携带ING4和GMCSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究

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浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究摘要近年来，癌症已成为严重威胁人类的生命和健康的罪魁祸首之一。传统的治疗癌症的方法由于受到各种原因的限制，效果并不理想且副作用明显。随着科学界对癌症治疗的不断探索，肿瘤的生物学疗法显示出了光明的前景。“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略结合了基因治疗和病毒治疗的双重优势，对病毒载体的选择和抑癌基因的治疗效果提出了新的要求。痘苗病毒由于其安全性高,复制快等优点，可以作为理想基因治疗载体。而ING4基因广泛参与肿瘤发生和发展的多个过程，包括增强P53基因的活性，抑制HIF的活性而抑制肿瘤细胞生长。GMCSF即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，是抗肿瘤免疫治疗中重要的细胞因子之一，能通过激活机体主动免疫来增强抗肿瘤的效果。结合病毒治疗和基因治疗的双重优点以及最近研究进展，本研究构思可以痘苗病毒为载体，以双基因为治疗基因构建出安全性好且杀伤效果更为显著的溶瘤痘苗病毒。其主要方法是将ING4-F2A-GMCSF双基因插入到pCB质粒载体TK区。痘苗病毒和质粒通过在细胞内发生同源重组将目的基因插入野生型痘苗病毒Pox基因组中而得到携带目的基因的重组溶瘤痘病毒Onco-ING4-F2A-GMCSF。由于重组的发生的随机性，实验进展的瓶颈期是从混有野毒的病毒中得到重组目的病毒株，经过不断的药物筛选，现已成功构建出携带单基因的溶瘤痘苗病毒,分PoxPox别是Onco-ING4和Onco-GMCSF，通过联合或单独作用初步探讨它们在体外实验中对癌细胞的杀伤效果。本研究经Westernblot检测目的基因的蛋白表达来鉴定病毒，通过细胞感染病毒后形态学观察，MTT、Hoechst33342染色对细胞的存活率进行初步检测，流式细胞术进行定量的凋亡检测，最后通过TUNEL免疫荧光检测病毒是否引起Pox染色体断裂而走向凋亡，结果显示Onco-ING4诱导凋亡的效果最显著，其余两组病毒处理呈现的杀伤效果较弱但均对正常细胞的显示了很好的安全性。由Pox此，可初步得出Onco-ING4可在癌细胞内有效地发挥作用并引起凋亡。鉴于Pox两个基因的作用机制，我们猜想Onco-GMCSF需要在机体内激活免疫系统才能发挥抗肿瘤作用，这为后期重组痘苗病毒的选择以及对后期在体内进一步研究奠定了一定的基础。关键字：ING4；双基因；牛痘病毒；基因治疗；GMCSFI 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究AbstractInrecentyears，carcinomahasbecameoneofthemostseriouskillersthatthreatentohuman’slifeandhealth.Thetraditionaltherapymethodforcarcinomahasalwaysbeenlesseffectiveandmostwithsideeffectforvariouskindsoflimitations.Aswiththeceaselessexplorationofthescientificcommunityforcancertherapy,biologicaltherapyhasindicatedabrightfuture.CancerTargetingGene-Vitro-Therapy(CTGVT)strategycombinesthedualsuperioritiesofgeneandvirustherapiesandrequiresnewdemandsforthechosenofvirusvectorsandthetherapeuticeffectsofthegenes.Oncolyticpoxvirusisanidealcarrierforgenetherapyasitissafe,simpletobeconstructedandetc.ING4intervenemultipleprogressintumourgenesisandprogressionincludingenhancingtheactivityofp53gene,suppressingtheactivityofHIFandinconsequenceinhibitingthegrowthofcancercells;Granulocyte-MacrophageColonyStimulatingFactor(GMCSF),whichisoneofthemostpowerfulimmunoregulationmolecularcurrently,couldenhancetheantitumorabilitybyactivatetheadaptiveimmunizationoftheorganism.Integratingthesuperioritiesofgeneandvirustherapieswiththeresearchstatus，wehypothesizedatypeofoncolyticpoxvirusarmedwithdualgene,whichissafetoorganismwhereaswithremarkablelethalitytocarcinoma..ThemainmethodtoconstructistogetthedualgeneING4-F2A-GMCSFinsertedintotheTKsiteofpCBplasmidvector,thenwiththehomologousrecombinationoftheoncolyticpoxvirusPoxandpCBintheTKsite,wegettheaimvirusOnco-ING4-F2A-GMCSF.However,thereisachokepointintheexperimentthatforthepurposeofgettingtheaimvirus,itrequiresalong-termdrugscreeningfortherecombinationrateisstochasticandthewildpoxvirusisalwaysmixedin.NowwehavesuccessfullyconstructedtwosinglePoxgeneoncolyticpoxviruses,whicharerespectivelyOnco-ING4andPoxOnco-GMCSF.Wehavepreliminaryexploredtheirkillingeffectstocancerouscellsinvitro.Inthisstudy,wedetectedtheproteinexpressiontoidentifytheoncolyticpoxvirusbywesternblotting,ThenmadethemorphologicalobservationafterthecancerousII 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究cellswereinfectedbyseveraloncolyticpoxvirusgroups,singleorcombination.weuseMTTassay,hoechst33342stainingtomakeainitialsurveyforthegrowthinhibitiontocancerouscells;flowcytometryassaytoevaluateamoreaccurateapoptosisstandard;TUNELimmunofluorescencemethodtoprobeiftheapoptosisisinducedviachromosomebreakage.TheresultsindicatethattheapoptosislevelPoxinducedbyOnco-ING4ismostconspicuous.Nevertheless,despitethefigureshandledfromtheresttwogroupsislessremarkable,theyallshowcommendablesafetytonormalcells.Thus,wecouldpreliminarygettheconclusionthatthePox-OncoING4mayinducetheapoptosismoreeffectivelyincancerouscells.ReferringPoxtothefunctionmechanismofthetwogenes,wesupposethattheOnco-GMCSFtendtobetransportedintotheorganismtostimulatetheimmunesystemandexerttheantitumoreffects,withwhichwemaylaidthefoundationfortheselectionofoncolyticpoxvirusesandthatwithsomeearlypromisingresults,weanticipatethatthefurthercombinationexploringinvivowillemergeadelightfulprospect.Keywords：ING4;Dualgenetic;vacciniavirus;GeneTherapy;GMCSFIII 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究缩写词表缩写英文名中文名WR野生型痘苗病毒WesternReserveMOI感染复数MultiplicityofinfectionDμlbecco’sModifiedEagleDMEMDMEM培养基MediumFBS胎牛血清FetalBovineSerumPFU空斑形成单位PlaqueFormingUnit3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,3，4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚四MTT5-Diphenyltetrazolium唑溴化物BromideDMSO二甲基亚砜DimethylSulfoxideinhibitorofgrowthfamilyING4生长抑制因子4member4Granulocyte-MacrophageGMCSF粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子ColonyStimulatingFactorPCR多聚酶链式反应polymerasechainreaction十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝Sodiumdodecylsulfate-polySDS-PAGE胶电泳acrylamidegelelectrophoresisIV 