀释（ｗｖｔ，，ｇ）的特异性阳性反应。，而检测其他麦类常见病毒时呈阴性反应本论文得到的６Ｃ４、２５Ｃ２、２４Ｇ４和１５Ａ１２单抗在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析中杂到一９ｋ了条约３Ｄａ的明显条带，与报道的ＯＲＦ１编码的非结构蛋白分子量相同，猜测可能是由于病毒粗提液中含有此蛋白造成，但这只是根据蛋白分子量推测的结果一，具体针对哪个蛋白还有待于进步分析。ＲＴ－ＰＣＲ对采自陕西和青海用建立的血清学方法和省的１３５个田间小麦样品进行检测，结果发现其中８８个样品感染ＢＹＤＶＰＡＶ，ＰＣＲ产物测序和核酸序列比对证明，本研究建立的检测方法检测到的阳性样品中确实感染ＢＹＤＶＰＡＶ。７２ 浙江大学硕士学位论文全文总结本论文制备了多株分别抗ＷＤＶ和ＢＹＤＶＰＡＶ株系的单克隆抗体，并以单克隆抗体为核心分别建立了这两种病毒的高度特异和灵敏的血清学检测技术并可用于大规模田间检测，从而为这两种病毒病的检测、预测预警和科学防控提供技术支持。－－－（１）以纯化的ＷＤＶＣＰｐＥＴ３２ａ重组蛋白为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠通过，杂交瘤技术获得了４株特异性强、灵敏度高的杂交瘤细胞株，分别为１８Ｇ１０、９Ｇ４、２３Ｆ４２２Ａ－－和１０。以制备的单抗为核心建立了ＡＣＰＥＬＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ两种血清学方法，检测ＷＤＶ病叶的灵敏度分别可以达到１：１６３８４０和１：５１２０倍稀释（ｗ／ｖ，／ｍＬ，并，检测结果ＰＣＲｇ）用建立的血清学方法对田间小麦样品进行检测与检测结果完全符合，说明这两种血清学方法可以准确可靠地用于田间样品中ＷＤＶ的检测。（２）以ＢＹＤＶＰＡＶ病毒粗提液作为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术获得了６株能够分泌抗ＢＹＤＶＰＡＶ单抗的杂交瘤细胞株（６Ｃ４、２４Ｇ４、２５Ｃ２、１５Ａ１２１９Ｇ７和１８Ｃ２。以ＰＡＶ、）制备的单抗为核心建立了检测ＢＹＤＶ的ＡＣＰ－ＥＬ－－ＩＳＡ和ｄｏｔＥＬＩＳＡ两种血清学方法，其中建立的ＡＣＰＥＬＩＳＡ方法检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ小麦病叶的灵敏度最高可迗到１：１６３８４０倍稀释ｗ／ｖ，／ｍＬ，建（ｇ）立的ｄｏ－ｔＥＬＩＳＡ方法检测感染ＢＹＤＶＰＡＶ小麦病叶的灵敏度最高可达到１：２５６０／ｖ／倍稀释（ｗｍＬ，，ｇ）用建立的两种方法对采自陕西省和青海省的田间小麦样品一进行检测检测结果与ＲＴ－ＰＣＲ的检测结果，其完全致，说明这两种血清学方法可以快速准确地用于田间样品中ＢＹＤＶＰＡＶ的检测。７３ 浙江大学硕士学位论文参考文献１．ＡｉｓａｎＧ，ＮｅｍａｔＳＢ，ＮａｈｉｄＭ．ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐａｒｔｏｆＷａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｅｎｏｍｅａｎｄｈｌｏｅｎｅｔｉｃａｌｃｏｍａｒｉｓｏｎｏｆ５ｉｓｏｌａｔｅｓｗｉｔｈｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｇｐｙｇｐｗｏｌｆ－ｒｌｄＪｌｄＦ．ＪｏｕｒｎａｏＡｒｉｃｕｔｕｒｅａｎｏｏｄＴｅｃｈｎｏｌｏ２０１２２６：９３１０１．［］ｇｇｙ，，（）２．．ＢａｋａｒｄｉｅｖａＮｒａｓｔｅｖａＣＨａｂｅｋｕｓｓＡＲａｂｅｎｓｔｅｉｎＦＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｒｅａｌｊ，Ｋ，，ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｓｔｕｄｙｏｆａｐｈｉｄｐｏｕｌａｔｉｏｎｉｎＢｕｌａｒｉａＪ．ＢｕｌａｒｉａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｐｇ［］ｇＡｒｌｉ０２－ｉｃｕｌｔｕｒａＳｃｅｎｃｅ２００４１：１６１１６４．ｇ，，（）３．ＢａｎｋｓＰＭ，ＬａｒｋｉｎＰＪ，ＢａｎａｎａＨＳ，ＬａｇｕｄａｈＥＳ，ＡｐｐｅｌｓＲ，ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭ，ＢｒｅｔｔｅｌｌＲＩＳＣｈｅｎＸＸｕＨＪＸｉｎＺＹ．Ｔｈｅｕｓｅｏｆｃｅｌｌｃｕｆｌｔｕｒｅｏｒ，，，ｉｆｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓｒｅｓｓｕｂｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｏｎｓｏＢａｙｙｆｉｓｔａｎｃｅｆｒｏｍ－ＴｈｉｎｏｐｒｕｍｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍｔｏｗｈｅａｔＪ．Ｇｅｎｏｍｅ１９９５３８２：３９５４０５．ｙ，，）［］（４．ＢｅｈａｔｎｉａＳＡＡ，ＡｆｓｈａｒｉｆａｒＡＲ，ＴａｈａｎＶ，ＭｏｔｌａｈＭＨＡ，ＧａｎｄｏｍａｎｉＯＥ，ｊｇＮｉａｚｉＡ，ＩｚａｄｐａｎａｈＫ．ＷｉｄｅｓｐｒｅａｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｄｗｖｉｒｕｓｉｎＪＡｒｌ－ＷｈｅｔａｒＩｒａｎｉＰｌｔＰｔｈｌ２０１１４０［］，ｕｓｔａａｓａｎａｎａｏｏ１：１２１９．ｆ，，ｇｙ（）５ｄａｈｍａｎｅＩｄｅｎｉｆｔｉＣｈｉｔｉｆＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓｆ．ＢｅｎＭ．ｔｉｃａｏｎａｎｄａｒａｃｔｅｒｚａｏｎｏｆｒｏｍＦｒａｎｃｅｕｓｉｎａｒａｉｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓＤＮＡｒｅａｒａｔｉｏｎＪ．ｇｐｐｐ［］Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９５｝８５（１１）：１４４９．６ｋｏｖｉｃＡＨＶｉｄＧＮｌＤＶｉＯＢｆｏｄＩＳｉｌｈａｖＤＢｌ．ＢｅｎｓａｅｓｏｎｅｓｚｅｄｒｏｕｔｏｎＭＩ．，，，，，ｙ，ＰａｒｔｉａｌｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓｉｎｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｔｃｕｌｔｉｖａｒｓＪ．Ｐｌａｎｔｆ［］－Ｐａｔｈｏｌｏ２０１０５９６１１４４１１５．：１ｇｙ，，（）７ｉＧＧｒｉＲＶｋｅＪ．Ｉｌｔｉｃｈａｒｉｔｉｗａｒ．ＢｓｚｔｒａａｂｏａｎａｃｓｏａｏｎａｎｄａｃｔｅｒｓａｏｎｏｆＷｈｅａｔｄｙ，ｊｙ，ｆｖｉｒｕｓｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｆｉｒｓｔｔｉｍｅｉｎＨｕｎｇａｒｙ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄ－Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ１９８９９６５４４９４５４．：，，）（８ＢｏｒａｉｔｅｒＣｅｈｌｉｎＨＭ．Ｒｅａｓｏｎｓｆｏｒａｎｄｃｏｎｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆｈｉ．ｒｅｅｓＰｏｔｅｓｅｒｏｕｓｇ，ｇｑＢＹＤＶｉｎｆｅｓｔａｔｉｏｎｉｎｎｏｒｔｈｅｒｎＧｅｒｍａｎｙ１９８９．［Ｊ］．ＢｕｌｌｅｔｉｎＯｉｌｂＳｒｏｐ，１９９１，１４（４）：６０．９ＢｉａＪＰ１ＭＺＶａｎＲｅｅｎｍｏｒｔｅｌＭＨ．Ｓｅｒｏｌｏｉｃａｌｄｉｆｆｅｔｉａｔｉ．ｒｎｄＡｒｅｎｏｎｏｆ，，ｇｇｂｉｂｓｏｆｍｏｌｌｔｉｂｏｄｉｅＪ．ＪｏｌｏｆＶｉｌｉｌｔｏａｍｏｖｒｕｓｅｓｙｍｅａｎｎｏｃｏｎａａｎｓ［］ｕｒｎａｒｏｏｇｃａＭ－ｅｔｈｏｄｓ１９８３５５）２９３３００．：，，（１０．ＢｕｋｖａｙｏｖａＮＨｅｎｓｅｌｏｖａＭ，ＶａｃｉｋｏｖａＶＫｏｒｍａｎｏｖａＴ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｄｗａｒｆ，ｊ，ｖｉｒｕｓｏｆｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｔａｎｄｂａｒｌｅｙｉｎｓｅｖｅｒａｌｒｅｇｉｏｎｓｏｆＳｌｏｖａｋｉａｄｕｒｉｎｇｔｈｅｗ－ｒｏｉｎｓｅａｓｏｎｓ２００１２００４Ｊ．ＰｌａｎｔＳｏｉｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ２００６５２９３９２，，：．ｇｇ［］（）－１１ＣＴｏｆａｌｖｉＳＡＬａｎｎｅａｕＭＤｕｎｅｚＪＨａｄｉｄｉＡ．ＡＰＣＲＥＬＩＳＡ．ａｎｄｒｅｓｓｅＫ，，，，ｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｔｈｅｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｕｎｕｓｎｅｃｒｏｔｉｃｐｐｒｉｎｓｏｔＰＮＲＳＶａｎｄａｌｅｍｏｓａｉｃＡＭＶｉｌａｒｖｉｒｕｓｅｓＪ．ＡｃｔａＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅｇｐ（）ｐｐ（ｐ）［］，－１９９８４７２４７２）：２１９２２６．，（１２．ＣｈａｙＣＡ，ＧｕｎａｓｉｎｇｅＵＢ，ＤｉｎｅｓｈｋｕｍａｒＳＰ，ＭｉｌｌｅｒＷＡ，ＧｒａｙＳＭ．Ａｐｈｉｄ７５ 参考文献ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎａｎｄｓｙｓｔｅｍｉｃｌａｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｐ－ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓＰＰＮａｒｅｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｃｏａｔｒｏｔｅｉｎｄｔｈｒｏｕｈｄｏｍｉｎｄ１７－ｋＤａｐｒｅａｇａａｎ－ｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＪ．Ｖｉｒｏｌｏ，１９９６，２１９１：５７６５．ｐ［］ｇｙ（）１３．ＣｏｍｍａｎｄｅｕｒＵＫｏｅｎｉＲＬｅｓｅｍａｎｎＤＥＴｏｒｒａｎｃｅＬＢｕｒｅｒｍｅｉｓｔｅｒＷＬｉｕＹ，ｇ，，，ｇ，，ＳｃｈｏｔｓＡＡｌｒｉｃＭＧｒａｓｓｉＧ．ＥｉｔｏｅｍａｉｎｏｎｆｒａｍｅｎｔｓｏｆＢｅｅｔｎｅｃｒｔｉｃ，，ｐｐｐｐｇｇｏｅｌｌｏｗｖｅｉｎｖｉｒｕｓｒｏｔｅｉｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９２７３３ｙｃｏａｔ：ｐ［］ｇｙ，，（）６９５－７００．１４．ＣｒａｓｔａＯＲ，ＦｒａｎｃｋｉＭＧ，ＢｕｃｈｏｌｔｚＤＢ，ＳｈａｒｍａＨＣ，ＺｈａｎｇＪ，ＷａｎｇＲＣ，ＯｈｍＨＷＡｎｄｅＪＭ－ｒｓｏｎ．Ｉｄｅｎｔｉｆｔｉｃｈｔｒｉｚａｔｉｏｎｆｔｔｉｃａｏｎａｎｄａｒａｃｅｏｗｈｅａｗｈｅａｒａｓｓ，ｇｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｌｉｎｅｓａｎｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅＪ．［］－Ｇｍｅ２０００４３４．ｅｎｏ：６９８７０６，，（）＇１５．ＤＡｒｃＪＤｏｍｉｅｒＬＬ．ＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｆＪ．ＰｌａｎｔＨｅａｌｔｈＩｎｓｔｒｕｃｔｏｒ２０００ｙＣ，ｙｙ［］，，３４－：１７７１８３．