自体骨髓干细胞治疗糖尿病足的Meta分析

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分类号：R587.1学号：2015110730重庆医科大学硕士学位论文（专业学位）论文题目自体骨髓干细胞治疗糖尿病足的Meta分析作者姓名谢楚玉指导教师姓名（职称、单位名称）简华刚教授重庆医科大学附属第二医院急诊科专业学位类别名称硕士专业学位领域名称急诊医学论文答辩年月2018年5月 重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任。１０学位论文作者签名：曰期：ｇ年今闷学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，日卩：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外）入有关数据库进行检索，并编，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：指导教师签名：＂日期：闷ｉ０等今 目录英汉缩略语名词对照................................................................................1中文摘要....................................................................................................2英文摘要....................................................................................................4论文正文：自体骨髓干细胞治疗糖尿病足的Meta分析.....................6前言......................................................................................................61资料与方法......................................................................................72结果..................................................................................................93讨论................................................................................................15参考文献..................................................................................................17文献综述：慢性创面生物膜分散机制的研究进展..............................21参考文献..................................................................................................26致谢...........................................................................................................29攻读硕士期间发表的论文目录..............................................................30 重庆医科大学硕士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称BMSCBonemarrowstemcell自体骨髓干细胞DFDiabeticfoot糖尿病足RCTSRandomizedcontrolledtrials随机对照试验RRRiskratio风险比MDMeandifference均数差CIConfidenceinterval可信区间EPCEndothelialprogenitorcell.内皮祖细胞VEGFVascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子FGF2Fibroblastgrowthfactor2成纤维细胞生长因子2EGFEpidermalgrowthfactor表皮生长因子ANG1Angiopoietin1血管生成素1IL-1Interleukin-1白细胞介素-11 重庆医科大学硕士研究生学位论文自体骨髓干细胞治尿病足的Meta分析摘要目的系统评价自体骨髓干细胞(bonemarrowstemcells，BMSC)治疗糖尿病足(Diabeticfoot，DF)的临床疗效。方法检索PubMed、TheCochraneLibrary、EMbase、中国期刊全文数据库(CNKI)、维普中文科技期刊全文数据库(VIP)、万方数据库(Wangfang)、中国生物医学文献数据库(CBM)等。两名评价者根据预定的纳入与排除标准独立进行文献筛查及数据提取，应用国际循证医学协作网Cochrane推荐的偏倚风险评价标准进行文献质量评价。将获得的数据使用Cochrane协作网提供的RevMan5.3软件进行Meta分析。结果最终共收集8篇符合纳入与排除标准的随机对照研究(Randomizedcontrolledtrials，RCTs），共包含468例患者。