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究目录摘要................................................................................................................................................IAbstract............................................................................................................................................II缩写词表.........................................................................................................................................IV目录...............................................................................................................................................V第一章前言.....................................................................................................................................11.1癌症治疗的现状...............................................................................................................11.1.1癌症的基因治疗.....................................................................................................21.1.2癌症的病毒治疗.....................................................................................................21.2目的病毒构建的相关介绍.................................................................................................31.2.1痘苗病毒的生物学特点.........................................................................................31.2.2建重组痘苗病毒......................................................................................................41.2.3ING4基因................................................................................................................41.2.4GM-CSF基因..........................................................................................................61.2.5口蹄疫病毒（footandmouthvirusdisease,FMDV）2A.....................................71.3实验目的和意义.............................................................................................................8PoxPox第二章重组痘苗病毒Onco-ING4，Onco-GMCSF的构建................................................92.1实验材料............................................................................................................................92.1.1主要工具酶和生化试剂.........................................................................................92.1.2质粒与菌株..............................................................................................................92.1.3主要溶液..................................................................................................................92.1.4细胞株...................................................................................................................102.1.5主要的实验仪器...................................................................................................112.1.6引物.......................................................................................................................122.2实验方法...........................................................................................................................132.2.1分子克隆...............................................................................................................132.2.2重组质粒pCB-ING4的构建...............................................................................142.2.3双基因质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF的构建.....................................................172.3细胞实验部分................................................................................................................212.3.1细胞复苏...............................................................................................................212.3.2细胞传代...............................................................................................................212.3.3细胞冻存...............................................................................................................212.4病毒构建部分................................................................................................................222.4.1病毒与质粒的共转染............................................................................................222.4.2重组病毒株的药物筛选........................................................................................222.4.3重组溶瘤痘苗病毒的单克隆病毒株的挑取........................................................232.4.4病毒基因组的抽提...............................................................................................232.4.5痘苗病毒的PCR鉴定.........................................................................................242.4.6痘苗病毒滴度的测定...........................................................................................242.4.7Westernblot检测溶瘤重组痘苗病毒株蛋白表达...........................................252.5实验结果..........................................................................................................................272.5.1重组质粒pCB-ING4构建的相关结果...............................................................272.5.2重组质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF的构建的相关结果.....................................28PoxPox2.5.3WesternBlot检测溶瘤痘苗病毒Onco-ING4和Onco-GMCSF的蛋白表达V 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究.........................................................................................................................................30PoxPox第三章重组痘苗病毒Onco-ING4、Onco-GMCSF联合对体外对肿瘤细胞的杀伤效应........................................................................................................................................................323.1相关实验方法..................................................................................................................323.1.1MTT法检测细胞毒性.......................................................................................323.1.2凋亡细胞染色实验：Hoechst33342染色..........................................................323.1.3AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡..............................................................323.1.4TUNEL法检测细胞凋亡......................................................................................323.2统计学分析......................................................................................................................343.3实验结果........................................................................................................................343.3.1细胞形态学观察...................................................................................................343.3.2MTT法检测目的病毒的肺癌杀伤能力与安全性评价.......................................363.3.3Hoechst33342染色观察细胞凋亡现象...............................................................373.3.4流式细胞术检测溶瘤痘苗病毒检测细胞凋亡现象...........................................383.3.5TUNEL检测细胞凋亡..........................................................................................403.4讨论..................................................................................................................................423.5展望..................................................................................................................................44参考文献.........................................................................................................................................45致谢..........................................................................................................................................49VI 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究第一章前言1.1癌症治疗的现状世界卫生组织指出，癌症在全球已经成为威胁人类健康的重要杀手，仅次于心血管疾病。