（）ｉｂｉｌ１６．ＤｉｅｔｚｅｎＲＧＳａｎｄｅｒＥ．ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｏｄｉｅｓａａｎｓｔａａｎｔｖｉｒｕｓＪ．ｇ，ｇｐ］［－ｒｃｈｉｖｅｓｏｆｒｏｌｏ１９８２７４２．ＡＶｉ：１９７２０４ｇｙ，，（）＇ＡＷ１７ＤｉＬＤＣＪＬｔｉ／／ＢＪＭ＆ＭＨＶ．ｏｍｅｒＬｒｃ．ｕｅｏｖｒｕｓｅｓ．．．ａｈ．．．ｖａｎ，ｙ［Ｍ］ｙＲｅｅｎｍｏｒｔｅｌ．ＥｎｃｃｌｏｅｄｉａｏｆＶｉｒｏｌｏ．ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓｇｙｐｇｙ，２０－０８：２３１２３８．１８．ＤｕｆｕｓＪＥ．Ａｐｈｉｄｓ，ｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄｔｈｅｙｅｌｌｏｗｐｌａｇｕｅａｐｈｉｄｓ：ＡｓＶｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ－Ｙｏｒｋ：ＡｃａｄＰｒｅｓｓ１９７７：３６１３８３．，ｉ１９．ＥｋｚａｅｚＡＭＫｕｍａｒｉＳＧＩｓｍａｉｌＩＦｉｒｓｔｒｅｏｒｔｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｖｒｕｓａｎｄｉｔｓｙ，，．ｐｆｖｅｃｔｏｒ（Ｐｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉｓ）ａｆｆｅｃｔｉｎｇｗｈｅａｔａｎｄｂａｒｌｅｙｃｒｏｐｓｉｎＳｙｒｉａＪ］．［ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ，２０１０，９５１：７６．（）２０ｄｅＳＭＳｉｉｆｆｉｉａｒｌｅｌｌｖｉｒｕｓｉｌ．Ｆｏｒ．ｔｒａｎｄｅｒｅｎｔａｔｏｎｏｆＢｙｙｅｏｗｄｗａｒｆｓｏａｔｅｓｕｓｉｎｇｓｅｃｉｆｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏＪ．ｐｐｙ［］Ｊｏｕｒｎａ－ｌｏｆＶｉｒｏｌｏｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９８９２３３：３１３３１９．ｇ，（）２１．ＦｒｉｅｂｅＢ，ＪｉａｎｇＪ，ＲａｕｐｐＷＪ，ＭｃｉｎｔｏｓｈＲＡ，ＧｉｌｌＢＳ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ－ａｗｈｅａｔｌｉｅｎｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐｅｓｔｓ：ｃｕｒｒｅｎｔｓ－ｔａｔｕｓＪ．Ｅｕｈｔｉｃａ１９９６９１１：５９８７．［］ｐｙ，，（）２２．ＧｉｂｂｓＭ．Ｔｈｅｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓｓｕｅｒｒｏｕ：ｒａｍａｎｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｅｒｓｉｓｔｅｎｔｐｇｐｐｐａｒｎｅｉ．ｌｌｒｉｒｌｕｉ．ｍｂｒｉｄｖｅｒｐｔｒｓｈｐｓＭｏｅｃｕａＢａｓｉｓｏｆＶｕｓＥｖｏｔｏｎ［ＭＣａｇｅＵｎｉｓｉｔｙ］Ｐｒｅｓｓ１９９５．，２３ＧｉｌｌＣＣｔｆｌｏｓｓｅｒｉｎｔｌｌｉｉｔｈｒｌｅ．．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｏｓｏｎｓｐｇｗｈｅａｎａｔｕｒａｙｎｆｅｃｔｅｄｗＢａｙｅ－ｙｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓＪ．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ１９８０６４２；１９７２０３．［］，，（）２４．ＧｒｏｏｔｈｕｉｓＪＲＮｉｓｈｉｄａＨ．Ｐｎｔｉｏｎｏｆｓｉｒａｔｏｎｃｔｉａｌｉｉｎｆｅｃｔｉｉｎ，ｒｅｖｅｒｅｐｒｙｓｙｙｖｒｕｓｏｎｓ－ｍｏｎｏｃｈｉｇｈｒｉｓｋｉｎｆａｎｔｓｂｙｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｌｉｖｉｚｕｍａｂＪ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（ｐ）［］Ｉｎ－ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ２００２４４３：２３５２４１．，，（）２５．ＨａｂｉｌｉＮＳｍｏｎｓＲＨ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｂｅｔｗｅｅｎｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｏｔｈｅｒ，ｙｙｐ７６ 浙江大学硕士学位论文ＲＮＡｌａｎｔｖｉｒｕｓｅｓｂａｓｅｄｏｎｓｅｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆｓｉｎｔｈｅｉｒｕｔａｔｉｖｅＲＮＡｏｌｅｒａｓｅｓｙｍｐｑｐｐ－ａｎｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｅｌｉｃａｓｅｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９８９１７２３：９５４３９５５５．，，（）２６．ＨａｒｒｉｓｏｎＢＤ，ＢａｒｋｅｒＨ，ＢｏｃｋＫＲ，ＧｕｔｈｒｉｅＥＪ，ＭｅｒｅｄｉｔｈＧ，ＡｔｋｉｎｓｏｎＭ．Ｐｌａｎｔ－－ｖｉｒｕｓｅｓｗｉｔｈｃｉｒｃｕｌａｒｓｉｎｌｅｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＪ．Ｎａｔｕｒｅ１９７７２７０５６３９６０Ａ：７７６２．ｇ［］，，（）２７ｂｏｏｍＨＲＧｒｉｆｆｉｔｈＡＤＪｏｈｎｓＫＳＣｈｉｓｗｅｌｌＤＪＨｕｄｎＰ．ＨｏｏｅｎｓｏｎｓｏＷｉｎｔｅｒＧ．ｇ，，，，，－ｂｕｎＭｕｌｔｉｓｕｉｔｐｒｏｔｅｉｎｓｏｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｈａｅ：ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｉｅｓｆｏｒｐｇｇｄｉｓｐｌａｙｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａｂ）ｈｅａｖｙａｎｄｌｉｇｈｔｃｈａｉｎｓ［Ｊ］．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ，－１９９１１９１５４１３３４１３７．：，（）２８．ｍｏｎｏｃｌｏｎ．ＨｓｕＨＴＡｅｂｉＪＲｏｗＷＦＤｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓａｍｏｎｌａｎｔｉｂｉｔｏ，ｃｈｏａｏｄｅｓ，ｇｇａｒ－ＢｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｐｈｔｏｔｈｏｌｏ１９８４７４５：６００６０５．ｙ［］ｐａｇｙ，，）ｙｆｙ（Ｗ－２９ｉＧｉｅｉｎＧｅｒｍａｎａｓｈｏｅｉＪｎａｌｏｆＰｌａｎ．Ｈｕｔｈ．Ｖｒｕｓｅｓｏｆｒａｍｎｅａｙｒｔｏｖｒｖｅｗ［］．Ｊｏｕｒｔ－ＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ２０００１０７４：４０６４１４，．，（）３０ｋｏｂｏｖｉｔＡ．Ｐｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆｕｌｌｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｉｅｂｔｉｉ．Ｊ．．Ｊａｓｒｏｙｓｙｒａｎｓｇｅｎｃｍｃｅ［］Ｃ－ｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，６（５）：５６１５６６．３．．．１．ＪｅｚｅｗｓｋａＭＦｉｒｓｔｒｅｐｏｒｔｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓｏｃｃｕｒｒｉｎｇｉｎＰｏｌａｎｄＪｆ［］－ＰｈｔｏａｔｈｏｌｏｉａＰｏ．ｌｏｎｉｃａ２００１２１：９３１００ｙｐｇ，，（）３２．ＪｉａｎｇＪＸ，ＣｈｅｎＺＸ，ＺｈｏｕＸＰ．ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｔｏＳｕｇａｒｃａｎｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｆｏｒｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎａ［Ｊ］，Ｊ－ｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｔｏａｔｈｏｌｏ２００３１５１６：３６１３６４．ｙｐｇｙ，，（）３３．ＪｉｌａｖｅａｎｕＡ，ＶａｃｋｅＪ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ（ＷＤＶ）ｉｎＲｏｍａｎ－ｉａ［Ｊ］．ＰｒｏｂｌｅｍｅｄｅＰｒｏｔｅｃｔｉａＰｌａｎｔｅｌｏｒ，１９９５，２３（１）：５１６２．３４Ｎｄｕｎ．．ＫａｏｏｒｉａＲＧｕｒｕＪＯｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｉｒｒｉａｔｅｄｗｈｅａｔｉｎＺａｍｂｉａｐ，ｇｇ－Ｊ．．ＥＰＰＯＢｕｌｌｅｔｉｎ２００４３４３：４１３４１９，，［］（）３５．．ＫｅｌｌＬＧｅｒｌａｃｈＷＬＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｂｅｎｏｍｉｃｙ，，ｇＲＮＡｓｏｆａｎＡｕｓｔｒａｌｉａｎｉｓｏｌａｔｅｏｆＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ［Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ，ｆ］ｇｙ－１９９４２０２２：５６５５７３．，（）３６．ＫｏｈｌｅｒＧ，ＭｉｌｓｔｅｉｎＣ．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｕｒｅｏｆｆｕｓｅｄｃｅｌｌｓｓｅｃｒｅｔｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｏｆ－ｅｃｉｆｉｃ．ｒｅｄｅｆｉｎｅｄｓｉｔＪＮａｔｕｒｅ１９７５２５６５５１７：４９５４９７．ｐｐｙ，，［］（）３７．ＫｏｋｌＵＧＲａｍｓｅｌｌＪＮＫｖａｍｈｅｄｅｎＡ．Ｔｈｅｃｏｍｌｅｔｅｅｎｏｍｅｓｅｕｅｎｃｅｆｏｒａ，，ｐｇｑＴｕｒｋｉｓｈｉｓｏｌａｔｅｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓＷＤＶｆｒｏｍｂａｒｌｅｃｏｎｆｉｒｍｓｔｈｅｒｅｓｅｎｃｅ（）ｙｐ－ｆ．．ｏｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔＷＤＶｓｔｒａｉｎｓＪＶｉｒｕｓＧｅｎｅｓ２００７３４３：３５９３６６［］，，（）－３８．ＫｏｏｎｉｎＥＶＤｏｌａＶＶｖ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｔａｘｏｎｏｍｏｆｏｓｉｔｉｖｅｓｔｒａｎｄＲＮＡｉｒｕｓｅｓ：，ｊｙｐｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓＪ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ［］ｌ－Ｒ．ｅｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒａｎｄＭｏｌｅｃｕａｒＢｉｏｌｏ１９９３２８５：３７５４３０ｙ，，ｇｙ（）３９．