运动激活自噬相关信号通路对阿尔茨海默病模型大鼠的影响研究

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摘要研究目的：目前我国已进入老龄化社会，神经退行性疾病发病率明显上升，已成为继癌症、心脑血管病、糖尿病后第四大影响国民体质健康的疾病。阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)又称老年性痴呆，是一种多发生在老年，以进行性认知障碍和记忆能力损伤为主要临床症状的神经系统退行性疾病，目前我国AD发病率明显呈上升趋势，而适宜负荷的运动被认为是非药物干预AD的一种有效策略。近年来，一种新的细胞自杀性死亡方式－自噬（autophagy）引起人们广泛的注意，通过自噬途径可以使功能障碍的细胞器或异常折叠的蛋白质得到有效降解，在维持细胞稳态方面发挥重要作用。但运动对AD神经元自噬相关通路的影响目前研究还很少，其机制有待于进一步阐明。本研究拟探讨长期中等负荷的运动刺激对D-半乳糖注射致AD模型大鼠学习记忆能力的影响及海马神经元自噬相关信号通路的影响及分子机制，为研究探索AD发病机制和治疗方案开辟新的思路。研究方法：本研究选取2月龄雄性SD大鼠为研究对象，实验前，随机将大鼠分为4组，即正常对照组(NormalControlGroup,NC组)、运动对照组（ExerciseControlGroup,EC组）、AD模型对照组(AlzheimerControlGroup,AC组)、AD模型训练组(AlzheimerExerciseGroup,AE组)，每组20只。NC组按常规饲养，自由活动，每日上午腹腔注射1次生理盐水(150mg/kg)，共8周；AC组按常规喂养，自由活动，每日上午腹腔注射1次D-半乳糖(150mg/kg)，共8周；AE组除每日腹腔注射D-半乳糖(150mg/kg)外，还进行跑台训练，共8周。大鼠训练方案为：第1周跑速10m/min，30min/d，6d/w，周日休息；第2-4周跑速15m/min，45min/d，6d/w，周日休息；第5-8周跑速15m/min，60min/d，6d/w，周日休息；EC组的训练方案同AE组，也持续8周。实验结束后，通过Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力；Nissl法检测海马神经元存活状态；Golgi法检测海马神经元树突密度；免疫荧光染色检测磷酸化AMPK表达；化学比色法测定海马组织超氧化物歧化酶（SOD）活性,丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH）含量；Westernblot法检测P-AMPK、LC3I、LC3II、Beclin-1、P-Akt和Bcl-2的表达。采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有数据均以xs表示，两组数据比较使用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果：定位航行实验结果显示，各组大鼠的Morris水迷宫逃避潜伏期随实验时间的增加都有下降的趋势。在实验的第3、4、5天，AC组和AE组逃避潜伏期与NC组比较，明显增加(p<0.05，p<0.01)。在实验第5天，AE组逃避潜伏期与AC组比较，明显降低(p<0.01)。与NC组相比，AC组在目标象限停留的时间明显降低(p<0.01)，II 穿越原平台位置次数也显著减少(p<0.01)，表明AC组大鼠的空间探索能力与NC组相比明显减弱。与AC组比较，AE组在目标象限停留的时间明显变长(p<0.05)，穿越原平台位置的次数也显著增加(p<0.01)。Nissle染色显示，NC组与EC组神经元饱满，细胞边界清晰，细胞排列紧密；AC组神经元排列稀疏，细胞边界模糊，细胞核出现大量固缩；AE组神经元部分细胞核也出现固缩，但细胞排列较清晰、紧密。Golgi染色结果表明，AC组海马神经元侧树突数目较NC组显著减少(p<0.01)，但AE组大鼠神经元侧树突数目较AC组和NC显著增加(p<0.01，p<0.05)；免疫荧光染色显示，AE组海马组织P-AMPK被激活；酶活性检测结果表明，AE组海马组织SOD活性明显提高（P<0.01），MDA含量显著降低（P<0.01），但GSH活性表达无明显差异（P>0.05）;WesternBlot检测结果显示，与NC组比较，AC组P-AMPK蛋白表达明显降低(p<0.01)，AE组P-AMPK表达较NC组和AC组明显增强(p<0.01)。AE组LC3II/LC3I比值较NC组和AC组明显增强(p<0.01)，其余三组LC3II/LC3I比值无显著性差异。与NC组相比，EC组和AE组Beclin-1蛋白表达明显增强(p<0.01)，AC组Beclin-1蛋白表达明显降低(p<0.01)；与AC组相比，AE组Beclin-1蛋白表达明显增强(p<0.01)。与AC组相比，AE组P-Akt、Bcl-2蛋白表达明显增加。研究结论：(1)8周的跑台运动可明显改善AD模型大鼠的学习和和记忆能力，这与AD大鼠海马CAI区神经元损伤数量减少和海马神经元树突密度增加密切相关。(2)8周的跑台运动可激活AD大鼠神经元磷酸化AMPK的表达，进而引起神经元自噬，表现为自噬的标志性蛋白LC3与Beclin-1在海马神经元表达明显增加。(3)8周的跑台运动可以通过提高AD大鼠海马组织SOD的活性，降低MDA的沉积从而保护AD大鼠的神经元。(4)8周的跑台运动可提AktBcl-2信号通路的表达，从而促进神经元存活。关键词：运动；阿尔茨海默病；AMP依赖的蛋白激酶；自噬论文类型：基础研究型III AbstractObjective:Atpresent,Chinahasenteredtheagingsociety,agingandagingrelateddiseaseshavebecomeoneofthemajorissuesfacingthecountryandsociety.Alzheimer'sdisease(AD),alsoknownasseniledementia,isamostlyoccursintheelderly,ofcognitiveimpairmentandmemoryabilitydamageasthemainclinicalsymptomsofnervoussystemdegenerativediseases,withtheaccelerationofpopulationagingprocess,ADincidencerateassumesthetrendofescalationobviously,suitableformovementoftheloadisconsideredtobeaneffectivestrategyfornondruginterventionad.Inrecentyears,anewkindofcelldeathmodeofautophagyhasattractedwidelyattention.Byautophagypathwaycandegradationdysfunctionoforganellesand/orabnormallyfoldedproteins,playanimportantroleinmaintainingcellularhomeostasis.However,thereislittleresearchonthecurrentstudyoftheautophagypathwayinADneurons.Themechanismneedstobefurtherclarified.Thisstudyintendstoexplorethelong-termmoderateloadmotorstimulationofinjectionofD-galactoseinducedADmodelratslearningandmemoryinfluenceandhippocampalneuronalautophagyrelatedsignalingpathwaysandmolecularmechanisms,astheresearchtoexploretheADpathogenesisandtreatmentoptionsofopeningupnewideas.Methods:ThisstudyselectedtwomontholdmaleSDratsastheresearchobject,beforetheexperiment,SDratswererandomlydividedinto4groups,namelynormalcontrolgroup(NCgroup,normalcontrolgroup),exercisecontrolgroup(ECgroup,exercisecontrolgroup),admodelgroup(ADcontrolgroupACgroup),admodeltraininggroup(Alzheimer'sexercisegroupandAEgroup),20ratsineachgroup.NCgroupaccordingtoconventionalbreeding,freeactivities,dailymorningintraperitonealinjectionofasaline(150mg/kg),atotalof8weeks;ACgroupaccordingtoconventionalfeeding,freeactivities,dailymorningintraperitonealinjectionof1D-galactose(150mg/kg),atotalof8weeks;groupofAEinadditiontothedailybyintraperitonealinjectionofD-galactose(150mg/kg),treadmilltrainingfor8weeks.Ratsweretrainedto:1weekrunningspeedof10m/min,30min/D,6D/Wfor,Sundayrest;at2-4weeksrunningspeed15m/min,45min/d,6D/Wfor,Sundayrest;the5-8weekrunspeed15m/min,60min/D,6D/Wfor,Sundayrest;ECgrouptrainingprogramwiththeAEgroupandcontinuesfor8weeks.Aftertheendoftheexperiment,byMorriswatermazetestineachgroupofratslearningandmemoryability;Nisslstainingwasdetectedinthehippocampusneuronsurvivalstate;Golgimethodtodetectthehippocampalneuronaldendriticspinedensity;immunofluorescencestainingdetectionofphosphorylatedAMPKexpression;chemicalcolorimetrytodetecthippocampaltissuesuperoxidedismutase(SOD)activity,malondialdehyde(MDA)contentandglutathioneperoxidase(GSH)content;Westernblotwasusedtodetectthep-ampk,lc3i,III lc3ii,beclin-1,p-Akt,bcl-2expression.SPSS13.0softwarewasusedforstatisticalanalysis,alldatawereexpressed,thetwogroupsofdatawerecomparedusingttest,multiplegroupswerecomparedusingANOVA,P<0.05forthedifferencewasstatisticallysignificant.Results:theexperimentalresultsshowedthattheescapelatencyofMorriswatermazeineachgroupdecreasedwiththeincreaseoftheexperimentaltime.Inexperimentthird,4,5days,ACgroupandAEgroupescapelatencycomparedwithNCgroup,significantlyincreased(p<0.05,p<0.01).Onthefifthdayoftheexperiment,theescapelatencyofAEgroupwassignificantlylowerthanthatofACgroup(p<0.01).ComparedwiththeNCgroup,theACgroupinthetargetquadrantofthestaytimewassignificantlyreduced(p<0.01),thenumberoftimesthroughtheoriginalplatformalsosignificantlyreduced(p<0.01),whichshowsthatthespaceexplorationabilityofACgroupwassignificantlyreducedcomparedwiththeNCgroup.ComparedwiththeACgroup,theAEgroupwassignificantlylonger(p<0.05)inthetargetquadrant,andthenumberofcrossingtheoriginalplatformwassignificantlyincreased(p<0.01).Nisslestainingshowed,NCgroupandECgroupofneuronsinthebrainisfull,clearcellboundary,tightlypackedcells;ACgroupofneuronsarrangedinasparse,fuzzyboundarycells,massivepyknoticnucleiappear;AEgroupneuronsnucleusalsoappearedpyknosis,butcellsarrangedmoreclearandtight.ExpressionofactivatedneuronsofratssignificantlyreducedthenumberofGolgistainingresultsshowthattheACgroupinhippocampalneuronsofthecontralateraldendritesthanintheNCgroup(P<0.01),buttheAEgrouponthelateraldendritenumbercomparedwiththeACgroupandNCincreasedsignificantly(P<0.01,P<0.05);immunofluorescencestainingshowedthatAEgrouphippocampusp-ampk;enzymeactivityassayresultsshowthatAEgroupofhippocampaltissueSODactivitywassignificantlyincreased(P<0.01),MDAcontentwassignificantlydecreased(P<0.01),buttheactivityofGSHhadnosignificantdifference(P>0.05).WesternblotresultsshowedthatwiththeNCgroup,theACgroupofp-ampkproteinexpressionwassignificantlydecreased(P<0.01),AEgroupofp-ampkexpressioncomparedwithNCgroupandACgroupsignificantlyincreased(P<0.01).TheratioofLC3II/LC3IingroupAEwassignificantlyhigherthanthatingroupNCandgroupAC(p<0.01),andtherewasnosignificantdifferenceintheratioofLC3II/LC3Iintheotherthreegroups.ComparedwiththeNCgroup,ECgroupandAEgroupBeclin-1proteinexpressionwassignificantlyenhanced(p<0.01),ACgroupBeclin-1proteinexpressionwassignificantlylower(p<0.01);comparedwiththeACgroup,AEgroupBeclin-1proteinexpressionwassignificantlyenhanced(p<0.01).ComparedwiththeACgroup,theexpressionofP-AktandBcl-2proteininAEgroupwassignificantlyincreased.Conclusions:(1)8weeksoftreadmillexercisecansignificantlyimprovethelearningandIV memoryabilityofADrats,increasethenumberofneuronsinhippocampalCAIregionandreduceinjuryofADrathippocampalneuronsanddendriticdensityarecloselyrelated.