在某些国家，癌症甚至已经成为人类头号死亡的原因。目前，全世[1]界每年有700多万人因癌症而失去生命，并且此数据还在持续增长。在当前医疗水平下，有些癌症在早发现，早治疗的情况下，80%可以治愈。但绝大部分癌症，特别是晚期癌症，一直是困扰医学界的重要难题，由此肿瘤的生物治疗应运而生。目前肿瘤的基因治疗在全球范围内不断扩大，其临床试验方案至少有800个，占全部基因治疗实验方案的67%。人们通过不断地探索和研究肿瘤发生的分子机制，发现致瘤是多种因素长期综合作用的结果，而且基因突变理论认为肿瘤的本质也是体内细胞多种基因突变并不断累积的结果。机体免疫力下降，不能及时识别并将已经发生癌变的细胞消灭是肿瘤产生的关键。这为肿瘤治疗的研究提供了新的思路。肿瘤的生物疗法是一种新的研究方向，它是通过改造和纠正机体已经发生突变的基因等生物学方法来激发机体主动免疫，达到从根本上治疗肿瘤的效果。传统的肿瘤治疗方法有手术、化疗和放疗，然易产生副作用而达不到根本治疗的效果，而生物疗法的发现恰好能弥补传统疗法的不足，给肿瘤的治疗带来曙光。目前生物疗法已经得到各界的认可，它对于肿瘤的治疗具有无可比拟的效果。生物治疗的研究方向可从以下几个方面进行阐述：(1)分子靶向治疗：主要是通过单克隆抗体特异性靶向肿瘤致癌位点，使肿瘤细胞死亡，所以分子靶向治疗又被称为“生物导弹”。(2)基因治疗：通过导入外源正常基因，使人体细胞或组织纠正或补偿有缺陷的基因来防治肿瘤。(3)细胞治疗：采用生物工程方法在体外将特定功能的细胞（获自患者体内），进行诱导培养和筛选使之特异性更强之后送回患者体内，增强患者自身的免疫功能，从而直接识别并杀死肿瘤细胞。(4)肿瘤疫苗：通过为患者提供抗原而激活其自身免疫系统而主动清除或抑制肿瘤。1 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究1.1.1癌症的基因治疗目前，肿瘤的生物治疗主要集中在基因治疗和免疫治疗两个大的方向。截止到2007年，对癌症的基因治疗在全世界范围内就已开展了约1000多项的临床[2]试验。2009年，依据基因治疗在肾上腺脑白质营养不良疾病上取得的重大突破，[3]Science杂志将基因治疗评为年度十大科学发现之一。基因治疗于1968年首次被提出，它是一种利用生物工程技术靶向并弥补机体缺失或突变的基因，而达到[4]治疗肿瘤效果的生物高新技术。在国外，有报道称将一种自杀基因系统运用于[5]临床试验，国内也有将其应用于一些癌症的治疗。由此可见，一些抑癌基因或自杀基因等能引起细胞凋亡的基因，都可以通过使用载体携带靶向机体肿瘤，实现治疗效果。目前使用病毒载体携带基因快速靶向并杀死肿瘤已越来越受到关注。1.1.2癌症的病毒治疗继传统的肿瘤治疗外，肿瘤的病毒治疗已经成为另一种极具吸引力的治疗策略。上个世纪，科学家们偶然发现病毒能在一定程度上引起肿瘤细胞失活，于是就开始尝试利用病毒对肿瘤的细胞毒性来治疗肿瘤。1956年，美国最早报道了采用不同血清型的野生型病毒治疗子宫颈癌，半数病人呈现肿瘤被抑制且对机体[5-6]没有明显毒性，而停止治疗后肿瘤又开始生长。可见，通过病毒来治疗肿瘤时，我们应加上其他一些方法加以配合。中国科学院上海生物化学与细胞生物研[7]究所刘院士提出了靶向基因－病毒治疗（TargetingGene-Virottherapy）策略。该治疗策略在体外实验及对荷瘤裸鼠体内实体瘤有显著的杀伤效果，甚至有出现[9]肿瘤全部消退的现象。它主要是对腺病毒基因组进行改造，使其在对正常细胞毒性很小的情况下，特异性靶向肿瘤细胞进行复制增殖，同时表达并发挥治疗基因的作用裂解并杀死癌细胞，具有安全性好、靶向性好和抗癌基因表达量高等优点，为肿瘤治疗开辟了新途径。不过以上的双基因病毒治疗是利用两个单基因病毒联合治疗，我们设想可以利用有效的连接子连接两个抑癌基因，克隆到一个病毒载体上，形成靶向性双基因溶瘤病毒。最近十年来，在肿瘤的生物治疗中常用到的病毒载体有疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等载体。基于痘苗病毒安全性好，基因组容量大，表达效率高，构建简便等优点，最近今年开始受到科学界病毒治疗的关注。痘苗病毒最初始用于治疗的天花的疫苗，可以通过静脉2 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究注射，对人体安全且不会通过空气传播，适合作为一种治疗癌症的新型载体。且目前在国外用此载体在临床上已获得重大进展，例如携带GMSF基因的溶瘤痘苗病毒JX-594在病毒治疗史上首例证实通过静脉注射经血液传递并在系统转移瘤内进行复制，通过多种机制证明了选择性及全身性效果。通过恶性转移瘤病人[8]的临床Ⅰ期和Ⅱ期的的数据强有力证明了其系统性效果。1.2目的病毒构建的相关介绍1.2.1痘苗病毒的生物学特点痘苗病毒是一种双链DNA病毒，是迄今为止发现的最大，最复杂的病毒之一，它是预防天花的疫苗病毒，经过多年的大规模人群接种，天花已被宣布在全球根除。痘苗病毒表达多种蛋白，如DNA和RNA聚合酶、poly(A)聚合酶、各[9-10]种接近真核表达的结构蛋白等肿瘤基因治疗策略不仅仅只是将目的基因引入体内进行长期表达，也包括使用各种病毒和非病毒载体携带外源基因进行短期表达，其治疗机制涉及通过直接恢复缺失或突变的基因或通过调控与此基因有关的上下游信号通路来恢复基因功能，包括阻断与肿瘤生长相关的基因的表达。本课题结合痘苗病毒的各种生物学特点，将其作为靶向治疗载体。该病毒主要有以下特点。[11]①安全：痘苗病毒是唯一能在胞浆内复制的DNA病毒，对人体产生副反应机率极低。②基因组容量大：近2000kb，即使不作缺失处理，在不影响其遗传稳定性的情况下，可在病毒的非必须基因内插入多个外源基因，构建出多价疫苗。表达效率高：在感染正常细胞48h，痘苗病毒就可以培养到很高滴度。④对热稳定：与普通疫苗相比，免去了冷藏的苛刻条件。⑤表达产物近乎天然构型：作为真核表达载体，在表达翻译后能正确的糖基化。⑥转导效率高：通常在感染2h后可使90%以上受感染的细胞表达目的产物。⑦有效的免疫应答：在机体表达的外源抗原连同病毒自身蛋白一起为宿主MHC共递呈，激发体液免疫和细胞免疫，且免疫应答高效持久，一般无需复种。⑧成本低廉：痘苗病毒宿主范围很广，无需繁琐的抗原提纯，无需使用佐剂（可能会产生副作用），直接划痕接种即可。3 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究1.2.2建重组痘苗病毒[11]重组痘苗病毒的构建：利用重组质粒目的基因两端的同源臂与痘苗病毒在细胞内发生同源重组，再根据筛选标记基因的条件加药物筛选出目的病毒。现从以下几个方面介绍（1）由于痘苗病毒RNA聚合酶只识别自身的转录调控序列，表达系统构件时必须选用痘苗病毒的启动子。依据两个启动子在不同时期的表达倾向，旨在激发细胞免疫反应时可选用早期启动子；而旨在获得高表达量时宜选用晚期启动子。（2）痘苗病毒缺乏RNA剪接能力，故要求表达的基因连续开放读框的cDNA，不含内含子序列。（3）为保证外源基因序列的完整表达，在采用早期启动子时需确保不含痘苗病毒含保守的终止序列TTTTTNT。由此构建的重组痘苗载体可用于肿瘤的特异性主动免疫治疗，具有表达高效且对机体安全的特点。1.2.3ING4基因ING4(inhibitorofgrowthfamilymember4)基因是肿瘤抑制因子家族的新成员，最早通过丘脑-脑垂体-肾上腺轴线的断面图基因表达从人类的脑垂体中分离[12]出。在正常组织中表达丰富，但在多种恶性肿瘤组织中，如胶质瘤、乳腺癌、肺癌等中表达明显下调。ING4基因位于12p13.31，由8个外显子和7个内含子组成，人的ING4基因ORF长度为747bp，编码约249个氨基酸残基，具有核定位信号以及C末端[13]高度保守的PHD锌指结构域。图1.1ING4的基因结构[14]Fig.1.1thestructureofING4genePHD结构是磷脂酰肌醇磷酸的核受体功能结构域，它们常常同组蛋白乙酰[15]化转移酶相互作用，使染色体结构发生改变，从而发挥转录调节作用，是某4 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究些与细胞生长有关的信号分子的核受体，这些细胞因子通过与ING蛋白相互作[16]用诱导细胞凋亡。它们与多种生理功能有关，如生长的调节，DNA损伤的修[17]复和细胞凋亡等，PHD结构的变异或者缺失会阻断该蛋白引起的细胞凋亡，[16]并能通过生长抑制因子影响其他基因的表达。ING4是HBO1组蛋白乙酰转移[20]酶（HAT）复合体的天然亚基，能与组蛋白H3K4me3相互作用，还能使组蛋[17]白H4、H5、H8、H12乙酰化，与甲基化的组蛋白H3相互作用。研究发现，ING4上含核定位信号（nuclearlocalizationsignal，NLS），它同核孔复合体的相互作用对于这些蛋白的识别，活化以及有效的核内靶向定位都具[18]有重要的意义。ING4基因在多种肿瘤实验中都表现出很好的治疗效果，在抑制胶质瘤增殖和凋亡的机制方面，大量研究表明ING4在生物体内可以与p300和p53相互作用，增强p53在Lys-382的乙酰化作用。而ING4与组蛋白和p53的相互作用与NLS密切相关。p53基因表达的蛋白能与起特殊作用的转录因子作用，活化p21基因的转录，使细胞停滞于G1期；p53蛋白与复制因子相互作用参与DNA的复制和修复，当修复失败时，p53蛋白能启动凋亡程序诱导细胞[19]凋亡，从而阻止细胞的癌变。最近，Kim等报道了ING4可以抑制由MYCN或MYC引起的接触抑制，同[14,时，ING4位点的敲除已被发现与10-20%人类各种乳腺癌和最原始的乳癌有关20]。通过对活体内U87MG胶质瘤细胞系血管生成的研究发现：ING4可以与NF-KB的p65亚基结合，从而抑制NF-kB的转录活性，引起IL-8表达水平下降，导致肿瘤血管生成减少。Ozer等研究证实ING4能通过募集反应来调节低氧诱导因子（hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1）的活性，能够明显抑制缺氧状态下[21]HIF靶基因（如Nip3、AK3等）的表达。在低氧状态下，HIF-1的上调是促进肿瘤生长的重要因素，所以可以通过抑制HIF的活性来达到治疗肿瘤的目的。Xie等则证实ING4能够增强肝癌细胞株SMMC-7721对抗癌药物顺铂的敏感性，在肝癌细胞中过表达ING4基因可以影响凋亡通路中的重要因子，如Fas、Bcl-2、[22]Bax、caspase-3等，为肝癌的联合治疗策略提供了新的理论依据。由此可见，ING4是一种新的有效抑癌基因，随着对ING4的生物学功能及其对肿瘤的调控机制的不断探索和研究，以ING4为治疗基因的靶向治疗将越来越得到关注。5 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究1.2.4GM-CSF基因GMCSF即粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子是一种分子量为14-22kD的糖蛋白，是发现最早和研究较深入的集落刺激因子之一，也是造血细胞主要生长因子之一，其功能强大且具有广谱效应，主要由T细胞和巨噬细胞产生，并通过旁分泌与自分泌作用，诱导粒细胞与巨噬细胞前体呈集落生长，进而促进巨核细胞生长，辅助调节红细胞生长，刺激骨髓祖细胞增殖和分化以及巨嗜细胞和树突状细胞增殖和成熟；提高粘附分子的表达和单核巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，影响细胞的增殖，分化与凋亡；能增强机体抗肿瘤免疫功能。