新城疫病毒D90毒株抑制人胃癌BGC-823细胞的体内外研究

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Universitycode：10223Classifiedcode：R735.2Graduatenumber：XS1291015Confidentialdegree：publicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationTheinhibitioneffectofNewcastlediseasevirusD90strainonhumangastriccancercellBGC-823invivoandinvitroPostgraduate：LiKun-pengSupervisor：ProfessorYuLi-yun,LiXiMajor：BiochemistryandMolecularBiologyResearchdirection：OncologyCollege：CollegeoflifescienceandbiotechnologyDaqingChina04,2015 摘要胃癌是发展中国家主要的消化系统恶性肿瘤之一，也是世界范围内最常见的因癌症导致死亡的肿瘤之一。通常，对于合并有散播或者转移病变的患者，外科手术或系统化疗带来的生存优势是有限的。目前研究认为，利用病毒进行溶瘤治疗是一种很有前途的肿瘤治疗方式。许多病毒被发现具有溶瘤作用。例如腺病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒和新城疫病毒。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）是一种重要的溶瘤病毒。NDV是一种家禽病毒，属副粘液病毒，对禽类具有高度的致病性，可以引起禽类的新城疫，被认为是重要的溶瘤病毒之一。NDV可有选择性地在肿瘤细胞中增殖并起到特异杀伤作用，不能在人正常细胞中复制，只能在特定肿瘤细胞中增殖。除了轻微的流感样症状和结膜炎，对人基本无致病性，具有较好的安全性。某些临床试验证明鸡新城疫病毒是一种高效、安全的治疗肿瘤的试剂。目前研究可用于治疗人类肿瘤的NDV包括MTH68/H、PV-701、73-T和HUJ。NDV-D90毒株是新分离得到的新城疫病毒，对癌细胞具有快速、高效杀伤的能力。本研究通过检测NDV-D90病毒在BGC-823细胞上清中的效价，分析NDV-D90在胃癌BGC-823细胞内的扩增能力。检测不同MOI值的NDV-D90对人胃癌BGC-823细胞株的细胞毒性分析NDV-D90毒株对胃癌BGC-823细胞生长的影响和MOI的变化对BGC-823细胞杀伤能力的变化。利用流式细胞术，分析NDV-D90对胃癌BGC-823细胞凋亡的作用影响。肿瘤细胞侵袭实验分析NDV-D90抑制胃癌BGC-823细胞侵袭转移的能力。用慢病毒载体GV260构建一株带有荧光素酶标记的BGC-823细胞，命名为BGC-823-luci。用细胞毒性实验比较分析NDV-D90对BGC-823和BGC-823-luci的杀伤能力的差异。用BGC-823-luci细胞构建裸鼠胃癌移植瘤模型。实验组移植瘤注射NDV-D90，对照组移植瘤注射PBS，利用发光分子成像技术评价分析实验组和对照组荧光信号。取实验组和对照肿瘤组织，用HE染色分析裸鼠体内的肿瘤坏死情况。结果显示NDV-D90在人胃癌BGC-82310细胞的增殖能力很强，在感染后为60h时最大值达到10TCID50/0.1ml。NDV-D90对人胃癌BGC-823细胞具有很强的细胞毒作用，最大杀伤率达到80%以上且MOI越高，细胞的死亡率越高，细胞死亡出现的也越快。流式细胞术结果显示NDV-D90在MOI为1感染时间为72h时，细胞的死亡率最大，达到79%，细胞凋亡随着感染时间的增长和MOI值的增大而加快。胃癌移植瘤体内实验结果发现注射NDV移植瘤的体积明显小于对照组。小动物活体成像也显示注射病毒肿瘤组织的体积和荧光信号明显小于注射PBS肿瘤体积。I HE染色结果显示实验组肿瘤组织出现大面积坏死，对照组生长状态良好。NDV-DN90对胃癌BGC-823细胞在体内外都有很好的抑制作用，可能成为一种溶瘤制剂。关键词：新城疫病毒D90毒株，胃癌BGC-823细胞系，凋亡，坏死II AbstractGastriccarcinomaisoneofthemalignanttumorsofhumanalimentarytractindevelopingcountry.Itisalsooneofthecommontumorswithhighmortalityallovertheworld.Forthepatientswithtumormetastasis,thereisalowerchanceofsurvivalaftertreatedbysurgeryorchemotherapy.Recentreportsindicatethattheoncolyticvirustherapyisapromisingpattern.Manyoncolyticvirusesarefound,includingadenovirus,rabiesvirus,poliovirus,herpessimplexvirus,influenzaavirus,measlesvirusandNewcastlediseasevirus(NDV).NDV,apoultryparamyxovirus,isconsideredasanimportantoncolyticvirustoselectivelyreplicateandproliferateintumorcellsratherthaninhumannormalcells.Itisasafetyreagent,besidesslightflu-likesymptomsandconjunctivitis.SeveralclinicaltrialsshowthatNDVisanefficientandsafereagentforthetumortreatment.NowtherearesomeNDVstrains,suchasoncolyticvirusMTH68/H,PV-701,and73-T,non-oncolyticstrainUlster,attenuatedstrainHUJ(OV001),usedastreatmentforhumancancer.NDV-D90strain,anewseparationNDVstrain,hadbeencharacterizedbyefficientandrapidoncolyticeffectforcancercells.Inthisstudy,forrevealingtheproliferationabilityofNDV-D90ingastriccancerBGC-823cell,thevirustiterwasdetectedininfectedBGC-823cellssupernatant.CytotoxicityofNDV-D90toBGC-823cellswasanalyzedwhenthevirustransfectBGC-823cellsatdifferentMOIinordertodemonstrateinhibitoryactionandlethalityongastriccarcinomacells.ThisstudyshowedapositiveeffectofNDV-D90onBGC-823cellreplicationandproliferationaswellasstrongcytotoxicorkillingactivity.Themaximumvirustiterreachedupto1010TCID50/0.1mlat60hafterinfectionandMorethan80%cancercellsdead.ThehigherMOIthehighermortalityrateandthefasterdeathoccurred.Flowcytometryindicated79%BGC-823cellsapoptosisat72hafterinfectionwithMOI=1.Ofnote,theapoptosisratewasconsiderablyincreasedwiththehigherofMOI.TumorcellinfestationexperimentshowedthattheaggressivenessofBGC-823cellswasinhibitedbyNDV-D90.ABGC-823celllabeledwithluciferasenamingBGC-823-luciwasconstructedbytransformingGV260lentivirusvectorsinsertedluciferasegenetomakethemodeloftransplantationtumornudemice.ThesizeoftransplantationtumorinjectedwithNDV-D90wasgettingsmallerandsmallerthanthatofPBScontrol.Theresultsofinvivoimagingshowedalowerfluorescentsignalthancontrol.ThelargerareaofnecrosisinthetumorIII tissuesectionwithHEstainingwasobservedinNDV-D90groupbutthecontrolcancercellsnormallygrewup.OurdataindicatedthatNDV-D90couldinhibitthegrowthofBGC-823cellsandmaybeanoncolyticagentforcancercell.Keywords:NDVD90strain;GastriccancerBGC-823cellline;Apoptosis;NecrosisIV 符号说明符号英文全称中文全称NDVNewcastlediseaseVirus新城疫病毒EDTAEthylenediamine-N,N,N',N'-tetraaceticacid乙二胺四乙酸ERKextracellularsignal-regulatedkinase胞外信号调节激酶FBSFetalBovineSerum胎牛血清IgGimmunoglobulinG免疫球蛋白GKDkiloDalton千道尔顿kbKilo-base千碱基kDaKilo-dalton千道尔顿DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸Lliter升MOIMultiplieityofInfection感染复数SDS-聚丙烯酰胺凝SDS-PAGESDS-Polyacrylamidegeleletrophoresis胶电泳minminute分钟MRSDeManRogosa-SharpeMRS培养基SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠mlmilliliter毫升mMmillimole/liter毫摩尔/升FITCFluoreseeinIsothioeyante异硫氰酸荧光素nmnanometer纳米APSAmmoniumpersulphate过硫酸铵NCnitrocellulose硝酸纤维素OVOcolyticvirus溶瘤病毒PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液V