Meta分析结果显示，自体BMSC移植治疗与常规治疗相比，能提高DF病人溃疡愈合率[RR=2.10，95%CI(1.67，2.64)，P<0.00001]，改善踝肱指数[MD=0.16，95%CI(0.13，0.19)，P<0.00001]，提高患肢皮肤温度[MD=1.23，95%CI(0.50，1.96)，P=0.0010]，降低截肢率[RR=0.19，95%CI(0.06，0.66)，P=0.008]，减少间歇性跛行评分[MD=-0.86，95%CI(-0.99，-0.73)，P<0.00001]，降低静息痛评分[MD=-1.33，95%CI(-1.77，-0.88)，P<0.00001]。所有纳入的研究均无治疗相关的不良反应及副作用的报道。结论自体BMSC治疗DF，可提高溃疡愈合率、踝肱指数、患肢2 重庆医科大学硕士研究生学位论文皮肤温度，能降低截肢率、间歇性跛行评分、静息痛评分。但仍需继续进行更多大样本、双盲的RCTs进一步验证。关键词：自体，骨髓干细胞，糖尿病足，Meta分析3 重庆医科大学硕士研究生学位论文META-ANALYSISONTHETREATMENTOFDIABETICFOOTWITHAUTOLOGOUSBONEMARROWSTEMCELLSABSTRACTObjectiveToevaluatetheclinicalefficacyofautologousbonemarrowstemcellsinthetreatmentofdiabeticfoot.MethodsAcomprehensivesearchinPubMed,theCochraneLibrary,EMbase,CNKI,VIP,WangfangandCBMdatabaseswasconducted.Twooftheinvestigatorsindependentlyscreenedallrelevantstudiesandcompleteddataextractionaccordingtothepre-definedinclusionandexclusioncriteriaWeappliedtheriskofbiasescriteria,recommendedby“CochraneHandbookforSystematicReviewsofInterventions”,toperformqualityassessment.AllstatisticalanalyseswereperformedwithReviewManagerSoftware(RevMan5.3).ResultsThecurrentstudycomprised8eligibleRCTs,involving468diabeticfootpatients.Meta-analysisshowedthatcomparedwithconventionaltherapy,autologousBMSCtransplantationcouldpromoteulcerhealingrate[RR=2.10,95%CI(1.67，2.64),P<0.00001],improveankle-brachialindex[MD=0.16，95%CI(0.13，0.19)，P<0.00001]andincreaseskintemperatureofilllimb[MD=1.23，95%CI(0.50，1.96)，P=0.0010].4 重庆医科大学硕士研究生学位论文Besides,autologousBMSCtransplantationcoulddecreasetherateofamputation[RR=0.19，95%CI(0.06，0.66)，P=0.008],reducethescoreofintermittentclaudication[MD=-0.86，95%CI(-0.99，-0.73)，P<0.00001]，anddecreasethescoreofrestpain[MD=-1.33，95%CI(-1.77，-0.88)，P<0.00001].Notreatment-relatedadverseeventsorsideeffectswerereportedforallincludedstudies.ConclusionAutologousBMSCtreatmentforDFcouldpromotetheulcerhealingrate，ankle-brachialindex，andsicklimb’sskintemperature.Besides,AutologousBMSCtransplantationcouldreduceamputationrate,thescoreofintermittentclaudicationandthescoreofrestpain.However,furtherlarge-scale,double-blindrandomizedstudiesareneededtoprovethisoption.Keywords:autologous,bonemarrowstemcells,diabeticfoot,Meta-analysis5 重庆医科大学硕士研究生学位论文自体骨髓干细胞治疗糖尿病足的Meta分析前言近年来随着人们生活水平的不断提高，糖尿病的发病率也在逐年增长。据报道，大约有19%~34%糖尿病患者后期会并发DF，且伴有不同程度的下肢缺血性表现（如静息痛、间歇性跛行、皮肤温度降低、患肢冷感等），并出现复发性溃疡、足坏疽，甚至截肢[1]。DF作为糖尿病常见严重并发症之一，约20%的DF患者面临不同程度的截肢[2]。DF的病因是多因素的，目前认为神经病变及外周血管病变是其主要致病因素，大约有40%的DF合并有不同程度的下肢血管病变[3]。针对DF这一顽固性溃疡，目前的主要治疗措施为控制血糖、控制血压、抗感染、改善循环、营养神经、创面清创、创面负压引流、创面植皮、支架植入术、截肢术等[4,5]。