(2)8weeksoftreadmillexercisecanactivateADneuronsinratswithphosphorylatedAMPKexpression,therebycausingneuronalautophagy,autophagyisthemarkerproteinLC3andBeclin-1expressioninhippocampalneuronsincreasedsignificantly.(3)8weeksoftreadmillexercisecanimprovetheSODrathippocampusADactivity,reducethedepositionofMDAsoastoprotecttheneuronsinADrats.(4)8weeksoftreadmillexercisecanimprovetheexpressionofAktBcl-2signalingpathway,whichpromotesneuronalsurvival.Keyword：exercise;alzheimer’sdisease;AMPK;autophagyTypeofThesis：experimentalstudyV 目录摘要..........................................................................................................................................................IIAbstract......................................................................................................................................................III目录........................................................................................................................................................VI1前言..........................................................................................................................................................81.1选题依据........................................................................................................................................81.2研究目的意义................................................................................................................................82文献综述..................................................................................................................................................92.1自噬与神经退行性疾病................................................................................................................92.1.1自噬体的结构.....................................................................................................................92.1.2自噬与AD.......................................................................................................................102.1.3自噬参与神经元保护性治疗..........................................................................................102.2自噬对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用.....................................................................112.2.1mTOR信号通路在自噬参与神经退行性疾病的意义...................................................112.2.2PI3K/AKT/mTOR信号通路在自噬调节细胞生存机能中的作用................................132.3AMPK信号通路与AD及自噬的关系......................................................................................142.3.1AMPK的结构及主要功能...............................................................................................142.3.2AMPK通过调节mTOR信号通路影响细胞自噬..........................................................152.3.3AMPK在调控衰老过程中的作用...................................................................................162.3.4AMPK控制抗衰老的信号网络.......................................................................................172.3.5AMPK与CRTC-1/CREB信号.......................................................................................172.3.6AMPK与SIRT1信号......................................................................................................182.3.7AMPK与FOXO轴.........................................................................................................192.3.8AMPK与p53途径..........................................................................................................213研究对象与方法.....................................................................................................................................223.1研究对象......................................................................................................................................223.2研究材料......................................................................................................................................223.2.1主要试剂..........................................