GM-CSF基因全长2.5Kb，基因定位于第五号染色体长臂5q21-5q31，包含四个外显子，三个内含[23]子，表达受转录和转录后一系列正、负调控元件及多种转录因子的调控。其基因上游一660bp左右的序列中包含一系列潜在可影响GMCSF基因转录的调控元件，如图1.2所示。图1.2ING4的基因结构Fig.1.2thestructureofING4geneGMCSF在增强机体抗肿瘤免疫功能方面显示了良好的应用前景。结合近年来的研究发现，利用生物学方法可以使GMCSF体内发挥显著的抗肿瘤作用:通过病毒或非病毒载体将GMCSF细胞因子基因导入肿瘤细胞后,通过细胞因子能在机体接种局部持续稳定地分泌，逆转T淋巴细胞免疫耐受，促进肿瘤抗原的MHC分子递呈,增强抗肿瘤的体液免疫和细胞免疫。目前认为GMCSF在体内抗肿瘤作用与自然杀伤细胞(NK细胞)在肿瘤部位浸润有关，此外还包括CTL、TIL及LAK等。1994年，GMCSF基因治疗方案已顺利通过了NIHRAC的批准[24]应用于临床。2011年，在病毒治疗史上出现首例通过静脉注射携带GMCSF的溶瘤痘苗病毒JX-594。经血液传递靶向系统转移瘤进行复制并且发挥抑癌效6 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究果。JX-594在细胞内的选择性复制依赖于EGFR-RAS途径，该信号途径普遍在上皮细胞的肿瘤中被激活，也在很多其它癌细胞中通过胸苷激酶上调和一型干扰[28]素下调而被激活。1.2.5口蹄疫病毒（footandmouthvirusdisease,FMDV）2A癌症的发生往往涉及细胞内多种基因的突变，因而其治疗策略常涉及多种外源基因的转运。人们已经认识到多基因要远比单基因治疗有效得多，因此在构建有效的多顺反子工具方面已经做了大量的尝试，如利用一个载体来表达融合蛋白，在一个载体内利用多个启动子来表达多个蛋白，利用细胞内部启动子等，但结果都不是非常理想。传统病毒来源的IRES由于其结构庞大以及下游基因表达水平不高等问题，限制了其在多基因治疗中的广泛应用。本研究采用了一种新的构建多顺反子的策略，即自剪切蛋白FMDV2A，来更好的实现多基因共表达，阻断肿瘤生长相关基因的表达来抑癌作用。口蹄疫病毒（footandmouthvirusdisease,FMDV）是基因治疗中共表达双基因和多基因的最具吸引力的元件，它属小核糖核酸病毒，是一种正链RNA病毒，[29,30]其基因组内含一长的开放读码框，编码一个225kD的多聚蛋白前体。与心病毒（cardiovirs）中发生的“剪切”类似，这个多聚蛋白前体在翻译时由2A在C端进行“剪切”，得到外壳蛋白前体2BC/P3和（PI-2A）。肠道病毒（enterovirus）和鼻病毒（rhinovirus）的2A与其他小核糖核酸病毒不同，在其N端剪切形成P1和2A-P2（图1.3）。比较这几组病毒发现，尽管心病毒2A蛋白（150aa）分子量大小与肠道病毒和鼻病毒的2A蛋白接近，序列上却没有任何同源性。尽管心病毒2A仅在C端高度保守，心病毒2AC端与FMDV2A（18aa）高度相似。FMDV2ARNA序列到目前为止在所有口蹄疫病毒中高度保守。而2BN端第一个氨基酸（-Pro-）[25]和2AC端最后三个氨基酸（-NPG-）则完全保守。研究发现FMDV和心病毒[26]2A是非蛋白酶类。7 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图1.3小核糖核酸病毒蛋白前体的自剪切。Fig1.3Picornavirus‘primary’polyproteincleavages.本课题以F2A为连接子将两个基因合为一个长的开放读码框，ING4-F2A-GMCSF，经过同源重组使其插入痘苗病毒基因组，使其在病毒启动子的控制下得以表达并同时发挥两种基因的治疗效果。1.3实验目的和意义由于肿瘤的发生往往是涉及细胞的基因突变和信号通路异常，传统的治疗方案往往有有一定的局限性，癌细胞可能通过隐藏该靶点或激活别的信号通路进行逃逸。由此，本课题构建了具有协同作用的两个基因构成的靶向性双基因溶瘤痘苗病毒，我们希望其能在发挥治疗基因的作用的同时激活机体的免疫系统对肿瘤进行由系统到局部的全身性治疗，因此本课题旨在构建以F2A为连接子的靶向Pox性双基因溶瘤痘苗病毒Onco-ING4-F2A-GMCSF，希望为肿瘤的病毒基因治疗提供理更理想的方案。8 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究PoxPox第二章重组痘苗病毒Onco-ING4，Onco-GMCSF的构建2.1实验材料2.1.1主要工具酶和生化试剂限制性内切酶HpaⅠ、XbalⅠ，Ligation连接酶，Taq酶、KOD-pLus聚合酶均购自Toyobo公司；T4DNA连接酶,KOD-pLus聚合酶购自TAKARA公司；DNA凝胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自QIAGEN公司；DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)、FBS(胎牛血清)购自GIBCOBRL公司；ING4antibody、GMCSFantibody购自Abcom公司；Effectene®TransfectionReagent试剂盒购自Qiagen公司；TUNELBrightGreenApoptosisDetectionKit购自Biotech公司；β-Actinantibody、ING4antibody、GMCSFantibody、GAPDHantibody购自CellSignalingTechnology公司；野生型痘苗病毒WesternReserve（WR）株获自美国NIH;黄嘌呤、次黄嘌呤、霉酚酸购自上海谱振生物科技有限公司；其它化学试剂上海生工生物工程有限公司、ΜNIPATH公司、杭州汇普化工仪器有限公司和杭州高晶精细化工有限公司。2.1.2质粒与菌株PoxE.coli菌株（DH5α）由本实验室保存。重组痘苗病毒（Onco-GMCSF）由上海中科院生化与细胞所提供。质粒（pCA-ING4、pCB-GMCSF）由上海中科院上海生化与细胞所提供，质粒（pCB）由浙江医学科学院惠赠。2.1.3主要溶液本课题的实验中所需的溶液及其配置方法，如表2.1所示：9 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究表2.1主要实验溶液及其配制方法溶液的种类配制方法LB液体培养基称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl10g，搅拌溶解，用10mol/LNaOH调pH至7.5，定容至1L，高压灭菌锅灭菌2h，4℃保存备用。PBS磷酸缓冲液称8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4，900mL蒸馏水，搅拌溶解，用HCl调pH至7.4，蒸馏水定容至1L琼脂糖凝胶用TAE缓冲液配质量体积比为1%凝胶，微波加热成透明液体，冷却至不烫手时加入储液为100μLmg/mLEB3μL，摇匀，倒入凝胶板中并插好梳子。10%(w/v)十二烷基称50gSDS于450mL双蒸水，搅拌溶解，双蒸水定容硫酸钠(SDS)至1L。1×Tris-甘氨酸电泳称Tris3.0g，甘氨酸14.4g，搅拌溶解，加10%的SDS10缓冲液mL，双蒸水定容1000mL。10%(w/v)过硫酸铵称取0.1mg过硫酸铵于1mL去离子水中充分溶解。(APS)电转缓冲液称3.03gTris-base，14.4g甘氨酸，搅拌溶解，双蒸水定容至800mL，使用前补加200mL的甲醇。封闭液用TBST配成5%（m/V）BSA10%FBSDMEM过滤后的DMEM加二抗配成含100µg/mL链霉素、100U/mL青霉素，使用前补入体积比为10%的FBS。TBS溶液称0.2gKCl，8gNaCl，3gTirs-base，800mL蒸馏水，搅拌溶解，蒸馏水定容1L。高压灭菌。TBST溶液1×TBS加0.05%（V/V）Tween-20。2.1.4细胞株10 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究表2.2细胞株名称细胞类型来源培养条件及性质293A人胚肾细胞株ATCCDMEM+10%FBSSW480人结肠癌细胞株实验室保存DMEM+10%FBSA549人肺癌细胞株实验室保存RPMI1640+10%FBSMRC5人肺成纤维细胞Microbix公司EMEM+10%FBS2.1.5主要的实验仪器本实验中所涉及到的主要实验仪器如表2.3所示：表2.3主要的实验仪器仪器名称公司型号倒置显微镜重庆光仪XDS-1B生物安全柜NUAIRENuaire425-400荧光显微镜奥林巴斯公司BX51T-32H01型荧光倒置显微镜日本奥林巴斯IX71-22FL/PH二氧化碳培养箱德国Heraeus公司BBG16UV151L型红外激光成像系统9201FLICOR公司生化培养箱上海一恒公司LRH-150L凝胶成像仪GeneGeniusGGM/D2稳压稳流电泳仪天能HE-120紫外分光光度仪日本HitachiHITACHIU2800PCR仪美国MJResearchPTC-100型-96型水平电泳槽天能HE-120自动蒸发消毒柜Tomy公司ES-315型超低温冰箱NUAIRENuaire6382E台式低温离心机贺利氏FRESCO酶标仪TECANTECANDNAexport鼓风干燥机上海一恒公司DHG-9203A型电子天平赛多利斯公司BL310型液氮罐ICIDirector400011 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究空气摇床BLUDPARDWSL-100A型TM流式细胞仪FACSAriaBD公司转移仪ELITE200WELTEC公司二氧化碳培养箱BBG16UV151LHeraeus公司纯水系统Millipore公司ZMQS50F01型高速冷冻离心机日本HitachiCF16RX2.1.6引物上海英骏公司合成，引物的工作浓度是10μM。本实验所用的引物如下：2.1.6.1ING4单基因扩增引物序列①ING4-Forward:5'-GCTCTAGAATGGCTGCGGGGATGTATTTGGAAC-3'(XbalI)②ING4-Reverse:5'-TTGCGTTAACCTATTTCTTCTTCCGTTCTTGGGAG-CAGC-3'（HpaI）2.1.6.2ING4-F2A-GMCSF双基因扩增引物序列③GMCSF双基因中间-上游:5′-AAGCAGACTCTAAACTTCGATCTTCTCAAGCTCGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCAATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGC-3′；④GMCSF双基因-下游:5′-TTGCGTTAACTCACTCCTGGACTGGCTCCCAGC-3′（HpaI）⑤ING4双基因-上游:5'-GCTCTAGAATGGCTGCGGGGATGTATTTGGAAC-3'（XbalⅠ）⑥ING4双基因中间-下游:5'-ATCTCCAGCGAGCTTGAGAAGATCGAAGTTTAGAGTCTGCTTTACTGGAGCCCTCTTAGCTCTTTTCTTCTTCCGTTCTTGGGAGCAGC-3′2.1.6.3WR病毒株引物上游：5'-TGTGAAGACGATAAATTAATGATC-3'下游：5'-GTTTGCCATACGCTCACAG-3'12 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究2.2实验方法2.2.1分子克隆本课题用质粒pCB构建所有重组质粒载体。实验技术和方法如下所述。2.2.1.1质粒DNA的小量制备(1)细菌培养12h，取1.5mL12000rpm1min离心，弃上清。(2)加SolutionI200μL，用枪充分吹散细菌。(3)加SolutionII200μL，轻轻上下颠倒混匀4-6次充分裂解菌体，此步不宜超过5min，直到形成透亮蛋清状溶液。(4)加SolutionIII350μL，轻轻上下颠倒混匀8-10次，室温静置2-5min，12000rpm离心10min，弃沉淀。(5)步骤4上清液移到套有收集管的离心柱内，6000rpm室温离心1min，弃废液。(6)加SolutionIV500μL，12000rpm室温离心1min，弃废液。(7)加500μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液。(8)重复步骤7。(9)弃废液，12000rpm空离1min。(10)将离心柱放入新的EP管，离心柱膜中央加65℃预热过的洗脱液50μL-70μL。37℃静置2min。12000rpm室温离心1min，离心管中液体为目的质粒溶液。