pHhydrogenionconcentration氢离子浓度PMSFPhenylmethanesulfonylfluorid苯甲基璜酰氟含吐温20的磷酸盐PBSTPhosphatebufferedsalinewithTween20缓冲液TrisTrischydroxymethy三羟甲基氨基乙烷TMBTetramethylbenzidine四甲基联苯胺APSAmmoniumpersulphate过硫酸铵rpmrotationperminute转/分CEFChickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞FACSFluorescenceactivatedcellsorter流式细胞仪KbKilobase千碱基RPMI1640RooseveltParkMemorialInstitutemediumRPMI1640培养基PIPropidiumiodide碘化丙啶μlmicroliter微升μgmicrogram微克SPFSpecificpathogenfree无特定病原体VI 目录第一章引言......................................................................................................................................................11.1胃癌的治疗现状.................................................................................................................................11.2溶瘤病毒的种类.................................................................................................................................21.3新城疫病毒及新城疫病毒的结构.....................................................................................................41.4新城疫病毒治疗肿瘤的研究进展.....................................................................................................51.5新城疫病毒抑制肿瘤的种类.............................................................................................................61.6新城疫病毒溶瘤作用的机制.............................................................................................................71.7可见光活体成像技术.........................................................................................................................81.8研究的目的及意义...............................................................................................................................9第二章NDV-D90对BGC-823细胞抑制作用的体外实验..................................................................112.1材料....................................................................................................................................................112.1.1病毒、细胞.............................................................................................................................112.1.2主要试剂.................................................................................................................................112.1.3主要的试剂和药品.................................................................................................................112.2实验方法...........................................................................................................................................122.2.1鸡胚扩繁NDV-D90病毒......................................................................................................122.2.2细胞培养................................................................................................................................122.2.3NDV-D90致BGC-823细胞病变.........................................................................................122.2.4病毒含量的测定....................................................................................................................122.2.5病毒在BGC-823细胞中的增殖能力分析...........................................................................132.2.6NDV-D90对BGC-823细胞的毒性检测.............................................................................132.2.7肿瘤细胞侵袭实验..................................................................................................................132.2.8流式细胞术............................................................................................................................142.2.9构建带有荧光素酶标记的BGC-823稳定细胞株...............................................................152.2.10体外细胞成像实验..............................................................................................................162.2.11NDV-D90对BGC-823细胞和BGC-823-luci细胞的细胞毒性实验...............................172.3结果...................................................................................................................................................172.3.1BGC-823细胞病变...............................................................................................................172.3.2病毒含量测定........................................................................................................................182.3.3细胞毒性检测........................................................................................................................182.3.4细胞侵袭实验........................................................................................................................192.3.5流式细胞术............................................................................................................................202.3.6构建荧光素酶标记的BGC-823细胞系...............................................................................222.3.7体外细胞成像实验................................................................................