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新城疫病毒抑制肝星状细胞活化的初步研究李亚琳渭南肺范学院化学与生命科学学院陕西渭南714099摘要：目的探讨新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)在活化肝星状细胞(Hepaticstellatecell,HSC)中的复制对HSC的活化增殖和细胞生物学功能的阻碍。方式用不同滴度的NDV溶瘤株Italien(NDV-Italien)感染经transforminggrowthfactor-P1(TGF-B1)刺激活化的人肝星状细胞系LX-2,MTT法检测NDV对细胞增殖率的阻碍。免疫荧光显微镜技术检测活化标志物a-SMA的表达转变。结果NDV的感染抑制了LX-2细胞的增殖，细胞增殖率和病毒滴度呈负相关。与未刺激组相较，NDV在TGF-P1刺激的LX-2细胞中的增殖抑制率提高，LX-2细胞的活化标志物Q-SMA的表达显著性下调。结论NDV在活化LX-2细胞中的复制具有抑制细胞增殖和HSC活化的作用。关键词：新城疫病毒；肝星状细胞；TGF-P1ApreliminarystudyofNewcastlediseasevirusrepressingtheavtivationofhepaticstellatecellYaiinLiCollegeofChemistryandLifeScience,WeinanTeacherUniversily,Weinan.Shaanxi.China.714099Abstract:AlmToexploretheinfluenceofNDVreplicationonLX-2cellsonthecellviabilityandbehaviorofcellularbiology.MethodsTransforminggrowthfactor-01(TGF-pi)-stimulatedLX-2cellswereinfectedbydifferenttitresofoncolyticNDV-Italien,theproliferationrateofLX-2cellswasdetectedbyMTTassay.Immunofluorescenttechniquewasusedtodetecttheexpressionofactivationmarkersa-SMAinLX-2cells.ResultsNDVinfectioninLX-2cellsrepressedthecellproliferationinadose-dependentmanner.Comparedwithcontrol,thegrowthinhibitionrateofactivatedLX-2cellswasincreased,theexpressionofactivationmarkersa-SMAofLX-2cellsweredown-regulated.ConclusionThereplicationofNDVinactivatedLX-2cellsrepressesthecellproliferationandattenuatedtheactivationofLX-2cells.Keywords:Newcastlediseasevirus;hepaticstellatecell;TGF-01 基金项目：陕西省教育厅资助项目（新城疫病而抑制肝星状细胞活化的体内外研究），（项目编号：009JK,127）：渭南师范学院基金资助项目（新城疫病毒抑制小鼠肝纤维化的机制研究），（项目编号：10YKZ054）作者单位：714000陕西省渭南市，渭南师范学院作者简介：李亚琳，女，博士，副教授，要紧从事肿瘤生物医治研究Email：通信地址：陕西省渭南市朝阳路西段渭南师范学院化学与生命科学学院，联系：2133096,电话：肝星状细胞（HSC）活化是肝纤维化发生的要紧缘故，而肝纤维化是肝癌前病变的重要病理时期。免疫组化研究显示，肝癌归并肝硬化中活化的HSC数量显著增高，而肝癌细胞分泌的细胞因子也具有增进HSC活化并增殖的作用⑴；活化HSC和癌变细胞的彼此作用会进一步加重肝癌归并肝硬化程度。因此着眼于活化HSC的靶向医治是抑制肝纤维化，改善肝癌状况的一个新的研究热点。新城疫病毒（Newcastlediseasevirus,NDV）是单股负链RNA病毒，属副粘病毒科。由于多数RNA病毒具有天然地在肿瘤细胞选择性复制的特点，最近几年来用这种病毒作为新型运载工具在肿瘤基因医治方面引发了人们的关注⑵刃。而咱们前期的实验已经证明了NDV也能够在活化的HSC中复制。基于那个研究基础，本研究通过测定细胞增殖和a-SMA的表达，证明了NDV在活化的HSC中的复制对HSC的增殖和活化标志蛋白a-SMA的表达的抑制作用，从而为以肝星状细胞为靶点的肝癌归并肝纤维化医治提供实验依据。1材料11细胞与病毒人肝星状细胞系LX-2,美国MountSinai医学院ScottL.Friedman教授馈赠;溶瘤株NDV-Italien由德国癌症研究中心VolkerSchirrmacher教授馈赠。