................................................................................223.2.2主要仪器..........................................................................................................................233.3研究方案.....................................................................................................................................233.4测试方法......................................................................................................................................243.4.1大鼠行为学测试...............................................................................................................243.4.2海马CAI区Nissle染色..................................................................................................253.4.3大鼠海马区Golgi染色....................................................................................................253.4.4海马CAI区P-AMPK免疫荧光染色............................................................................253.4.5氧化应激指标检测...........................................................................................................263.4.6WesternBlot检测............................................................................................................263.5统计学分析.................................................................................................................................264研究结果................................................................................................................................................264.1大鼠行为学测试结果.................................................................................................................264.1.1各组大鼠定位航行实验结果...........................................................................................264.1.2各组大鼠空间探索成绩比较..........................................................................................27VI 4.2大鼠海马CAI区神经元Nissle染色结果.................................................................................274.3大鼠海马区神经元Golgi染色结果...........................................................................................284.4大鼠海马CA1区P-AMPK免疫荧光染色结果......................................................................294.5各组大鼠海马组织氧化应激指标测定结果..............................................................................294.6WesternBlot检测结果................................................................................................................295讨论与分析............................................................................................................................................315.1AD大鼠模型的建立及运动干预对其学习记忆功能的影响................................................315.2运动对AD大鼠海马神经元突触及氧化应激的影响.............................................................335.3运动对AMPK的激活和自噬对AD的影响.............................................................................346结论........................................................................................................................................................36致谢........................................................................................................................................................37参考文献....................................................................................................................................................38VII 1前言1.1选题依据目前我国已正式迈入老龄化社会，一些与衰老相关的神经退行性疾病已成为影响我国老年人群重要的疾病。阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)又称老年性痴呆，是一种多发生在老年，以认知和记忆障碍为主要临床表现的神经系统退行性疾病。AD的病理改变主要表现为神经元外的老年斑沉积，神经元内的神经原纤维缠结和海马神经元突触的丢失。老年斑的主要成分是β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)异常折叠后所形成的沉积物，神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFTs)是一种被称为tau蛋白的细胞骨架相关蛋白的异常磷酸化后的聚集体。据此，有学者认为AD是一种蛋白质异常折叠性疾病。其发病机制和病理过程尚未被完全阐明，因而缺乏对其有效的早期干预手段。近年来，一种新的细胞活动—自噬（autophagy）引起了人们广泛的注意。通过自噬途径可以使异常折叠或受损的蛋白质得到降解，在保持细胞稳态中意义重大。