................................222.3.8比较NDV-D90对BGC-823细胞系和BGC-823-luci细胞系的细胞毒性........................232.4讨论......................................................................................................................................................24第三章NDV-D90对BGC-823细胞抑制作用的体内实验.........................................................................273.1实验材料...........................................................................................................................................273.1.1病毒、细胞和实验动物........................................................................................................273.1.2主要试剂................................................................................................................................273.2实验方法...........................................................................................................................................273.2.1实体瘤注射病毒及活体动物成像........................................................................................27VII 3.2.2细胞预感作病毒后的动物实验............................................................................................283.2.3制作石蜡切片及HE染色.....................................................................................................293.2.4统计和分析............................................................................................................................293.3结果...................................................................................................................................................303.3.1实体瘤....................................................................................................................................303.3.2溶解瘤....................................................................................................................................313.3.3实体瘤组的HE染色.............................................................................................................323.3.4溶瘤组的HE染色.................................................................................................................333.4讨论...................................................................................................................................................343.5结论...................................................................................................................................................35参考文献................................................................................................................................................37致谢................................................................................................................................................................47附录................................................................................................................................................................49个人简历............................................................................................................................................................51科研经历....................................................................................................................................................51在学期间发表论文....................................................................................................................................51VIII 第一章引言1.1胃癌的治疗现状胃癌在中国的发病率达到第二位，在中国仅次于肺癌，是中国主要的五大肿瘤之一。胃癌在中国的死亡率很高而且一直朝着上升的趋势发展。据2009年统计，随机抽查样本地域的胃癌发病率为3.6/万，平均男性的发病率4.9/万，女性的发病率为2.2/万。胃癌在[1][2][3]中国的平均发病率为1.7/万，在世界的平均发病率为0.39/万。胃癌的治疗方式包括四[4]种，分别为手术疗法、化学疗法、放射疗法和免疫疗法，其中以外科手术疗法为主。在[5]传统根治性手术术式的基础上，早期胃癌手术是更加趋于创伤小，治愈率高的微创手术。晚期胃癌一般是指手术后容易复发和不能用手术的方法完全切除的胃癌。晚期胃癌手术后的复发率达到60%，在确诊时不可切除的晚期占全部胃癌的30％且确诊时确诊时晚期胃癌已经发生转移，且占全部胃癌的30％以上。如果不进行术后治疗如化疗、放疗和生物[6-10]疗法，则只有3~4个月的寿命，而术后治疗后寿命可以达到1年。免疫疗法是肿瘤生物治疗(Biotherapy)方法的一种。免疫疗法是利用低毒性的病毒刺激机体或注射人造抗体和人造嵌合抗体，提高机体免疫力来治疗相关疾病的治疗手段。随着分子生物学的发展，肿[11,12]瘤生物治疗越来越受到重视，被认为是继肿瘤外科、放疗、化疗之后的第四种模式。[13][14]人胃癌细胞系有很多，根据分化程度不同和分离地点不同，有以下细胞系：BGC-823细胞系，SGC-7901细胞系，MGC-803细胞系，MKN-28细胞系，MKN-1细胞系，MKN-45细胞系，MKN-74细胞系等。其中BGC-823为低分化的胃癌细胞系，恶性程度很[15]高。1982年，蔡玉晖等在中国建立了人胃癌BGC-823细胞系。该细胞生长繁殖比较快，在裸鼠体内容易形成瘤。很多人对BGC-823细胞凋亡作用的做了深入研究，王旭等应用HE染色和流式细胞术等实验发现：丹参酮ⅡA能诱导BGC-823细胞发生凋亡，抑制其增[16]值，并且改变其凋亡形态。WeiLiu等发现藤黄酸也具有使BGC-823细胞发生凋亡的作[17]用及抗肿瘤效果。徐立春等用流式细胞术法、FITC-AnnexinV与PI双染法、AO/EB双荧光染色及荧光显微镜、MTT等实验方法，证明莪术醇能抑制BGC-823细胞生长并在此[18]过程中发生凋亡。也有研究报道，用熊果酸、复康辛、牡蛎天然活性肽、冬凌草甲素、[19-24]奥沙利铂联合培美曲塞及二烯丙基二硫等均能诱导BGC-823细胞增殖且抑制其生长。1 1.2溶瘤病毒的种类溶瘤病毒是指能够特异性识别并感染肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中大量、快速复制一类[25]病毒。溶瘤病毒能特异性的识别肿瘤细胞并在肿瘤细胞中复制，最终使肿瘤细胞破碎裂解，但是在正常组织细胞中不复制。溶瘤病毒的这个特点使溶瘤病毒具有成为一种理想生物治疗肿瘤的安全抗肿瘤试剂。目前，具有溶瘤作用的病毒被发现了很多。这些病毒包括腺病毒、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒、呼肠孤病毒（reovirus）和新城疫[26][27]病毒。新型天然溶瘤病毒M1属甲病毒属，也具有溶瘤作用。腺病毒是一种重要的溶瘤病毒。它具有球形结构且无囊膜的双链DNA病毒，一共有[28]约36000个碱基。一共分为A、B、C、D、E、F和G7个亚种,一共有52个血清型[29]。腺病毒是一种具有高滴度、低致病性、高效率并且在体内不整合入宿主细胞染色体等[30]优点的基因转导载体，未来腺病毒载体将在基因治疗中拥有极其良好的发展前景。