ＫｒｕｅｇｅｒＥＮ，ＢｅｃｋｅｔｔＲＪ，ＧｒａｙＳＭ，ＭｉｌｌｅｒＷＡ．Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ￣ｓｅｕｅｎｃｅｏｆｈｅａｒｌｌｄｗａｒｖｉｒｕｓｖｅａｌｉｑｔｇｅｎｏｍｅｏｆＢｌｅｙｙｅｏｗｆＫＭＶｒｅｓｔｔｏｂｅａｎｅｗＰｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓｄｉｓｔａｎｔｌｒｅｌａｔｅｄｔｏｏｔｈｅｒｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｙｙ［］２０１３４．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ：２０５ｇｙ，，７７ 参考文献４０．ＫｖａｍｈｅｄｅｎＡＬｉｎｄｂｌａｄＭＬｉｎｄｓｔｅｎＫＶａｌｋｏｎｅｎＪＰ．Ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｆ，，，ｙｏＷｈ－ｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓＪＡｈｉｖＶｉｌ２００２１４７１２０５２１６ｆ．ｒｃｅｓｏｆｒｏｏ：．［］ｇｙ，，（）４１ＬａｉｋｉｎＰＪＲｔｌｌＲＩＳＢＰＡｌＲＷｔＰＭＣｈＺＭＺｈｏｕ．ｒｅｔｅａｎｋｓｅｓａｅｒｈｏｕｓｅ，ｅｎ，，，ｐｐ，ｇ，ＧＨＸｉｎＺＹＣｈｅｎＸ．Ｉｄｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｆｕｒｃｅｓ，，ｅｎ，，ｏｓｏｏｆｒｅｓｌｄｗｖｌｄｌｉｓｔａｎｃｅｔｏＢａｒｅｅｌｌｏｗａｒｆｉｒｕｓ：ＷｏｒＰｅｒｓｅｃｔｉｖｅｓｏｎＢａｒｅＹｅｌｌｏｗｙｙｐｙＤｗａｒｆＪｕｌ６－１１１９８７Ｃ．Ｍｅｘｉｃｏ：ＣＩＭＭＹＴ１９９０．，ｙ，，［］ｕｕ－ｅｗａｒｎｗｉｎ４２ｌｒｅｒｆｅａｖｉｒｕｓ．ＬｅｍｍｅｔｔＡＨｓｅｌａＶｉｓｔｏａＥ．ＦｉｒｓｔｏｔｏＷｈｔｄｉｔｅｒｙ，ｐｆｗｈｅａｔｉｎＦｉｎｌａｎｄ［Ｊ，ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ２００５８９８：９１２．］，，（）４３．ＬｉＮＣｈｅｎＺＬｉｕＹＬｉｕＹＺｈｏｕＸＷｕＪ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ，，，，，ｐａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌａｓｓａｙｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓＧＡＶｓｔｒａｉｎＪ．ＶｉｒｏｌｏＪｏｕｒｎａｌ，２０１５，１２１：１３６．［］ｇｙ（）４４ＬｉｎｄｂｌａｄＭＳｉｖａｌｄＲ．ＴｅｍｏｒａｌｓｒｅａｄｏｆＷｈｅａｔｄｗｒｖｒｕｓａｎｄｍａｔｕｒｅｌａｎｔ．ａｉ？ｇｐｐｆｐ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｗｉｎｔｅｒｗｈｅａｔＪ．ＣｒｏＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ２００４２３３：２２９２３４．，，［］ｐ（）４５ｉｌＷａｅｍＰ．ｆｗｈｅａｄｗａｆｄｅｎｃｅｈ．ＬｎｄｂａｄＭＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｏｔｒｉｎｃｉｔｏｗｉｎｔｅｒｗｅａｔ，－ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｒａｃｔｉｃｅｓＪ．ＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅＥｃｏｓｙｓｔｅｍｓ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ２００２９２２３：ｐ［］ｇ，，，（）－１１５１２２．－ｗ４６．ＬｉｎｄｓｔｅｎＫＬｉｎｄｓｔｅｎＢ．Ｗｈｅａｔｄｗａｒｆａｎｏｌｄｄｉｓｅａｓｅｉｔｈｎｅｗｏｕｔｂｒｅａｋｓｉｎ，Ｓｗｅｄｎ－ｅｎＪｌｆＰｌａｎｉｅｃｔｉｏｎ１９９９０６３：３２３３２［］．ＪｏｕｒａｏｔＤｓｅａｓｅｓａｎｄＰｒｏｔ１５．，，（）４７．ＬｉｎｄｓｔｅｎＫ，ＬｉｎｄｓｔｅｎＢ，ＡｂｄｅｌｍｏｅｔｉＭ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｏｍｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅ３ｒｄｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅｏｎｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｏｆＧｒａｍｉｎｅａｅｉｎＥｕｒｏｅＲｏｔｈａｍｓｔｅｄＵＫａ２８－３０１９８０．Ｈａｒｅｎｄｅｎ：ｐ，，，Ｍｙ，［Ｃ］ｐＲｏｔｈａｍｓｔｅｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ，１９８１．４８．ＬｉｎｄｓｔｅｎＫＶａｃｋｅＪＧｅｒｈａｒｄｓｏｎＢ．Ａｒｅｌｉｍｉｎａｒｒｅｏｒｔｏｎｔｈｒｅｅｃｅｒｅａｌｖｉｒｕｓ，，ｐｙｐｄｉｓｅａｓｅｓｎｅｗｔｏＳｗｅｄｅｎｓｐｒｅａｄｂｙＭａｃｒｏｓｔｅｌｅｓａｎｄＰｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｅｄｄ－ｅｌａｎｄｅｎｆｒａｎＳｔａｔｅｎｓＶａｘｔｓｋｄｄｓａｎｓｔａｌｔ１９７０，１４１２３：２８５２９７．ｙ，（）４９ＬｉｔｔｌｅｆｅｌｄＪＷ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆｈｂｒｉｄｓｆｔｉｎｓｏｆｆｉｂｂｌａｓｔｓｉｎｖｉｔｄｔｈｅｉｒ．ｉｙｒｏｍｍａｇｒｏｒｏａｎｒｅｓｕｍｅｄｒｅｎ－１ｐｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｃｅ，９６４，１４５（３６３３）：７０９７１０．５０．ＬｉｕＹ，ＺｈａｉＨ，ＺｈａｏＫ，ＷｕＢ，ＷａｎｇＸ．ＴｗｏｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓｏｆＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇ－ｅｎｃｏｄｅｄｂｃｅｒｅａｌｉｎｆｅｃｔｉｎｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅｆａｍｉｌＬｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｙｇｙ［］ｒ－ＧｅｎｅｒａｌＶｉｏｌｏ２０１２９３Ｐｔ８：１８２５１８３０．ｇｙ，，（）５１．ＬｉｕＺ，ＣｈｅｎＺ，ＨｏｎｇＪ，ＷａｎｇＸ，ＺｈｏｕＣ，ＺｈｏｕＸ，ＷｕＪ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－ｒａｎｔｉｂｏｄｙｂａｓｅｄｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＣｉｔｒｕｓｔｉｓｔｅｚａｖｉｒｕｓｉｎｃｉｔｒｕｓｒｏｖｅｓＪ－ＶｉｒｏｌｏｉｃａＳｉｎｉｃａ２０１６３１４：３２４３３０．ｇ［］．ｇ，，（）５２．ＭａｋｋｏｕｋＫＭ，ＣｏｍｅａｕＡ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｖａｒｉｏｕｓｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ．－少ｔ／ｗａ／／ｗｒｗｓｂｔｈｅｔｉｓｓｕｅｂｌｏｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａａｎｄｉｔｓｕｓｅｆｏｒｖｉｒｕｓｙｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎｃｅｒｅａｌｓｉｎｏｃｕｌａｔｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｏｗｔｈｓｔａｅｓＪ．ＥｕｒｏｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆｇｇ［］ｐＰ－ｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ１９９４１００１：７１８０．ｇｙ，，（）５３．ＭａｎｕｒａｎｇＢ，ＷｉｔｓａｃｋＷ，ＭｅｈｎｅｒＳ，ＧｒｕｎｔｚｉｇＭ，ＦｕｃｈｓＥ．Ｔｈｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆ７８ 浙江大学硕士学位论文ＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｔｏｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｌｅａｆｈｏｅｒＰｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘｐｐ－－ａｌｉｅｎｕｓｉｎＭｉｄｄｌｅＧｅｒｍａｎ［Ｊ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ２００４１００１：１０９１１３．ｙ］，，（）５４．ＭａｒｔｉｎＲＲ，ＫｅｅｓｅＰＫ，ＹｏｕｎｇＭＪ，ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭ，ＧｅｒｌａｃｈＷＬ．ＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄＭｏＬ．ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｏｆｕｔｅｏｖｉｒｕｓｅｓＪＰｈｔｏａｔｈｏｌｏ１９９０２８２８：ｇｙ［］ｙｐｇｙ，，（）３４－１３６３．５５．ＭａｙｅｒＫＦＸ，ＲｏｇｅｒｓＪ，ＤｏｌｅｚｅｌＪ，ＰｏｚｎｉａｋＣ，ＥｖｅｒｓｏｌｅＫ，ＦｅｕｉｌｌｅｔＣ，ＧｉｌｌＢ，ＦｒｉｅｂｅＢＬｕｋａｓｚｅｗｓｋｉＡＪＳｏｕｒｄｉｌｌｅＰＥｎｄｏＴＲＤｏｌｅｚｅｌＪＫｕｂａｌａｋｏｖａＭ，，，，，，ｈａｌｋｏｖａｂｋａＺｌ－Ｃ．ｂａｄｄｆｔｆｔｈｉｉＪＤｕｓｅｔａＡｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｅｒａｓｅｕｅｎｃｅｏｅ，，ｑｈｅｘａｐｌｏｉｄｂｒｅａｄｗｈｅａｔ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍ）ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４，３４５（６１９４）：１２５１７８８．５６．ＭａｏＭＡＺｉｅｌｅｒｒａｆｆＶＭｏｌｅｃｕｌａｂｉｌＬｔｉＪＡｄｖａｎｃｅｓｉｎ．ｒｏｏｏｆｕｅｏｖｒｕｓｅｓ．ｙ，ｇｇｇｙ［］－ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ１９９６４６４４１３４６０．：，，（）５７．ＭｉｌｌｅｒａｎｄＷＡ，ＲａｓｏｃｈｏｖｄＬ．Ｂａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｈ－ｔｏａｔｈｏｌｏ１９９７，３５１：１６７１９０．ｐｙｐｇｙ，（）ｒｕｃ５８．ＭｉｌｌｅｒＷＡＢｅｃｋｅｔｔＲＬｉｕＳ．ＳｔｔｕｒｅＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＶａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＢａｒｌｅ，，，，ｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓａｎｄＣｅｒｅａｌＹｅｌｌｏｗＤｗａｒｖｉｒｕｓＧｅｎｏｍｅｓ：ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆａｎｆＭｅｘ－ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｓｉｕｍＴｅｘｃｏｃｏｉｃｏＳｅｔｅｍｂｅｒ１５２００２，Ｄ．Ｆ．；ｙｍｐ，，，ｐ，［Ｃ］ＣＩＭＭＹＴ，２００２．５９－ＫｕｍａｒＳＰｌｕｔｅｏｖｒｕ．ＭｉｌｌｅｒＷＡＤｉｎｅｓｈＰａｕＣＰ．ＬｉｓＧｅｎｅＥｘｒｅｓｓｉｏｎＪ．，，ｐ［］ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ１９９５１４３：１７９．，，（）－－６０．ＭｉｌｌｅｒＷＡＪａｃｋｓｏｎＪＦｅｎＹ．ＣｉｓａｎｄｔｒａｎｓｒｅｕｌａｔｉｏｎｏｆＬｕｔｅｏｖｉｒｕｓｅｎｅ，，ｇｇｇｅｘ＇ｒｅｓｓｉｏｎｂｔｈｅ３ｅｎｄｏｆｔｈｅｖｉｒａｌｅｎｏｍｅＪ．ＶｉｒｕｓＲｅｓｅａｒｃｈ２０１５２０６２０１５：ｐｙｇ［］，，（）３７－４５．６．ａｒｌｏｗａｒｖｉｒｕｓｖｒｄｒ１．ＭｉｌｌｅｒＷＡＬｉｕＳＢｅｃｋｅｔｔＲＢｌｅｅｌｄｗ：Ｌｕｔｅｏｉｉａｅｏ，，ｙｙｆｖｄ－Ｔｏｍｂｕｓ．ｌｌｌｌｉｒｉａｅ？ＪＭｏｅｃｕａｒＰａｎｔＰａｔｈｏｏ２００２３４：１７７１８３．，，［］ｇｙ（）６２ｒＷａｔｅｒｈｏｕｌｈＷ．ｕｅｎｃｅｄｉｉｆＢａｒｌｅ．ＭｉｌｌｅＷＡｓｅＰＭＧｅｒａｃＬＳｅａｎｏｒａｎｓａｔｏｎｏ，，ｑｇｙｅｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓｌｉｉｄｈ８３ｌｌｅｎｏｍｉｃＲＮＡＪ．ＮｕｃｅｃＡｃｓＲｅｓｅａｒｃ１９８１６１：ｙｆｇ［］，，（）６０９７－６１１１．－ＷＡ－６３ｉＫｕｍＳＰｉｌｌ．Ｇｉｉ．ＭｏｈａｎＢＲＤｎｅｓｈａｒＭｅｒｅｎｅｓａｎｄｃｓａｃｔｎｓｅｕｅｎｃｅｓ，，ｇｑａｒ－ｖｏｌｖｅｄｉｎｌｉｉｆｌｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓ？ＰＮＲＮＡＪＶｉｒｏｌｏｉｎｒｅｃａｔｏｎｏＢｙｙｅｆ．［］．ｐｇｙ，９５２－１９１２１：１８６１９５．，（）６４．ＭｏｒｒｉｓｏｎＳＬ，ＪｏｈｎｓｏｎＭＪ，ＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇＬＡ，ＯｉＶＴ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃｈｕｍａｎａｎｔｉｂｏｄｙ－ｌｅｃｕｌｅｓｔｉｂｉｎｄｉｎｄｏｍｉｉｔｈｈｔｔｉｏｎｄｏｍａｉｎｍｏ：ｍｏｕｓｅａｎｇｅｎｇａｎｓｗｕｍａｎｃｏｎｓａｎｒｅｇｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆ－１９８４８１２１６８５１６８５５．Ａｍｅｒｉｃａ：，，（）６５．ＭｏｕｄａｌｌａｌＺＡ，ＢｒｉａｎｄＪＰ，ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌＭＨＶ．ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｓｒｏｂｅｓｏｆｔｈｅａｎｔｉｅｎｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＪ．ＴｈｅＥｍｂｏＪｏｕｒｎａｌ［，ｐｇ］－１９８２１８：１００５１０１０．，（）７９ 参考文献６６ＭｕｈＭａＮａｖ－Ｍｏｒｉｏｎ．ｉｒｅＢｒｔｉｎＤＰＢｒｏｗｎＪＫａｓＣａｓｔｉｌｌｏＪ，ｅｓＥ，ＺｅｒｂｉｎｉＦＭ，，，，－ＲｉｖＢｓｔａｔＲＢｉｄｄＲＷＶａｉＡ－ｅｒａｕｅＭａｌａｔｈｉＶＧ．Ａｅｉｄｍａｎ，ｒｏｎ，ｒｓａｎｎｏｍｅｗｅ，ｇｗ－－ａｉｒｉｓｅｉｄｅｎｔｉｔｂａｓｅｄｐｒｏｏｓａｌｆｏｒｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｔｈｅｇｅｎｕｓｐｙｐＭａｓｔｒｅｖｉｒｕｓｆａｍｉｌｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅＪ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏ，２０１３，１５８６：（ｙＧ）［］ｇｙ（）－２４１４１１１４．６７．ＮａａｒＡＯｔｈｍａｎＦＢＢｏｕｄｈｉｒＨＭａｋｋｏｕｋＫＭＺａｒｏｕｋＲＢｅｓｓａｉＲＫｕｍａｒｉＳｊ，，，，，，Ｇ．ＶｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅｓｏｆｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｌｅｇｕｍｅａｎｄｃｅｒｅａｌｃｒｏｐｓｉｎＴｕｎｉｓｉａ［Ｊ］．ｔｈ－Ｐｈｙｔｏａｏｌｏｉａｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ２００７３９３：４２３４３２．ｐｇ，，（）６８．ＮｉｅｌｓｏｎＭＷ．Ｔｈｅｌｅａｆｈｏｐｐｅｒｖｅｃｔｏｒｓｏｆｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｖｉｒｕｓｅｓ（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ，Ｃｉｃａｄｅｌｌｉｄａｅ）：Ｔａｘｏｎｏｍｙ，ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ．ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ．－１３８２ＲＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＤｅａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｒｉｃｕｌｔｕｒｅ１９６８：３０７３０９．［］ｐｇ，６９Ａｒｉｎｈ．ＮｉｓｏｎｏｆｆＨｏｅｒＪＥＳＳＢ．ＮａｔｕｒｅｏｆｔｅＡｃｔｉｖｅＳｉｔｅｏｆａｎＡｎｔｉｂｏｄ，ｐｐ，ｐｇｙｆ－ＭｏｌｅｃｕｌｅａｎｄｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏＡｎｔｉｂｏｄｙＨａｐｔｅｎＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓＭ／／Ｔｈｅ［］Ａｎ－ｔｉｂｏｄＭｏｌｅｃｕｌｅ．１９７５：１６８５．ｙ７０．ＮｒｅｎＪＮ．ＲｅｓｏｎｓｅｔｏＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｗｉｌｄａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄｗｈｅａｔＤ］．ｙｇｐ［ＪｉｍＮｕｒｍｉｎｅｎＮｙｇｒｅｎ，２０１６．７１－．ＯｓｗａｌｄＪＷＨｏｕｔＢＥ．ＴｈｅｅｌｌｏｗｄｗｖｉｒｓｄｉｓｅａｓｒｅａｌｓＪ．，ｓｏｎｙａｒｆｕｅｏｆｃｅｃｒｏ［ｐ］Ｐｈ－ｔｏａｔｈｏｌｏ１９５３４３３：１２８１３６．ｙｐｇｙ，，（）７２．ＰａｓｕｉｉＧＳｉＣｏｎｔｅＬＢａｒｂａＭｆｒｕｓｎｍｅｏｎｅＡＭ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏＰｌｕｍｏｘｖｉｉｎｑ，，，ｐ－ａｒｉｃｏｔｓｅｅｄｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＶｉｒｏｌｏｉｃａ１９９８４２４：２６０２６３．ｐｇ，，（）７３．ＰａｚｈｏｕｈａｎｄｅｈＭＤｉｅｔｅｒｌｅＭＭａｒｒｏｃｃｏＫＬｅｃｈｎｅｒＥＢｅｒｒＢＢｒａｕｌｔＶ，，，，ｙ，，ＨｍｅｒＯＧ－－ｅｍＫｒｅｔｓｃｈＴＲｉｃｈａｒｄｓＫＥｅｎｓｃｈｉｋＰ．Ｆｂｏｘｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｉｎｔｈｅ，，，ＰｏｌｅｒｏｖｉｒｕｓｐｒｏｔｅｉｎＰ０ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｉｌｅｎｃｉｎｇｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅ－ｒｉｃａ２００６１０３６：１９９４１９９９．，，（）７４．ＲａｍｓｅｌｌＪＮＥＢｏｕｌｔｏｎＭＩＭａｒｔｉｎＤＰＶａｌｋｏｎｅｎＪＰＴＫｖａｍｈｅｄｅｎＡ．Ｓｔｕｄｉｅｓ，，，，ｏｎｔｈｅｈｏｓｔｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｂａｒｌｅｙｓｔｒａｉｎｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｕｓｉｎｇａｎ－ａｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖｉｒａｌｃｌｏｎｅＪ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２００９５８６：１１６１１１６９．ｇ［］ｇｙ，，（）７５－Ｇ．ＲｅｕｔｅｎａｕｅｒＡＺｉｌａｆｆＶＬｏｔＨｉｄｅＤＧｕｉｌｌＨＲｉｈｄ，ｅｅｒｒ，Ｓｃｈｅｃｋｅｒ，ｅ，ｃａｒｓＫｇ，ｙ，ＪｏｎａｒｄＧ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢｅｅｔｗｅｓｔｅｒｎｙｅｌｌｏｗｓＬｕｔｅｏｖｉｒｕｓｅｎｅｓｉｍｌｉｃａｔｅｄｉｎｇｐ－ｖｉｒａｌｒｅｌｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｒｔｉｃｌｅｍｏｒｈｏｅｎｅｓｉｓＪ．Ｖｉｒｏｌｏ１９９３１９５２：６９２６９９．ｐ，，ｐｐｇ［］ｇｙ（）７６．ＲｉｐｌＪ，ＫｕｎｄｕＪＫ．Ｃｙｎｏｓｕｒｕｓｃｒｉｓｔａｔｕｓ，ａｎｅｗｈｏｓｔｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅＣｚｅｃｈＲｅｕｂｌｉｃＪｌｌ．ＪｏｕｒｎａｏｆＰａｎｔＰａｔｈｏｌｏ２０１５９７３：５４７．ｐ，，［］ｇｙ（）７７．ＲｏｃｈｏｗＷＦ．ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＢａｒｌｅｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓａｃｕｉｒｅｄｆｒｏｍｌｉｕｉｄｙｑｑｅｘｔｒａｃｔｓｂａｈｉｄｓｆｅｅｄｉｎｔｈｒｏｕｈｍｅｍｂｒａｎｅｓ［Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏ１９６０１２２：ｙｐｇｇ］ｇｙ，，（）２２３－２３２．７８．ＲｏｃｈｏｗＷＦ．ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｆｏｕｒｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓＪ－．Ｐｈｔｏａｔｈｏｌｏ１９６９５９１１：１５８０１５８９［，．］ｙｐｇｙ，（）８０ 浙江大学硕士学位论文７９．ＲｏｃｈｏｗＷＦ．Ｂａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ：ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｍｉｘｉｎｇａｎｄｖｅｃｔｏｒ－ｓｅｃｉｆｉｃｉｔｙＪ．Ｓｃｉｅｎｃｅ１９７０１６７３９１９：８７５８７８．ｐ［］，，（）８０ＲｏＷＦ．Ｃｒａｔｉｄｉｉｂｌｌｌｄｂｌｉｌ．