哺乳动物5’-磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5’-AMPactivatedproteinkinase,AMPK）被称为真核生物能量代谢变化的感受器，研究表明，AMPK在营养缺乏，能量降低，氧化应激时均能被激活，自噬途径的活化主要是通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin,mTOR）的抑制来实现的。AMPK是在能量稳态，葡萄糖和脂质代谢的调节中的关键酶，它可能与阿尔茨海默氏病（AD）的发病机制相关。AMPK的活化可以通过调节胆固醇和鞘磷脂水平从而降低神经元产生淀粉样蛋白（Aβ），AMPK还可以改善AD患者的脑能量代谢紊乱，AMPK对tau蛋白的磷酸化的调节作用具有相反的结论，其机制尚不清楚。越来越多的研究表明，AMPK是防止代谢应激的保护因子，在AD的发病机制中发挥重要作用。它是用于治疗AD的潜在靶蛋白。1.2研究目的意义本研究旨在揭示自噬及AMPK信号相关通路在运动干预AD中的作用及分子机理。我们根据既往在运动干预AD大鼠内质网应激及促存活通路PI3K/Akt信号通路的作用方面研究积累，提出如下假说：“神经细胞的自噬和凋亡在运动干预AD海马神经元丢失的发病中具有交叉和协同作用，AMPK通路可能是二者共同作用的中心环节。”为此，本研究就是着眼于自噬相关信号通路，观察运动对AD模型大鼠的影响及其机制研究。我们重点研究自噬相关信号分子在运动干预AD脑中的表达。运用形态学及多种分子生物学和细胞生物学手段，综合研究运动对AD大鼠海马神经细胞自噬、凋亡及相关信号分子的影响及其机制。以期为今后运动对AD的早期干预提供理论依据。8 2文献综述2.1自噬与神经退行性疾病自噬是一种通过溶酶体途径捕捉和降解细胞内退化的细胞器、蛋白质等结构的自[1]食过程。它在维持细胞内环境稳态和维持代谢平衡方面起着重要作用，并且在细胞应激的条件下能够降解细胞质内错误折叠的蛋白质。自噬分为三种类型：大自噬，小[2]自噬和分子伴侣介导自噬。越来越多的研究表明，与自噬相关的囊泡状结构统称为自噬泡（AVs），它在因毒蛋白聚集造成的神经退行性疾病的神经元内大量存在。此外，在神经退行性疾病的背景下，诱导自噬能够实现神经元的保护，但过度的自噬则能够引发细胞的死亡，这种观点已经被普遍接受。鉴于以上观点，诱导自噬作为一种治疗神经退行性疾病治疗的潜在方法，已经越来越受到广泛关注。自噬的研究已经开辟了对衰老和神经退行性疾病治疗的新视野。2.1.1自噬体的结构自噬是由自噬相关基因编码的蛋白质（ATG1-ATG12）组成的免疫复合物，能够间接地在下游调节自噬体的进程，其包括：自噬的启动、溶酶体的融合、降解过程。这个过程的起始阶段是自噬小体或小泡的形成，可能是来源于细胞质的磷脂双分子层[3]的质膜，包括高尔基复合体、内质网、质膜或者线粒体。此外，内质网-线粒体的接触位点也参与自噬小体的装配。这种双层质膜结构形成的吞噬泡可吞噬细胞质或选择性吞噬细胞器，使吞噬泡扩大并形成自噬体。此外，若干不同的低聚蛋白复合物，在自噬的启动阶段起着重要的作用。营养耗竭抑制哺乳动物雷帕霉素靶复合物1（mTORC1），导致去磷酸化作用和ULK1-ATG13-FIP200的激活，这在自噬形成的初[4]始阶段起着很重要的作用。随后可激活beclin-1、Bcl-2家族蛋白，激活的beclin-1能够与VPS34和ATG14L产生相互作用关系。Vps34能够促进PI3K的活化和磷脂酰[5]肌醇-3-磷酸盐的形成，从而促进自噬泡的集结。此外，还有两个专门的类似泛素化共轭系统参与管理和控制，ATG5-ATG12共轭系统和LC3-ATG8共轭系统。其中第一个系统的促进是通过ATG7，ATG10，ATG12；第二个系统的促进是通过ATG3和ATG4。LC3在其C残端通过ATG4裂解，形成LC3-I，随后结合脂质酰乙醇胺形成LC3-II或[6]者ATG8酰乙醇胺，存在于自噬小泡膜上。自噬体的形成是随机发生在细胞质当中，自噬体的形成是在细胞微管中心，其运输沿细胞微管方向，并在此与溶酶体较好的发生融合。某些动力蛋白和LC3-II，均对细胞微管运输有重要作用。在运输过程中，自噬体能够和晚期胞内体融合形成自噬溶[7]酶体，最终与溶酶体结合，消化内容物或者立刻与溶酶体结合形成自吞噬泡。然后其内容物被溶酶体内的酸性蛋白质水解酶水解成氨基酸和其他副产物，并释放重新参与新陈代谢循环和高分子结构的新建。在自噬体形成过程中，最重要的分子是Rab7，它能够促进自噬小体的成熟并引导其沿细胞微管运动，最终实现与溶酶体的融合。此外，最新研究表明，在黑腹果蝇体内，突触融合蛋白17能够介导自噬溶酶体外膜融合，9 [8]并实现SNAP-29和VAMP7的相互作用。蛋白质通过溶酶体水解清除，转录因子EB（TFEB）通过控制溶酶体酶类的表达，调控溶酶体和自噬的形成。此外，通过TFEB[9]的超表达，能够诱导产生一种溶酶体和自噬小体数量增多的新型细胞。2.1.2自噬与AD[10]遗传学实验表明，AD会导致包涵体-溶酶体路径异常。通过AD动物模型实验证[11]实了自噬体和自噬溶酶体的积累会使人脑组织神经元受到影响，这表明可能发生了神经元的不稳定自噬和有毒蛋白清除障碍。此外，细胞内由于tau蛋白的聚集致使神经元纤维缠结（NFT）累积，以及细胞外β样淀粉蛋白沉积这两种情况是AD的典型的神经病理学标志，这表明AD神经元中蛋白质质量控制系统和蛋白质水解路径可能出现问题。大多数家族遗传性AD，均存在早老素蛋白（PS-1）基因突变的现象。研究表明，PS-1是溶酶体膜上固有装配ATP酶泵所必须的，AD结合的PS-1突变会导致溶酶体磷酸[12]化受阻，从而使溶酶体的稳定性和蛋白水解能力受到影响。自噬溶酶体以及蛋白聚集体（NTF和淀粉斑块）积累未能尽快分解消化，终会使得溶酶体破裂。其它自噬相关因素，也能够通过影响分解能力进而影响到自噬功能。积累的Aβ蛋白和ApoE4蛋白能够影响溶酶体膜的稳定性并且促进其透化作用，容易造成蛋白水解酶类的释放，进而间接引起细胞死亡。对AD患者进行遗传学分析发现，其自身自噬相关基因发生了改变。Beclin-1是自噬诱导的启动蛋白，是VSP-34复合物的一部分，能够减缓AD患者由于AD引发的早期的自噬调节失调。此外，通过对基因组的研究显示，较多的不同基因能够向上调节相[13]关诱导自噬的基因的转录水平，这很可能是机体对自噬损伤做出的代偿性反应。最[14]后，改变溶酶体蛋白有关的Rab5的水平，能够抑制Aβ的沉积和早期AD的发生。2.1.3自噬参与神经元保护性治疗神经退行性疾病有一个共同的特征，就是神经元自噬途径的障碍。因此，通过药物作用活化自噬相关基因的表达，进而提高自噬，清理神经元异常积累的蛋白质和神经元内功能损害的细胞器，最终促进神经元的保护。已有实验表明，在培养的AD细胞和AD动物模型中有激活自噬的蛋白，它们克服着AD自噬损伤初期的各种问题，若干条路径均参与自噬进程的调节，包括在自噬发生的诱导或自噬体的形成过程，促进溶酶体的功能作用或增强自噬溶酶体的形成。不同的神经元变性疾病会有不同导致自噬功能障碍的因素。例如，组织细胞内溶酶体功能障碍，会导致吞噬物无法消化分解，造成自噬体的积累，刺激自噬体形成系统的激活，有助于自噬体更多的生成。相反，如果病损导致对自噬诱导反应迟钝无效，那么借助药物作用，能够使自噬的表达上调，从而解决相应的问题。一些动物研究表明，通过激活上调自噬，能够起到较好的效应（例如认知记忆发生较好的改变，错误折叠蛋白毒性减少或者积累降低等）。到目前为止，大量的临床实验证明，白藜芦醇，姜黄素，二甲双胍，锂以及雷帕霉素类似物CCI-779在不同的神经元病变中，都起到一定的疗效。通过VSP34靶向调控自噬，也是一种可选的治疗方法。ABT-737是一种模拟BH3的化合物，能够降低BCL-2和10 [15]Beclin-1之间的相互抑制作用，借此激活自噬。Tat-beclin-1肽能够有选择性的与[16]Beclin-1相结合，诱发自噬小体的形成。此外，L-NAME抑制剂能够间接作用NOS，支持vsp34复合物的形成和诱导细胞自噬。实验证明了这些药品能够有效作用于神经元变性的相关疾病，如HD通过诱导Beclin-1的基因表达，也能够促进自噬体的形成。同样，溶酶体损伤也出现在神经元变性疾病当中，改善溶酶体活性或减少溶酶体损伤这是一个有趣的对策。但遗憾的是，药物作用还不足以促进提高溶酶体的高效性，只能通过遗传组蛋白的超表达或者西司他汀类的基因缺失。这两种途径能够在AD动物模型中高效的提升溶酶体的活性。避免溶酶体的损伤或溶酶体膜的胺化（LMP）是一种有趣的方法。稳定溶酶体能够提高抗氧化剂或钙蛋白抑制剂1例如钙蛋白酶和钙蛋白抑制剂。卡配因是一种能够负性调节自噬体的形成和促进LMP的发生；在AD和HD动物模型中，钙蛋白抑制剂表现出阳性的结果。Bci3为Bax选择性诱导抑制剂，有选择的抑制Bax介导的LMP和MMP，同样在体外细胞培养和AD模型中，减轻细胞死亡与LMP相关。激活自噬，用于对神经元变性疾病的治疗还存在很大的挑战。有希望通过体内研究和体外研究以及初步的临床试验，通过对患者产生的效力。目前研究者的目标是研发出能够进行治疗的新药而不会影响神经元胞体内其他自噬相关机制。