而促进患肢血运恢复是改善DF预后的关键措施之一，由于DF患者下肢血管病变多位于远端，常同时合并多个节段、弥漫性的血管病变，内科保守治疗效果欠佳[6]。DF患者多为高龄病人，心肺功能差，基础疾病多，可能无法耐受支架植入术等血管再通手术。因此,寻找新的治疗措施是必然趋势。干细胞移植作为再生医学的一个重要分支，被广泛应用于心血管系统疾病、血液系统疾病、神经系统疾病、消化系统疾病、急慢性创面等[7]。现已有大量研究报道，自体BMSC能促进DF患者创面愈合，改善血运情况，降低截肢率，缓解静息痛，延长间歇性跛行距离等[8-10]。因此，我们纳入关于自体BMSC移植治疗DF的RCTs进行Meta分析，用以评价自体BMSC移植治疗DF的临床疗效。6 重庆医科大学硕士研究生学位论文1资料与方法1.1纳入标准1.1.1研究类型纳入所有关于自体BMSC移植治疗DF的RCTs，纳入文献的语种无特殊限制。1.1.2研究对象研究对象符合相关临床指南对DF的定义[11,12]，研究对象的性别、年龄、种族、国籍、病程不限。1.1.3干预措施试验组采用自体BMSC移植治疗，进行自体BMSC移植实施方法均为下肢局部肌肉注射，自体BMSC移植治疗中的骨髓动员干预时机、动员方法、骨髓采集的量、治疗时间、实施肌注的距离、肌注间隔面积等不限。对照组采用生理盐水或常规治疗等。1.1.4结局指标①溃疡愈合率；②踝肱指数；③皮肤温度；④截肢率；⑤间歇性跛行评分；⑥静息痛评分。1.1.5排除标准①除DF以外的下肢溃疡。②干预措施不符。③动物实验。④重复发表。⑤实验数据缺失。⑥非RCT研究。1.2检索策略1.2.1计算机检索计算机全面检索PubMed、theCochraneLibrary、EMbase、CNKI、VIP、Wangfang、CBM等数据库，同时追溯相关的会议记录、学位论文等。所有数据库检索时间从建库至2018年2月。1.2.2检索策略7 重庆医科大学硕士研究生学位论文检索策略采取主题词和自由词相结合：1.中文检索式：#1‘糖尿病足’OR‘糖尿病足溃疡’OR‘糖尿病足病变’OR‘糖尿病创面’OR‘慢性创面’OR‘慢性难愈性创面’#2‘自体骨髓干细胞’OR‘骨髓干细胞’OR‘骨髓间充质干细胞’OR‘骨髓单核干细胞’OR‘干细胞治疗’OR‘干细胞移植’OR‘干细胞’#3#1and#22.英文检索式：#1‘diabeticfoot’OR‘diabeticfeet’OR‘diabeticfootulcers’OR‘DF’OR‘diabeticlegulcer’OR‘diabeticwounds’OR‘diabeticfootproblem’OR‘chronicwound’#2‘autologousbonemarrowstemcell’OR‘bonemarrowstemcell’OR‘bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells’OR‘bonemarrow-derivedmononuclearcells’OR‘stemcelltherapy’OR‘stemcelltransplantation’OR‘stemcell’#3#1and#21.3文献筛选两名评价者依据预先设定的纳入与排除标准独立筛选文献，纳入符合自体BMSC移植治疗DF的RCTs。由两名评价者对纳入研究进行交叉核对，对于有争议的结果或征求第三方意见。1.4文献质量评价对纳入研究的文献质量评价应用Cochrane协作网推荐的偏倚风险评价工具进行评价。对纳入文献的随机方法、是否分配隐藏、有无应用盲法、结局数据是否完整、有无选择性发表及其他偏倚来源等6方面进行统计分析。1.5资料提取两名评价者分别对每一篇已纳入文献实施数据提取，并交叉核对，对于有争议的结果或征求第三方意见。提取内容包括：①研究的基本特征：第一作者、发表时间、资料来源、人数、干预措施、随访时间、基线可比性；②结局指标：溃疡愈合率、踝肱指数、皮肤温度、截肢率、间歇性跛行评分、静息痛评分。8 重庆医科大学硕士研究生学位论文1.6统计学方法采用国际循证医学协作网Cochrane提供的系统评价专用软件RevMan5.3行Meta分析。二分类变量采用风险比（Riskratio，RR）为效应指标；连续性变量采用均数差(Meandifference，MD)为效应指标，并均给出95%可信区间(95%Confidenceinterval，95%CI)[13]。根据P值及I2异质性结果决定Meta分析时选择随机效应模型或固定效应模型。当P≥0.1，I2≤50%时，提示各研究间无明显异质性，采用固定效应模型进行Meta分析；当P＜0.1，I2＞50%时，提示各研究间存在统计学异质性，则采用随机效应模型进行Meta分析[14]。2结果2.1文献检索结果最终共检索出RCTs8篇，7篇文献来自中国，1篇来自印度，均为前瞻性研究，包括中文5篇，英文3篇，总病例数468例，其中自体BMSC移植组235例，对照组233例。具体检索流程见图1。通过数据库检索获得相关文献（n=1201）:通过其他资料补充获得PubMed=199，EMbase=160，Cochrane=189，相关文献（n=0）CNKI=499,VIP=430，Wangfang=503，CBM=410排除(n=674)：综述（n=190）非RCT（n=92）剔重后获得文献(n=731)动物实验（n=156）病例报道（n=88）重复报道（n=28）阅读标题和摘要初筛(n=731)干预措施不符（n=120）阅读全文复筛(n=57)排除（n=49）：原始数据缺失（n=11）最终纳入RCTs（n=8）非DF创面（n=38）图1文献检索流程图Fig1Flowdiagramofthesearchstrategyandstudyselection9 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.2纳入研究的基本特征8篇纳入研究的基本特征见表1。