2.2.1.21%琼脂糖凝胶的配置称取适量琼脂糖，将其溶于1×TAE缓冲液，使其质量体积比为1%，微波炉加热溶解，稍微冷却后加入适当比例的EB，摇匀，即可倒入凝胶板中。2.2.1.3DNA片段电泳及其回收1)将完全凝固后的琼脂糖凝胶放进装有1×TAE缓冲液的电泳槽中，加样孔中中小心点入DNAMarker和PCR或酶切产物，确保样品沉淀至管底，打开电泳仪在160V电泳30min，取出琼脂糖凝胶。2)在紫外灯下找到目的DNA条带。为防止DNA片段碱基发生突变，切含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块时，尽量快速和准确，切下的胶块尽可能薄。胶块放入备用的离心管，称重，并算出琼脂糖凝胶重量。3)加入3倍上述胶块体积量的DR-I缓冲液。颠倒混匀，将此离心管放置在干式13 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究恒温加热器中，设置温度65℃，30min，使其融化。4)冷却后，将混合液转移到干净的离心柱中，静置1-2min。10000rpm离心1min，弃废液。5)在离心柱中加入漂洗液500μL，12000rpm离心1min，弃废液。6)重复步骤5。7)空离2000rpm，1min，取出离心柱，弃废液。8)离心柱中加取事先65℃预热的洗脱缓冲液50μL，室温静置2min。将离心柱转移到新的1.5mL的EP管中并在盖子上做好标记，转移至离心机2000rpm离心1min，弃离心柱。将离心管中的样品溶液进行电泳鉴定。2.2.1.4酶切1)按照所需体系在最佳的Buffer溶液中加入两种限制性酶和约1μg的质粒DNA轻轻混匀。2)在37℃水浴锅中将混合液酶切3h。3)用琼脂糖凝胶电泳或PCR纯化试剂盒来回收酶切后的DNA片段。2.2.1.5连接加1/10的总体积的10×连接Buffer在纯化的酶切产物中，DNA（据插入片段和载体大小及浓度），连接酶（1μL），无菌双蒸水（补加至总体积为20μL）。用枪头吹打均匀，在16℃充分连接16h。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，进入后续试验。2.2.1.6转化1）取连接产物加入到感受态细胞中，轻轻混匀，冰上静置30min。2）42℃水浴热激90s，迅速冰上放置冷却5min。3)加入预热的LB培养基，37℃摇床活化1h。4）4000rpm离心10min，弃上清重悬沉淀。5）均匀涂布与含抗性的平板上，37℃生化培养箱倒置培养。2.2.2重组质粒pCB-ING4的构建2.2.2.1ING4基因扩增ING4基因PCR体系如下：14 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究pCA-ING4质粒1μLKOD-plus-DNA多聚酶1μL10×KODBuffer5μL25mMMgSO44μL2mMdNTPs1μLING4上下游引物各1.5μLPrimer21.5μLDdH2O36μL总体系50μLPCR温度体系为：预变性:95℃5min变性:94℃45s退火:58℃30s32个循环延伸:68℃1.5min终延伸:68℃10min2.2.2.2ING4基因PCR产物与pCB质粒的酶切反应(1)ING4酶切反应体系：ING4基因回收片段40μLXbalⅠ2μLHpaI2μLBuffer4(10×)5μLDdH2O1μL总体系50μL15 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究(2)pCB质粒酶切反应体系如下：pCB质粒40μLXbalⅠ2μLHpaI2μLBuffer4(10×)5μLDdH2O1μL总体系50μL(3)将两个反应体系分别放入37℃水浴锅中酶切过夜，次日早上用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物。2.2.2.3ING4基因与pCB质粒连接连接体系：ING41μLpCB质粒9μLLigation10μL总体系20μL16℃连接过夜后将连接产物转化，涂板，在37℃培养12h，用小枪头挑取阳性单克隆菌落(选择尽可能小的菌落)，加入含氨苄抗性的LB培液内，在摇床扩增10-12h后小抽提取质粒，酶切鉴定。2.2.2.4质粒pCB-ING4的鉴定挑取的单克隆抽提质粒后做如下双酶切鉴定。酶切体系如下：16 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究pCB-ING4质粒10μLXbalⅠ1μLHpaI1μLBuffer4(10×)2μLDdH2O6μL总体系20μL37℃酶切2h，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.2.3双基因质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF的构建通过融合PCR进行构建双基因重组质粒。将连接子F2A设计在引物里，分别以两个基因的第一次PCR产物为模板进行融合PCR，扩增出重组双基因片段，然后将酶切后的双基因与载体连接。2.2.3.1基因扩增(1)第一次PCR1)ING4基因PCR体系如下：pCB-ING4质粒1μLKOD-plus-DNA多聚酶1μL10×KODBuffer5μL25mMMgSO43μL2mMdNTPs5μLING4上游引物1.5μLING4中间下游1.5μLDdH2O30μL总体系50μLPCR温度体系为：17 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究预变性:95℃5min变性:94℃45s退火:58℃30s32个循环延伸:68℃1.5min终延伸:68℃10min2)GMCSF基因PCR的体系如下：pCA-ING4质粒1μLKOD-plus-DNA多聚酶1μL10×KODBuffer5μL25mMMgSO43μL2mMdNTPs5μLGMCSF中间上游引物1.5μLGMCSF下游引物1.5μLddH2O30μL总体系50μLPCR温度体系为：预变性:95℃5min变性:94℃45s退火:55℃30s32个循环延伸:68℃1.5min终延伸:68℃10min用PCR纯化试剂盒分别回收ING4和GMCSF基因，并准备将上述回收的产物作为模板做融合PCR。⑵融合PCR重组PCR的体系如下：18 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究纯化的ING4基因3μL纯化的GMCSF基因3μLKOD-Plus1μL10×KODBuffer5μL25mMMgSO43μL2.5mMdNTP5μLING4上游引物1.5μLGMCSF下游引物1.5μLddH2O27μL总体系50μLPCR温度体系为：预变性:95℃5min变性:94℃45s退火:55℃30s35个循环延伸:68℃2min终延伸:68℃10min反应结束，将所有PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收ING4-F2A-GMCSF基因，片段大小为1266bp。2.2.3.2将融合PCR产物和pCB质粒进行双酶切(1)ING4-F2A-GMCSF片段酶切反应体系如下：ING4-F2A-GMCSF40μLXbalⅠ2μLHpaI2μLBuffer4(10×)5μLddH2O1μL总体系50μL19 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究(2)pCB质粒酶切反应体系如下：pCB30μLXbalⅠ1μLHpaI1μLBuffer4(10×)5μLddH2O3μL总体系50μL将两个反应体系分别放在37℃酶切3h。用PCR纯化试剂盒纯化酶切产物。2.2.3.3ING4-F2A-GMCSF双基因连接到pCB质粒载体上连接体系如下：pCB1μLING4-F2A-GMCSF9μLLigation10μL总体系20μL连接后的转化步骤见2.2.1.62.2.3.4质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF做双酶切鉴定酶切体系如下：pCB-ING4-F2A-GMCSF40μLXbalⅠ1μLHpaI1μLBuffer4(10×)2μLddH2O6μL总体系20μL37℃酶切2h，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。20 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究2.3细胞实验部分2.3.1细胞复苏实验开始前打开水浴锅调至37℃，打开超净台的紫外灯灭菌30min，穿戴白大褂及面罩，从液氮罐中取出冻存的细胞，装入无菌的PE手套，尽快转移至37℃水浴锅，快速的搅动来解冻(通常1~2min)，待管中的细胞液只剩少许冰块，用75%的酒精棉擦拭冻存管外壁（初步灭菌）后转移到超净台；在酒精灯附近打开冻存管；慢慢的用移液管逐滴移至预热过的培养液中；在37℃，5%CO2培养箱培养4h后观察细胞并换液，根据细胞的状态和密度决定传代。2.3.2细胞传代观察细胞状态，细胞密度以及确定无污染；小心吸取并弃培养皿中的培养液；用预热过的PBS清洗单层细胞2次；加入500μL预热过胰酶消化单层细胞，十字形晃动使其覆盖或浸润细胞单层，根据不同细胞消化难易程度估摸消化时间，移去多余的胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞，当细胞间隙变小且漂浮，转移至超净台轻拍培养皿底部使残留的贴壁细胞脱落，加入少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以终止消化。吹打均匀后取出100μL稀释后用于计数；视所需细胞密度在新的培养皿中混入一定体积的细胞和培液，放入37℃，5%CO2培养箱中，按照细胞系的生长特性重复该步骤，培养得到状态良好的细胞株，用于后续实验或冻存。2.3.3细胞冻存实验之前将超净台的紫外打开，培养液，PBS缓冲液，胰酶于37℃水浴锅预热30min。按90%血清、10%DMSO配好冻存液，放在4℃预冷。冻存管做好细胞名称，传代次数和冻存时间的标记。显微镜下观察的细胞状态和密度；移去培养皿中的培养液；用预热过的PBS（冷的PBS易导致脆弱的细胞脱落）清洗单层细胞2次；加入500μL预热过胰酶消化单层细胞，十字形晃动使之覆盖细胞单层，根据不同细胞消化难易程度估摸消化时间，移去多余的胰蛋白酶，在倒置显微镜下观察细胞，当细胞间隙变小，分离且漂浮，轻拍培养皿底部使残留的贴壁细胞脱落；转移至超净台用少量的含新鲜血清的培养液重悬细胞以终止消化。将剩余的细胞8000rpm离心4.5min，弃上清，轻弹离心管底部，小心加入6预冷过的冻存液（使细胞密度约4×10/mL）并重悬细胞，这么做是为了确保较21 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究高的复苏存活率。吸取500μL至1mL细胞悬液转移至相应的的冻存管中。梯度降温后置-80℃冰箱过夜，转置液氮罐中保存。2.4病毒构建部分PoxPox溶瘤痘苗病毒Onco-ING4、Onco-ING4-F2A-GMCSF的包装2.4.1病毒与质粒的共转染62(1)取对数生长期的293A细胞，按5×10cells/孔种在两个6cmdish中，次日分别在2个dish中接种500μL野生型痘苗病毒液。在37℃，5%CO2培养箱中培养感染1.5h。期间每隔15min小心地十字形晃培养皿一次，避免细胞因局部干燥而影响状态。(2)按试剂盒说明书配制转染液。(3)1.5h后，移去dish内的细胞培养液，用3mLPBS小心洗去残余的未吸附的病毒，补加2mL新鲜培养液，然后在每个配好转染液的EP管中分别加2入1mL新鲜细胞培养液，上下颠倒混匀后分别加入铺有细胞的6cmdish。2加入新鲜培养基。将6cmdish放入37℃，5%CO2的细胞培养箱进中行培养。(4)待细胞完全病变，收集各处理组的病毒液于离心管，置于-80℃和室温反复冻融三次。12000rpm离心10min去掉细胞碎片，超净台内收集上清液，转移至-80℃保存。2.4.2重组病毒株的药物筛选(1)筛选原理重组痘苗病毒因为含有gpt基因（黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶基因），经药物筛选后可以通过补偿途径合成鸟嘌呤，使病毒得以正常复制而存活，而野毒因不含改标记基因造成鸟嘌呤缺失而使DNA复制被阻断而难以存活，最终得到重组痘苗病毒。(2)筛选药物稀释：用0.1MNaOH配制配成25μg/mL的霉酚酸，250 μg/mL的黄嘌呤,15 μg/mL的次黄嘌呤，过滤除菌。(3)取出置于-80℃保存的病毒液解冻，在处于对数生长的293A细胞中加入病毒，感染1.5h后，弃上清，在补加的上清中将霉酚酸，黄嘌呤，次黄嘌呤22 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究以1:1:5的比例加入（药物体积不超过体系总体积的5%），进行筛选。.(4)待细胞病变，将残余细胞吹落，将培液转移至无菌的离心管中并做好标记。