1.2要紧试剂DMEM培育基购于美国Hycolon；新生牛血清购于中国杭州四季青公司；重组人TGF-pl购于以色列PeproTechAsia；鼠抗人a-SMA一抗购于英国Abeam；羊抗鼠偶联AlexaFluor594IgG二抗购于美国Invitrogeno2方式2.1MTT检测NDV感染对LX-2细胞增殖的阻碍LX-2细胞以5xl（）3cells/孔接种在96孔板中培育24h,然后换以％小牛血清的DMEM饥饿24ho然后用2ng/ml的TGF-pl（W/V,用含2%NBCS的DMEM配制）刺激LX-2细胞24h,以不同滴度的NDV感染细胞，细胞培育24h后，MTT法检测NDV对细 胞增殖的阻碍。2.2免疫荧光检测NDV感染后a-SMA在LX-2细胞中的表达LX-2细胞以lxlO%ells/孔接种在6孔板中（预铺盖玻片）。培育24h后,用NDV-Italien（1:400稀释）感染细胞。继续培育24h后，掏出盖玻片，进行a-SMA的免疫荧光检测,步骤如下：PBS洗3次,4%多聚甲醛固定10min：%的TritonX-100（用PBS配）渗透5min；PBST（含％Tween-20的PBS）洗2次后，用5%的羊血清室温封锁20min：直接加入鼠抗人a-SMA一抗（1:50稀释），37℃孵育1h；PBST洗3次后，加入偶联AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗（1:800稀释），37℃避光孵育30min：PBST洗2次后，用DAPI（1:5,000稀释）染核2min；PBS洗3次，荧光显微镜观看a-SMA在细胞中的表达。2.5统计分析数据用三个独立样本的均数土标准差来表示（x土s）,用独立t查验（independentStudents't-test）来分析不同组之间的不同显著性，显著性界限定为PV（双尾）。所有结果通过SPSS统计学软件来完成。3结果3.1NDV抑制LX・2细胞的增殖LX-2细胞会随着传代培育而自发活化⑶。为了考查NDV对LX-2细胞的增殖阻碍，实验用不同稀释浓度的NDV-Italien感染传代到第5代的LX-2细胞和用2ng/mlTGF-pl刺激活化的LX-2细胞，并用MTT方式检测NDV对两组细胞增殖阻碍。如图1所示，LX-2细胞不管是在未刺激状态仍是刺激后的活化状态，NDV均能够抑制细胞的增殖（A）,且具有剂量依托性。可是NDV对2ng/mlTGF-pl刺激活化细胞的增殖抑制率更高（B）,与未刺激组相较具有显著性不同（PV）。 2ng/mITGF-plNDVZ-U0汽ThedilutionofNDV2ng/mlTGF-P1NDV86420864201111130」U。三(=一三1/16001/32001/64001/12800ThedilutionofNDV图1NDV对LX-2细胞生长的抑制作用。LX-2细胞经2ng/mlTGF-pl预刺激后，再用NDV-Italien感染24h。MTT检测细胞在490nm时的吸光度值(A),并计算细胞的生长抑制率(B)o数据为三次独立检测的平均值(x±s).Figure1TheproliferationofLX-2CellswasinhibitedbyNDV.LX-2cellswerepretreatedwith2ng/mlTGF-01,theninfectedwithNDV-Italienfor24h.CellproliferationwasdetectedusingMTTassayatwavelengthof490nm(A)andcellgrowthinhibitionratewascalculated(B).Datarepresentthemeansoftriplicate.2.2NDV抑制LX-2细胞的a・SMA表达实验用NDV-Italien感染传代到第5代的LX-2细胞，免疫荧光法检测细胞中a-SMA的表达。结果显示，在NDV感染前，LX-2细胞中有较强的a-SMA表达(图2A)；而NDV感染后，细胞中a-SMA的表达明显消失(图2B)。 图2LX-2细胞中a-SMA的表达。LX-2细胞接种在6孔板中培育24h,用NDV-Italien感染细胞。24h后，细胞被固定、渗透，羊血清封锁后加入鼠抗人a-SMA一抗，37，C孵育11】。加入偶联AlexaFluor594的羊抗鼠IgG二抗，379孵育30min0用DAPI染核后，荧光显微镜观看a・SMA的表达。NDV感染前(A)；NDV感染后(B),(放大倍数400x)Figure2Theexpressionofa-SMAinLX-2cells.LX-2cellswereinoculatedin96-wellplatesandculturedfor24hfollowedbyinfectionwithNDV-Italien.After24h,thecellswerefixed,permeabilized,blockedbygoatserumandincubatedwithmouseanti-humana-SMAantibodyat37for1h.ThensectionswereincubatedwithAlexaFlour594goatanti-inouseIgGsecondaryantibodyfor30minat37℃.AfterstainedthenucleuswithDAPI,a-SMAexpressionwerevisualizedunderafluorescencemicroscope.BeforeNDVinfection(A);AfterNDVinfection(B).