表1纳入研究的基本特征Tab1Summaryofincludedstudycharacteristics纳入发表资料总例实验对照干预措施随访基线研究时间来源数组组实验组对照组时间可比张忠[15]2007中国613130Bmsc常规2月可比Lu[16]2008中国452223Bmsc常规3月可比Dash[17]2009印度633Bmsc常规3月可比甘宇[18]2010中国804040Bmsc常规3月可比苗苗[19]2010中国623230Bmsc常规3月可比贾鹏[20]2010中国804040Bmsc常规3月可比Lu[21]2011中国743737Bmsc生理盐水1.5月可比郭梅珍[22]2017中国603030Bmsc常规3月可比2.3纳入研究的偏倚风险评价8篇纳入研究的偏倚风险评价见表2。表2纳入研究的偏倚风险评价Tab2RiskofbiasforeachincludedRCTs纳入随机分配盲法结果数据选择性报其他偏倚文献方法隐藏应用的完整性告结果来源张忠[15]随机不清楚无完整不清楚不清楚Lu[16]随机不清楚无不完整不清楚不清楚Dash[17]随机不清楚无完整不清楚不清楚甘宇[18]随机不清楚无完整不清楚不清楚苗苗[19]随机数字表不清楚无完整不清楚不清楚贾鹏[20]随机数字表不清楚无完整不清楚不清楚Lu[21]信封随机不清楚双盲不完整不清楚不清楚郭梅珍[22]随机不清楚无完整不清楚不清楚2.4结果分析2.4.1溃疡愈合率共有7个[15-17,19-22]研究报道了DF患者溃疡愈合的情况，共纳入300例患者，其中自体BMSC移植组151例，对照组149例。各研究间具有同质性(P=0.92，10 重庆医科大学硕士研究生学位论文I2=0%)，采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示：自体BMSC移植组溃疡愈合率优于对照组，两组差异有统计学意义[RR=2.10，95%CI(1.67，2.64)，P<0.00001]，见图2。图2两组溃疡愈合率Meta分析Fig2Meta-analysisoftherateofulcerhealingintwogroups2.4.2踝肱指数共有6个[16,18-22]研究报道了踝肱指数，共纳入348例患者，其中自体BMSC移植组175例，对照组173例。各研究间具有同质性(P=0.61，I2=0%)，采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示：与对照组相比，自体BMSC移植组的踝肱指数高于对照组，两组差异具有统计学意义[MD=0.16，95%CI(0.13，0.19)，P<0.00001]，见图3。图3两组踝肱指数Meta分析Fig3Meta-analysisofankle-brachialindexintwogroups2.4.3皮肤温度共有3个[18,20,22]研究报道了患肢皮肤温度情况，共纳入220例患者，其中自体BMSC移植组110例，对照组110例。采用随机效应模型进行Meta分析，结果显示：自体BMSC移植组对于提高患肢皮肤温度优于对照组，两组差异具有统计学意义[MD=1.23，95%CI(0.50，1.96)，P=0.0010]，见图4。11 重庆医科大学硕士研究生学位论文图4两组皮肤温度Meta分析Fig4Meta-analysisofskintemperatureintwogroups2.4.4截肢率共有4个[16,19-21]研究报道了截肢情况，共纳入219例患者，其中自体BMSC移植组105例，对照组114例。各研究间具有同质性(P=0.97，I2=0%)，采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示：自体BMSC移植组较对照组能更好降低截肢率，两组差异具有统计学意义[RR=0.19，95%CI(0.06，0.66)，P=0.008]，见图5。图5两组截肢率Meta分析Fig5Meta-analysisoftherateofamputationintwogroups2.4.5间歇性跛行评分共有3个[18,20,22]]研究报道了间歇性跛行评分，共纳入220例患者，其中自体BMSC移植组110例，对照组110例。各研究间具有同质性(P=0.64，I2=0%)，采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示：自体BMSC移植组的评分低于对照组的间歇性跛行评分，两组差异具有统计学意义[MD=-0.86，95%CI(-0.99，-0.73)，P<0.00001]，见图6。图6两组间歇性跛行评分Meta分析Fig6Meta-analysisofthescoreofintermittentclaudicationintwogroups12 重庆医科大学硕士研究生学位论文2.4.6静息痛评分共有5个[16,18,20-22]研究报道了静息痛评分，共纳入339例患者，其中自体BMSC移植组169例，对照组170例。采用随机效应模型进行Meta分析，结果显示：自体BMSC移植组与对照组相比，能更好降低静息痛评分，两组差异具有统计学意义[MD=-1.33，95%CI(-1.77，-0.88)，P<0.00001]，见图7。图7两组静息痛评分Meta分析Fig7Meta-analysisofthescoreofrestpainintwogroups2.5发表偏倚通过漏斗图分析文献的发表偏倚情况。本荟萃分析漏斗图以溃疡愈合率为指标，以RR值为横轴，SE（LogRR）为纵轴，结果显示非对称性分布，提示纳入的文献存在一定程度的发表偏倚，见图8，考虑原因为纳入文献量及研究样本量少。图8纳入研究漏斗图分析Fig8Invertedfunnelplotofincludedstudies2.6敏感性分析敏感性分析是通过去除单项研究法实施，即对纳入的研究逐篇剔除后再行13 重庆医科大学硕士研究生学位论文Meta分析。