将离心管于-80℃和室温反复冻融3次。12000rpm离心10min，超净台内收集上清液转移至-80℃保存。2.4.3重组溶瘤痘苗病毒的单克隆病毒株的挑取(1)称取0.25gAgariseL.M.P装至50mL离心管,加入5mLPBS，用报纸包扎瓶口，于高压灭菌锅中灭菌2h。(2)将293A细胞均匀的铺到六孔板中，等细胞的生长汇合至100%，在超净台内将培液移去。将药物筛选过一次的各个病毒液稀释成不同的梯度并分别加1mL至做好标记的六孔板中，期间每隔一段时间晃动培养皿，避免细胞干燥。(3)2h后，将L.M.P放在100℃水浴锅中，使低熔点胶完全溶解，并用75%酒精棉球擦拭外壁消毒，在超净台中加入15mL5%FBS的新鲜培液（37℃预热）并混匀，移去板中的培液，待低熔点胶温度降至37℃，沿着六孔板的内壁轻轻加入孔中，每孔3mL，避免产生气泡，加完将六孔板静置于超净台内30min，待培液凝固再转至细胞培养箱培养。(4)两天后在显微镜下观察，关注病毒噬斑的产生（空斑周边区域的细胞应是完整的），用2.5μL移液枪小心地在显微镜下吸取2.5μL的空斑细胞液，转移至汇合度为80%的293A细胞的培养液中。2.4.4病毒基因组的抽提(1)待细胞完全病变后，吸出150μL到EP管中为病毒基因组提取备用，剩余的转移至无菌离心管内并做好相应标记。同时打开水浴锅，65℃预热洗脱液。(2)分别在各EP管中加TBM溶液300μL混匀，移液枪吹打均匀。再将EP管放入55℃的水浴锅中温热10min；再在EP管中加入4μL的蛋白酶K，混匀，55℃水浴30min。(3)加PB溶液300μL，混匀，12000rpm室温离心5min。(4)将上清液全部转移至干净的离心柱中。8000rmp室温离心1min。(5)弃滤液，在离心柱中加漂洗液600μL，8000rmp室温离心1min。(6)重复步骤5。(7)弃滤液，12000rpm室温空离1min。23 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究(8)离心柱转至新的EP管中，于柱膜中央加30μL的洗脱液，12000rmp室温离心1min。做好标记。-20℃保存。2.4.5痘苗病毒的PCR鉴定提取痘苗病毒基因组，进行PCR鉴定。PCR的反应体系为：基因组模板6μLKOD-plus-DNA多聚酶1μL10×KODBuffer5μL25mMMgSO43μL2mMdNTPs5μLWR-Forward2μLWR-Reverse2μLddH2O30μL总体系50μLPCR温度体系为：预变性:95℃5min变性:94℃45s退火:55℃30s30个循环延伸:68℃1.3min终延伸:68℃10min反应结束后电泳鉴定。2.4.6痘苗病毒滴度的测定(1)对293A细胞消化并计数后等密度接种到6孔板。待细胞完全长满，用于下述实验。(2)将胰蛋白酶与待测痘苗病毒等体积混合。37℃水浴锅温热，每隔5min剧烈震荡数秒，确保病毒团块完全分散。-3-8(3)用含1%FBS的培养液将待测病毒依次作梯度稀释，从10稀释到10。(4)在超净台内，标记好六孔板的稀释度，吸去6孔板内的培养液，PBS洗2遍，24 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究取稀释好的病毒液各0.5mL到6孔板的各个孔里。再将加好病毒的6孔板在37℃，5%CO2细胞培养箱里培养1.5h，期间每15-20min轻轻晃动一次，使病毒均匀吸附到细胞上并防止因局部干燥而影响细胞状态。(5)每孔补加3mL含5%血清的培养液，置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养，隔天观察（一般两天后产生空斑）。(6)吸去各孔的培养液，沿着孔壁小心加入0.5mL的染色液（0.1%结晶紫/20%乙醇），室温染色5min。(7)小心吸去各孔的染色液，此步骤需不能触及底部细胞，动作轻柔以防细胞脱落。-4(8)计算各梯度病毒噬斑数，运用公式算出各孔的病毒滴度。比如在10稀释度45孔内有50个病毒噬斑，则病毒滴度=50×10×2×2=2×10pfu/mL说明：此滴度测定法存在不可避免的误差，为使结果更加真实可靠，可将所需的各病毒在同一批次进行测量，并且做三个重复。2.4.7Westernblot检测溶瘤重组痘苗病毒株蛋白表达2.4.7.1收集样品5A549细胞以4×10cells/孔的密度铺于六孔板，约12h细胞贴壁后每孔分别PoxPox加5MOI的Onco-ING4、Onco-GMCSF，以加PBS组作为空白对照，放在5%CO2，37℃培养箱培养48h后，吸取上清并离心（收集已漂起的细胞），用预冷的PBS洗2次并离心，往六孔板中加入含有100g/mLPMSF（使用前加入）的裂解液100μL，冰上放置30min，期间不间断晃动六孔板，使裂解液均匀覆盖细胞，用枪头或细胞刮刮下裂解后的细胞，收集于对应的EP管中，12000rpm离心10min，收集上清，-20℃保存。2.4.7.2SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳①准备玻璃板：用沾了洗衣粉的抹布洗净后，自来水冲洗数次，去离子水冲洗一次并晾干。②配胶将长短玻璃板垂直加紧，水平卡在制胶架上，根据蛋白的分子量不同而选择配制不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶。先后分别配制分离胶和浓缩胶，注意加入促凝剂后立即将溶液混匀后灌胶，配好浓缩胶后插入梳子，为避免液体25 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究溅出，可倾斜着缓慢插入玻璃板，确定无气泡或赶走气泡后再转为垂直。③电泳待胶凝固，将玻璃板转至电泳槽，加入电泳液，轻轻地垂直向上拔出梳子。根据目的蛋白的大小，选择合适的marker，并用移液枪小心将样品加入上样孔内，100V恒压条件下跑2h。2.4.7.3转膜电泳结束后，小心切下分离胶。裁剪与凝胶大小相同的PVDF膜（先在甲醇中活化10s）和厚滤纸片两张，将其浸入电转缓冲液中平衡10min。由于蛋白质在SDS-PAGE中带负电，在电场中由负极转向处于正极的PVDF膜。半干转膜仪的底座为正极，从底座分别铺上平衡好的滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸。注意在此过程中不能留有气泡。15V恒压电转50min。电转完毕，取下PVDF膜，在右上角剪个小角做为正面（与凝胶接触的那一面）的记号.2.4.7.4封闭封闭的目的是降低一抗的非特异结合概率。常用的封闭液有5%BSA或脱脂奶粉，我们一般用5%脱脂奶粉。在转移结束前配好5%脱脂奶粉(TBST溶解)。转膜结束后将膜放入脱脂奶粉中，室温在摇床进行封闭(一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜)1h。2.4.7.5一抗孵育按抗体说明用现配的5%BSA溶液将抗体进行稀释，稀释好后加入0.01%的叠氮化钠防腐，4℃冰箱保存。封闭结束的PVDF膜先以TBST漂洗三遍，每次洗5-10min，去除残余的脱脂奶粉溶液；将PVDF膜放入盛有一抗溶液的容器中进行孵育（注意确保正面被溶液覆盖），室温孵育2h或4℃孵育过夜。孵育结束后，用TBST在摇床清洗三遍，每遍5min，也可以缩短每次清洗的时间，增加清洗次数，务必将多余的一抗溶液清洗干净。2.4.7..6二抗孵育5%BSA按1:10000的比例稀释二抗原液，4℃避光保存备用；将洗涤干净的PVDF膜转入配好的二抗溶液，避光室温孵育1h。二抗孵育结束，用TBST洗涤三次，每次5min，期间保证PVDF膜避光，也可以增加洗涤次数，减小每次洗涤时间，确保多余二抗被洗涤干净，防止多余的二抗造成扫膜时背景太深。26 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究2.4.7.7扫描将清洗好的PVDF膜放在近红外激光扫描系统上进行扫描，偶联有800nm的激发基团发绿光，偶联有700nm的激发基团发红光。扫描结束按自己的要求调整图片并保存。2.5实验结果2.5.1重组质粒pCB-ING4构建的相关结果2.5.1.1质粒pCA-ING4的PCR结果pCA-ING4质粒获自上海中科院陈勇毅。用ING4-F和ING4-R引物进行PCR扩增，扩增出的ING4基因为750bp大小的条带。琼脂糖凝胶电泳如图2.1所示图2.1ING4基因扩增Fig.2.1ING4geneamplification.LaneM:250bp-ⅠDNALadder;Lane1,2,3,4:ING4genePCRbands2.5.1.2重组质粒pCB-ING4的酶切鉴定将ING4基因连接到质粒载体pCB上后，用XbaI和HpaI两个酶进行双酶切鉴定，应该切出4867bp和750bp的条带，结果如下图2.2所示。27 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图2.2pCB-ING4质粒酶切图Fig.2.2pCB-ING4plasmiddigestedFigureLaneM:MarkerⅣ;Lane1,2,3:digestedING4;Lane4:Plasmiddigested2.5.2重组质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF的构建的相关结果2.5.2.1ING4-F2A-GMCSF融合PCR结果(1)分别对ING4和GMCSF双基因第一次进行PCR，ING4基因全长为747bp（去掉终止子），加上F2A的前半部分总长度为810bp后为，GMCSF基因全厂为435bp，加上F2A后半部分长约为498bp，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，分别会有810bp和498bp的条带，回收（如图2.3）。图2.3ING4和GMCSF基因重组PCR图Fig.2.3ING4andGMCSFgenerecombinantPCRLaneM:Trans5K;Lane1,2:ING4genePCR;Lane3,4:GMCSFgenePCR(2)分别将ING4和GMCSF基因分别用胶回收试剂盒纯化，将回收产物作为模28 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究板，用ING4的上游引物和GMCSF的下游引物进行第二次PCR。结束后进行琼脂糖凝胶电泳，会有大小为1605bp的条带（如图2.4）。M123454500bp3500bp3000bp2000bp1500bp1000bp500bp200bp图2.4ING4-F2A-GMCSF双基因的重组PCRFig.2.4ING4-F2A-GMCSFdoublegenerecombinantPCRLaneM:Trans5K;Lane1,2,3,4，5:ING4-F2A-GMCSFdoublegenePCR2.5.2.2重组质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF的酶切鉴定结果根据重组质粒pCB-ING4-F2A-GMCSF序列，用XbaI和HpaI两个酶进行双酶切鉴定，应该切出4867bp和1266bp的条带，结果如下图2.5所示。图2.5pCB-ING4-F2A-GMCSF质粒酶切图Fig.2.5pCB-ING4-F2A-GMCSFplasmiddigestedLaneM:Trans5K;Lane1:plasmidcontrol;Lane2,3,4,5:negetivecontrol;Lane6:pCB-ING4-F2A-GMCSFplasmiddigested29 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究Pox2.5.2.3重组痘苗病毒的酶切鉴定结果Onco-ING4的PCR鉴定将挑取的单克隆重组噬斑在6孔板小扩，48h观察细胞病变，并提取病变后病毒基因组，做PCR鉴定，结果如图2.6所示。Pox图2.6Onco-ING4PCR鉴定图PoxFig.2.6PCRidentificationofOnco-ING4PoxLaneM:250bp-ⅠDNALadder;Lane1:Positivecontrol;Lane2:Onco-ING4PCR；;Lane3:WRgenePCRPoxPox2.5.3WesternBlot检测溶瘤痘苗病毒Onco-ING4和Onco-GMCSF的蛋白表达PoxPox将含Onco-ING4和Onco-GMCSF重组痘苗病毒分别加到汇合度为80%的A549细胞中。感染24h后，收集蛋白。WesternBlot检测的结果如图2.7，2..8PBS+-OncoPox-ING4-+ING4GAPDH图2.7ING4蛋白的表达Fig.2.7TheexpressionofING430 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究PBS+-OncoPox-GMCSF-+GMCSFβ-actin图2.8GMCSF蛋白的表达Fig.2.8TheexpressionofGMCSF31 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究PoxPox第三章重组痘苗病毒Onco-ING4、Onco-GMCSF联合对体外对肿瘤细胞的杀伤效应3.1相关实验方法3.1.1MTT法检测细胞毒性取对数生长期的细胞按5000cells/well种入96孔培养板，隔夜待细胞贴壁后，加入不同滴度的病毒，于5%CO2，37℃培养箱中培养不同的时间梯度后，每孔加入20μLMTT（使MTT终浓度为5mg/mL）。