(Magnification400x)4讨论活化HSC高表达a-SMA,因此a-SMA已经被用作判定HSC活化和纤维化进展的标志⑸。而在HSC活化和肝纤维化进程中，TGF-pl无疑是一个重要的调剂因子，是HSC活化的一个关键因素⑹。TGF-pl能够增进HSC由星状的静止状态转型为成肌纤维细胞样的活化状态，诱导HSC活化并产生过量的ECM进而形成肝纤维化亿叫HSC活化和肝纤维化的发生与肝癌发生也有紧密的关系。国内几个报导均用免疫组化证明了肝癌组织中活化的HSC明显高于正常组织阳叫体外实验证明HSC在肝癌的血管生成中起要紧作用口】。有文献报导大鼠的肝癌细胞能增进HSC的召募和活化।⑶；而肝脏损伤后病变的肝细胞也能诱导HSC的活化1口。因此，肝癌发生进展进程中，活化的肝星状细胞和病变的肝细胞彼此作用，一起增进肿瘤发生进程，而靶 向HSC的抗纤维化医治也成为阻止肝癌发生的有效途径之一।也⑸。咱们以前的实验也证明了TGF-pl具有增进HSC活化作用，而且用不同方式证明了NDV能够在活化LX-2细胞中高效复制。本实验通过进一步的研究工作探讨NDV在活化LX-2细胞中的复制对细胞的增殖和活化功能的阻碍，证明了NDV在活化HSC中的复制能够抑制该细胞的增殖及活化，并降低细胞内一些活化相关基因的表达。MTT方式证明，LX-2细胞不管是不是被TGF-pl预刺激，NDV均剂量依托性地抑制细胞的增殖。TGF-pl刺激后，细胞在490nm的吸光度值和计算所得的生长抑制率整体高于未刺激组，说明TGF-P1的刺激诱导了LX-2细胞的增殖，增进细胞的活化。而当NDV感染后，其在TGF-pl刺激活化的LX-2细胞的复制率更高，从而对细胞生长抑制率也比为刺激组高。那个结果说明NDV更易在刺激活化的细胞中复制而引发更高的细胞死亡率，即NDV的复制效率越高，对细胞的生长抑制率也越高，对细胞活化的抑制也加倍有效。为了证明NDV的复制能够抑制HSC的活化，本实验检测了NDV感染对LX-2细胞中的a-SMA表达的阻碍。同预期结果一样，NDV感染后a-SMA表达明显消失。说明NDV的复制确实专门大程度地降低了LX-2的活化程度。NDV能在活化HSC中相对高效地复制，进而抑制细胞的活化功能。以上实验数听说明：NDV在活化HSC中的复制，能够抑制HSC的增殖和活化相关蛋白的表达，很大程度地抑制了HSC的活化功能。该结果为将NDV进一步用于抑制肝纤维化和肝癌医治提供必然的实验基础。参考文献：[1]Myofibroblastsandhepatocellularcarcinoma:aninvivoandinvitrostudy[J|.JHepatol.1998,29:120-128.[2]BianH.FournierP,PeetersB.etal.Tumor-targetedgenetransferinvivoviarecombinantNewcastlediseasevirusmodifiedbyabispecificfusionprotein[J].IntJOncology,2005,27(9):377-384.[3]BianH.FournierP,MoormannR,etal.SelectivegenetransfertotumorcellsbyrecombinantNewcastleDiseaseVirusviaabispecificfusionprotein[J].IntJOncol.2005,26(3):431-439.[4],,,etal.Humanhepaticstellateceilline,LX-1andLX-2:newtoolsforanalysishepaticfibrosis[J].Gut,2005,54:142-151.[5]…etal.Thevalueofa-SMAintheevaluationofhepaticfibrosisseverityinhepatitisBinfectionandcirrhosisdevelopment:ahistopathologicalandimmunohistochemicalstudy[J].Histopathology,2005,47:276-280.[6]Effectsofinterferon-alphaonexpressionofhepaticstellatecellandtransforminggrowthfactor-beta1andalpha-smoothmuscleactininratswithhepaticfibrosis[J].WorldJGastroentcroL2005,11:2634-2636. 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