对6个结局指标分别行敏感性分析，结果显示：溃疡愈合率、踝肱指数、截肢率、间歇性跛行评分经逐项剔除后得到的Meta分析结果与之前结果相比无本质性改变，提示结果稳定可靠。而皮肤温度、静息痛评分2项结局指标经逐项剔除后发现较之前结果仍存在较大异质性（见表3，表4），且无法明确解释异质性来源原因，说明对于皮肤温度、静息痛评分这两项结局指标，所纳入的各研究间结果尚不太一致，暂不能做出肯定结论，未来期待更多大样本、双盲的RCTs加以证实及评价。表3皮肤温度敏感性分析Tab3Sensitivityanalysisofskintemperature皮肤温度（℃）Meta分析结果异质性结果3个研究[18,20,22]MD=1.2395%CI(0.50,1.96)P=0.003;I²=83%2个研究[18,20]MD=1.5295%CI(0.72,2.32)P=0.03;I²=78%2个研究[18,22]MD=1.2395%CI(0.87,1.59)P=0.0006;I²=92%[20,22）2个研究MD=0.8795%CI(0.51,1.23)P=0.22;I²=33%表4静息痛评分敏感性分析Tab4Sensitivityanalysisofthescoreofrestpain静息痛（评分）Meta分析结果异质性结果5个研究[16,18,20-22]MD=-1.3395%CI(-1.77,-0.88）P<0.00001;I²=89%4个研究[18,20-22]MD=-1.3295%CI(-1.88,-0.76）P<0.00001;I²=92%4个研究[16,20-22]MD=-1.2795%CI(-1.88,-0.66）P<0.00001;I²=91%4个研究[16,18,21,22]MD=-1.3995%CI(-1.94,-0.85）P<0.00001;I²=90%4个研究[16,18,20,21]MD=-1.5095%CI(-1.92,-1.08）P<0.0001;I²=86%4个研究[16,18,20,22]MD=-1.1495%CI(-1.52,-0.76）P=0.001;I²=81%3个研究[16,18,21]MD=-1.6595%CI(-2.07,-1.23）P=0.006;I²=80%3个研究[16,20,21]MD=-1.4995%CI(-2.13,-0.86）P<0.0001;I²=91%3个研究[16,21,22]MD=-1.3495%CI(-2.20,-0.48）P<0.00001;I²=93%3个研究[18,20,21]MD=-1.5595%CI(-2.10,-1.01）P<0.0001;I²=90%3个研究[18,21,22]MD=-1.4195%CI(-2.15,-0.67）P<0.00001;I²=93%3个研究[20-22]MD=-1.2495%CI(-2.10,-0.39）P<0.00001;I²=94%3个研究[16,18,20]MD=-1.3195%CI(-1.61,-1.01）P=0.05;I²=66%3个研究[16,18,22]MD=--1.1695%CI(-1.70,-0.63）P=0.001;I²=85%3个研究[16,20,22]MD=-1.0095%CI(-1.39,-0.60）P=0.04;I²=70%3个研究[18,20,22]MD=-1.0795%CI(-1.59,-0.55）P=0.0004;I²=87%14 重庆医科大学硕士研究生学位论文3讨论3.1自体BMSC治疗DF的疗效与局限性自体BMSC是一类具有多向分化潜能的细胞，可分化成各种组织细胞，如血管细胞（vascularcell）和血管内皮主细胞（endothelialprogenitorcell，EPC），并进一步形成新生毛细血管[23]。自体BMSC是临床治疗DF较为常见的干细胞类型[24]。本荟萃分析结果显示：较常规治疗相比，自体BMSC移植能促进溃疡愈合[P<0.00001]，改善DF患者踝肱指数[P<0.00001]，提高患肢皮温[P=0.001]，减少DF截肢率[P=0.008]，降低间歇性跛行评分[P<0.00001]，降低静息痛评分[P<0.00001]。自体BMSC能产生多种促血管生长因子，如血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF），成纤维细胞生长因子2（Fibroblastgrowthfactor2，FGF2），表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF，血管生成素1（angiopoietin1，Ang1），白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）等，这些促血管生长因子能改善局部缺血组织的血管新生，促进创面的愈合[25]。Kusmanto[26]等人通过一项双盲随机对照试验比较VEGF与安慰剂对DF患者溃疡愈合的影响，结果显示：与对照组相比，VEGF组DF创面的面积减少了60%。甘宇等[18]人对20例DF患者行自体BMSC移植，研究结果发现：移植术后1周复查病人体内血清VEGF较移植前明显升高，同时患者踝肱指数、静息痛评分、间歇性跛行评分等均有所改善。自体BMSC移植能有效促进创面中细胞外基质产生、角质细胞形成、细胞迁移和血管生成[27,28]。有研究[29]对比自体BMSC移植前后患肢动脉造影的血流情况，结果发现移植后下肢局部血流较移植前明显丰富，且伴有新生血管生成，表明干细胞在一定程度上可改善下肢血液循环，促进侧支血管生成、血运重建，有效改善局部微循环、降低截肢率。