37℃孵育4h后，小心吸尽孔内培养液，用排枪在每孔精准加入150μLDMSO,振荡器振荡10min后,在酶标仪上测定A570吸光值。实验中需设置与所加病毒相同体积PBS的空白对照组以及加同体积的PBS的入培液做为调零孔。3.1.2凋亡细胞染色实验：Hoechst33342染色将对数生长期的A549细胞按5000cells/well植入96孔板，于37℃，5%CO2PoxPox培养箱中培养过夜,次日分别用Onco-ING4（5MOI）、Onco-GMCSF（5PoxPoxMOI），Onco-ING4（2.5MOI）+Onco-GMCSF（2.5MOI）处理。48h后，每孔加入1μLhoechst33342，37℃孵育30min后在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照记录。3.1.3AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡分别离心收集培养基中细胞，并消化收集仍贴壁的细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两遍，用500μL的1×BindingBuffer重悬细胞，加入5μL的AnnexinV-FITC和5μL的PI，冰上避光15min后，过滤（除去细胞团块），然后用流式细胞仪进行分析。流式细胞仪激发光波长用488nm，用波长大于560nm的滤器检测PI，波长为515nm的通道滤器检测FITC荧光。3.1.4TUNEL法检测细胞凋亡细胞爬片的准备：6在Lab-Tek®小室(ChamberSlides)以5×10cells/孔植入A549细胞。在加入个病PoxPoxPox毒组Onco-ING4（5MOI）、Onco-GMCSF（5MOI），Onco-ING4（2.5MOI）Pox+Onco-GMCSF（2.5MOI）诱导处理之后，用PBS轻轻漂洗2次。进入后续32 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究实验。(1)固定细胞，每孔加入4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛1mL，在4℃放置25分钟。(2)倾去多聚甲醛，加入2mLPBS，室温放置5min。重复用PBS洗一次。(3)轻轻去掉多余液体。在实验过程中，切勿让样品干燥。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。(4)按1:100的比例，用PBS作为稀释液来稀释2mg/mL的ProteinaseK溶液，使其终浓度为20µg/mL。每个样本需要100µlProteinaseK溶液。(5)每个样本上滴加100µl浓度为20µg/mL的ProteinaseK溶液，使溶液覆盖样本区域，37℃孵育10min(也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton®X-100溶液中，37℃孵育10min进行通透处理)。ProteinaseK帮助细胞对后续步骤的染色试剂通透。孵育时间过长会增加细胞脱落的风险，过短则可能造成透性处理不充分，影响标记效果。为得到最好的结果，需要探索优化ProteinaseK孵育的时间。(6)小心去除多余液体，加入2mLPBS，温室放置5min，重复2-3次。(7)标记及检测1)按1：5的比例用双蒸水稀释5×EquilibrationBuffer(每个样本需用20µl5×EquilibrationBuffer和80µl双蒸水混合稀释成100µl1×EquilibrationBuffer)。2)在待检样本区域中间小心滴加100µl1×EquilibrationBuffer使其全部覆盖，室温孵育10-30min。在平衡细胞的同时在冰上解冻BrightGreenLabelingMix，并且依照表准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT。表3.1.准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液组分体积（50μL体系）样本数目总体积ddH2O34μL4136μL5×EquilibrationBuffer10μL440μLBrightGreenLabelingMix5μL420μLRecombinantTdTEnzyme1μL44μL33 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究3)在平衡后的体系内用小枪头小心吸掉100μLEquilibrationBuffer中的大部2分，然后在5cm面积的细胞上小心滴加50μLTdT孵育缓冲液。4)为避免细胞干掉，在小室上方放一块双蒸水浸润过的滤纸。于37℃孵育60分钟。用铝箔纸包裹以避免光照。5)轻轻去掉多余液体，换用新鲜的PBS溶液室温孵育5分钟。重复该步骤1次。6)为了降低背景，在用PBS洗两遍之后，可再用含0.1%Triton®X-100和5mg/mLBSA的PBS洗三次，每次5min，将游离的未反应标记物清除干净。7)黑暗中加入5μLPI染色液，使终浓度为1μg/mL，室温中放置5min。8)洗涤样本，体系中加入2mL去离子水，室温放置5min。重复两次，总共洗三次。9)立即在激光共聚焦显微镜下观察样本，用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光；在>620nm下观察PI的红色荧光。注意：PI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色。只在凋亡的细胞核中才有FITC掺入而产生的绿色荧光。3.2统计学分析所有定量实验均重复至少三次，采用统计学软件采用SPSS10.1分析，组数据以“均值±标准差”表示，P<0.05。3.3实验结果3.3.1细胞形态学观察按照实验步骤将处于对数生长期的SW480细胞和A549细胞分别接种于6孔板中，37℃，5%CO2培养箱内培养过夜，分别加入不同病毒处理组：PoxPoxPoxOnco-ING4（5MOI），Onco-GMCSF（5MOI）及Onco-ING4（2.5MOI）Pox+Onco-GMCSF（2.5MOI）联合组，加等体积的PBS作为对照组，分别作用48h后，倒置光学显微镜下观察并拍照记录细胞形态学变化。观察发现病毒处理组出现了典型的病变形态学变化：细胞间隙变大，连接Pox消失，细胞肿胀，细胞膜有小泡状突起。在两个细胞株中均以Onco-ING4引起的病变最为明显.如图3.1，3.2所示34 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图3.1各病毒处理组感染SW480细胞的形态学变化Fig3.1ThemorphologicalsurveyoftheSW480cellsafterinfectedbydifferentrecombinantOncolyticpoxvirus图3.2各病毒处理组感染A549细胞的形态学变化Fig3.2ThemorphologicalsurveyoftheA549cellsafterinfectedbydifferentrecombinantOncolyticpoxvirus35 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究3.3.2MTT法检测目的病毒的肺癌杀伤能力与安全性评价肺癌细胞与结肠癌细胞分别以5000cells/孔的密度种入96孔板，分别加入PoxPox不同梯度的重组病毒处理组，Onco-ING4，Onco-GMCSF及PoxPoxOnco-ING4+Onco-GMCSF联合组，用MTT法检测这两种病毒对癌细胞的杀伤作用，结果如3.3,3.4所示。A54924hA54948h1.50.8Pox-EmptyPox-EmptyPox-GMCSFPox-GMCSF0.6Pox-ING4Pox-ING41.0Pox-CombiPox-Combi0.40.50.2Cellviability(%ofcontrol)0.0Cellviability(%ofcontrol)0.015015110MOIMOIA54972h0.5Pox-Empty0.4Pox-GMCSFPox-ING40.3Pox-Combi0.20.1Cellviability(%ofcontrol)0.01510MOI图3.3各重组痘苗病毒抑制A549增殖能力比较Fig.3.3ComparisonoftheantitumoractivitytoA549cellsofeachtreatmentgroupwithrecombinantoncolyticpoxvirus36 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究SW48024h1.5Pox-EmptyPox-GMCSFPox-ING41.0Pox-Combi0.5Cellviability(%ofcontrol)0.01510MOISW48072h0.8Pox-EmptyPox-GMCSF0.6Pox-ING4Pox-Combi0.40.2Cellviability(%ofcontrol)0.01501MOI图3.4各重组痘苗病毒抑制SW480细胞增殖能力比较Fig.3.4ComparisonoftheantitumoractivitytoSW480cellsofeachtreatmentgroupwithrecombinantoncolyticpoxvirus结果发现，通过使用各个重组痘苗病毒以相同的感染复数对A549和SW480Pox-这两种细胞株抗癌效果的检测，OncoING4呈现出最强的杀伤力。在较低MOIPox感染（1MOI）情况下，Onco-ING4对两种细胞的杀伤力依然显著，在作用48h后，对两种癌细胞的产生接近过半的致死率；96h后，对两种细胞的杀伤力高达80%。而另外几个处理组的相对弱些，在高滴度感染（10MOI）的情况下，PoxOnco-ING4依然没有因为病毒的高度复制而掩盖其治疗基因ING4的抑癌效果。3.3.3Hoechst33342染色观察细胞凋亡现象按实验操作步骤将处于对数生长期的肿瘤细胞A549植入6孔板中，于Pox5%CO2，37℃培养箱培养过夜。次日早晨加病毒Onco-ING4（5MOI），PoxPoxPoxOnco-GMCSF(5MOI)及Onco-ING4(2.5MOI)+Onco-GMCSF(2.5MOI)分别感染细胞，并设置只加同体积的PBS组作为对照。48h后在6孔板内加入5μL，1mg/mL的Hoechst33342，37℃染色30min在荧光倒置显微镜观察并拍照记37 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究录。结果如图3.5所示加入对照病毒与目的病毒48h后，PBS处理组细胞染色质均匀，无浓缩、边集现象，荧光显微镜下观察，细胞核染色均一，没有凋亡的特征。而病毒处理组的细胞核则出现核膜破裂，细胞核凝集，固缩，核碎裂出现凋亡小体的特征。图3.5hoechst33342观察细胞凋亡现象Fig.3.5Apoptosisdetectionbyhoechst33342staining3.3.4流式细胞术检测溶瘤痘苗病毒检测细胞凋亡现象按操作步骤在六孔板中分别植入处于对数生长期的A549和SW480细胞，PoxPox贴壁培养12h后在病毒处理组分别加Onco-ING4（5MOI），Onco-GMCSF(5PoxPoxMOI)及Onco-ING4(2.5MOI)+Onco-GMCSF(2.5MOI)，对照组中加入等体积的PBS，37℃、5%CO2培养48h后。参照AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明书处理样品，1h内流式细胞仪检测。结果如图3.6,3.7所示38 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图3.6各重组痘苗病毒诱导A549细胞发生凋亡Fig.3.6ApoptosisinducedbyeachtreatmentgroupofoncolyticpoxvirusinA549cellsPoxPoxPoxA:control;B:Onco-ING4;C:Onco-GMCSF;D:Onco-Combi39 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图3.7各重组痘苗病毒对正常细胞MRC-5无促凋亡作用Fig.3.7NoadvancedapoptosiswasdetectedinnormalcellsMRC-5wheninfectedbyeachtreatmentgroupofrecombinantvacciniavirusPoxPoxPoxA:control;B:Onco-ING4;C:Onco-GMCSF;D:Onco-CombiPox结果显示，Onco-ING4对肺癌细胞株A549诱导凋亡的效果是最显著的，Pox其对A549的杀伤效果为35.2%，高于Onco-GMCSF(14.4%)及联合组（18.1%）；Pox而在对正常细胞MRC-5的检测中，发现除却Onco-ING4有轻微的细胞毒性，其余实验组与对照组没有明显差别。