ｃｈｏｗｏｍｐａｖｅａｇｎｏｓｓｏｆａｒｅｙｙｅｏｗｗａｒｆｙｓｅｒｏｏｇｃａａｎｄｈｉｄｔｒａｎｍｉ－ａｓｓｓｉｏｎｔｅｓｔｓＪＰｌｉＲｅｏｒｔｅ１９７９６３５：４２６４３０［］．ａｎｔＤｓｅａｓｅｐｒ．ｐ，，（）８１．ＲｏｃｈｏｗＷＦ．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｒｌｅｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｅｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｙｂ－ｉｏｌｏｉｃａｌａｎｄｓｅｒｏｌｏｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓ．．ＰｌａｎｔＤｉｓｅａｓｅ１９８２６６５：３８１３８４．ｇｇ［Ｊ］，，（）８２ＲｏｃｈｏｗＷＦＣｉｌＬ．ＳｉｆｉｉｔＢｌｅｗｄｗａｒｖｉｒｕｓｅｓｉｎ．ａｒｍｃｈａｅＥｅｃｃａｍｏｎａｒｅｌｌｏ，ｐｙｇｙｆｙ－ｅｎｚｉｔａｓｓａｓ．ＪＶｉｌ１９７９９５２４１５４２０．ｍｅｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ［］．ｒｏｏｙ，：ｙｙｇ，（）８３．ＲｏｃｈｏｗＷＦ，ＭｕｌｌｅｒＩ．ＡｆｉｆｔｈｖａｒｉａｎｔｏｆＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎＮｅｗＹｏｒｋＪＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＣｒａｆｉｓｈ１９７１１３６－：８４９８５３［］．．ｙ，，（）－－ＤＤｅ８４．ＲｏｕｄｅｔＴａｖｅｒｔＧＧｅｒｍａｎＲｅｔａＳｅｌａｕｎａＴｌ６ｃｏｌｌｅＢＣａｎｄｒｅｓｓｅＴＬｅＧｎａ，，，，ｙ，Ｏ－．ＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＰｏｔｙｖｉｍｓｈｅｌｅｒｃｏｍｐｏｎｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｓｅａｎｄｃａｐｓｉｄｏｔｅｉｎｐｐｒ－ｉｎｉｎｆｅｃｔｅｄｌａｎｔｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ，２００２，８３Ｐｔ７：１７６５１７７０．ｐ［］ｇｙ（）８５．Ｒｕｂｄｆｗｈ．ｉｅｓＡｕｔｏｎｅｌｌＣｕｒｉｎａＭＶａｌｌｅａＶ．ＶｉｒｕｓｉｓｅａｓｅｓｏｅａｔｉｎＩｔａｌＪ，Ｔ，ｇｙ［］－ＩｎｆｏｒｍａｔｏｒｅＦｉｔｏａｔｏｌｏｉｃｏＩｔａｌ１９９５４５１０：２４３５．ｐｇ（ｙ），，（）８６．．ＳａｄａｖａＤＥＨｉｌｌｉｓＤＭＨｅｌｌｅｒＨＣＢｒｅｎｂａｕｍＭＬｉｆｅ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅｏｆＢｉｏｌｏ，ｅ，，ｇｙＭ．．１０ｔｈＥｄｉｔｉｏ．Ｃｒａｎｂｕｒ：ＷｏｒｔｈＰｌｉｓｈｅｒｓ２０１２８６７ｎｕｂ，，［］ｙ８７－．ＳｃｈｕｂｅｒｔＪａｂｅｋｕｓｓＡＫａｉｅＫＪｅｓｋｅＨ．Ｓｕｒｖｅｉｎｃｅｒｅａｌｉｎｆｅｃｔｉｎ，Ｈ，ｚｍａｒ，ｙｇｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓｉｎＧｅｒｍａｎ：Ｄｉａｎｏｓｔｉｃｓａｎｄｄｉｒｅｃｔｓｅｕｅｎｃｉｎｕｓｉｎｒｏｌｌｉｎｃｉｒｃｌｅｇｙｇｑｇｇｇ－ａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＪ．ＶｒｕｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ２００７１２７（１：６１７０．ｐ［］，，）－．ＷｕＪｂｏｄ８８ＳｈａｎＨＸｉｅＹＺｈｏｕＸｉａｎＹ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂａｓｅｄｓｅｒｏｌｏｉｃａｌｇ，，，Ｑ，ｙｇｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＣｕｃｕｍｂｅｒｇｒｅｅｎｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓＪ．Ｖｉｒｏｌｏ［］ｇｙＪｏｕｒｎａｌ２０１１８１：２２８．，，（）．ｉｉｈＭｌｌＳｈｅｉｄｅｋｅＤｒｌｉｎｂｌｄＣ８９ＳｍｒｎｏｖａＥＦｒｔＡＥｉｅｒＷＡｃｃｒＢａｕｔＶＲｅｏ，，，，，，ｄ－ＲａｋｏｔｏｎｒａｆａｒａＡＭＣｈｕｎＢＹＺｉｅｌｅｒＧｒａｆｆＶｉｖｅｆｌｌ．Ｄｓｃｏｒｏａｓｍａ，ｇ，ｇｙ－－ｄｖｎｏｎＡＵＧｉｈｉｉｄｆｏｉｎｉｔｉａｔｅｄＯＲＦｉｎＰｏｌｅｒｏｖｉｍｓｅｓａｎＬｕｔｅｏｒｕｓｅｓｔａｔｓｒｅｑｕｒｅｒ－．ｌｏｎｄｉｓｔａｎｃｅｍｏｖｅｍｅｎｔＪ．ＰｌｏｓＰａｔｈｏｅｎｓ２０１５１１５：ｅｌ０Ｏ４８６８ｇ，，［］ｇ（）－Ｍａｒａｉｂｉｆａｒ９０．ＳｖａｎｅｌｌａＤｕｍａｓＬＣａｎｄｒｅｓｓｅＴＨｕｌｌｅＭｉｓＡ．ＤｉｓｔｒｕｔｏｎｏＢｌｅ，，，ｙｅ－－ｙｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ？ＰＮｉｎｔｈｅＳｕｂＡｎｔａｒｃｔｉｃＫｅｒｇｕｅｌｅｎｉｓｌａｎｄｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｗｏｎｅｗＬｕｔｅｏｖｉｒｕｓｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１３，８（６）：ｅ６７２３１．９１．ＴａｃｋｅＥ，ＰｒＱｆｅｒＤ，ＳｃｈｍｉｔｚＪ，ＲｏｈｄｅＷ．ＴｈｅＰｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓ１７Ｋｔ－－ｒｏｅｉｎｉｓａｓｉｎｌｅｓｔｒａｎｄｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｂｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌｐｇｇｐ［］Ｖ－ｉｒｏｌｏ１９９１７２８２０３５２０３８：．ｇｙ，，（）９２．ＴａｃｋｅＥ，ＳｃｈｍｉｔｚＪ，ＰｒｔｌｆｅｒＤ，ＲｏｈｄｅＷ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃ－ａｃｉｄｂｉｎｄｉｎ１７ｋＤａｈｏｓｈｏｒｏｔｅｉｎｏｆＰｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓａｎｇｐｐｐ－ａｍｈｉａｔｈｉｃａｌｈａｈｅｌｉｘａｓｔｈｅｄｏｍａｉｎｆｏｒｒｏｔｅｉｎ／ｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓＪ．ｐｐｐｐｐ［］－Ｖｉｒｏｌｏ１９９３１９７１：２７４２８２．ｇｙ，，（）８１ 参考文献９３ＴｏｂｉａｓＩＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏ０ＫｉｓｓＢＢｓｏＡＳｎｉｈｕｒＨｏｌｉｓｃｈｕｋＶＳａｌａｎｋｉＫ．，ｖ，，，，，，ｙＰＰａｌｋｏｖｉｃｓＬ．ＣｏｍａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓｐｑｆＷＤＶｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍＨｕｎａｒａｎｄＵｋｒａｉｎｅＪ，ＰｏｌｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ，（）ｇｙ［］ｇｙ２０－１１６０２：１２５１３１．，（）９４．ＴｏｒｒａｎｃｅＬ，ＰｅａｄＭＴ，ＬａｒｋｉｎｓＡＰ，ＢｕｔｃｈｅｒＧＷ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｏｎｏｃｌａｏｎｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏａＵＫｉｓｏｌａｆＢｒｌｅｌｌｄｗａｒｖｉｒｕｓｌＧｌ．．ｔｅｏａｙｅｏｗ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｏｆｅｎｅｒａｙｆＶ－ｉｒｏｌｏｇ１９８６６７３：５４９５５６．ｙ，，（）９５．ＵｅｎｇＰＰ，ＶｉｎｃｅｎｔＪＲ，ＫａｗａｔａＥＥ，ＬｅｉＣＨ，ＬｉｓｔｅｒＲＭ，ＬａｒｋｉｎｓＢＡ．－－ＮｌｅｏｔｉｄｅｓｅｅｎｃｅａｎａｕｃｑｕｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｎｏｍｅｓｏｆｔｈｅＭＡＶＰＳ１ａｎｄＰＰＡＶｉｓｏｌａｔｅｓｇｏｆＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓＪ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９２７３２：ｙｙｆ［，，］ｇｙ（）４８７－４９２．－９６．ＶａｃｋｅＪ．ＷｈｅａｔｄｗａｒｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅＪ．ＢｉｏｌｏｉａＰｌａｎｔａｒｕｍ１９６１３３：２２８２３３．ｆ，，（［］ｇ）９７．ＶｉｎｃｅｎｔＪＲ，ＬｉｓｔｅｒＲＭ，ＬａｒｋｉｎｓＢＡ．Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｇｅｎｏｍｉｃ－ｏｒａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＮＹＲＰＶｉｓｏｌａｔｅｏｆＢａｒｌｅｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｇｙｆ［］Ｇ－ｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ１９９１７２１０：２３４７２３５５．，ｇｙ，（）９８．ＷａｎｇＭＢ，ＣｈｅｎｇＺ，ＫｅｅｓｅＰ，ＧｒａｈａｍＭＷ，ＬａｒｋｉｎＰＪ，ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｇｅｎｅｓｅｕｅｎｃｅｓｏｆＡｕｓｔｒａｌｉａｎＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＡｍｅｒｉｃａｎｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＢａｒｅｌｅｌｌｏｗｄｗａｒｑ，，ｙｙｆｖｉｒｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｂＲｈｏｐａｌｏｓｉｈｕｍａｄｉＪ．ＡｒｃｈｉｖｅｓｏｆＶｉｒｏｌｏ１９９８１４３５：ｕｓｙｐ，，ｐ［］ｇｙ（）－１００５１０１３．９９．ＷａｎＹＭａｏｉｕＷＭａｒＴＷｅｉＴＬｉｕＹＷａｎＸ．Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｇ，Ｑ，Ｌ，，，，ｇｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｉｔｓｖｅｃｔｏｒｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ，ＰｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘａｌｉｅｎｕｓＪｈ－［．Ｐｔｏａｔｈｏｌｏ，２０１４１０４８：８９７９０４．］ｙｐｇｙ，（）１００．ＷａｔｓｏｎＭＡ，ＭｕｌｌｉｇａｎＴＥ．ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｗｏＢａｒｌｅｙｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｅｓｉｎｌａｓｓｈｏｕｓｅａｎｄｆｉｅｌｄｅｘｅｒｉｍｅｎｔｓＪ．