自体BMSC移植治疗DF的局限性主要体现在以下几个方面：1）自体BMSC移植的采集和分离需要较为成熟的技术及设备支持；2）自体BMSC移植属于有创操作，虽然创伤较小，但部分患者对骨髓采集及移植存在恐惧心理；3）自体BMSC移植治疗方法仍处于临床研究阶段，且目前尚缺乏统一的自体BMSC移植操作规范，对于骨髓动员干预时机、动员方法、骨髓采集的量等在各研究中均未完全统一15 重庆医科大学硕士研究生学位论文[15-22,30-32]，未来需要更多高质量研究进一步进行规范；4）自体BMSC移植治疗DF的机制仍需进一步详细探究。3.2本系统评价的局限性（1）纳入的研究样本量较少，文献质量欠佳，所纳入的文献来源大部分为中国，考虑与不同地区的国情、宗教信仰、经济水平、道德伦理有关，可能存在选择偏倚；（2）部分纳入的原始研究，方法学质量不高，大部分研究未具体阐述随机方法、未采用盲法及分配隐藏，可能存在实施偏倚、选择偏倚；（3）报道皮肤温度这一结局指标的各项研究中，其研究对象种族、疗程、剂量、病程、随访时间等均不同，且各研究中测量体温的仪器亦不同，考虑存在选择偏倚及测量偏倚等可能，由于样本量少，无法进一步进行亚组分析。而报道静息痛评分这一结局指标的各项研究中，静息痛评分标准相同，而研究对象普遍高龄、文化素质水平参差不齐，因此可能受研究对象的主观感受影响存在报告偏倚可能；（4）本项荟萃分析纳入的各研究中均未报道糖尿病周围神经病变，自体BMSC移植对糖尿病周围神经病变的影响尚无定论；（5）纳入的各研究中自体BMSC动员时所需的药物剂量、动员时间、采集的骨髓量等存在差异，不同变量对DF疗效是否存在差异需进一步研究探讨；（6）纳入的研究均未报道与自体BMSC移植治疗相关的副作用，但并不说明自体BMSC移植治疗方法一定安全，其中可能存在选择报道或者其他原因，未来相关研究需延长随访时间，观察其长期副作用，并结合治疗费用等因素进一步评估其治疗优劣性。综上，自体BMSC移植治疗DF与常规治疗相比疗效确切，可促进DF患者溃疡愈合，改善踝肱指数，提高患肢皮温，降低截肢率，降低间歇性跛行评分，降低静息痛评分，且未出现与治疗相关副作用。但纳入研究均样本量小，纳入研究的文献质量较差，对实验的结果准确性可能造成影响，最终影响评价结果，未来仍需进行更多大样本、多中心、双盲的RCTs进一步验证。16 重庆医科大学硕士研究生学位论文参考文献[1]ArmstrongD.G.,AjmBoulton,BusS.A.DiabeticFootUlcersandTheirRecurrence[J].NewEnglandJournalofMedicine,2017,376(24):2367-2375.[2]LipskyBenjaminA,BerendtAnthonyR,CorniaPaulB,etal.2012InfectiousDiseasesSocietyofAmericaClinicalPracticeGuidelinefortheDiagnosisandTreatmentofDiabeticFootInfections[J].ClinicalInfectiousDiseasesAnOfficialPublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2012,54(12):e132-173.[3]PrompersL.,SchaperN.,ApelqvistJ.,etal.Predictionofoutcomeinindividualswithdiabeticfootulcers:focusonthedifferencesbetweenindividualswithandwithoutperipheralarterialdisease.TheEURODIALEStudy[J].Diabetologia,2008,51(5):747-755.[4]EverettE,MathioudakisN.Updateonmanagementofdiabeticfootulcers[J].AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,2018,1411(1):153-165.[5]闫振成.糖尿病足的诊治进展[J].重庆医科大学学报,2017,42(3):263-267.[6]MargolisD.J.,KantorJ,BerlinJ.A.Healingofdiabeticneuropathicfootulcersreceivingstandardtreatment.Ameta-analysis[J].DiabetesCare,1999,22(5):692-695.[7]LarijaniB,EsfahaniE.N.,AminiP,etal.Stemcelltherapyintreatmentofdifferentdiseases[J].ActaMedIran,2012,50(2):79-96.[8]HansonSummerE.,KleinbeckKyleR.,CantuDavid,etal.Localdeliveryofallogeneicbonemarrowandadiposetissue-derivedmesenchymalstromalcellsforcutaneouswoundhealinginaporcinemodel[J].JournalofTissueEngineering&RegenerativeMedicine,2016,10(2):E90-E100.[9]DabiriG,HeinerD,FalangaV.Theemerginguseofbonemarrow-derivedmesenchymalstemcellsinthetreatmentofhumanchronicwounds[J].ExpertOpiniononEmergingDrugs,2013,18(4):405-419.