段瑞红等以腺病毒为载体，构建了siRNA腺病毒载体转染到HepG2细胞中，发现siRNA腺病[31]毒载体抑制生存素基因的表达，并诱导HepG2细胞发生凋亡现象。李明霞等以腺病毒[32]为载体表达NDRG2药物，对人胶质瘤细胞A172和SHG-44的起到很好的抑制作用。[33]吕赛群等发现溶瘤腺病毒SG665-mGMP毒株对肿瘤干细胞有很好的抑制作用。腺病毒作为基因表达载体，可以运载细胞因子和肿瘤凋亡因子基因，通过细胞因子的抗肿瘤作用[34]和肿瘤凋亡因子的促凋亡作用增强抗肿瘤效果。李明霞等应用腺病毒载体表达人ndrg2蛋白，人ndrg2蛋白对人脑胶质瘤具有抑制作用，观察重组腺病毒对人脑胶质瘤细胞A172、U251和SHG-44的抑制作用。结果表明：重组ndrg2腺病毒对三株细胞均有很强的抑制能[35]力。谢发军等以腺病毒为载体在肿瘤细胞中表达IFN-γ，结果表明：瘤内注射重组IFN-γ[36]腺病毒对胰腺肿瘤细胞Capan-2有很好的抑制作用。以腺病毒为载体表达外源基因和siRNA的研究有很多，如：携带siRNA干扰FAT10基因、携带IFN-β和携带hTR-siRNA[37-39][40]等。BischoffJR等发现腺病毒只能识别p53基因缺陷的肿瘤细胞。腺病毒载体表[41]达单纯疱疹病毒胸苷激酶治疗局部恶性间皮瘤患者已经应用到了临床Ⅰ期。但是腺病毒溶瘤作用的靶向性不好，所以在人体临床中削弱了其溶瘤作用。大部分人体中，都含有腺病毒的中和抗体，所以未来应用腺病毒治疗肿瘤，需要优化腺病毒载体，提高腺病毒溶瘤靶向性。呼肠孤病毒也是一种重要的溶瘤病毒。它是分节段的双链RNA病毒，病毒粒子呈球2 形的二十面体。具有使红血球凝集的能力。呼肠孤病毒也是一种重要的溶瘤病毒，而且对[42]人类基本无致病性。Gupta-SarafP等发现MRV在许多癌症动物模型和人类的临床试验中对肿瘤有很好的抑制作用。DuanHY等用呼肠孤病毒处理人宫颈癌HeLa细胞，发现[43]HeLa发生凋亡现象。M等研究发现，腺病毒发挥溶瘤作用时，是依靠激活Ras信号通[44]路来实现的。WilcoxME等应用呼肠孤病毒对人脑胶质瘤U87和U251细胞进行体外实[45]验研究发现：呼肠孤病毒对U87和U251细胞系都有很好的抑制能力，并诱导其凋亡。提出呼肠孤病毒可以作为人脑胶质瘤细胞的溶瘤细胞代理。HirasawaK等用呼肠孤病毒在[46]完全免疫小鼠系统性治疗转移性癌症。HirasawaK等发现溶瘤细胞的呼肠孤病毒对卵巢[47]癌、结肠癌具有抑制作用。QiaoJ等发现环磷酰胺对呼肠孤病毒抑制肿瘤细胞具有促进[48]作用。细小病毒是最小最简单的一类线状ssDNA病毒，基因组大小约5kb。该病毒无囊膜[49]并且呈二十面体结构。细小病毒也是一种重要的溶瘤病毒，诱导肿瘤细胞发生凋亡。细小病毒能选择性的杀伤肿瘤细胞，而不杀伤正常细胞，选择识别特异性比较好。具有较好溶瘤作用的细小病毒有细小病毒H-1毒株和细小病毒MVM毒株。Rommelaere等发现细[50]小病毒H-1毒株能诱导多种肿瘤细胞发生凋亡。冉志华等发现，H-1病毒对不同分化程[51]度的胃癌细胞具有不同的敏感性和杀伤能力。冉志华等发现在体外研究中，利用反向遗传操作技术构建重组细小病毒H-1——rhH1△/p21，重组病毒可诱导胃癌细胞株HGC-27[52]细胞在细胞周期G1期停滞，抑制HGC-27细胞增殖。RayetB等发现细小病毒H-1毒株[53]能对U-937细胞具有溶瘤能力，这种凋亡与肿瘤细胞坏死因子α信号通路有关。细小病[54-56]毒H-1株还能抑制人乳腺上皮细胞、神经胶质瘤细胞和淋巴瘤等多种肿瘤细胞。Brandenburger等发现小鼠细小病毒MVMp株的NS-1蛋白和NS-2蛋白在肿瘤细胞凋亡的[57]过程中起到重要作用。此外，细小病毒也可以作为基因载体，来治疗肿瘤疾病。例如Jan[58]J.Cornelis等以细小病毒为载体，表达白细胞介素-2，在治疗裸鼠黑色素移植瘤模型中，取得了很好的治疗效果。GieseNA等以MVMp株细小病毒为载体，转导IP-10趋化因子。[59]在裸鼠血管肉瘤移植瘤模型中，注射重组的IP-10-MVMp毒株，治疗有非常好的耐受性。单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)属于疱疹病毒科病毒亚科，基因组有约152kb，根据血清型不同，分为HSV-1型和HSV-2型两个亚型。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是一种嗜神经组织的DNA病毒，HSV-1作为一种重要的溶瘤病毒有许多有利的优势。单纯疱疹1型病毒具有高度传染性，所以单纯疱疹1型病毒可以作为载体在细胞内高效的表达外源基因。HSV-1病毒的固有细胞毒性，如果利用选择性的遗传操作，使这种病毒发展3 [60]成为有效的溶瘤病毒。研究发现HSV-1能引起多种肿瘤细胞发生凋亡现象。BennettJJ等以HSV-1的突变株NV1023作为载体插入小鼠IL-12基因，命名为NV1042。比较NV1023和NV1042对直肠癌的杀伤作用。结果显示：在体外实验中，两株病毒都能在直肠癌细胞中复制，且对直肠癌细胞的毒性达到100%；NV1042能表达IL-12。NV1023和NV1042[61]都有很好的潜在临床作用。KambaraH等应用HSV-1的突变株（rQNestin34.5）治疗人[62]神经胶质瘤细胞。在体外实验中rQNestin34.5对人神经胶质瘤细胞有很好的抑制作用。Tae-JinSong等用HSV-1的弱毒株G207对肝癌的16株细胞进行体外实验。实验结果表明：G207毒株对11株肝癌细胞都有很强的抑制作用；病毒的MOI值越高，对细胞的毒性越[63]高，细胞发生凋亡的时间也越快。G207突变株治疗神经胶质瘤已经应用到临床第一阶[64][65-70]段。HSV突变株有很多，其中治疗人神经胶质瘤的报道最多。水疱性口炎病毒（VesicularStomatitisVirus，VSV）为弹装病毒科水疱病毒属，有囊膜[71]的不分节段的ssRNA病毒。基因组结构为3’-N-NS-M-G-L-5’。水疱性口炎病毒也是一种重要的溶瘤病毒，Balachandran等发现VSV能使几种肿瘤发生溶瘤而对正常组织无致病[72]性。同时VSV也可以作为外源基因表达载体。WillmonCL等用VSV载体表达IFN-β，IFN-β能提高免疫效应，VSV具有溶瘤作用。VSV-IFN-β在治疗恶性肿瘤中取得了惊人的[73]治疗效果。EbertO等用反向遗传技术构建VSV-GFP，VSV-GFP对人肝癌和老鼠肝癌都有很好的溶解作用。向老鼠肝癌移植瘤模型中注射VSV-GFP，发现VSV-GFP有效和选择性在实体瘤中复制，引起肿瘤破坏和抑制肿瘤的生长,对正常肝脏组织没有明显毒性，使[74]老鼠的生命得以延续。DiazRM等用VSV治疗黑色素瘤时发现，提高CD8+可以提高[75]VSV治疗肿瘤的能力。我国是肿瘤高发国家，而且人口基数大，恶性肿瘤难以控制，致使我国每年有大量的人口死于肿瘤疾病。肿瘤疾病已经严重的困扰着人类的身心健康。肿瘤细胞具有多药耐药[76]性，所以容易出现复发现象。有关治疗肿瘤方面的研究是目前医学领域的热点之一。随着分子病毒学和细胞生物学的不断进步，溶瘤病毒在将来会有很大的发展空间。溶瘤病毒还可以作为表达细胞某些基因的载体，发挥更好的溶瘤效果。1.3新城疫病毒及新城疫病毒的结构新城疫病毒是ssRNA病毒，基因组全长为15186个核苷酸，基因排列方式依次为3’[77][78]NP-P-M-F-HN-L5’，分别编码NP、P、M、F、HN、L蛋白。新城疫病毒颗粒长杆状、椭圆形和有圆形等，有包膜，包膜为双层结构膜，由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结4 合衍生而来。包膜表面长有刺突，具有溶血素、血凝素和神经氨酸酶。病毒由单链核糖核酸分子与蛋白质衣壳粒组成，衣壳蛋白相互缠绕形成螺旋对称的直径约18nm的核衣壳，。新城疫病毒以细胞膜融合的方式进入细胞，复制增殖后的子代病毒以出芽的形式释放细胞到细胞外。完整的新城疫病毒的直径在100～400nm之间，是一种有囊膜的球状颗粒。L蛋白是RNA依赖性的DNA聚合酶。P为磷蛋白，NP为核衣壳蛋白，L蛋白、P蛋白和NP蛋白常附着在一起。M蛋白是基质蛋白，病毒囊膜的支架就是M蛋白构成的，它能维持病毒结构的完整性。还具有能抑制宿主细胞基因的转录和翻译的功能，也参与病毒的组装[79]和释放。NDV根据毒力的强弱分为强毒株、中强毒株和弱毒株。NDV的毒力由两个糖蛋白决定，分别是HN糖蛋白和F糖蛋白。HN糖蛋白和F糖蛋白是构成新城疫病毒致病作用的两个重要蛋白，HN蛋白具有免疫原性，能够与抗体直接发生中和反应。HN糖蛋白和F糖蛋白在新城疫病毒感染细胞的过程中起到识别，吸附的作用。HN蛋白位于病毒的囊膜上。该蛋白的N端插入病毒内部，C端分布在病毒的外部，构成新城疫病毒囊膜表面的大纤突。即具有血凝素活性又具有神经氨酸酶活性。F蛋白位于也处于新城疫病毒的囊膜表面，是形成囊膜上小纤突的主要蛋白。具有促使病毒和靶细胞膜发生融合和破坏细胞的作用，从而使病毒侵入细胞。在病毒的感染的过程中，HN糖蛋白能识别细胞表面受体——唾液酸，对病毒吸附到细胞膜上起到重要作用。F蛋白与细胞膜[25]接触，发挥融合细胞的作用，使病毒与细胞发生融合，病毒的基因组和RNA聚合酶进入到细胞质中，并且细胞质中复制。F蛋白先是以无活性的F0前体存在，当F0被宿主细胞[79]蛋白酶裂解为F1和F2后，才具有融合活性。新城疫病毒的强毒株对禽类来说是高致病性病毒，偶尔感染人类，其表现为轻微流感症状、轻度结膜炎、头疼、不适合寒战等，弱毒株对人类基本无致病性。1.4新城疫病毒治疗肿瘤的研究进展[80]新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）是一种重要的溶瘤病毒，鸡新城疫病毒作为一种溶瘤试剂具有悠久的历史。NDV是一种家禽病毒，属副粘液病毒，对禽类具有高度的致病性，可以引起禽类的新城疫。NDV可有选择性地在肿瘤细胞中增殖并起到特异[81][82-84]杀伤作用，NDV在人类癌细胞中的复制效率是在正常细胞中的10000倍。目前研究可用于治疗人类肿瘤的NDV包括溶瘤型毒株MTH68/H、PV-701、和73-T，非溶瘤型病[85]毒株Ulster，弱毒株HUJ（OV001）。新城疫病毒的毒株和毒力不同，对癌细胞产生的5 杀伤作用也有很大的区别。几个临床试验证明鸡新城疫病毒是一种高效、安全的治疗肿瘤的试剂。对人基本无致病性，除了轻微的流感样症状和结膜炎。NDV与胃癌的研究可以追溯到上世纪，尤其在1950~1960年之间，应用溶瘤病毒的抗肿瘤的作用得到了更深入的研[86]究。1912年，DePace发现了狂犬病病毒具有使抑制子宫颈癌的能力，科学家们从此开始研究溶瘤病毒，并挖掘出了多种溶瘤病毒。1950年，Sinkovics研究证明新城疫病毒对肿[87]瘤细胞具有细胞毒性，之后科学家认识到可以利用溶瘤病毒来攻克癌症疾病的困扰。在1956年，SmithR等证明利用不同亚型的野生腺病毒来治疗人类宫颈癌，从此正式开始对[88]如何应用溶瘤病毒治疗癌症的研究。在1971年匈牙利医生Csatary发现农场主在感染新城疫病毒(NDV)后，他患有胃癌不治而愈，因此猜想NDV可能也具有治疗肿瘤的作用。