ＡｎｎａｌｓｏｆＡｌｉｅｄＢｉｏｌｏＩ９６０４８３：ｇｐ［］ｐｐｇｙ，，（）５５９－５７４．１０１．ＷｅｉｎｅｒＬＭ．ＦｕｌｌｙｈｕｍａｎｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓＪ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ，［］ｐｙ２００６２９－１：１９．，（）ｕＢ－１０２ＳｃｈｕｂｅｒＨｋｕｆｉＡｌａｎｌｌｌ．ＷＳｈａｎＸｔＪａｂｅＥｅｎａＳＦＷＸ．Ｇｏｂａｓｃａｅ，ｇ，，，，ｇｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｎｏｍｉｃｓｅｕｅｎｃｅｓｒｅｖｅａｌｓｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｔｔｅｒｎｇｑｐａｎｄｃｏｅｖｏ－ｌｕｔｉｏｎｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｃｅｒｅａｌｉｎｆｅｃｔｉｎｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓＪ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｇｇ［］Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５５：８１５３．，１０３．ＷｕＪ，ＭｅｎｇＣ，ＳｈａｎｇＨ，ＲｏｎｇＳ，ＺｈａｎｇＣ，ＨｏｎｇＪ，ＺｈｏｕＸ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－－ａｎｂｌ－ｔｉｂｏｄｙａｓｅｄｔｒｉｅａｎｔｉｂｏｄｓａｎｄｗｉｃｈｅｎｚｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｐｙｙｙｄｕｒｅｒｅｖｅｒ－ａｎｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｆｏｒＯｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２０１１１７１１４０－４５．：，（）１０４ｕｕＨｎｏｃｌｏｎａｌａｎ－．ＪＮｉＹＬＤｉｎｈｏｕｉｂｂａｄｓｅｒｏｌｏｌＷｉ，ＭＺＸ．Ｍｏｔｏｄｙｓｅｉｃａ，，ｇ，ｇ８２ 浙江大学硕士学位论文－－ａｓｓａｓａｎｄｉｍｍｕｎｏｃａｐｔｕｒｅＲＴＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎＲｉｃｅｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｆｉｅｌｄｒｉｃｅｙｇｌａｎｔｓａｎｄｌｅａｆｈｏｅｒｖｅｃｔｏｒｓＪ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２０１４１９５１：ｐｐｐ［，，］ｇ（）－１３４１４０．ｌ〇５．ＷｕＪ，ＮｉＹ，ＬｉｕＨ，ＲａｏＬ，ＺｈｏｕＹＺｈｏｕＸ．Ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔａｎｄｕｓｅｏｆｔｈｒｅｅ，ｐ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＲｉｃｅｂｌａｃｋｓｔｒｅａｋｅｄｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｉｎｆｉｅｌｄｌａｎｔｓａｎｄｌａｎｔｈｏｅｒｖｅｃｔｏｒｓ．．ＪＶｉｒｏｌｏＪｏｕｒｎａｌ２０１３１０１：１１４．，，ｐｐｐｐ［］ｇｙ（）１０６．ＸｉａＺＣａｏＲＳｕｎＫＨｕａＺ．ＴｈｅｍｏｖｅｍｅｎｔｒｏｔｅｉｎｏｆＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒ，，，ｐｙｙｆ－ｖｉｒｕｓ￣ＧＰＮｆｒａｃｄｆｏｒｍｈｖｓｅｌｉｎｔｅｔｓａｎｓｏｍｏｄｉｍｅｒｓｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｉｖｏＪ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ［］－ｏｆＶｉｒｏｌｏ２０１２１５７７２３３１２３：１９．ｇｙ，，）（１０７．ＸｉａＺＹａｎＷＤｕＺＬｉＪＺｈａｏＲａｎＤ．Ａｏｔｅｎｔｉａｌｎｕｃｌｅａｒ，，，，，Ｗｇｐ－ｄｏｍａ－ｅｎｖｅｉｎｄｈｂｄｌｉｄｉｆｄｌｏｐｅｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎａｎａｒｉｎｉｎｅｒｉｃＲＮＡｉｎｉｎｅｅｍｅｎｔｅｎｔｉｅｇｇｉｎｔｈｅｕｔａｔｉｖｅｍｏｖｅｍｅｎｔｒｏｔｅｉｎｏｆｈＧｆＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｓｔｅＡＶｓｔｒａｉｎｏｙｖｉｒｕｐｐｙｆ－Ｊｌｏ２００８３５．．ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＰｌａｎｔＢｉｏ１：４０５０，，［］ｇｙ（）１０８．ＸｉｅＪＷａｎＸＬｉｕＹＰｅｎＹＺｈｏｕＧ．ＦｉｒｓｔｒｅｏｒｔｏｆｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆＷｈｅａｔ，ｇ，，ｇ，ｐｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｈｉｎ．ｌ９ｉｎｗｈｅａｔｉｎＣａ［Ｊ］ＰａｎｔＤｉｓｅａｓｅ２００７１１：１１１．，，（）１０９．ＹｅＲ，ＸｕＬ，ＧａｏＺＺ，ＹａｎｇＪＰ，ＣｈｅｎＪ，ＣｈｅｎＪＰ，ＡｄａｍｓＪ，ＹｕＳＱ．Ｕｓｅｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｆｏｒｔｈｅｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｗｈｅａｔａｎｄｏａｔ－ＦｕｒｏｖｉｒｕｓｅｓＪｌＰｈｔｔｌ２０００１４８５２５７２６２［］．Ｊｏｕｒｎａｏｆｏａｈｏｏ：．ｙｐｇｙ，，（）１ｌＯ．ＺｈａｎｇＸ，ＺｈｏｕＧ，ＷａｎｇＸ．ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ（ＷＤＶ）ｉｎｗｈｅａｔａｎｄ－ｖｅｃｔｏｒｌｅａｆｈｏｅｒＰｓａｍｍｏｔｅｔｔｉｘａｌｉｅｎｕｓＤａｈｌｂ．ｂｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｐｐ（）ｙ［］－Ｖｉｒｏｌｈｏｄ６９２．ｌｏｉｃａＭｅｔｓ２０１０１：４１６４１９ｇ，，（）１１１Ｗｔ－ＺｈＫｉ．Ｒｅｖｅｒｉｔｉｌｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｌ．ａｏＬｕＹａｎｒｓｅｒａｎｓｃｏｎｏｏｍｅｄｅｒｍａ，，ｇＸｐｐａｍｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＢａｒｌｅｙｅｌｌｏｗｄｗａｒｖｉｒｕｓｅｓｉｎＣｈｉｎａＪ．ｐｙｆ［］Ｊ－ｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｒｏｌｏｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ２０１０１６９１：２１１２１４．，ｇ，（）－Ｍｕ１１２ＺｉｌＧＶＢｌｔＶｔｔｅｒｅｒＪＤＳｉｍｏｎｉＭＴＨｅｒｒｂａｃｈＥＧｕｉｌｌＨ．ｅｅｒｒａｆｆｒａｕ，，ｓ，，ｅ，ｇ，ｙＲｉｃｈａｒｄｓＫＥ，ＪｏｎａｒｄＧ．ＴｈｅｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｏｆＢｅｅｔｗｅｓｔｅｒｎｙｅｌｌｏｗｓｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓｉｓｅｓｓｅｎｔｉａｌｆｏｒｓｙｓｔｅｍｉｃｉｎｆｅｃｔｉｏｎｂｕｔｔｈｅｖｉｒａｌｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓＰ２９ａｎｄＰ１９ａｒｅｍ．ｄｉｓｅｎｓａｂｔｉｉｔｉｏｈｉｄｔｉｉｏｎＪＭｏｌｌｐｌｅｆｏｒｓｙｓｅｍｃｎｆｅｃｎａｎｄａｐｒａｎｓｓｓ［］ｅｃｕａｒ－Ｍ－ＰｌａｎｔｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ１９９６，９６：５０１５１０．，（）１１３．．蔡文启，田，电融合产生黄，王荣，覃秉益，马顺福波，张成良陈京，季良－Ｊ．９８９２９０６．瓜花叶病毒的单克隆抗体：４４４４５１［］微生物学报，１，（）１１４．．田曹洁，杨翠云，潘卫，于翠，戚中，代光辉番茄环斑病毒单克隆抗体的制－Ｊ．备［．２００７２３０３：３５３７，，］微生物学杂志（）１１５王树琴．番茄环斑病毒单克隆抗体细胞株的．陈京，张成良，宋淑敏，，胡伟贞Ｊ－建立及检测方法的研究［．植物检疫９４８０１：１３．，１９，］（）１１６．人源抗发热伴血小板．陈素华孙丽娜刘洋，李川，刘林梁米芳，仇佩虹，，，－Ｇｎ蛋白重组抗体的研究Ｊ减少综合征布尼亚病毒．病毒学报２０１５０１：，，［］（）２４－２９．８３ 参考文献１１７．陈浙，宋革，周雪平，吴建祥．西瓜花叶病毒（ＷＭＶ）单克隆抗体的制备及其－Ｊ．２０１６４９１４应用［中国农业科学：２７１１２７２４．，，］（）１１８．稻麦重要病毒病株系鉴定和防控技术体系研究课题组．稻麦主要病毒病识别Ｍ．与控制．中国农业出版社２０１１，［］１１９．董静云．水稻条纹病毒病程相关蛋白ＳＰ寄主互作因子的分离鉴定及水稻齿叶矮缩病毒单克隆抗体的制备和应用［Ｄ．２０１２．］浙江大学，１２０．谷登峰，陈文彬，伊来提，龚成润，康良仪，邱并生，张秀华，田波，陈京，张成良．抗黄瓜花叶病毒单克隆抗体细胞株的建立及其抗体鉴定［Ｊ］．微生物学报，１卯７，２７（〇２）：１２８］３３．－１２１．郭景荣．ＳＭＶＭｃＡｂＪ．，陈永萱大豆花叶病毒单克隆抗体（）的研究［］植物９９０２００２－病理学报：５３５５．，１，（）１２２．郭军，肖小文，蔡少华，路文长，刘诩平，徐惠迪．分泌抗马铃薯Ｙ病毒单克隆抗体的大鼠杂交瘤细胞系的建立及抗体稳定性测定［Ｊ］．生物工程学报，９９０－１６０３．：２３０２３５，（）１２３．郭素华．Ｊ．，关兵，杜强根，张鹤龄抗马铃薯Ｘ病毒单克隆抗体的制备［］内９９０２－蒙古大学学报（自然科学版），１，１０４：５７８５８１．（）２４１．郭素华，周岚，孟清，张鹤龄．马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备［Ｊ］．中国－９９１６０４．病毒学：３５０３５５，１，（）１２５．．郭向东．小麦病毒病的发生规律及防治对策［Ｊ河北农业科技９９１１０：］，１，（）１９．１２６－．．Ｊ何忠效浅谈单克隆抗体［．生物学通报２００４３９０９：１４．］，，（）１２７．．吉栩ｎｓ６的，魏春红，李毅水稻矮缩病毒非结构蛋白Ｐ表达及其单克隆抗体－Ｊ．的特异性分析［中国科学（Ｃ辑：生命科学）２００９３９０８：７６１７６７．，，］（）１２８．金文．ＳＨ，张金良，刘艳，王锡锋小麦矮缩病毒ＮＡ快速检测方法的建立及Ｊ２０－应用［．１５４１０３：１００１０３．］植物保护，，（）１２９．．李大伟我国植物病毒学的研究现状及发展策略Ｊ．植物保护２０１０３６２：，，［］（）５－８．１３０．．李桂芬，曹振，马杰，李明福，陈笑瑜，丁建云，李娜黄瓜绿斑驳花叶病毒－单克隆抗体的研制［Ｊ］？植物保护２００９３５０６：４０４２．，，（）１３１．李桂芬洁生．Ｊ．，马，魏梅，朱水芳番茄环斑病毒单克隆抗体的制备及检测［］２００９２３０６－植物检疫：１６１８．，，（）１３２．李桂芬．，马洁，张永江，魏梅生，朱水芳玉米褪绿斑驳病毒抗体及＇－－ＴＡＳＥＬＩＳＡＪ．０１４２４０６．