双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体的构建及介导抑癌基因HCCS1治疗肝癌的实验研究

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1、上海交通大学硕士学位论文双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体的构建及介导抑癌基因HCCS1治疗肝癌的实验研究姓名：张剑申请学位级别：硕士专业：肿瘤学指导教师：赵新泰20080401Ad-PEG-3p-HCCSl病毒，通过PCR鉴定病毒的正确性。Westernblot检测PD55-HCCS1与5个对照病毒在正常和恶性肝细胞中介导E1A和HCCS1蛋白表达的情况。结晶紫染色观察各腺病毒的致细胞病变效应，MTT试验检测各腺病毒感染后的细胞存活率。大量扩增PD55-HCCS1,CsCl梯度离心纯化后用空斑形成实验测病毒滴度。利用原代培养的

2、BEL-7404细胞成瘤，并通过分组瘤内注射PD55-HCCS1和ZD55-HCCS1,比较瘤体的生长曲线和最终的抑瘤率。免疫组化染色观察HCCS1蛋白在病毒处理瘤体中的表达情况。结果重叠延伸PCR缺失了pZD55载体上210bp的E1A启动子区域，引入了MluI/NotI/BclI三个酶切位点。PEG-3p经PCR成功获得，荧光素酶试验提示：相对于正常肝细胞L-02而言，其在BEL-7404>BEL-7405>QGY-7703、HepG2中的相对活性分别为3.9、4.7、1.5、2.1倍。PEG-3p成功亚克隆入pMD5

3、5的E1A启动子区域，并经酶切鉴定，获得pPD55载体。HCCS1表达盒插入该载体中，并成功包装出双肿瘤靶向的基因病毒PD55-HCCS1,纯化后经PCR鉴定正确。成功构建pShuttle-PEG-3p-HCCSl,并通过AdeasyTM系统得到了非增殖型腺病毒Ad-PEG-3p-HCCS1,PCR鉴定正确后，连同Ad.Null、ONYX-015、Ad-CMV-HCCS1>ZD55-HCCS1共5个病毒作为PD55-HCCS1的对照。Westernblot显示PD55-HCCS1能够介导E1A及HCCS1在肝癌细胞中的特异

4、性表达。结晶紫染色和MTT试验均显示，PD55-HCCS1在没有增加正常细胞毒性的情况下，保持甚至提高了肿瘤细胞的抑制率。大量扩增得到的PD55-HCCS1滴度为5xl010pfii/mlo动物实验显示，PD55-HCCS1注射组较ZD55-HCCS1组生长速率慢，且在接种后第35天时，抑瘤率达到(77.41±11.65)%。免疫组化显示PD55-HCCS1能够介导肝癌细胞内HCCS1蛋白的大量表达。结论本研究成功构建了一个双肿瘤靶向基因-病毒治疗载体，能够最有效地介导病毒在肿瘤细胞内的增殖及治疗基因的大量表达。同时实验进

5、一步提示，HCCS1在诱导细胞凋亡及肝癌治疗中的重要作用，为肿瘤的基因-病毒治疗提供了新内容。关键词双肿瘤特异性增殖腺病毒，HCCS1,靶向肿瘤基因一病毒治疗，肝细胞肝癌CONSTRUCTIONOFDUALCANCER-SPECIFICGENE-VIROTHERAPEUTICVECTORANDPOTENTANTI-HEPATOMAEFFECTOFHCCS1VIATHISSYSTEMABSTRACTObjectiveToconstructadualcancer-specificgene-virotherapeuticvect

6、or,andtoverifyitstumor-targetingcharacterandtherapeuticefficacyviainsertingtheexpressioncassetteofnovelhepatomasuppressorgeneHCCS1(hepatocellularcarcinomasupressorgene-1).Inaddition,tofurtherexhibittheimportantroleofHCCS1inHCCtreatment.MethodsTheregionsofE1Apromot

7、erofpZD55wasdeletedbyoverlapextensionPCRandamultiplecloningsitewasintroducedtocreatpMD55・TheminimalactiveregionofPEG-3(progressionelevatedgene-3)promoter,PEG-3p,wasobtainedfromextractedratgenomicDNAbyPCR.pGL3-PEG-3pwasthenconstructedandtherelativetranscriptionalac

8、tivityofPEG-3pwasdeterminedinHCCcellsbyluciferaseassay.PEG-3pwassubclonedintopMD55togetadualcancer-specificgene-virotherapeuticvector,pPD55.HCCS1express