Song等人应用基因工程改造过的带有绿色荧光蛋白标记的NDV通过腹腔注射的途径治疗人类腹膜移植瘤小鼠，疗效确定，毒副反应不明显，并讨论了治疗效果与病毒剂量和复制能力有关。随着科学技术的进步，应用反向遗传操作平台来构建新的重组病毒已经不是科学难点。有人利用反向遗传技术给病毒加入新的基因来构建新的病毒，例如给新城疫病毒加入GFP或EGFP基因，使NDV病毒粒子带有绿色荧光蛋白。WongJ等用反向遗传技术构建GFP标记的NDV，通过检测新城鸡瘟病毒表达绿色荧光蛋白来检测人腹膜胃癌细[89]胞。Zhengchai等也用反向遗传技术构建了D90-GFP新城疫病毒，概括了D90和D90-GFP[90]病毒对肺癌A549具有相似的抑制能力。PhuangsabA等用新城疫病毒73-T、HUJ和MHT-68/H株治疗人神经脑细胞瘤（IMR-32细胞），取得了很好的疗效。同时对肺癌（NCIH460细胞）、结肠癌（SW620和HT29细胞）和乳腺癌（SKBR3细胞）都有很好[91-94]的疗效。CsataryLK等用新城疫病毒MHT-68/H毒株对癌症晚期患者进行了有益治[95-96]疗。。新城疫病毒PV701株是自然分离出来的，它能选择性杀死肿瘤细胞与不杀伤正[97]常的人类细胞，是基于肿瘤细胞缺陷干扰素(IFN)介导的抗病毒反应。PV701已经进入临[98]床1期应用。VigilA等用反向遗传的方法，重新构建NDV来增强病毒的溶瘤作用。1.5新城疫病毒抑制肿瘤的种类目前，新城疫病毒可治疗的人肿瘤种类有很多种，包括肺癌（A549）[78]、直肠癌（SW480）、恶性黑色素瘤、肝癌（HepG2）、乳腺癌、宫颈癌（KB8-5-11）、膀胱癌（HCV29T）、神经母细胞瘤（IMR32）、胃癌（KHOS）、胚胎性肿瘤（G104）和纤维肉瘤（HT1080）[99]等。NDV可有选择性地在肿瘤细胞中增殖并起到特异杀伤作用，在不同分化程度的细胞中复制增殖能力也不同。6 1.6新城疫病毒溶瘤作用的机制[100]细胞凋亡主要包括三种凋亡途径：死亡受体介导途径、内质网介导途径和线粒体介[101-102]导途径。死亡受体是一类跨膜蛋白，细胞外区有一段富含半胱氨酸的区域，细胞质区有一同源的氨基酸残基组成的结构，有蛋白水解功能，称之为死亡区域。死亡受体有两种主要的受体：Fas（又叫CD95或Alo1）和TNFR1。Fas是一种同源三聚体，与FADD结合，FADD通过自身的DD与Fas作用，而FADD则与caspase-8和caspase-10作用。启动凋亡酶家族（caspase）的级联反应，最终诱导细胞凋亡。在Fas或TNFR1诱导细胞凋亡时，Bid蛋白被凋亡酶家族的酶类裂解，裂解后的Bid肽段被豆蔻酰基化修饰后，可使线粒体膜电位发生变化，从而使线粒体释放细胞色素C，进而引起细胞发生凋亡。[103]2+内质网介导途径，内质网诱导细胞凋亡主要表现在两个方面：一是内质网调控Ca2+离子的浓度，二是活化内质网上的凋亡酶。内质网是Ca的主要储存库，当细胞质中的2+Ca浓度增加时，使线粒体的通透性和膜电位改变。激活线粒体凋亡途径使细胞发生凋亡。2+当Ca平衡态受到破坏或在内质网上积累过多的蛋白质时，能够激活凋亡酶家族（caspase家族）的凋亡酶发生级联反应，从而起因细胞发生凋亡。线粒体介导途径。线粒体在介导细胞凋亡时有很大的作用，主要包括：释放半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）激活因子如细胞色素C和凋亡诱导因子。当细胞受到病毒刺激后，促细胞凋亡信号发生级联反应，促使线粒体通透性改变，发生不可逆的开放，释放细胞色素C，引起凋亡酶家族的级联反应，致使细胞凋亡。2011年，JianchunBian等证明新城疫病毒诱导肺癌A549细胞系凋亡时通过p38-MAPK信号通路和caspase凋亡酶级联反[104]应来实现的。Bcl-2家族诱导细胞凋亡就是通过线粒体通透性改变，诱导细胞发生凋亡的。由于HN蛋白具有血凝素和神经酰胺酶活性，所以HN蛋白能特异性的识别肿瘤细胞表面的唾液酸受体。恶性肿瘤细胞一般都过表达唾液酸受体，而正常细胞不过表达唾液酸[105]。病毒通过表面的HN蛋白识别细胞膜表面的唾液酸受体，使病毒吸附到肿瘤细胞表面。病毒吸附在细胞表面后，在表面的F蛋白的作用下，使几个细胞的细胞膜膜相互融合，细胞骨架蛋白改变，融合成一个新的合胞体。病毒与细胞融合后，在细胞内大量增殖，使细[25]胞的新陈代谢功能紊乱造成细胞病变或死亡。病毒入侵细胞后，机体发生免疫应答，提[106][107][108]高机体免疫力，干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）上调，与细胞的死亡受体相结合，激活细胞的死亡受体通路，从而引起细胞的凋亡。Termeer7 [109]CC等证明新城疫病毒通过诱导激活T细胞来治疗人黑色素瘤细胞的。病毒吸附到肿瘤细胞上之后，引起肿瘤细胞内信号蛋白发生活化，依赖凋亡酶家族（caspase）的活化，[110]致使肿瘤细胞凋亡。新城疫病毒可以作为一种基因载体，利用反向遗传操作平台给病毒插入新的基因序[111][112]列，可以使病毒更好的发挥病毒的溶瘤效果，如插入IL-6，IL-15，IFN和一些具有溶瘤功能的非编码RNA。新城疫病毒（NDV）对人类多种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用，是一种安全有效的肿瘤增殖病毒。新城疫病毒（NDV）是一种重要的溶瘤病毒，具有对人[113-115]类无创伤性、无致病性且能特异性选择杀伤人肿瘤细胞等优点。1.7可见光活体成像技术可见光技术主要包括生物发光和荧光发光。生物发光的原理是荧光素酶在ATP或有氧气存在的条件下，能催化D型荧光素发生氧化，产生光子，造成生物发光的现象。荧光素酶根据来源不同，有不同的分类名称，主要包括：萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、Gaussia荧光素酶、海萤荧光素酶、红色萤火虫荧光素酶、绿色海肾荧光素酶等。不同的荧光素酶催化过程中有不同的发光，如萤火虫荧光素酶生物催化发光为绿色光，RedFirefly（红色萤火虫）荧光素酶催化发光为红色光，海肾荧光素酶催化发光为蓝色光。不同的荧光素酶需要的反应条件不同，有的需要ATP，有的需要ATP和氧气同时存在。不同的荧光素酶可催化不同的反应底物发出不同颜色的光。可根据不同的实验条件做出不同的选择。荧光发光的原理是基因表达的荧光蛋白经激发光照射，发出荧光。目前主要的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白（GFP）、增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、红色荧光蛋白（RFP）和Cherry蛋白等。不同的荧光蛋白激发光也不同，例如绿色荧光蛋白（GFP）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的激发光为蓝光，红色荧光蛋白（RFP）为绿光，Cherry蛋白的激光光波长587nm。荧光素酶基因或荧光蛋白基因标记细胞或DNA后，利用活体成像系统采集活体生物体内的细胞活动和基因行为。通过活体成像系统，就可以观察移植瘤模型中，肿瘤细胞的凋亡和转移情况。该方法具有检测灵敏度高，不涉及放射性物质，安全方便等优点。哺乳动物荧光素酶生物发光，是将荧光素酶报告基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，通过静脉或腹腔注射荧光素底物（luciferin），当荧光素扩散到细胞内时，细胞内的荧光素酶在ATP及氧气的存在条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，该发光只存在活细胞中，且在荧光素底物充足的情况下，发光强度和细胞数成正比。该反应快速，一般在注射荧光素底物10min左右，利用活体成像技术收集信息。荧光素的脂溶性非常好8 而且易透过血脑屏障。荧光素酶生物发光具有反应灵敏、发光时间长等优点。哺乳动物荧光生物发光，是将荧光蛋白报告基因整合到细胞染色体DNA上以表达荧光蛋白，只需要利用活体成像系统发射激发光，就可以收集到荧光蛋白基因的表达情况[116][117]。1.8研究的目的及意义NDV-D90是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所李曦老师实验室在长春分离的一株新[118][119]城疫病毒。2006年，符芳等证明NDV-D90对肺癌A549细胞有很好的抑制能力。柴政等利用反向遗传技术在NDV-D90基因组插入了绿色荧光蛋白基因，命名为rNDV-D90-GFP。并比较分析了NDV-D90与rNDV-D90-GFP对肺癌A549移植瘤模型的抑[78]制能力，结果显示：rNDV-D90-GFP与NDV-D90对A549具有相同的抑制能力。2014[120]年，张春晓等证明了NDV-D90具有抑制口腔鳞癌细胞系迁移和侵袭的能力。2014年，[121]张增岭等证明NDV-D90对乳腺癌MCF-7细胞具有抑制作用。NDV-D90对多种细胞具有抑制作用，为了进一步探究NDV-D90是否对人胃癌BGC-823细胞也具有抑制作用，本实验将研究NDV-D90对人胃癌BGC-823细胞系体内外的抑制能力。9 10 第二章NDV-D90对BGC-823细胞抑制作用的体外实验2.1材料2.1.1病毒、细胞病毒：NDV-D90毒株来自于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。细胞：BGC-823细胞采购自中国细胞系资源库上海细胞库。2.1.2主要试剂主要仪器：荧光显微镜：Leica，德国；流式细胞仪：FACSAriaBD公司，美国；低温离心机：Eppendorf，德国；-70℃冰箱：Thermo，美国；4℃冰箱：海尔，中国；微量加样器：Gilson，法国；超净工作台：Airtech，国产；制冰机：AF-100,苏格兰；液氮罐：CBS,美国；超纯水系统:LabconcoHPLC/PS，美国；小动物活体成像：BERTHOLD，德国；细胞培养箱：Thermo，美国；倒置显微镜：Nikon，日本；荧光显微镜：Leica，德国；流式细胞仪：FACSAriaBD公司，美国；低温离心机：Eppendorf，德国；-70℃冰箱：Thermo，美国；微量加样器：Gilson，法国；超净工作台：Haerforce。2.1.3主要的试剂和药品青、链霉素（10000U/ml），PBS缓冲液，0.25%含EDTA胰蛋白酶，0.25%无EDTA11 胰蛋白酶国产。RPMI1640，胎牛血清：Hyclone公司，美国。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂购买于KeyGEN公司，CellCountingKit-8（CCK-8）试剂盒购自DOJINDO。BDBioCoat™Matrigel™InvasionChamber购自BD公司。慢病毒（HIV-1）GV260载体和嘌呤霉素都购买于上海吉凯基因化学技术有限公司。D型荧光素钾盐采购于佳美生物公司。2.2实验方法2.2.1鸡胚扩繁NDV-D90病毒采用9~11日龄的无特定病原（Specificpathogenfree，SPF）鸡胚5个，放在37℃恒-6温培养箱中培养备用。