试剂盒的研制：４２４５［］检验检疫学刊，２，（）１３３．李桂芬．，马洁，朱水芳，魏梅生，梁新苗，于翠南芥菜花叶病毒单克隆抗体的研制及检测应用Ｊ２０１２５０６－［．１：１８２０．］植物检疫，，（）１３４．李华平胡晋生范怀忠．黄瓜花叶病毒的株系鉴定研究进展Ｊ．，，［］中国病毒９９４９０３１８７－１９４学．，１，（）：１３５１９９９．．李晋梅．年晋南小麦黄矮病流行原因与防治对策［Ｊ农业科技通讯，］８４ 浙江大学硕士学位论文１９９９１０３１：．，（）１３６．．ＢＹＤＶＪ．李经略主范围的研究［中国农，赵玉霞，赵君东小麦黄矮病（）寄］－业科学１９８５１８０６：７１３．，，（）１３７．李娜．大麦黄矮病毒ＧＡＶ株系和小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及其应Ｄ２０１５．用［］．浙江大学，－１３８ＧＰＶ株系ＢＹＤＶＧＰＶＯＲＦ４基因的原核表达及抗血．李永丽．大麦黄矮病毒（）Ｄ２００４．清的制备［］．河南农业大学，３９琦．西瓜１．梁新苗，李桂芬，马洁，邓丛良，边勇，张永江，李建光，骆卫峰，周－ＴＡＳＥＬＩＳＡ试剂盒的研制Ｊ．植物检疫０１３花叶病毒单克隆抗体及［，２，］２７０２５３－５６：．（）１４０．林壁润杰欧阳明辉范怀忠．番木瓜环斑病毒单克隆抗体的制备及，李英，，Ｊ－在病毒分型上的初步应用．病毒学杂志１９８９，４０２：１７２１７５．［］，（）１４１．．ＲＳＶ测试剂盒研制与应用［Ｄ］．扬州大学刘海建水稻条纹病毒（）免疫检，２００５．４２．．１刘欢南方水稻黑条矮缩病毒和中国小麦花叶病毒单克隆抗体的制备及其应用［Ｄ］．２０１３．浙江大学，１４３．．刘欢，任春梅，程兆榜，吴建样中国小麦花叶病毒（ＣＷＭＶ），李娜，周雪平单克隆抗体制备及其检测应用Ｊ．农业生物技术学报，２０１５，２３０６：［］（）７－１１７１９．１４４．刘欢倪跃群，饶黎霞，吴建祥，周雪平．南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条，－Ｊ．２０１３４３０１．植物病理学报：２７３４矮缩病毒的单抗制备及其检测应用］，，（）［１４５混作区麦蚜与黄矮病发生关系研究Ｄ．２０１５．．刘楠．青海省冬春麦［］青海大学，４６生情况调查Ｊ．江１．刘楠，闰佳会，姚强，郭青云．青海省麦类黄矮病发［］苏农２０１６４４２－业科学：１５４１５８．，，（）．Ｊ．１４７．刘萍陈苗苗刘学荣中国畜，牟克斌，黄银君单克隆抗体研究进展［］，，２０－１２３９０１：６７７０．枚兽医，，（）“”？１４８１５０．八五．刘秀梵当代科技重要著作农业领域国家重点图书单克隆抗．９９４体在农业上的应用［Ｍ］安徽科学技术出版社．，１１４９．刘栩平路文长，林宝详，卢和英，齐秀菊，李省印，李经略，赵椎雅，王洪，ＴｕＭＶ久．株系分化研，王翠花我国十省（市）十字花科蔬菜芜菁花叶病毒（）－究Ｊ．？病毒学杂志１９９０５０１：８２８７，，［］（）－１５０．刘艳，王锡锋，周广和．ＢＹＤＶＧＰＶ与ＧＡＶ混合侵染蚜传专化性研究：中国植２００４．物病理学会年学术年会论文集［Ｃ］北京：中国农业科学技术出版社，２００４．１５１．刘艳，王锡锋，周广和．大麦黄矮病毒ＧＰＶ与ＧＡＶ株系间异源装配现象的初－Ｊ．步研究［．植物病理学报２００５３５６：４３４６，，］（）１５２．刘震．柑橘衰退病毒和柑橘黄化脉明病毒单克隆抗体的制备及其应用［Ｄ］．浙江大学，２０１６．８５ 参考文献１５３．刘志昕蔡祝南崔星明．ＢＮＹＶＶ，，，刘仪甜菜坏死黄脉病毒（）单克隆抗体研制［Ｊ］．植物病理学报，１９９０２００４：２９２．，（）１５４．吕琦，吴峰，林洁，谭仲夏，秦西云，夏振远莫笑晗，马岚．烟草花叶病毒，单克隆抗体的制备和鉴定［Ｊ．云２０１３３５０１：］南大学学报（自然科学版），，（）－９３９８．－１５５．．马洁ＥＬＩＳＡ试剂盒，魏梅生，粟智平，李桂芬李痘病毒单克隆抗体及ＴＡＳＪ２０－的研制［．植１２２６０２：９１２．］物检疫，，（）１５６．孟春梅吴建祥谢礼郑锦凯周雪平．建兰花叶病毒单克隆抗体的，，，，洪健，Ｊ－制备及检测应用［．２００７４７５９２８９３１．］微生物学报，：，（）１５７．．苗洪芹Ｊ．，李秀明河北省春小麦黄矮病的主要介体和病毒株系研究［］植物９８２５３－保护学报：２２７２３０．，１９，（）１５８．倪跃群．水稻矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒单克隆抗体的制备及其应用［Ｄ］．２０１３浙江大学．，９．１５．庞俊兰利用ＲＮＡｉ介导抗ＢＹＤＶ和ＷＤＶ小麦新种质的研究［Ｄ］．中国农业科学院２０１２．，１６０．．钱幼亭Ｊ，周广和麦类种质资源抗耐小麦黄矮病毒的田间鉴定技术研究［］．９８６－植物保护学报，１，１３（３：１５９１６４．）１６１．青玲，吴建祥，戚益军，周雪平，李德葆．蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体制备及检Ｊ２０００４００２－测应用．微生：５４６１．［］物学报，，（）１６２２００４１９０３．邱并生？Ｊ．：，王敏植物病毒学的研究进展［］中国病毒学，，（）０３－１１０６．－１６３．Ｊ１９７３０５：２２２７．裘维藩麦类病毒病的几个问题［］．甘肃农业科技，．，（）１６４向辉．小麦种质资源及品种对小麦黄矮病的抗性鉴定研究Ｄ．任［］．西北农林００９科技大学．，２１６５．尚海丽．番茄黄化曲叶病毒和黄瓜绿斑驳花叶病毒单克隆抗体的制备及其检Ｄ．２０１１测应用．［］浙江大学，１６６．尚晓楠．小麦矮缩病毒实时荧光定量ＰＣＲ体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用［Ｄ］．中国农业科学院２０１５，．１６７．施曼玲，吴建祥，郭维，周雪平．芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应Ｊ－用［．徽生物学报００４４４２：１８５１８８．］，２，（）６８Ｓ１．宋革．马铃薯病毒和马铃薯Ｙ病毒单克隆抗体的制备及应用［Ｄ］．浙江大学，２０１６．１６９．宋革郭玉双饶黎霞雪平．，，，周，吴建祥马铃薯Ｙ病毒单克隆抗体的制备及Ｊ－其检测应用［．浙江大学学报（农业与生命科学版）２０１６４２０５］：５１７５２６．，，（）１７０．宋淑敏，张成良，阚晓枫，陈京，胡伟贞，张作芳，由雪娟．南方菜豆花叶病－毒单克隆抗体的初步研究［Ｊ］．病毒学报１９９１７０２：１７６１７９．，，（）１７１．宋西娇．柑橘碎叶病毒和香蕉束顶病毒单克隆抗体的制备及其检测应用Ｄ．［］浙江大学，２０１４．８６ 浙江大学硕士学位论文１７２．ＢＢＴＶ．宋西娇刘欢，周雪平洪健吴舒艾吴建祥，，，，单克隆抗体的制备及Ｊ－其检测应用［．农业生物技术学报６２４２：２８８２９４．］，２０１，（）１７３．孙茂林．，和春育，庄俊英，王宪焘，陈利，李迅东，唐恩华香蕉束顶病毒单Ｊ９９２０３－克隆抗体的制备及其应用［．西南农业学报５：７５７９．］，１，（）１７４．Ｖ与二Ｄ．陶烨大麦黄矮病毒ＧＡ穂短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究［．西北］２０１６农林科技大学．，１７５．涂正金于善谦．长叶车前花叶病毒上海分离株单克隆抗体的制备及其免疫，－Ｊ８９４０１１０６１０８．学特性［．病毒学杂志］，１９，（）：１７６．．王彩霞柑橘衰遐病毒多克隆和单克隆，王国平，洪霓，姜波，刘辉，吴康为－．生物工程学报２００６２２０４２９．抗体的制备及检测效果分析：６６３４［Ｊ］，，（）．１７７．王江飞，柳树宾，吴蓓蕾，谢家建，王锡锋陕西韩城严重发生的小麦矮缩病Ｊ２００８３４２－病原鉴定与原因分析［：１７２１］？植物保护．，，（）１７８．王亮王锡锋．ＬＮＡ探针实时荧光定量ＰＣＲ检测小麦矮缩病毒体系的，刘艳，－建立Ｊ．植物病理学报２０１６４６０３１：３３３１９．，，（［］）１７９．王锡锋赵中华云峰．我国小麦病毒病害发生现状与趋势，刘艳，韩成资，吴，－分析［Ｊ］．２０１０３６３：１３１９．植物保护，，（）８０．１王锡锋周广和．大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白，２００３４８１５６７１－１６５的确定［Ｊ］．．科学通报：１７，，（）１８１亚娇．小麦矮缩病毒在介体条沙叶蝉体内循回机制的研究Ｄ．．王［］中国农业科学院，２０１３．１８２．．王亚娇小麦矮缩病毒外壳蛋白基因的原核表迗、抗，任堂雨，刘艳，王锡锋－Ｊ．体制备及应用［．植物病理学报２０１３４３４：３６２３６７］，，（）．．１８３王阳与大麦黄矮病毒介体传毒相关的通读蛋白ＯＲＦ５基因的分子变异研究２０１０［Ｄ］．兰州理工大学．，１８４１８６．Ｊ．王志文噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展［］．蚌埤医学院２０－１５４０１：１３１１３３．学报，，（）１８５．温孚江．用ｃＤＮＡ点杂交及ＥＬＩＳＡ测定大麦黄矮病毒及分子间互作［Ｊ．山］－东农业大学学报１９９４２５０２：１５１１５７．，，（）８６．．１吴建祥四种植物病毒单克隆抗体和传染性法氏囊病病毒疫苗研制及应用［Ｄ］？浙江大学，２〇０８．１８７．．吴建祥，叶美琴百合无症病毒单克隆抗体的制备及，刘成科，洪健，刘文洪Ｊ２００５４５０４－：５８０５８３．检测应用［］．微生物学报，，（）１８８．吴建祥，青玲，周雪平，陈正贤，李德葆．蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体研制ｍ．浙江农业大学学报１９９９２５０２－：３９４２．，，（）１８９．吴建祥．香，王贵珍，洪健，张仲凯，周雪乎石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备－３２６２００５３５４．及检测应用［Ｊ］．植物病理学报：３２２，，（）１９０．２０１３．吴晓雁．苹果茎沟病毒单克隆抗体的制备与应用［Ｄ］华中农业大学．，１９１．Ｊ业．吴云峰蚜虫与病毒间相互作用及循回传毒［．世界农，，魏宁生，周广和］８７ 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浙江大学硕士学位论文４－１０９２６６３２６６９．（）：２０９．张成良，张作芳，阙晓枫，陈京，胡伟贞，宋淑敏，陆家珏，孙月英，陈伯权，田原决定簇及其抗原型的分析波．，季良应用单克隆抗体对烟草花叶毒病抗－研究Ｊ？，１９８６，１０２：３２３７．［］病毒学杂志（）２１０田波秀华谷登峰．张成良，陈京，宋淑敏，胡伟贞，，张，，孙，张作芳，阙晓枫月英，吴美英，周国芳，王树惠，陈伯权．烟草花叶病毒单克隆抗体杂交瘤细－Ｊ．９８５１０２３６胞株的建立［病毒学报：１５１５．］，１，（）２１１．Ｄ．西张华伟．小麦黄矮病品种抗病性鉴定及防治技术研究［］北农林科技大学，２０１４．Ｊ２１２．．大麦条纹花叶病毒单克隆抗体及抗原特性的分析．张菁［］病毒学，于善谦１９９０６０４－报：３４７３５１．，，（）２１３．张淋淋，李小宇，张春雨，尤晴，张正坤，李启云，张俊华，王永志．大豆花３号株系Ｎ、Ｊ．东北农业叶病毒东北ｉｂ蛋白表达纯化及单克隆抗体制备［］－２０１６４１０３．科学：６２６６，，（）２１４．张秦凤，朱象三．小麦黄矮病毒主要株系组成及其变异的研究［Ｊ］．麦类作物１９９１３－：４４４６．学报，，（）ｌＤ．２１５．张珣．六种植物病毒ＲｅａＴｉｍｅＰＣＲ定量方法的建立及其应用［］中国农业科学院楦物病理学，２００８．２１６．张永平，李德某，李洗．长叶车前花叶病毒（ＲＭＶ）单克隆抗体的研制及初步－Ｊ？１９８６１２０４：９５９７应用［浙江农业大学学报．］，，（）２１７ＬＡＭＰ检测及其基因沉默抑制子鉴定［Ｄ．中国农业科．赵琨．大麦黄矮病毒］学院，２０１０．２１８．．赵小立，马红，翁醒华，徐阿炳，黄纯农大麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备－Ｊ．３７０５４０１４０４微生物学报１９９７：．，，（）［］２１９．．郑光宇柑桔速衰病毒株系特异性单克隆抗体的制备及其免疫学特，赵荣乐－．性Ｊ．北京师范大学学报（自然科学版）２００５４１０６：６２０６２２］，，（）［一２２０．Ｊ？植．