[10]HumpertP.M.,BärtschU,KonradeI,etal.Locallyappliedmononuclearbonemarrowcellsrestoreangiogenesisandpromotewoundhealinginatype2diabeticpatient[J].Experimentalandclinicalendocrinology&diabetes:officialjournal,17 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重庆医科大学硕士研究生学位论文体周围环境的细菌群体密度，进而调控相关基因的表达，是细菌调控生命活动的主要机制之一。近年来许多研究表明，QS在调节BF的分散阶段中有一定作用[5]。生物膜形成是细菌以协作的方式完成的最常见的过程之一，QS作为细菌协作的重要机制，广泛存在于G-和G+菌中。QS信号分子主要包括酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserinelactone，AHL)，呋喃酮酰硼酸(furanosylboratediesters，AI2)，顺式不饱和脂肪酸(DSF家族信号)和肽[6]。以铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)为例，其群体感应系统是由拥有两个完整的AHL系统(LasI/LasR和RhI/RhlR)和喹诺酮类信号系统(pseudomonasquinolonesignalPQS系统)构成，通过调控构建生物膜基质中富含葡萄糖基因pel的转录化合物的合成来促进生物膜的分散；通过调控表面活性剂(鼠李糖脂等)的生成促进生物膜的解离[6]。Mayri等[7]在研究表面活性剂(鼠李糖脂)对枯草芽孢杆菌BBK006生物膜的破坏或抑制作用过程中，得出鼠李糖脂的产生是受QS感应系统调节的，是有利于BF的分散；此外，QS还可以调控细菌胞内第二信使c-di-GMP，c-di-GMP的增加能促进生物膜的形成，反之则抑制生物膜的形成，更利于分散解离[8]。在金黄色葡萄球菌BF形成过程中的QS系统是指辅助基因调节系统(accessorygeneregulator，Agr)，Agr系统由膜结合蛋白(AgrB)、AgrB修饰的前体肽(AgrD)、组氨酸蛋白激酶(AgrC)及AgrC可识别的反应调节子(AgrA)组成的细菌双组分信号转导系统[6]。Agr系统在金黄色葡萄球菌中激活后，能启动其RNAIII效应分子的表达，进而调控多种毒力因子的产生，比如调控具有表面活性剂性质的特定类别的分泌肽：酚可溶性调节肽(phenolsolublemodulins，PSMs)。PSM不仅可以直接影响生物膜分散，而且可以通过影响生物膜的体积、厚度、粗糙度及通道形成，进一步调节生物膜的分散。综上，在生物膜分散期，细菌可利用QS系统影响种群的社会行为，进而调控BF的形成或分散。然而，对于混合菌生物膜间QS系统的相互作用仍需进一步研究。1.2BF分散与降解酶1.2.1蛋白酶类细胞外蛋白质是细胞外聚合物(extracellularpolymericsubstance，EPS)的重要组成成分，外源蛋白质对维持和修饰EPS的能力至关重要。降解细胞外蛋白质是降解EPS的措施之一，可促进生物膜分散发生。金黄色葡萄球菌作为创面中常见革22 重庆医科大学硕士研究生学位论文兰氏阳性病原体，可分泌10余种的蛋白酶，包括7种丝氨酸蛋白酶(SspA和SplA-F等)，2种半胱氨酸蛋白酶(SspB和ScpA)和1种金属蛋白酶(Aur)，其中SspA、SspB、ScpA和Aur均被证明参与生物膜的破坏[9]。Loughran将Aur，ScpA和SspB在体外纯化，并通过外源性的方式加入已建立的金黄色葡萄球菌生物膜中，分析其结果显示均具有促进生物膜分散的作用，且Aur是效果最明显的[10]。Aur是一种葡萄球菌金属蛋白酶，可通过降解生物膜相关蛋白(biofilm-associatedprotein，Bap)和凝集因子B(clumpingfactorB，ClfB)破坏金黄色葡萄球菌生物膜[11]。1.2.2脱氧核糖核酸酶类(DNase)在许多生物膜中，细胞外DNA(eDNA)作为EPS的结构性支架，可促进细菌粘附、聚集。在2002年，Whitchurch等[12]发现eDNA是BF的另一重要组成部分，经体外试验加入外源性脱氧核糖核酸酶(DNaseI)能够抑制P.aeruginosa生物膜的形成，用DNaseI处理已建立的P.aeruginosa生物膜60小时后分析其结果示DNaseI可促进生物膜分散。用DNaseI预处理金黄色葡萄球菌生物膜后，再加用妥布霉素后可增强妥布霉素的杀菌活性，这可能与DNaseI能降解eDNA有关[13]。研究发现，DNase1L2也能促进P.aeruginosa及金黄色葡萄球菌的生物膜分散[14]。链球菌去氧核糖核酸酶也能干扰已建立的P.aeruginosa生物膜[15]。1.2.3糖苷水解酶类糖苷水解酶类主要是水解生物膜中的胞外多糖成分。胞外多糖为生物膜的建立和维持提供了许多重要帮助，比如结构稳定性、耐药性、对宿主免疫进行物理和化学防御、促微生物细胞的粘附和聚集及在营养不足时提供碳源。经研究，至少有三种胞外多糖参与P.aeruginosa感染的生物膜形成，如，Psl、Pel和藻酸盐，藻酸裂解酶能降解P.aeruginosa菌株生物膜胞外多糖-藻酸盐导致生物膜分散；PslG具有糖苷内切酶的典型特征，主要破坏Psl基质以分散生物膜中的细菌[16]。分散蛋白B(DspB)通过水解β-(1，6)糖苷键来降解多糖，能破坏β-1，6-乙酰氨基葡聚糖(poly-β-1，6-N-acetyl-d-glucosamine，PNAG)，破坏其生物膜基质，促进生物膜分散解离，使细菌成浮游状态[17]；该酶能作用于多种细菌生物膜，包括金黄色葡萄球菌，放线菌素，表皮葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯杆菌，大肠杆菌，伯克霍尔德氏菌属和荧光假单胞菌。