在超净工作台中，将NDV-D90病毒连续10倍稀释6次，取10倍稀释的NDV-D90病毒稀释液100ul，注射鸡胚的尿囊腔内。在37℃恒温培养箱中培养3天，无菌操作吸取尿囊液（如果有沉淀，则10000rpm/min离心5min），测定病毒液的TCID50，-70℃保存，备用。2.2.2细胞培养在液氮罐中取出冻存的BGC-823细胞，放入含有37℃水的烧杯中，细胞冻存液融化后，将细胞吸入无菌Ep管中。在离心机中瞬离，去掉细胞冻存液。将BGC-823细胞接种于含有1%青-链霉素10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养基。在含有5%CO2,温度为37℃,饱和水分的培养箱中培养。待细胞贴壁率为80%-90%时传代一次（约两天）。2.2.3NDV-D90致BGC-823细胞病变5首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌细胞。将胃癌细胞以10个/孔接种于6孔板，待细胞长满加入MOI为0.01的NDV-D90，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱感作1小时。弃去病毒液，加入2ml的2%FBS的RPMI-1640细胞维持液。随时观察细胞病变的情况。2.2.4病毒含量的测定5首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌细胞。将胃癌细胞以10个/孔接种于6孔板，待细胞长满加入MOI为0.01的NDV-D90，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱感作1小时。弃去病毒液，加入2ml的2%1640细胞维持液。每12h收取一孔细胞（共6次）及上12 清。1000rpm/min离心5min，留上清。则病毒感染细胞的时间分别为12h、24h、36h、48h、60h和72h。测病毒感染细胞不同时间点，上清液中病毒的含量。用TCID50/0.1ml表示病毒的含量。该实验重复3次。2.2.5病毒在BGC-823细胞中的增殖能力分析5首先用0.25%EDTA胰酶消化收集胃癌细胞。将胃癌细胞以10个/孔接种于6孔板，待细胞长满加入MOI为0.01的NDV-D90，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱感作1小时。弃去病毒液，加入2ml的2%FBS的RPMI-1640细胞维持液。每12h收取一孔细胞（共6次）及上清。1000rpm/min离心5min，留上清。则病毒感染细胞的时间分别为12h、24h、36h、48h、60h和72h。测病毒感染细胞不同时间点，上清液中病毒的含量。用TCID50/0.1ml表示病毒的含量。该实验重复3次。2.2.6NDV-D90对BGC-823细胞的毒性检测用CellCountingKit-8（CCK-8）试剂盒检测NDV-D90对BGC-823细胞的细胞毒性，具体步骤如下：41）用100ul排枪吸取细胞悬液放入96孔板中，使加入细胞的量为5×10个。将96板放在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中预培养。2）待细胞长满加入病毒感染复数（multiplicitiesofinfection，MOI=病毒颗粒/肿瘤细胞）分别为0.001,0.01,0.1,1和10的NDV-D90，在含有5%CO2,温度为37℃，饱和水分的培养箱中感作1小时，对照组不加病毒感作。换2%RPMI-1640细胞维持液，将培养板在培养箱继续培养孵育12h、24h、36h、48h、60h和72h。每孔设三个复孔。3）待孵育时间完成后向待测孔中加入10μLCCK-8溶液，加入的过程中不要产生气泡（若有气泡，用棉签去除），否则会影响OD值的读数。4）将细胞培养板放入37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中孵育1-4小时。5）用酶标仪测定细胞培养板在450nm处的吸光度值，并计算分析。6）细胞存活率（％）=[A(加病毒)-A（空白）]/[A（未加病毒）-A（空白）]×100A（加病毒）：含有病毒溶液、CCK溶液和细胞的孔的吸光度值A（空白）：只含有CCK溶液和培养基而没有细胞的孔的吸光度值A（未加病毒）：只含有细胞、CCK溶液孔的吸光度值。2.2.7肿瘤细胞侵袭实验6用0.25%含EDTA胰酶消化收集胃癌细胞。胃癌细胞以1×10/孔接种于6孔板，待细13 胞长满后加入NDV-D90（MOI=0和0.1）在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱感作1小时。应用BD公司的的24孔板侵袭小室，该小室包被一层薄的细胞外基质并由8um聚乙烯膜封闭。消化法从6孔板中获取经NDV-D90处理的胃癌细胞和未经病毒处理的胃癌细胞，用含1%FBS培养基洗涤3次（1000rpm/min，5min）。用含有1%FBSRPMI-1640培养基4重悬细胞调整至5×10个/ml。上室加200ul细胞悬液，下室加入750ul细胞RPMI-1640培养基，含有10%FBS的RPMI-1640培养基，10%的FBS作为化学吸引物，37℃饱和水分的CO2培养箱孵育14h。吸掉上室中的培养基，将侵袭小室移到无培养基的24孔板中，用无菌的PBS缓冲液清洗2-3次。上室中加入250ul的50uM的Calcein-AM溶液，下室中加入750ul的50uM的Calcein-AM溶液。在37℃饱和水分的CO2培养箱中避光孵育15-30分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞两次。在绿光为激发光的荧光倒置显微镜上观察细胞。随机选取3个视野进行细胞计数并保存图片。该实验重复两次。2.2.8流式细胞术用不含EDTA的胰酶（EDTA对实验有影响，容易造成假阳性）消化收集胃癌细胞。5将胃癌细胞以4×10个/孔接种于12孔板，放入37℃饱和水分的CO2培养箱中培养。待细胞长成单层后，吸去培养基分别加入不同MOI值的NDV-D90（MOI=0，0.01，0.1和1）在37℃饱和水分的CO2培养箱中感作1小时，弃去病毒稀释液，加入2%FBSRPMI-1640培养基，放入37℃饱和水分的CO2培养箱中培养，分别在24h、48h和72h收取细胞。在每个时间点，用不含EDTA胰酶消化收集一孔细胞，重悬于PBS缓冲液中，收集细胞大于4等于1×10个。2.2.8.1流式上机具体操作步骤如下：1）用无菌预冷的PBS缓冲液清洗三次（1000rpm，5min）。2）加入100μl1×BindingBuffer重悬细胞。3）加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPIStainingSolution，轻轻混匀。避光、室温反应10min。4）加入400μl1×BindingBuffer，混匀，冰上备用。2.2.8.2阴性对照及AnnexinV和PI的补偿实验操作步骤如下：51）阴性对照：取正常（未经病毒处理）细胞约10个，用无菌预冷的PBS缓冲液清洗三次（1000rpm，5min）。加入500ul1×BindingBuffer。冰上备用。52）AnnexinV补偿：取正常（未经病毒处理）细胞约10个，在60℃水浴锅水浴614 分钟（不同的细胞水浴的时间不同）。取出细胞用无菌预冷的PBS缓冲液清洗三次（1000rpm，5min）。加入100μl1×BindingBuffer重悬细胞。加入5μlAnnexinV-FITCStainingSolution，避光、室温反应10min。加入400μl1×BindingBuffer，混匀。冰上备用。53）PI补偿：取正常（未经病毒处理）细胞约10个，在60℃水浴锅水浴6分钟（不同的细胞水浴的时间不同）。取出细胞用无菌预冷的PBS缓冲液清洗三次（1000rpm，5min）。加入100μl1×BindingBuffer重悬细胞。加入5μlPIStainingSolution，避光、室温反应10min。加入400μl1×BindingBuffer，混匀。冰上备用。以上操作皆尽量在冰上操作。利用FACScan流式细胞仪（USA）分析技术检测细胞凋亡情况。以碘化丙啶（PI）染色阴性，膜连蛋白（AnnexinV）染色阳性为早期凋亡细胞。以碘化丙啶（PI）染色阳性性，膜连蛋白（AnnexinV）染色阳性为晚期凋亡细胞。以碘化丙啶（PI）染色阳性，膜连蛋白（AnnexinV）染色阴性为死细胞。以碘化丙啶（PI）染色阴性，膜连蛋白（AnnexinV）染色阴性为正常的活细胞。重复该实验3次。2.2.9构建带有荧光素酶标记的BGC-823稳定细胞株2.2.9.1准备目的细胞1)在液氮罐中取出冻存的细胞管。2)迅速放入42℃水浴中，搅动水流以加速细胞冻存管的溶解。3)。用新吉尔灭消毒液给细胞冻存管消毒后，在超净工作台中打开冻存管。吸取冻存液放于1.5ml的Ep管中。置于离心机10000rpm/min，瞬离。4)吸去冻存液上清，加入1ml新鲜的10%FBSRPMI-1640完全培养基重悬细胞，将细2胞悬液接种至25cm的细胞培养瓶中，再加入10%FBSRPMI-1640完全培养基4ml轻轻晃匀后置于在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中培养。5)观察细胞状态，及时给细胞换新鲜的培养基。2.2.9.2细胞传代1)将长成单层融合度约为90%的细胞进行传代2)倒掉细胞培养瓶中的旧培养液，加入5ml无菌的PBS缓冲液，洗涤细胞培养瓶中残留的旧培养基，然后弃去PBS缓冲液。3)加入0.25%含EDTA胰酶消化液1ml，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中消化40s到1min，细胞出现无细胞形态，并且细胞呈圆形时，弃掉胰酶消化液。4)加入10%FBSRPMI-1640完全培养基5ml，用无菌的培养液吸管轻轻吹打数次，将15 培养瓶壁上的细胞冲洗下来。25)将5ml含细胞的培养液平均分装到3个25cm的细胞培养瓶中，补足新鲜的10%FBSRPMI-1640完全培养基至5ml，继续培养。2.2.9.3IC50的测定41）将BGC-823细胞接种于96孔板中，使加入细胞的量为5×10个。2）待细胞贴壁后，融合度约60%~70%时，加入不同浓度的嘌呤霉素，筛选出BGC-823细胞致死的最低嘌呤霉素浓度。一般设置嘌呤霉素浓度为1ug/ml、2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml，如果嘌呤霉素的浓度如果高了，可以从0.25、0.5开始筛选；3）取细胞24h完全死亡的最低puromycin药物浓度，作为筛选新构建细胞系的的puromycin药物浓度。2.2.9.4慢病毒感染目的细胞1)将生长状态良好，融合度为90%的BGC-823细胞用0.25%含EDTA胰酶消化液消化，制成细胞悬液并计算细胞悬液的浓度。42)将约为5×10个细胞接种于六孔板中，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中培养。3)待细胞贴壁且融合度达到约30%左右时，根据操作手册中BGC-823细胞需要的MOI值，加入适宜量的慢病毒载体。