说明重组痘苗病毒对正常细胞安全性好，而Pox其中Onco-ING4诱导癌细胞凋亡的效果最佳。3.3.5TUNEL检测细胞凋亡在玻璃底培养皿小室分别按步骤接种A549，贴壁培养12h后，病毒处理PoxPoxPox组分别为Onco-ING4（5MOI），Onco-GMCSF(5MOI)及Onco-ING4(2.5PoxMOI)+Onco-GMCSF(2.5MOI)。对照组中加入等体积的PBS，于37℃、5%CO2培养箱培养48h后，参照TUNEL试剂盒说明，原位进行染色体末端标记。结果如图3.8。40 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究图3.8TUNEL检测肿瘤细胞凋亡Fig.3.8ThedetectionofapoptosisincarcinomacellsbyTUNEL如图所示，绿色为断裂DNA末端被标记上的颜色，而PI染的红色作为细胞核背景。结果发现，对照PBS处理组细胞核完整，没有被染上绿色荧光，说明Pox未出现染色体断裂而凋亡；Onco-ING4感染A549细胞后引起的染色体断裂最为明显，然其它几个重组痘苗病毒处理组的也有引起DNA断裂的现象，但都不Pox及Onco-ING4明显。说明携带基因的重组痘苗病毒在A549细胞内复制能力更强，而其诱导细胞凋亡的机制很可能取决于其表达基因在细胞内作用的效果。41 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究3.4讨论[27]近年来有报道称美国Amgen公司花费10亿美元收购溶瘤病毒，引起科学界病毒研究领域的关注，很好的激励和促进了人们对溶瘤病毒的开发和利用。溶瘤病毒包括腺病毒，疫苗病毒，疱疹病毒等。溶瘤病毒在靶向肿瘤细胞后能够释[34]放或表达特定抗原来激发机体相关的抗肿瘤免疫应答。其中疫苗病毒因其相对较高安全性得到公认而被看好，而痘苗病毒就是其中的佼佼者。我们知道，痘苗病毒最初是用于天花的防御和治疗，如今天花已被宣布在全球灭绝，而目前对痘苗病毒的应用已经远远超出了这个领域。2011年，在病毒治疗史上出现了首例重组痘苗病毒JX-594，被证实可以通过人体静脉注射经血液传递在系统转移瘤内进行复制并发挥很好的治疗效果。这为重组痘苗病毒在临床上的应用开启了绿色通道。全身性抗癌治疗的最大挑战之一是使药物高浓度集中在肿瘤，而非正常组织。生物分子（如多肽和siRNA），如果可以集中获得并且在静脉注射后选择性在肿瘤组织中放大信号，那么其在癌症治疗中的功效和安全性可以显著提高。我们猜测，如果将一个病毒在哺乳动物血液中进行全身性扩散演变成一种积极作用，我们可以将其改造成经静脉注射的方式让其传递并靶向肿瘤细胞进行选择性复制进而在肿瘤中表达转基因的载体。我们发现，痘苗病毒可以胜任这个要求，痘苗病毒感染能力具有广谱性，能够感染多种肿瘤组织，感染过程无需特定的细[28]胞表面受体，而是通过某些膜融合途径进入细胞，它可以在包膜的保护下通[29-30]过血液循环系统运输到转移瘤部位。研究表明，牛痘苗病毒在血液中不产生耐药且有免于被抗体中和的优点，非常适用于静脉注射。对此我们在临床上发现JX-594可以通过静脉注射后在肿瘤组织中选择性感染，复制并且表达转基因蛋[30]白成剂量依赖型。而且临床检测发现，正常组织不被感染。该技术展示了在人类转移性实体瘤中可以通过多功能载体选择性表达几种互补的治疗元件和成像分子的可能性。另外，并且由于痘苗病毒相对较大，而肿瘤组织的新生血管渗透增加，痘苗病毒可以优先被堆放于肿瘤组织，此时重组痘苗病毒如JX-594，其携带的基因GMCSF可以激活机体对抗肿瘤的主动免疫。JX-594在细胞内的选择性复制依赖42 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究于EGFR-RAS途径，该信号途径在上皮细胞的肿瘤中普遍被激活，也在很多其它癌细胞中通过胸苷激酶上调和一型干扰素下调而被激活。综上所述，重组痘苗病毒使得在肿瘤细胞中实现放大和转基因表达并最终导致细胞溶解而发挥抗癌免疫力成为可能。结合本研究结果，通过流式细胞术检测，我们发现在TK区插入目的基因，构建出的重组痘苗病毒，增强了病毒对肿瘤细胞的特异性同时降低了对正常细胞的毒性。这可能是由于病毒在癌细胞的复制水平显著高于在正常细胞的复制水平，进一步提高了治疗的安全性。Pox同时，我们也发现携带ING4的重组痘苗病毒Onco-ING4，在体外实验中显现了较强的肿瘤杀伤效果，这很可能跟ING4基因的表达有关。研究证实：ING4可以通过上调p53的转录活性来打乱细胞的正常周期过程，造成细胞生长[31]停滞并且促进细胞凋亡。而p53基因是一个重要的抗癌基因，当染色体DNA遭到损害时，p53蛋白与基因的DNA的相应结合部位结合，活化p21基因转录，使细胞停滞于G1期；参与DNA的复制与修复。如果修复失败，p53蛋白即启动程序性死亡（凋亡）过程诱导细胞自杀。而这个猜想还需做相关蛋白检测来进一步验证。另外，鉴于JX-594已在临床上已取得振奋人心的疗效，而本实验在细胞水Pox平上对携带GMCSF的重组痘苗病毒Onco-GMCSF的探究却并没有取得显著的杀伤效果，这看似与“兄弟”痘苗株JX-594相去甚远，然究其原因，可能与GMCSF的作用相关，它是一种细胞因子，本身不能发挥很好的抑癌效果，需要在机体的免疫系统中通过激活机体抗肿瘤的主动免疫而发挥强大的抑癌作用。所以课题后阶段需做动物实验在体内进一步探究其治疗效果。综上，本研究为各重组痘苗株的选择提供了一定参考，为课题方向的继续探索和深入奠定了一定的基础。43 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究3.5展望虽然在病毒治疗史上已出现首例被证实可通过静脉注射经血液传递并可以在系统转移瘤内进行选择性复制的溶瘤痘苗病毒JX-594，然而，和任何一种新型治疗一样，缺点还是存在的。首先，最为重要的是平衡免疫应答的利弊关系。虽然抗体和CTLs可以清除该外来病毒，但还是可以通过先天免疫和诱导肿瘤特异性的体液和细胞免疫来显著增强效果。为避免过早被免疫系统清除，可以用使用病毒工程通过在细胞内复制来激活免疫调节。已证实在有抗体中和JX-594的情况下反复进行瘤内注射的方式依旧可行，但反复进行静脉注射是否可行还未在病人中进行评估。第二，肿瘤抵抗或逃逸机制还需得以阐明。生物安全性问题必须持续进行评估以确保病人使用的安全性，包括散播到环境（目前还没有在接受JX-594治疗的病人中检测到）。痘苗病毒空气传播的缺陷是最关键的优点。最后，在试验阶段，为确保最佳效果以及管理批准以治疗对基因类型敏感性不同的肿瘤，病人的选择至关重要。比如，EGFR途径的激活和细胞TK水平可以作为JX-594和VVDD功效的预测。尽管缺陷存在，靶向武装的溶瘤痘苗病毒仍具有广阔的前景，该研究成果很可能会成为癌症治疗领域的重要部分。44 浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究参考文献[1]M.M.Center,A.JemalandE.Ward.Internationaltrendsincolorectalcancerincidencerates[J].CancerEpidemiolBiomarkersPrev,2009,18(6):1688-1694.[2]M.L.Edelstein,M.R.AbediandJ.Wixon.Genetherapyclinicaltrialsworldwideto2007--anupdate[J].JGeneMed,2007,9(10):833-842.[3]N.Cartier,S.hacein-Bey-Abina,C.C.Bartholomae,G.Veres,M.Schmidt,I.Kutschera,M.Vidaud,U.Abel,L.Dal-Cortivo,L.Caccavelli,N.Mahlaoui,V.Kiermer,D.Mittelstaedt,C.Bellesme,N.Lahlou,F.Lefrere,S.Blanche,M.Audit,E.Payen,P.LeboμLch,B.l'Homme,P.Bougneres,C.VonKalle,A.Fischer,M.Cavazzana-Calvo,P.Aubourg.hematopoieticstemcellgenetherapywithalentiviralvectorinX-linkedadrenoleukodystrophy[J].Science,2009,326(5954):818-823.[4]董坚.肿瘤生物治疗在肿瘤治疗发展中的地位[J].昆明医学院学报,2010,31(4):1-3.[5]RoweWPhuebnerRJ,SchattenWE,SmithRR,ThomasLB.Studiesontheuseofvirusesinthetreatmentofcarcinomaofthecervix[J].Cancer1956Nov-Dec,9(6):1211-1218.[6]C.M.Southam.Presentstatusofoncolyticvirusstudies[J].TransNYAcadSci,1960,22(657-673.[7]X.Y.Liu,S.B.Qiu,W.G.Zou,Z.F.Pei,J.F.Gu,C.X.Luo,h.M.Ruan,Y.Chen,Y.P.Qi,C.Qian.Effectivegene-virotherapyforcompleteeradicationoftumormediatedbythecombinationofhTRAIL(TNFSF10)andplasminogenk5[J].MolTher,2005,11(4):531-541.[8]C.J.Breitbach,S.h.Thorne,J.C.Bell,D.h.Kirn.Targetedandarmedoncolyticpoxvirusesforcancer:theleadexampleofJX-594[J].CurrPharmBiotechnol,2012,13(9):1768-1772.[9]JameshS，EllenGS.Virusesandhumandisease[M].2006,北京:科学出版社.[10]张仁舟,杨松涛,夏咸柱.重组痘苗病毒载体研究进展[J].动物医学进展,2009,30(1):57-61.[11]B.Moss,B.Y.Ahn,B.Amegadzie,P.D.Gershon,J.G.Keck.Cytoplasmictranscriptionsystemencodedbyvacciniavirus[J].JBiolChem,1991,266(3):1355-1358.45 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浙江理工大学硕士学位论文携带ING4和GM-CSF双基因的重组痘苗病毒对肿瘤治疗的研究致谢本论文的所有研究工作从论文的选题、实现条件到论文的写作等阶段都是在刘新垣院士和王毅刚副教授的悉心指导下完成的。两位导师在我研究生学习期间在学术和生活等方面的给予了无微不至的关怀和指导。王老师严谨的科学态度，精益求精的工作作风，平易近人的待人方式，艰苦朴素的生活作风，深深地感染和激励着我。王老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀。刘老师对学术的信念和对科研事业的执着，是我心中的一面旗帜，将指引我对学术的热爱和对事业的追求。他严谨认真的做事风范、惜时如金的工作态度以及宽厚和蔼的处事品德，是我一生的榜样，必将激励我不断前行。目前刘老师还依然奋斗在科研的第一线，这种老骥伏枥志在千里的精神也将激励我终生。恩师之情，终生难忘。在此谨向两位导师致以最诚挚的敬意和最衷心的感谢。感谢课题组李恭楚老师、周秀梅老师、贾晓渊老师、骆菁菁老师、陈侃老师、杨晓晓老师等对我的指导和帮助。感谢郭科妮师姐、夏玉龙师兄、余越美师姐、陈勇毅师兄、梁裕培师兄、吴欣欣师姐、王世兵师兄等，是你们热情的帮我解决课题中遇到的各种问题。感谢吴丽琴、潘姝花、刘涛、杨新燕，郑婷婷等同学，是你们陪我共同度过了整个研究生生活，我将终生铭记和难忘。感谢马步云师弟、黄盼盼师妹、张蓉师妹、段雪梅师妹、孙笑竹师妹等，感谢你们对我实验的支持、理解和帮助。感谢陪伴我从大学走到现在的潘灵敏，在我困难和无助的时候耐心的聆听并且引导我找到解决问题的方案。最后，感谢培养我长大含辛茹苦的父母，感谢爷爷，舅舅，小姨，慧珍等亲人们对我关爱和鼓励，没有你们，就没有我的今天，你们永远是我最温暖的港湾和最大的精神动力！愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意。卓玲燕2013年11月49