因此，正在研发新的药物，最好独立于mTOR，可以穿过血脑屏障，直接到达受影响的脑区。据新的研究发现，开发的自噬新药物，能够成为自噬的调节器，在自噬网络中的转录因子能调节自噬基因的表达或抑制自噬基因的表达，在动物模型中也显示出良好的效果。2.2自噬对PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控作用2.2.1mTOR信号通路在自噬参与神经退行性疾病的意义在神经退行性疾病中，大量异常、变性的蛋白质聚集能够诱发细胞的衰老和死亡，自噬在神经退行性疾病中扮演重要角色，它能够清除异常聚集、折叠的蛋白质，并且能够促进细胞产生相应的应激。通过诱导上调自噬，从而有效清除神经元中异常聚集的蛋白质，是促进神经元生存的一种有效途径。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是主要的自噬激活调节器，在饥饿、生长因子的释放以及细胞压力应激等条件下都能对其表达进行调控。PI3K/AKT是存在于mTOR上游的信号通路，能够激活mTOR活性，同时也能够改变阿尔茨海默病和帕金森等神经退行性疾病的病理特征，但是PI3K/AKT/mTOR信号通路与自噬之间的相互关系是非常复杂的，因此需要更多的神经退行性疾病动物模型和患者在组织和细胞水平上进行更深入精确的研究。自噬能够降解细胞内受损的细胞器和促进长寿蛋白质的再循环，从而维持细胞正[17]常的新陈代谢和细胞的自动调节机能。自噬降解所产生的细胞膜脂质和蛋白质，能够转化成为供细胞再次利用的游离脂肪酸和氨基酸，细胞借此合成新的蛋白质以及线[19,20]粒体产生的ATP，进而维持细胞生存。自噬通过形成双层膜小泡结构的自噬体，通过与溶酶体相结合，从而对受损蛋白质、部分细胞器以及微丝等细胞骨架结构进行11 [21]降解。自噬相关蛋白（ATGs）介导自噬体的形成，借助若干自噬相关蛋白与磷脂酰乙醇甘油酯结合，从而使没有活性的LC3I（轻链蛋白I）转化成为具有活性的LC3II(轻链蛋白II)，这种激活过程发生在膜包被小泡形成的初始阶段和结束阶段，LC3II会结合[22]于完整的自噬体内、外双膜结构中，是自噬体形成的标志性物质。自噬是清除掉细胞内无用的结构和物质，在饥饿、肿瘤抑制过程，颅脑损伤，蛛网膜下腔出血，局部脑组织缺血，对抗神经元病变和细胞的氧化应激均能够诱发机体自噬。异常紊乱的蛋白质折叠是阿尔茨海默病和帕金森症这两种神经退行性疾病主要病理特征，以及与细胞氧化应激反应相关的线粒体功能障碍，均可导致中枢神经系统内不同区域中正常神[23]经元的坏死。许多的神经系统退行性疾病等都被认为是由于机体自噬机能缺陷造成的。除此之外，破坏机体自噬途径，可阻止不同生物体的细胞存活。因此，自噬途径被认为是实现细胞保护的关键。然而，自噬被过度激活，则能够诱发细胞自噬性死亡。因此，自噬在神经退行性疾病方面是引起细胞生存还是死亡方面还存在疑问。最新的研究工作表明，促进机体自噬，能够促进神经元的体外存活和体内外异常聚集蛋[24]白的清除。因此，诱导自噬在神经退行性疾病治疗方面可能是一个有效的方法。mTOR是一种原始的抑制信号，在ATG蛋白上游参与信号转导。mTORC1和mTORC2是功能有着明显差异的两种复合物，为mTOR主要的亚型结构。然而，只有[25]对雷帕霉素敏感的mTORC1能够通过抑制机体自噬，维持细胞稳态。当生长因子，例如胰岛素生长因子与胰岛素生长因子受体（IGF1R）相结合，I类PI3K信号通路催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸肌醇，磷脂酰肌醇3,4,5-三磷[26]酸肌醇募集AKt和DDK1到膜上，并且允许后者磷酸化AKt。激活的AKt能够抑制[27]TSC1或TSC2复合物的活性，抑制mTORC1信号的活性。与之相比，细胞内的诱发信号包括饥饿、能量消耗、营养缺乏、缺氧以及DNA损伤从而抑制mTOR的活性。P53是存在于人类癌症中的突变基因，其也能够调节mTOR的活性。在致癌基因和基因中毒的应激条件下，P53能够通过调节自噬相关基因表达，上调自噬，通过sestrin2和DRAM对AMPK的激活。与之相反，细胞内p53通过磷酸化AMPK抑制细胞自噬，进而减弱其蛋白激酶活性。此外，由于p53基因突变，能够通过上调自噬，使秀丽杆状线虫寿命延长。另外，P53能够通过对损伤调节自噬调制器1的调控，诱导自噬发生。根据最近研究发现，损伤调节自噬调制器1能够通过溶酶体磷酸化程度进而调节自噬和溶酶体的融合，从而水解自噬溶酶体。通过最新的研究揭示了一种全新的mTORC1和自噬间的调控机制，即为质子耦合氨基酸转运蛋白4的rab12质量控制。rab12的敲除会导致mTORC1活性增加。小GTP酶rab12促进氨基酸转运蛋白4的质[28]子耦合退化，低浓度的rab12细胞内聚集，能够调节mTORC1的活性和自噬。另外，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C也能够诱导自噬的发生，通过在细胞内对mTOR的抑制，于此同时，将细胞处于营养缺乏和氧化应激的情况下，也能够增加自噬的表达。通过几组mTOR和自噬调控相关的研究发现，一种复合物是mTOR的下游靶点，激活mTORC1能够使ATG13发生磷酸化反应，其抑制磷酸化能够通过阻塞自噬泡的形成从而抑制自12 噬。当细胞一旦能量消耗过度，饥饿等应激状况下，就会使ATG13立即脱磷酸化，进[29]而诱导相应复合物合成，诱发自噬。此外，最近的研究发现，TFEB，一种溶酶体生成的主要调节器，通过mTORC1通路对溶酶体进行调控。TFEB的局部定位由[30]mTORC1信号通路，经过GTPase激活状态直接调控。2.2.2PI3K/AKT/mTOR信号通路在自噬调节细胞生存机能中的作用mTOR在机体内有两种不同的复合表达形式，分别是mTORC1和mTORC2，两者[31][32]蛋白表达有所不同。mTORC1对自噬主要起负向调控，能够抑制自噬的表达，与此同时PI3K/AKT信号通路在mTORC1的上游对其起到重要的调控作用。PI3K/AKT信[33]号通路在不同类型的细胞中参与促进细胞存活和抑制细胞凋亡的反应。许多细胞生长因子能够促进细胞的存活，例如胰岛素生长因子1（IGF-1），其能够通过激活PI3K[34]在丝氨酸473残基（ser473）位点磷酸化AKT，从而达到促进细胞存活，除此之外，促进细胞增殖的细胞因子，例如白介素-3（IL-3),其能够在淋巴母细胞中通过激活PI3K[35]和磷酸化AKT实现促进细胞存活。值得注意的是，激活AKT实现抑制细胞凋亡是通[36]过磷酸化在丝氨酸136残基上与促进肿瘤细胞死亡相关联的BCL-2因子实现的，减少细胞死亡相关的激动剂半胱氨酸细胞凋亡蛋白酶9对细胞凋亡初始阶段的参与，以及抑制染色体易位相关的叉头蛋白家族中的FKHRLI转录到细胞核，其能够转录诱导细胞死亡的蛋白质，例如Fas配体，从而促进细胞的存活。AKT也能够通过在丝氨酸399残基和相关联的14-3-3号蛋白质上使TSC2磷酸化而抑制结节硬化症，从而提高mTOR的[34,37]活化。连续TSC2的磷酸化，能够使脑组织中是Ras同源物增多以及上调mTOR的活[38]性。激活mTOR能够使许多与核糖体合成以及与细胞生长相关的受体蛋白磷酸化，例如P70核糖体S6激酶（S6K）以及真核起始因子4E结合蛋白（4EBF）。通过饥饿或者细胞应激上调自噬-Beclin1(AMBRA1)通路能够抑制mTOR的活性，[39]激活UNC-51自噬激活激酶1（ULK1)复合体以及诱导AP开始形成。另外，通过服[40]用免疫抑制剂、雷帕霉素抑制mTOR活性，从而激活自噬以及APs的形成。mTORC1对雷帕霉素有着较高的敏感性，而mTOR2对雷帕霉素的反应相对不敏感，雷帕霉素[41]的主要功能作用是通过mTORC1为传递在Ser473位点上磷酸化AKT。然而，通过雷帕霉素抑制mTORC1活性同样也能够在若干抑制位点上抑制激酶S6K磷酸化以及[42]胰岛素受体底物（IRS）的磷酸化作用，从而增大AKT的激活，这即就是所周知的PI3KAKT负调节信号传导通路，借此激活AKT能够对抗细胞凋亡通路促进细胞存活。因此，可通过对PI3KAKTmTOR信号通路的调节获得有益的结果：一方面，通过对此信号通路的调节，能够促进细胞存活抑制过度自噬导致的细胞死亡；另一方面，抑制mTORC1能够刺激受损的细胞结构以及沉积毒蛋白通过mTOR2活化AKT从而上调细胞自噬表达促进细胞存活。然而，其通路的上下游关系以及mTORC1和mTOR2在细胞保护等方面所具有的作用大小还有待研究，例如，通过对mTOR复合物进行调节，能够导致不正常的生存或死亡。PI3K/AKT/mTOR信号通路在脑组织中能够促进神经元突触的生长发育（轴突和13 [43]树突），使脑组织中神经元突触数量增多。通过脑源性神经生长因子蛋白（BDNF）激活PI3K/AKT/mTOR信号通路可增大神经元树突长度和复杂性，小幅度siRNA介导[44,45]mTOR和S6K或缺损的4BEF高磷酸化表达，可使神经元树突长度和复杂型缩小。