4)12h后观察细胞状态：如果细胞生长状态良好且没有产生明显的细胞毒性，继续培养12h后更换新鲜的10%FBSRPMI-1640的培养基；继续培养24h后，更换带有最低致细胞死亡嘌呤霉素浓度的10%FBS-RPMI-1640培养基；如果有明显的细胞毒性作用，立即换带有最低致细胞死亡嘌呤霉素浓度的10%FBS-RPMI-1640培养基。48h后，存活的细胞为转染成功的细胞，命名为BGC-823-luci并进行细胞传代，用于以后的实验研究。2.2.10体外细胞成像实验取处于对数生长期的BGC-823-luci细胞，用0.25%含EDTA的胰酶消化并收集，细胞5计数调整细胞浓度。按每孔1×10个细胞接种于6孔板上，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中培养。孵育12h后，1孔留做阴性，2孔分别加入MOI为0.01和0.1的病毒，在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中感作1h，弃去病毒液，加入2%的1640细胞培养液培养24h。24h后用无菌PBS清洗一次。然后加入0.05mmol/L的D-荧光素钾盐反应3min，之后立即拿到小动物活体成像系统中检测荧光强度。分析细胞数量与荧光强度的关系、分析细胞凋亡后与荧光强度的关系。16 2.2.11NDV-D90对BGC-823细胞和BGC-823-luci细胞的细胞毒性实验用CellCountingKit-8（CCK-8）试剂盒检测NDV-D90对BGC-823细胞的细胞毒性，具体步骤如下：41）用100ul排枪吸取细胞悬液放入96孔板中，使加入细胞的量为5×10个。将96板放在37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中预培养。2）待细胞长满加入病毒感染复数（multiplicitiesofinfection，MOI=病毒颗粒/肿瘤细胞）为0.1的NDV-D90，在含有5%CO2,温度为37℃,饱和水分的培养箱中感作1小时，对照组不加病毒感作。换2%RPMI-1640细胞维持液，将培养板在培养箱继续培养孵育12h、24h、36h、48h、60h和72h。每孔设三个复孔。3）待孵育时间完成后向待测孔中加入10μLCCK-8溶液，加入的过程中不要产生气泡（若有气泡，用棉签去除），否则会影响OD值的读数。4）将细胞培养板放入37℃，饱和水分的5%CO2培养箱中孵育1-4小时。5）用酶标仪测定细胞培养板在450nm处的吸光度值，并计算分析。6）细胞存活率（％）=[A(加病毒)-A（空白）]/[A（未加病毒）-A（空白）]×100A（加病毒）：含有病毒溶液、CCK溶液和细胞的孔的吸光度值A（空白）：只含有CCK溶液和培养基而没有细胞的孔的吸光度值A（未加病毒）：只含有细胞、CCK溶液孔的吸光度值2.3结果2.3.1BGC-823细胞病变BGC-823细胞对NDV-D90病毒敏感，接入MOI=0.01的病毒24h后，细胞出现合胞体结构，如图2.1所示，有明显的CPE产生。图2.1BGC-823细胞病变Fig2.1TheBGC-823cell’sCPE17 图A为对照组，未加入NDV-D90病毒。图B为加入NDV-D90病毒24h后图片2.3.2病毒含量测定用MOI为0.01的NDV-D90感染BGC-823细胞，用TCID50/0.1ml表示病毒的滴度。如图2.2中，NDV-D90在BGC-823细胞中，12h开始增殖。12~60h持续增殖，并且在60h10时增殖到最大，达到10个TCID50/0.1ml。图2.2NDV-D90病毒在BGC-823细胞中增殖曲线Fig2.2NDV-D90virusmultiplicationinBGC-823cell2.3.3细胞毒性检测用不同MOI的NDV和不同的感染时间处理BGC-823细胞，在OD450nm扫描分析存活细胞数。去掉背景后，用实验组OD值/对照组OD值表示细胞存活率。得到的数据绘制如图2.3所示：BGC-823细胞经不同MOI值的NDV-D90病毒处理，MOI分别是0.001，0.01，0.1，1和10，在12h、24h、36h、48h、60h和72h检测细胞的存活率。NDV-D90病毒对BGC-823细胞有强的杀伤能力。随着MOI值的增大，出现BGC-823细胞死亡的时间越快，存活率越低。在MOI为0.001时，细胞刚开始出现了少量增殖的情况，在40h后出现明显的凋亡。当MOI为0.01时，BGC-823细胞刚开始也出现了少量增殖的情况，在40h后出现明显的凋亡。当MOI为0.1时，BGC-823细胞也出现了少量增殖，在24h出现明显的凋亡，细胞的存活率下降。当MOI为1时，BGC-823细胞未出现增殖，在24h时18 出现明显的凋亡。在MOI为10时，BGC-823细胞也未出现增殖，在12h后就能看出来明显的凋亡。并且无论MOI值为多少，最后的细胞存活率几乎一致。图2.3NDV-D90对BGC-823细胞的细胞毒性分析Fig2.3TheBGC-823cellviableassay2.3.4细胞侵袭实验肿瘤细胞侵袭实验，侵袭指数（invasionindex）=实验组穿过细胞数/对照组穿过细胞数。如图2.4中A和B所示，经NDV-D90处理BGC-823细胞穿过细胞外基质和8um膜的细胞数量少，未经过NDV-D90处理的BGC-823细胞穿过膜的细胞数多。如图2.4中C所示，对照组和实验组比较具有显著性差异，p<0.01。图2.4肿瘤细胞侵袭实验Fig2.4TumorInvasionAssay19 图中A为对照组，图B为NDV-D90病毒处理组，图C为两组实验每个视野下的细胞数。**表示p<0.01，差异显著。2.3.5流式细胞术流式细胞术分析不同的MOI值和不同的病毒感染时间，对不同细胞凋亡发生的凋亡进行分析。左上限（Q1区）为死细胞，左下限（Q3区）为正常的活细胞，右上限（Q2区）为晚期凋亡细胞（死亡细胞），右下限（Q4区）为早期凋亡细胞。如图2.5中所示，Annexin-V单染出现在Q3区和Q4区，Annexin-V单染的半数细胞凋亡可以用。PI单染出现在Q2和Q4区，PI单染的半数细胞凋亡可以用。在不同的MOI感染组中，随着病毒感染BGC-823细胞的时间的延长，细胞发生死亡越来越多。细胞死亡率等于细胞凋亡率加上细胞坏死率。如图2.6所示，Control组中，24h，48h，72h对应的死亡率分别是5.8±0.2%，6.3±3.1%，8.4±0.7%。死亡率增加的不明显，几乎没有变化。在MOI=0.01组中，24h，48h，72h对应的死亡率分别是5.3±1.1%，26.3±1.3%，50.1±3.1%。随着病毒感染细胞时间的增长，BGC-823细胞的死亡率明显增加。在72h死亡率达到最高，为50.1±3.1%。在MOI=0.1组中，24h，48h，72h对应的死亡率分别是14.9±0.3%，58.4±3.9%，74±3.5%。随着病毒感染细胞时间的增长，BGC-823细胞的死亡率明显增加，在72h时，细胞的死亡率已经达到74±3.5%。在MOI=1组中，24h，48h，72h对应的死亡率分别是18.1±1.5%，74±2.6%，79±8.2%。随着病毒感染细胞时间的增长，BGC-823细胞的死亡率明显增加，在72h时，细胞死亡率已经达到79±8.2%。如图2.7所示，在24h组中，随着MOI值的增加，细胞的死亡率也增加。在48h组中，细胞的死亡率也随着MOI值的增大而增加。在72h组中，细胞的死亡率也随着MOI值的增大而增加。MOI值越大，细胞发生死亡越快，越多。图2.5流式未染色组、AnnexinV-FITC单染和PI单染组Fig2.5Thecontrolgroup,theAnnexinV-FITCsinglestainingandPIsinglestaining20 图2.6BGC-823细胞流式图Fig2.6TheBGC-823cellFlowchartNDV-D90处理BGC-823细胞以不同的MOI值感染时间为24、48、72h，PI和Annexin-V双染法FACS检测细胞死亡率。图2.7BGC-823细胞死亡率与感染时间的关系Fig2.8RelationshipofBGC-823celldeathwithinfectiontime21 2.3.6构建荧光素酶标记的BGC-823细胞系IC50的测定得出药物处理48h后细胞全部死亡的最低药物浓度为1ug/ml。如图2.8A，在细胞维持液下培养48h后，细胞全死亡。由于没有嘌呤霉素抗性基因，因此不生长并且成为死细胞。图2.8B中，有活细胞和死细胞。活细胞能存活，因此含有嘌呤霉素抗性，为转染成功的阳性细胞。细胞在1ug/mlpuromycin的细胞维持液下继续继续培养48h。然后进行细胞传代，得到带有荧光素酶标记的稳定细胞株。图2.8构建荧光素酶标记的BGC-823稳定细胞系Fig2.8UseluciferasestamptoconstructBGC–823line图中A和B是加入嘌呤霉素24h后的细胞状态。其中A为未加GV260载体感染的细胞。B为加GV260载体感染的细胞。2.3.7体外细胞成像实验BGC-823-luci细胞含有萤火虫荧光素酶报告基因，D型荧光素在ATP和荧光素酶的催化作用下，底物被氧化发光。当底物过量时，产生的光量子数与荧光素酶的浓度呈正相关性，荧光素酶的浓度和细胞的数量呈正相关性，所以产生的光量子数与细胞的数量呈正相关性。如图2.9，A孔为对照组，B、C两孔分别加入了MOI为0.01和0.1的病毒。光量子数A＞B＞C。所以A孔中活细胞大于B孔，B孔中的活细胞大于C孔。22 图2.9体外细胞成像实验Fig2.9CellimagingexperimentsinvitroA为对照组，未加病毒处理。B、C为实验组，分别加入MOI为0.01和0.1的NDV-D90病毒。24h后，每孔加入0.05mmol/L的D型荧光素钾盐。拿到小动物活体成像仪器下检测荧光强度。2.3.8比较NDV-D90对BGC-823细胞系和BGC-823-luci细胞系的细胞毒性想要用新构建的BGC-823-luci细胞系代替BGC-823细胞系去做体内实验，需要了解比较NDV-D90对两株细胞系的抑制作用和细胞毒性。如图2.10所示，NDV-D90对两株细胞的都有杀伤作用，在24h时表现为抑制，抑制持续到72h。在72h，细胞存活率达到最低。在12~72h，NDV-D90病毒对两株细胞的细胞毒性都是相似的，无明显差异。23 图2.10NDV-D90对BGC-823细胞和BGC-823-luci细胞的细胞毒性分析Fig2.10NDV-D90toBGC-823cellandBGC-823-lucicellcytotoxicityassay2.4讨论新城疫病毒是溶瘤病毒的成员之一，新城疫病毒具有抑瘤效果首次报道于1955年。从此，对新城疫病毒抑制肿瘤的研究越来越多。新城疫病毒有多种不同的毒株，不同的新城疫毒株具有不同的溶瘤效果。溶瘤型的新城疫毒株有MTH68/H、PV-701、和73-T，非[73]溶瘤型的新城疫毒株有Ulster，弱毒株HUJ。其中MTH68/H和PV-701已经应用到了临床Ⅰ期。NDV-D90毒株是新分离出来的溶瘤病毒，符芳等证明NDV-D90对肺癌A549细胞有[118][119]很好的抑制能力。NDV-D90能使BGC-823细胞产生合胞体结构，出现明显的CPE。