周广和物保护，，陈剑波九八八年大麦黄矮病毒株系监测研究［］－１９９０１６２：２２２３．，（）２２１．４种株系鉴定与应用Ｊ．中国周广和．农业，张淑香，钱幼亭小麦黄矮病毒［］科学，丨９８７，２０〇４：７］２．（）８９ ＇９０ 浙江大学硕士学位论文附录Ａ本论文中所用病毒缩写及中英文对照缩写英文名中文名ＬＳＶＬｉｌｙｓｍｔｏｍＬｅｓｓｖｉｒｕｓ百合无症病毒ｙｐＢＢＷＶＢｒｏａｄｂｅａｎｗｉｌｔｖｉｒｕｓ蚕且萎蔫病毒ＳＭＶＳｏｙｂｅａｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ大丑花吟病毒ＢＹＤＶＢａｒｌｅｅｌｌｏｗｄｗａｒｆｖｉｒｕｓｙｙ大麦黄矮病毒ＢａＹＭＶＢａｒｌｅｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ大麦黄花叶病毒ｙＢＳＭＶＢａｒｌｅｓｒｉｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｙｔｐ大麦条纹花叶病毒ＰＲＳＶＰａｐａｙａｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ番木瓜环斑病毒ＴＳＷＶＴｏｍａｔｏｓｐｏｔｔｅｄｗｉｌｔｖｉｒｕｓ番燕斑萎病毒ＴｏＭＶＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ番东花叶病毒ＴｏＲＳＶＴｏｍａｔｏｒｉｎｇｓｐｏｔＶｉｒｕｓ番东环斑病毒ＴＹＬＣＶＴｏｍａｔｏｙｅｌｌｏｗｌｅａｆｃｕｒｌｖｉｒｕｓ番满黄化曲吁病毒ＳＣＭＶＳｕｇａｒｃａｎｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ甘廉花叶病毒ＣＹＶＣＶＣｉｔｒｕｓｅｌｌｏｗｖｅｉｎｃｌｅａｒｉｎｖｉｒｕｓ柑橘黄化脉明病毒ｙｇＣＴＶＣｉｔｒｕｓｔｒｉｓｔｅｚａｖｉｒｕｓ柑橘衰遐病毒■ＣＴＬＶＣｉｔｒｕｓｔａｔｔｅｒｌｅａｆｖｉｒｕｓ相橘碎叶病毒ＣＭＶＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ黄瓜花叶病毒ＣＧＭＭＶＣｕｃｕｍｂｅｒｇｒｅｅｎｍｏｔｔｌｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ黄瓜绿斑驳花叶病毒ＣｍＭＶＣｙｍｈｉｄｉｕｍｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ建兰花叶病毒ｙＰＰＶＰｌｕｍｐｏｘｖｉｒｕｓ李瘦病毒ＰＶＳＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＳ马铃薯Ｓ病毒ＰＶＸＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ马铃薯Ｘ病毒ＰＶＹＰｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹ马铃薯Ｙ病毒９１ 附录Ａ本论文中所用病毒缩写及中英文对照ＰＬＲＶＰｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｒｕｓ马铃薯卷叶病毒ＳＢＭＶＳｏｕｔｈｅｒｎｂｅａｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ南方菜豆花叶病毒ＳＳＤＶＳｏｕｈｅｒｎｒｉｃｅｂｌａｃｋ－ｋｅｄＲＢｔｓｔｒｅａｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ南方水稻黑条矮缩病毒ｒａｂｉｉｒｕＡｒＭＶＡｉｓｍｏｓａｃｖｓ南界菜花叶病毒ＡＳＰＶＡｌｅｒｏｉｎｖｉｒｕｓ苹果垄沟病毒ｐｐｓｔｅｍｏｖｇｇＷＤＶＷｈｅａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ小麦矮缩病毒ＲＤＶＲｉｃｅｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ水稻矮缩病毒ＲＲＳＶＲｉｃｅｒａｇｇｅｄｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓ水稻齿叶矮缩病毒ＲＢＳＤＶＲｃｋ－ｒｅａｋｅｗａｒｖｒｉｃｅｂｌａｓｔｄｄｆｉｕｓ水稻黑条矮缩病毒ＲＳＶＲｉｃｅｔｒｉｉｒｕｓ水稻条纹病毒ｓｐｅｖＢＮＹＶＶＢｅｅｔｎｅｃｒｏｔｉｃｅｌｌｏｗｖｅｉｎｖｉｒｕｓ甜菜坏死黄脉病毒ｙＴｕＭＶＴｕｒｎｉｐｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ芜菁花叶病毒ＷＭＶＷａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ西瓜花叶病毒ＢＢＴＶＢａｎａｎａｂｕｎｃｈｙｔｏｐｖｉｒｕｓ香蒸束顶病毒ＣａｒＭＶＣａｒｎａｔｉｏｎｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ香石竹斑驳病毒ＢＤＶＢａｒｌｅｙｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ大麦矮缩病毒ＯＤＶＯａｔｄｗａｒｆｖｉｒｕｓ燕麦矮缩病毒ＷＹＭＶＷｈｅａｔｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ小麦黄花吟病毒ＴＭＶＴｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ烟草花叶病毒ＭＣＭＶＭａｉｚｅｃｈｌｏｒｏｔｉｃｍｏｔｔｌｅｖｉｒｕｓ玉米攝绿斑驳病毒ＲＭＶＲｉｂｇｒａｓｓｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ长叶车前花病毒ＣＷＭＶＣｈｉｎｅｓｅｗｈｅａｔｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ中国小麦花叶病毒９２ 浙江大学硕士学位论文附录Ｂ常用生化及分子生物学试剂与仪器１．常用化学试剂十二烷基硫酸钠ＳＤＳＳｉｍａ进口分装（）ｇ－－Ｐ乙醇ｍｅｒｃａｔｏｅｔｈａｎｏｌＳｉｍａ巯基（Ｐｐ）ｇ三羟曱基氨基曱烷（Ｔｒｉｓ）Ｓａｎｇｏｎ－－ＭＳＡＰａｎｔｉｏｕｓｅＩｇＧｉｇｍａ－－ＭｏｕｓｅＨＲＰａｎｔｉＩｇＧＳｉｇｍａ其它常用化学试剂均为国产分析纯。２．分子生物学试剂多种限制性内切酶ＰｒｏｍｅａｇＴ４ＤＮＡ聚合酶ＰｒｏｍｅｇａＭＤ－ｔＴａＫａＲａｐ１８ＴＶｅｃｏｒＴａｑＤＮＡ聚合酶上海博彩ＮＢＴ和ＢＣＩＰＰｒｏｍｅａｇ硝酸纤维素膜ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔＡＸＹＧＥＮＤＮＡＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＡＸＹＧＥＮ３．仪器超速离心机Ｌ８－８０ＭＢｅｃｋｍａｎ高速离心机Ｊ２－ＨＳＢｅｃｋｍａｎ高速台式离心机５４１７ＣＥｐｐｅｎｄｏｒｆＵＶ－２２０紫外分光光度计１Ｓｈｉｍａｄｚ摇床ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ细胞培养箱Ｒ／ＳＢｉｏｔｅｃｈ超净工作台苏州净化仪器设备厂３７度恒温箱上海福马实验设备有限公司ＪＥＯＬＪＥＭ－－１２００ＥＸ电镜日本电子其它小型仪器均为国产。９３ 附录Ｃ常用缓冲液及培养基配方附录Ｃ常用缓冲液及培养基配方ＣＴＡＢ抽提液ＣＴＡＢ２０ｇ－ＨｌＭＴｒｓＣＩ８．０ｌＯＯｍＬｉ（ｐ）０．．５ＭＥＤＴＡＨ８０４０ｍＬ（ｐ）ＮａＣｌ８２ｇ定容至１Ｌ，高压灭菌，于室温保存。－ＣｌＭＴｒｉｓｌＨ８．０（ｐ）１２１Ｔｒｉｓ碱溶于８００ｍＬ去离子水１Ｈ至，浓ＨＣ调８．０定容至ｇｐ，补去离子水ｌＬ〇０．５ＭＥＤＴＡＨ８．０（ｐ）－３７２２２Ｈ２０４０ｍＬＮＯＨ调Ｈ至８．０．ＥＤＴＡ溶于１水中ａ，ｇ，用固体ｐ补去离子水定容至２００ｍＬ。ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ１０％ＣＴＡＢ０．７ＭＮａＣｌ（，）ＣＴＡＢ２０ｇＮａＣｌ８．２ｇ加入１６０ｍＬ去离子水，加热至６５Ｘ：溶解，补去离子水定容至２００ｍＬ高压，灭菌。ＣＴＡＢ沉淀液（ｐＨ８．０）ＣＴＡＢ１０ｇＭＴ＊ｌｒｉｓＣｌｐＨ８．０５０ｍＬ（）０．５ＭＥＤＴＡＨ８０２０ｍＬ（ｐ．）定容至１Ｌ，高压灭菌。９４ 浙江大学硕士学位论文３ＭＮａＡＣＨ５．２（ｐ）８‘１６２ＮＡＣ３Ｈ２０６０ｍＬＨ至５２．ａ溶于１去离子水中，冰乙酸调．定容至ｇｐ，２００ｍＬ，高压灭菌。０．２ＭＨ７．５ＰＢ缓冲液（ｐ）＊Ｎａ２ＨＰ０４１２Ｈ２０４２．４０ｇ＊２Ｈ２０ＮａＨ２Ｐ０４４．４２ｇ定容至１Ｌ即可。３％磷钨酸负染液磷钨酸（ＰＴＡ）３ｇ用水定容至ｌＯＯｍＬ，ＮａＯＨ调ｐＨ至６．７。完全培养基－２０％新生超级牛血清／ＲＰＭＩ１６４０培养液中含１５，１００ＵｍＬ的青霉素，１００Ｕ／ｍＬ链霉素。ＨＡＴ及ＨＴ选择培养基．／ｍＬ次黄噪ｈｉＨ／ｍＬ胸腺唆完全培养基中含有１３６ｉＨｏｘａｎｔｎｅ、３．８８，ｊｇ（ｙｐ）ｐｇ咬（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，Ｔ）及０．１９（ｉｇ／ｍＬ氣基喋呤（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ，Ａ）。ＥＬＩＳＡ包被液Ｎａ２Ｃ０３１．５９ｇＮａＨＣ０３２．９３ｇ定容至１ＬＨ至９．６。，调ｐＥＬＩＳＡ洗涤液（０．０１ＭＰＢＳＴ）５Ｌ００１ＭＰＢＳ２－．５ｍＬＴｗｅ２０．中加ｅｎ９５ 附录Ｃ常用缓冲液及培养基配方ＥＬＩＳＡ封闭液０．０１ＭＰＢＳＴ中加入脱脂奶粉至终浓度５％碱性磷酸晦底物缓冲液１０％乙二醇铵５０ｍＬ加水至５００ｍＬ，ＨＣ１调ｐＨ至９．８。４ｘ浓缩胶缓冲液Ｔｒｉｓ１２．１１ｇＳＤＳ０．８ｇ．加水溶解，用浓盐酸调ｐＨ至６８，定容至２００ｍＬ。４ｘ分商胶缓冲液Ｔｒｉｓ９０．８３ｇＳＤＳ２ｇ加水溶解，用浓盐酸调ｐＨ至６．８，定容至２００ｍＬ。３０％丙婦酰胺溶液丙烯酰胺８７．６ｇ甲叉双丙烯酰胺２．４ｇ－用水溶解后定容至３００ｍＬ，４Ｃ保存。ｘＴ－５ｒｉｓ甘氟酸缓冲液Ｔｒｉｓ１５．ｌｇ甘氨酸９４ｇ１０％ＳＤＳ５０ｍＬ用水定容至１Ｌ，用时稀释５倍。９６ 浙江大学硕士学位论文Ｗｅｓｔｅｒｎ电转移缓冲液２９甘氨酸．ｇＴｒｉｓ５．８ｇＳＤＳ０＿３７ｇ甲醇２００ｍＬ加水定容至１Ｌ。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ底物缓冲液Ｔｒｉｓ１２．１４ｇＮａＣ．ｌ５８４ｇＭｇＣｂ０．４７５ｇＨＣ１调ｐＨ至９．５，加水至１Ｌ。ＬＢ液体培养基蛋白胨ｌ〇ｇ酵母抽提物５ｇＮａＣｌｌＯｇ加９５０ｍＬ水溶解，用５ＭＮａＯＨ调Ｈ至７．０。定容至１Ｌ，高压灭菌后保存ｐ备用。麦康凯固体培养基毎１Ｌ水中加４８ｇ培养基粉，煮沸溶解后分装三角瓶，高压灭菌后保存备用。５ｘＴＢＥ缓冲液Ｔｒｉｓ５４ｇ硼酸２７．５ｍＬ０．５ＭＥＤＴＡＨ８．０２０ｍＬ（ｐ）用去离子水定容至１Ｌ，用时稀释１０倍。９７ 附录Ｃ常用缓冲液及培养基配方６＿Ａ上样缓冲液溴酚蓝０．２５％二曱苯青ＦＦ０．２５％甘油３０％８Ｍ尿素缓冲液缓冲液Ｂ（ｐＨ８．０：）Ｕｒｅａ８ＭＮａＨＰ〇２４０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ０．０１Ｍ缓冲液Ｃ（ｐＨ６．３）：Ｕｒｅａ８ＭＮａＨ２Ｐ０４０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ０．０１Ｍ缓冲液Ｄ（ｐＨ５．９）：Ｕｒｅａ８ＭＮａＨ２Ｐ０４０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ０．０１Ｍ缓冲液ＥＨ４．Ｓ：（ｐ）Ｕｒｅａ８ＭＮａＨ２Ｐ０４０．１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ０．０１Ｍ９８
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