除此之外，应激活化蛋白激酶-相互作用蛋白1（SIN1）和RPTOR是树突间相互联系[46]所必需的蛋白，避免果蝇IV神经元树突的重叠，延长雷帕霉素抑制标记，TOR复[47]合体2影响果蝇神经元树突的分布。过度异常活跃的PI3K/AKT/mTOR信号通路能[48]够使pten转基因鼠产生畸形巨头，神经元树突和轴突异常过度肥大，以及行为改变，[49,50]这突出表明自噬在中枢神经系统内神经元改建与重塑的重要意义。[51，52]然而，mTOR蛋白成分缺失，会在大脑形成缺陷，使小鼠胚胎出生之前死亡。[53]敲除神经元祖细胞中raptor，可降低脑死亡小鼠出生后脑组织细胞的数量。对动物的生存能力能够起到一个比较好的影响是通过脑组织RPTOR缺陷实现的，使小鼠存活，但显示出较小的大脑尺寸，海马和小脑的浦肯野氏细胞及锥体神经元的细胞体尺[54]寸也减小，不仅如此，树突变得更短。因此，mTORC1在小鼠中枢神经系统的发生和发育过程中起到重要作用，mTORC2在神经元尺寸和形态以及智力发育方面也起着重要作用。然而，它仍然被证明，如果自噬在降低小鼠存活和脑细胞死亡中起重要作[55]用，那么细胞凋亡将不参与成熟小鼠的神经元死亡过程。在脑结构中的发展作用中，PI3K/AKT/mTOR信号通路参与调节大脑神经元突触的可塑性，特别是在海马中。此[56]外，mTORC1参与树突的突触转化活性调节。长时程抑制（LTP)记忆相关的电生理参数，通过代谢型谷氨酸受体激动剂上调PI3K/AKT/mTOR信号通路，与锥体细胞在[57,58]海马CAI区迁移活动相关。然而，LTP氯化钾或-N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体在海马锥体细胞自噬性降解AMPA受体（AMPARs）是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。除此之外，兴奋性突触传递信号的强度取决于突触后膜表面AMPARs的数量。AMPARs通过磷酸化丝氨酸残基845，使NMDA受体激活和溶酶体途径下降，通过突触内体循环途径，调节突触的LTP程度。因此，不同的自噬参与突触的传导和可塑性可能是依赖不同的受体类型，离子迁移和代谢可能是PI3K/AKT/mTOR信号通路的一种刺激诱发方式，与之相反，活跃的PI3K/AKT/mTOR信号通可能对突触传递有调节作用。2.3AMPK信号通路与AD及自噬的关系2.3.1AMPK的结构及主要功能AMP激活的蛋白激酶AMPK是一个高度保守的能量感受器，可感知由于ATP的消耗而升高的ADP和AMP的水平。哺乳动物AMPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其组成包括起催化作用的α亚基和起调节作用的β、γ亚基，在哺乳动物的组织中，两种亚基有着不同的表达和组合，升高的AMP/ADP比值能够通过变构活化从而激活AMPK。一些上游激酶，如丝氨酸/苏氨酸激酶11（LKB1），Ca++/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）和转化生长因子β激活激酶（TAK1），能够在Thr172片段上14 通过磷酸化α催化亚基激活AMPK。相反，磷酸化AMPK能够灭活蛋白磷酸酶（PP），如PP2A，PP2C和Ppm1E。在很多生理学和病理学条件下可激发AMPK信号蛋白功能活动，如运动刺激和个别疾病。除此之外，一些激素，如脂联素、胃促生长素和瘦[59]素能够在一些组织中以特异的方式激活或者抑制AMPK信号。众所周知，AMPK激活能够促进葡萄糖的能量产生，在应激情况下，抑制蛋白质和脂肪酸的分解消耗以及胆固醇和肝糖原的合成。限制热量能够激活AMPK，与之相反，营养负荷过重又似乎削弱了AMPK的活性，同时又诱导在许多组织中发生胰岛素抵抗，从而引起了肥胖、糖尿病等代谢综合症和心血管疾病的发生。当前，AMPK被视为一个重要的分子靶点，因为AMPK异常激活剂，在代谢和神经退行性疾病的治疗中可能会起到一定作用。二甲双胍是临床上常用以通过激活AMPK达到降低血糖水平的2型糖尿病药物，此外，5-氨基咪唑-4甲酰胺核苷（AICAR）、他汀类药物、噻唑烷二酮类和许多植物素，如黄连素、槲皮素和白芦藜醇均是证实的能够使AMPK激活的植物素。[60]有研究表明，AMPK的功能不限于增加能量消耗，维持能量代谢，还参与协调多个机体的管理机制，如损伤结构的自噬作用和通过增加组织抗应激反应，激活AMPK通过上调硫氧还蛋白的表达水平从而降低氧化应激。此外，激活AMPK能够抑制内质网应激和抑制炎性反应，而氧化应激和内质网应激能够增加衰老的进程，自噬功能受损和低度炎症过程能促进衰老进程。此外，代谢疾病在中老年人群中更为常见。这些结果意味着在衰老进程中，AMPK激活能力可能会下降。2.3.2AMPK通过调节mTOR信号通路影响细胞自噬自噬相关信号通路主要包括腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及其上下游信号通路。AMPK是能量代谢平衡的有效控制器，其基因表达保守，是由管家基因表达生成。[61]AMPK信号通路通过信号集成网络进行调节。低等生物的研究表明，AMPK活性的增加可以延长寿命，哺乳动物的实验表明，AMPK通过mTOR和ULK1途径控制细胞自噬，而mTOR和ULK1途径可以增加细胞管家基因的质量。另外，AMPK促进FoxO/DAF-16，Nrf2/SKN-1和SIRT1途径改善细胞抗逆性。此外，AMPK抑制NF-kB信号通路可以抑制炎症反应。最新的研究表明，AMPK信号通路的反应性随着衰老明显下降。AMPK对细胞应激状态敏感性的损失会损害代谢调节、增加氧化应激和减弱自噬性清除作用，可清除那些与年龄相关的免疫防御机能下降，引发轻度炎症和代谢紊乱，这个信号通路中通过AMPK控制能量代谢、自噬性降解和抗逆性最后控制老化程度。对能量代谢的有效管理，是实现细胞稳定性自动调节起决定作用的因素，改善能量代谢紊乱可以影响健康的衰老。AMP激活的蛋白激酶AMPK是一个高度保守的传感器，感知由于ATP的消耗而升高的ADP和AMP的水平(SteinbergandKemp,2009;Hardie,2011;MihaylovaandShaw,2011)。哺乳动物AMPK是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其组成包括起催化作用的α亚基和起调节作用的β、γ亚基。在哺乳动物的组织中，催化作用和调节作用的亚基两者都有着不同的表达和组合。升高的AMP/ADP比值能够15 通过变构活化从而激活AMPK。一些上游激酶，如丝氨酸/苏氨酸激酶1（LKB1），Ca++/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）和转化生长因子β激活激酶（TAK1），能够在Thr172片段上通过磷酸化α催化亚基激活AMPK。相反，激活磷酸化AMPK能够灭活某些蛋白磷酸酶，如：PP2A和PP2C。在一些生理学和病理学条件下可激发AMPK信号功能活动，如运动和个别疾病。除此之外，一些激素，如脂联素、促生长素和瘦素能够在一个组织中以特异的方式激活或者抑制AMPK信号。而且，对于AMPK激活功能的控制要依靠不同的实际情况的发展和周围环境情况。众所周知，AMPK激活能够促进葡萄糖合成，在压力情况下，抑制蛋白质和脂肪酸的分解消耗以及胆固醇和肝糖原的合成。限制热量能够激活AMPK，与之相反的营养负荷过重削弱了AMPK的活性，同时又会诱导在许多组织中发生胰岛素抵抗，从而引起了肥胖、糖尿病代谢综合症和心血管疾病的发生。当前，AMPK被视为一个重要的治疗分子靶点，因为AMPK激活剂在代谢和神经退行性疾病的治疗中可能会起到一定作用。二甲双胍是临床中常用以通过激活AMPK达到降低血糖水平的2型糖尿病药物，此外，5-氨基咪唑-4甲酰胺核苷（AICAR）、他汀类药物、噻唑烷二酮类和许多植物素，例如，黄连素、槲皮素和白藜芦醇均是证实的能够使AMPK激活的植物素。[62]有研究表明，AMPK的功能不仅限于增加能量消耗，维持能量代谢，还参与协调多个机体的管理机制，如损伤结构的自噬作用和通过增加组织抗应激性缓解应激反应。激活AMPK通过上调硫氧还原蛋白的表达水平从而降低氧化应激。此外，激活AMPK能够抑制内质网应激和抑制炎性反应，通过衰老能够侵扰到这些特性。氧化应激和内质网应激能够增加衰老的进程，自噬功能受损和低度炎症过程能促进衰老进程。此外，代谢疾病在中老年人群中更为常见。这些结果意味着在衰老进程中，AMPK激活能力可能会下降。最近的研究证实，在衰老的组织切片中，不同的损伤能够抑制AMPK的应答反应。AMPK存在相关联的巨大的转录因子网络，AMPK通过这个集成信号网络，在衰老过程中起到重要作用。2.3.3AMPK在调控衰老过程中的作用AMPK在衰老进程中对动物代谢率具有决定性的调节作用。在生命体中，能量代谢能够维持有机体的稳态平衡，然而能源物质的过度消耗，又能够加速衰老的进程。