研究发现，多种细菌能产生透明质酸酶，透明23 重庆医科大学硕士研究生学位论文质酸酶促进生物膜的分散主要是通过分解透明质酸；而当透明质酸酶缺陷时能抑制生物膜的分散[18]。纤维素酶可由多种微生物产生，其水解的部位是β(1，4)糖苷键。Fleming等[19]人经试验发现α-淀粉酶、纤维素酶能导致金黄色葡萄球菌和P.aeruginosa生物膜的分散。1.3BF分散与特殊化合物的产生此外，生物膜分散与一些特殊化合物的产生相关。生物表面活性剂主要是微生物细胞表面的两亲化合物，它所具有的表面活性作用能降低细胞与细胞间、细胞与基质间的黏附作用[20]，此前有报道将生物表面活性剂作为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌剂。鼠李糖脂是一种糖脂生物表面活性剂，由连接到脂肪酸链上的二-鼠李糖或单-鼠李糖构成，经试验发现能促进生物膜分离[7]。PSM-β肽能促进表皮葡萄球菌生物膜结构分离[21]。Xing等[22]人发现，D-氨基酸(D-aminoacids)可以预防生物膜的形成并分解枯草芽孢杆菌、P.aeruginosa和金黄色葡萄球菌的现有生物膜；D-氨基酸可以由多种细菌产生，通过调整外源性D-酪氨酸浓度，结果显示生物膜环境中D-酪氨酸浓度越高，粘附性越低，破坏率越高，推测D-酪氨酸可能是生物膜分散的一种信号之一。此外，温度、pH值和营养条件(如营养饥饿)[23]、一氧化氮(NitricOxide，NO)[24]、金属敖合剂[25]、脂肪酸样信号[26]、乳铁蛋白[27]等多种因素均可调节生物膜的分散。2生物膜分散的临床意义慢性创面生物膜为微生物群体的生存创造了更好的条件，不利于慢性创面愈合。慢性创面的传统治疗手段一般为采用大剂量的抗生素、物理清创、负压吸引及新型敷料等，但其效果均有一定的局限性，且经治疗后，这些慢性伤口常复发。生物膜通过黏附素黏附于宿主或物体的表面，其胞外基质有助于生物膜抗生素耐药性的形成。通过促进生物膜分散阶段的发生，联合传统治疗方案可能更利于创面愈合。研究表明QS参与生物膜形成、维持和分散，QS抑制剂(QSinhibition，QSI)可以抑制QS信号分子合成或降解；抑制信号分子与受体的结合或抑制信号转导级联的触发来实现QS抑制。Brackman等[5]提出QSI可作为抗菌剂，如S-腺苷同型半胱氨酸、西奈芬近、5-甲基硫代腺等。金缕梅能干扰金黄色葡萄球菌TraPQS系统，通过对细菌细胞壁厚度的影响和生物膜eDNA降解释放，来达到生物膜易感性。24 重庆医科大学硕士研究生学位论文从分子层面上来看可能是通过肽聚糖和肽聚糖前体的生物合成(包括参与L-赖氨酸和葡糖胺-6-磷酸合成的基因)和自溶调节剂(如lytS)的差异性表达，最终实现对金黄色葡萄球菌生物膜的干。Kutty等[28]人制备不同NO供体的AHL-NO杂交体作用于铜绿假单胞菌生物膜，并评估其生物学作用，分析其结果表明以硝酸盐为供体NO的AHL杂交体其生物活性最高，能抑制QS并减少相关的毒力因子合成，这可能提示将不同的化合物混合可能表现出协同效应。Bhattacharjee等[29]人经试验发现由铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂同样对大肠杆菌生物膜起分散作用，这可能与鼠李糖脂选择性地改变了大肠杆菌膜对某些分子的渗透性，如亲脂性AHL中的3oxoC12HSL有关。然而单独应用鼠李糖脂对大肠杆菌缺乏任何生长抑制或生物膜分散活性，这提示细菌衍生的分散剂不但可以分散自身生物膜，还可以对一些其他细菌物种生物膜起分散作用。这种能诱导自分散和种间分散的信号分子为治疗以混合菌感染为主的慢性创面提供新的治疗方向。体外实验证明乙二胺四乙酸(EDTA)是P.aeruginosa和金黄色葡萄球菌生物膜的有效分散剂和杀菌剂，加用EDTA可致QS中AI2含量降低，这也为开发抵抗细菌感染的无毒的、有效的AHL拮抗剂提供基础。EDTA和庆大霉素联用对P.aeruginosa生物膜的清除能力优于单独应用EDTA，考虑两者存在协同作用关系[30]。经生物膜降解酶DNaseI及分散蛋白B预处理的金黄色葡萄球菌生物膜可增强妥布霉素的杀菌活性[13]。3展望综上所述，生物膜的分散阶段受到多种机制调节以及内外界环境因素的调控，研究相关的促生物膜分散剂能为解决临床上慢性创面难愈合问题提供新思路。然而，临床中慢性创面以多种细菌的混合感染为主，且不同的慢性创面病种中，其主要优势菌群不同，而目前对于生物膜分散机制研究均以纯种生物膜为基础，无法模拟真实的慢性创面中的微生物生物膜。因此，未来关于以混合菌感染的不同的慢性创面BF分散机制的研究仍有待进一步的明确和完善。25 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重庆医科大学硕士研究生学位论文致谢时光荏苒，转眼便到了毕业季。值此离别之际，我有许多不舍，有许多的感谢要说。首先我要感谢的是我的导师：简华刚教授。“桃李不言，下自成蹊”，在这宝贵的三年研究生学习生涯中,简老师不仅在学业上、工作上给我以谆谆教导，同时还在思想上、生活上给我以细致入微的关怀；导师严谨的工作作风，求实的治学态度，渊博的学识修养，高超的诊疗技术是我毕生学习的榜样。在此，我想向您诚挚的道一声：谢谢您，简老师！衷心感谢王晓龙老师，宗建春老师，王丽华老师，李淳文老师及急救部全体医护老师在研究生学习期间给我诸多教诲和无私关爱。衷心感谢秦开秀师姐，曾勇师兄，刘风师姐等各位师兄师姐、师弟师妹在学习生活中给予我的诸多关爱与帮助。衷心感谢我的家人和朋友对我的理解、支持与信任。衷心感谢重庆医科大学及第二临床学院给我提供一个这样良好的学习平台。最后，衷心感谢各位答辩评审组专家教授。谢谢大家！29 重庆医科大学硕士研究生学位论文攻读硕士期间发表的论文目录[1]谢楚玉,简华刚.慢性创面生物膜分散机制的研究进展[J].重庆医学,2018,47(04):560-563.30