10NDV-D90可在BGC-823细胞中大量增殖，病毒的最高滴度达到10TCID50/0.1ml。NDV-D90对BGC-823细胞有很强的细胞毒性，病毒感染时间越长，细胞的存活率越低。细胞的最低存活率达到18.5%。MOI越大，细胞凋亡出现的越快，细胞的存活率越低。在MOI为10时，BGC-823细胞一直处于抑制生长状态，逐渐开始凋亡。MOI为0.01时，细胞刚开始出现了少量增长，然后出现了凋亡，并且与MOI为10时的细胞存活率相等，说明MOI值低的时候，病毒出现了大量复制，导致了低的MOI值也和高MOI值有相似的杀伤力。这也间接地说明了NDV-D90在BGC-823细胞复制能力很强。流式细胞术测得细胞的最大24 凋亡率为80%左右，且细胞的凋亡率随着MOI的增大和感染时间的增长而变高，此结果与细胞毒性实验结果一致。一般恶性肿瘤细胞具有侵袭转移和迁移的能力。在侵袭转移和迁移的过程中，基质金属蛋白酶类（matrixmetalloproteinases，MMPs）具有重要作用。MMPs能分解细胞外基质（extracellularmatrix，ECM），使细胞更容易从组织中转移其他脏器及[122]对周围组织发生侵袭。恶性肿瘤细胞能大量表达MMP-2和MMP-9，使肿瘤细胞更容易发生侵袭和转移。在肿瘤细胞侵袭实验中，在侵袭小室中加入人工的ECM，观察BGC-823细胞能穿过侵袭小室8um孔的细胞数，来说明NDV-D90对BGC-823细胞的抑制作用。经NDV-D90处理的肿瘤与对照组相比，侵袭过8um孔的细胞数量明显减少。以上数据都说明NDV-D90对人胃癌BGC-823细胞具有高效的杀伤能力且能抑制BGC-823发生侵袭。荧光素酶能使D型荧光素底物产生化学发光，此细胞系由于带有荧光素酶基因，所以构建的细胞能催化D型荧光素底物发光。该细胞系用于以后的体内实验，可以很好的检测肿瘤组织的位置、大小。用细胞毒性实验分析了NDV-D90对两株细胞系的细胞毒性，结果显示NDV-D90对两株细胞系的杀伤作用基本一致，可以应用BGC-823-luci细胞系代替BGC-823细胞上动物实验。如图2.9所示，荧光素酶在ATP或有氧气存在的条件下，能催化D型荧光素发生氧化，产生光子，造成生物发光的现象。该发光只存在活细胞中，且在荧光素底物充足的情况下，发光强度和细胞数成正比。随着科学的进步，应用新城疫治疗肿瘤的方法主要分为三类：一是单独使用NDV作为抗肿瘤试剂，如MTH68/H和PV-701。此种方法已经应用到了临床Ⅰ期，初见成效。二[113]是应用NDV与化学药物联合治疗，如紫杉醇等。这样可以减少副作用和用药成本。三是以NDV为基因载体，表达外源基因。如IL-2，IL-6，IFN-β，TNF-α等。NDV-D90对胃癌BGC-823细胞系具有高效杀伤和抑制其发生侵袭转移的能力，可以作为胃癌患者的抗肿瘤生物制剂。25 26 第三章NDV-D90对BGC-823细胞抑制作用的体内实验3.1实验材料3.1.1病毒、细胞和实验动物裸鼠：BABL/cSPF级裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；病毒：NDV-D90病毒来自哈尔滨兽医研究所；细胞：BGC-823-luci细胞由自己构建。3.1.2主要试剂青、链霉素（10000U/ml），PBS缓冲液，0.25%胰蛋白酶，国产；RPMI1640，胎牛血清：Hyclone公司，美国；台盼蓝购自北京中生瑞泰科技有限公司；D型荧光素钾盐采购于佳美生物公司；戊巴比妥钠购自Amresco。3.2实验方法3.2.1实体瘤注射病毒及活体动物成像1）细胞培养将人胃癌BGC-823-luci细胞接种于含10%灭活胎牛血清和双抗（青霉素和链霉素各100U/ml）的1640培养液中，于37°C、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。24h后细胞长满至培养皿约90%左右时，用0.25%胰蛋白酶溶液进行消化、传代，取生长状态良好的细胞进行实验。2）实验动物的观察和饲养本实验中，所有的裸鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司购买。为3周龄雌性BALB/cSPF级裸鼠。裸鼠所用的饮用水、垫料以及饲料均经高压处理，无菌无毒。观察裸鼠7天，无裸鼠死亡和异常反应可进行下一步实验。3）移植瘤模型的建立取BGC-823-luci细胞处于对数期时，0.25%胰酶消化后，用无菌的PBS溶液清洗细胞3次，离心5min，1000r/min，用4g/L台盼蓝染色后计算细胞活率(98%以上），用PBS缓7冲液悬浮细胞并计数。调整细胞数浓度为5~10×10个/ml。然后在无菌条件下用注射器吸27 取100ul细胞悬液，接种于经75%酒精消毒裸鼠两个后腿内侧皮下。接种时局部出现一个明显小皮丘，4-6天后被接种裸鼠皮下均出现结节，裸鼠BGC-823-luci移植瘤模型建立成功。细胞悬液处理后至接种完毕需要尽快完成。4）实验动物的活体成像3裸鼠皮下成瘤后，瘤体的体积为50mm时开始注射NDV-D90病毒。4-6天成瘤后，给裸鼠腹腔注射250ul7mg/L戊巴比妥钠和230ul15mg/L的D-荧光素钾盐。10分钟后拿到7小动物成像系统下扫描成像。待裸鼠苏醒后一侧注射100ulTCID50为10/ml的NDV-D90病毒，一侧注射等剂量的PBS溶液作为阴性对照。在注射病毒后1、3、5、10天，都进行小动物成像系统成像。重复该实验3次。3.2.2细胞预感作病毒后的动物实验1）细胞培养将人胃癌BGC-823-luci细胞接种于含10%灭活胎牛血清和双抗（青霉素和链霉素各2100U/ml）1640培养液的75cm细胞培养瓶中，于饱和水分37°C、5%CO2的细胞培养箱中2培养。24h后细胞在75cm细胞培养瓶中的融合度约90%时，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶进行消化、传代。2）实验动物的观察和饲养本实验中，所有的裸鼠均由上海斯莱克实验动物有限责任公司购买。为3周龄雌性BALB/cSPF级裸鼠。裸鼠所用的饮用水、垫料以及饲料均经高压处理，无菌无毒。观察裸鼠7天，无裸鼠死亡和异常反应可进行下一步实验。3）移植瘤模型的建立2取BGC-823-luci细胞接种于75cm的细胞培养瓶中，待细胞长成单层后，加入MOI=0.01的NDV病毒，37°孵育1h。然后弃去培养液，用无菌PBS清洗并弃去病毒液，经过0.25%胰酶消化后，用无菌的PBS溶液清洗细胞3次，离心5min，1000r/min，用4g/L台盼蓝染色后计算细胞活率(98%以上），用PBS缓冲液悬浮细胞并计数。调整细胞数浓7度为5~10×10个/ml。然后在无菌条件下用注射器吸取100ul细胞悬液，接种于经75%酒精消毒裸鼠一个后腿腹内侧皮下。另一个后腿内侧皮下接种的BGC-823-luci细胞为未经过NDV感作的细胞。细胞悬液处理后至接种完毕需要尽快完成。4）实验动物的活体成像在接种瘤后，每天给裸鼠打250ul7mg/L戊巴比妥钠和230ul15mg/L的D-荧光素钾盐。28 10分钟后拿到小动物成像系统下扫描成像。连续观察5天，并都进行活体成像。重复该实验3次。3.2.3制作石蜡切片及HE染色1)移植瘤标本蜡块制备移植瘤标本蜡块制备的具体操作步骤如下：裸鼠人胃癌BGC-823细胞皮下移植瘤组织经10%甲醛溶液固定24h后，取大小约0.5cm×0.5cm×0.3cm的组织块。采用乙醇为脱水剂，脱水步骤的具体步骤如下：①胃癌组织浸泡于50%乙醇6~8h。②胃癌组织浸泡于75%乙醇6~8h。③胃癌组织浸泡于85%乙醇3~5h。④胃癌组织浸泡于95%乙醇1~2h，重复两次。⑤胃癌组织浸泡于无水乙醇中1h，重复两次。透明：将脱水完全的胃癌组织浸泡于透明试剂二甲苯中，浸泡30~40min。透明效果不好，可以进行二次透明。浸蜡：取金属小盒，倒入熔融的石蜡，将透明好的胃癌组织放在熔融的石蜡中，然后放入60℃的恒温箱中放置3h。包埋：浸蜡的胃癌组织置于室温下自然凝固为蜡块。待蜡块的温度冷却到室温时，拆开金属小盒，取出蜡块并做好标记。2)移植瘤组织切片的制备将胃癌组织蜡块放置于切片机中，调整切片机上的参数，设置切片的厚度为4μm，连续切片。将切片展开，置于载玻片上，室温保存备用。3)苏木素—伊红(HE)染色常规苏木素—伊红(HE)染色操作步骤如下：①烤片：将胃癌组织切片置于70℃烤箱2h；②脱蜡：在二甲苯I中放置10min，在二甲苯II中放置5min；③乙醇水化过程：在无水乙醇I中放置5min、在无水乙醇II中放置5min、在95%乙醇放置5min、在85%乙醇放置3min、在75%乙醇中放置2min，在蒸馏水中放置1min，并清洗；④染色：苏木素染色5min，用自来水洗净、盐酸酒精分化15s，自来水洗净、自来水洗净15min，蒸馏水洗2min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、0.5%伊红染lmin、95%乙醇I中5min、95%乙醇II中5min、无水乙醇中5min，二甲苯I中透明5min，二甲苯II中透明5min。⑤封片：上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡中性树胶固封。移植瘤组织切片经常规苏木素—伊红(HE)染色后，于光学显微镜下进行病理形态学观察，并保存图片数据。3.2.4统计和分析采用GraphPadPrism6.0软件进行作图和统计分析，各组间指标的比较采用t检验方29 差分析。实验结果用均数±标准差(means±SD)表示，p<0.05为差异有显著性意义。3.3结果3.3.1实体瘤NDV-D90对BGC-823细胞有很强的杀伤能力。如图3.1，左侧为对照组（注射PBS），7右侧为实验组（注射TCID50为10/0.1mlNDV-D90病毒）。观察各个图中肿瘤组织的变化，对照组（左侧瘤）中随着培养时间越来越长，肿瘤组织的体积越来越大，且荧光信号越来越强。而实验组（右侧瘤）经注射NDV-D90病毒后，肿瘤体积随着病毒与肿瘤组织作用时间越长而越来越小，荧光信号也相应的减弱。图3.1小动物活体成像检测肿瘤细胞的变化Fig3.1Smallanimalinvivoimagingdetectionoftumorcells图3.1中的每个小图中左侧注射100ulPBS为对照组，右侧注射100ulNDV-D90病毒液。A为裸鼠皮下种瘤后，成功成瘤图像。B为注射病毒1天后的活体成像图片。C为注射病毒3天后活体成像图片。D为注射病毒5天后的活体成像图片。E为注射病毒10天后活体成像图片。根据肿瘤发光位置面积的变化绘制如图3.2A所示。根据肿瘤体积计算公式，绘制肿瘤体积变化曲线如图3.3B所示。在注射病毒3天后，实验组肿瘤荧光面积与对照组肿瘤荧光面积相比出现显著差异。在注射病毒5和10天后，实验组肿瘤荧光面积与对照组肿瘤荧光面积相比差异极显著。在注射病毒3天后，实验组肿瘤体积与对照组肿瘤体积相比出现显著差异。在注射病毒5天后，实验组肿瘤体积与对照组肿瘤体积相比差异极显著。在注射病毒10天后，实验组肿瘤体积与对照组肿瘤体积相比差异显著。30 AB图3.2小动物活体成像检测肿瘤体积和面积的变化。Fig3.2TumorAreaandvolumevariationwasdectectedbysmallanimalinvivoimaging图中A为实验组和对照组肿瘤面积的变化，图中B为实验组和对照组肿瘤体积的变化。*表示0.01