几十年前发现了通过饮食限制能够延长啮齿类动物的寿命。随后，大量的研究已经证[63]实，各种控制热限制（CR）的办法能够延缓物种衰老途径，此外，一些调节信号转导途径已经被确定。似乎这一类型的延长寿命的机制均是与AMPK信号通路控制相关联。然而，要搞清的是在衰老过程中，增强AMPK和CR是如何延缓衰老的，此过和AMPK相关信号网络之间有什么联系。通过对动物模型的研究发现，哺乳动物AMPK与秀丽隐杆线虫基因同源，AMP-活化的激酶-2（AAK-2）,在长寿调节中起着非常重要的作用。AAK-2/AMPK的表达和它的激活通过二甲双胍延长某些物种寿命，例如，在线虫和果蝇模型及人工诱导基因敲除AMPKα2小鼠，均引发许多代谢紊乱，从而危及健康和寿命。与此相反，二甲双胍作用于啮齿类动物，能够防止癌症和心脑血管疾病16 的发生，从而延长寿命。然而，也有不同的研究证实，二甲双胍抑制mTOR复合物-1以独立的方式通过AMPK翻转酶实现功能作用，反映出对健康的益处是与AMPK信号通路不相关的。似乎在哺乳动物体内能够适当诱导激活AMPK，例如，在运动之后，尤其是持续的过度运动对健康有着比较严重的影响，例如在中风和心肌缺血中，能够加重病理进程和对机体的伤害。在衰老进程中，反应性的AMPK激活应答有所降低，研究证实，AICAR治疗和体育运动能够明显增加年轻大鼠肌肉中AMPK2的活性，与之相反，人工诱导损伤老年大鼠AMPK2激活无反应。此外，在年轻大鼠肌肉中，通过β胍基酸（β-GPA）诱导，增加食量，升高AMPK2活性水平，减少骨骼肌能量代水平，但老年鼠除外。β-GPA的治疗也能够使线粒体的生物合成增加，下游效应对AMP有激活作用，但仅限于青年大鼠，老年大鼠无此效应。结合上述观察，Ljubicic等证明，在老化肌肉中，通过人工诱导抑制肌肉收缩，激活AMPK。随着衰老的进行，AMPK活性敏感性下降，能够引起多种与年龄衰老相关的疾病发生，例如心血管疾病和代谢综合症。Qiang等报道，在老化受损的骨骼肌中，抑制减弱AMPK激活和胰岛素受导[64]致的葡萄糖摄取，从而增加了代谢综合症的发展。此外，Turdi等也发现缺乏AMPK能加剧衰老引起的心肌功能障碍。在小鼠脑组织中，也证明了AMPK的基线活动在老年动物内比年轻动物更高。然而，在年轻鼠体内AMPK活性大幅度增加是脑卒中的激活效应，此效应未在老年小鼠中体现。这些研究表明，在衰老组织中，AMPK活化敏感性存在明显不足。AMPK似乎存在蛋白磷酸酶功能与年龄相关的变化，例如，PP2A,PP2Ca和Ppm1E它可以参与随衰老出现的AMPK活化的抑制。通过营养因素、某些激素和一些炎症信号，特别是在老化组织中出现的低度炎症现象，可能对AMPK信号信号有抑制作用。2.3.4AMPK控制抗衰老的信号网络通过对低等生物老化的研究发现了几个参与衰老调节和延长寿命的信号转导途径。最先发现并且被广泛研究的通路是异常持久形成蛋白16（DAF-16）和叉头框蛋白O(FOXO)长寿蛋白，特别是在线虫、哺乳动物和细胞的老化研究中发现，其中p53和细胞核因子-kb（NF-kb）信号通路在多方面的相互干扰作用中起到一定作用。在酵母和低等生物中，衰老的酵母说明了Sirt1/Sirtuins在能量代谢和作为延长因子的作用。最近的研究显示，环AMP调节转录激活剂1（CRTC-1）和环AMP效应原件结合蛋白（CREB）和核因子红细胞相关因子2（Nrf2）及skinhead-1(SKN-1)在调控衰老过程均发挥作用，这些途径有许多共同的特点，如AMPK能够调节这些路径的许多功能并且他们多数靶点均调控自噬和氧化应激，是衰老过程中有意义的标志。而且，似乎表明不同的信号通路在有机体内形成信号网络，并且也在AMPK活动中提供正反馈或负反馈效应。2.3.5AMPK与CRTC-1/CREB信号在过去数十年中，研究人员重点寻找了AMPK/AAK-2相关信号通路和他们在衰[65]老进程中所起到的作用。最近，Mair等研究表明，CRTC-1细胞质活化剂CREB，17 其以AAK-2/AMPK为靶目标，对AMPK起到直接磷酸化作用。在C型线虫体内或哺乳动物体内，CRTCs是CREB介导基因表达的激活剂。非活性磷酸化的CRTC，能够通过去磷酸化激活细胞质，如钙调神经磷酸酶（蛋白磷酸酶2B），之后它被转运到细胞核内，与CRTC因子结合，并且促进靶基因的转录。Mair等研究表明，人工AAK-2/AMPK诱导磷酸化CRTC-1，阻止其发生核转位，并且因此抑制CRTC-1转录的哺乳动物CREB转录因子同源蛋白。有趣的是，通过AAK-2/AMPK信号通路抑制CRTC-CREB途径，达到延长C线虫寿命，从相应级别标准的蠕虫观察到CRTC-1并无效力。另外，Mair注意到，抑制神经钙素同源的TAX-6也能够延长C型线虫的寿命。这一划时代的研究表明，人工诱导抑制CRTC活化CREB途径，在调节衰老和延长寿命中起到关键作用。当前，人们已经知道热量限制和热负荷应激能够阻碍CRTC-CREB途径和寿命的延长，至少在C型线虫内能够实现。然而，需要说明的是，是否有其他的AMPK激活剂，如二甲双胍、某些激素和植物化学物质或者某些蛋白激酶均可增加CRTCs的磷酸化，通过CREB信号通路阻碍衰老进程。除此之外，对于CRTC有几个其它途径能激活CREB介导的转录。例如许多激酶，蛋白激酶A、Ca++/钙调蛋白依赖蛋白激酶II/IV和P90核糖体蛋白S6激酶类（P90RSK），可激发CREB介导的基因表达。在脑中CREB途径与许多重要的功能相关联，如突触的可塑性和记忆功能，但是另一方面，它又与[66]许多病理条件相关联。最新的研究表明，抑制蛋白激酶A信号，这是否可通过CREB介导增强健康老化。有一些研究也显示，通过Ca++失调可激活钙神经素，加速衰老进程。Dwivedi等观察到，在C线虫体内，钙神经素缺乏，能明显的升高自噬的水平并且延长寿命。特别是，bec-1和atg-7基因延长寿命的关键在于TAX-6神经钙素无效突变体。已知，AMPK能够增强自噬，并且通过这种方式延长寿命，CRTC-CREB信号与自噬调节相关联，这是否与年龄相关还不清楚。2.3.6AMPK与SIRT1信号AMPK和沉默信息调节剂1（SIRT1）信号通路是进化保守的细胞能量反应传感器，分别应对细胞AMP和NAD+浓度的增加。哺乳动物的SIRT1是sirtuin蛋白家族包涵7个基因编码的III类蛋白针对去乙酰酶组蛋白和若干转录因子。SIRT1主要是调节细胞的能量代谢以及许多细胞生存相关的重要因素，如细胞凋亡、细胞增殖和炎症反应。SIRT1通过直接调节FOXO功能、P53和NF-KB信号达到对应激抵抗的调控。Canto[67]等证明，通过增加细胞内NAD+的浓度，激活AMPK，刺激SIRT1的功能活动。因此SIRT1激活若干下游目标，如PGC-1、FoxO1和FoxO3。比方说，PGC-1是一个较强有力的线粒体生物再生诱导物。SIRT1也能够增强Nampt的表达，随后增加NAD+的水平，从而使SIRT1活动赋予能量。有趣的是，Lan等注意到，SIRT1能够脱去乙酰基LKB1激酶，随后增加它的活动。由于LKB1的上游激活AMPK，因此这种信号通路对AMPK具有激活作用。我们可以假设，这种在SIRT1和AMPK之间的正反馈回路，也可以加强一下描述的其他AMPK活性信号通路的功能。AMPK和SIRT1之18 间的密切关系表明，通过集成信号网落应答，成为细胞能量平衡的有力控制器。从出芽酵母到哺乳动物，在不同物种进化的范围，热量控制均是一个可以延长寿命的统一条件。有个别研究指明，虽然SIRT1信号与延长寿命相关联，但似乎SIRT1独立因子也参与其中。增加SIRT1活性期间，热量限制能够增强细胞抵抗应激的能力，这是一个良好的对抗衰老的防御机制。最近的研究强调了自噬在延长寿命方面的作用。[68]已经观察到，在衰老期间，自体吞噬能力下降。Kume等证明，热量限制能够在衰老鼠的肾脏中增强SIRT1的表达。他们证实了SIRT1能够有效减少缺氧诱导损伤刺激的FOXO-3表达的影响Bnip3,称为有效的自噬的诱导物。Hariharan表示，SIRT1脱去乙酰基FOXO1随后诱发自噬，通过相关联的蛋白Rab7的表达，并且在心肌细胞内Rab7能够激发溶酶体和自噬体的融合。断食诱导，小鼠心脏内自噬明显减少，特异性删除FOXO1，也诱发这些小鼠心脏功能的损害。除此之外，通过FOXO介导机制，SIRT1也能够诱发自噬作用，通过直接脱去乙酰基自噬（ATG）蛋白,如Atg5、Atg7和Atg8。脱去乙酰作用蛋白质，能够实现自噬吞噬体的形成。Lee等证明了在断食饥饿期间，胚胎成纤维细胞从SIRT1途径无法实现小鼠的自体吞噬的激活。这也强调了，在SIRT1和Atg5都缺乏的老鼠显示，损伤细胞器的清除率不足，例如线粒体。这些研究暗示着，SIRT1能够直接激发自噬的上调，这是一个至关重要的调节机制，尤其是在衰老过程中。[69]最近有研究表明，在鼠的脂肪细胞中，成纤维细胞增长因子21（FGF21）活化的LKB1-AMPK-SIRT1信号通路与自噬相关。人们观察到一个有趣的现象，激活FGF21，需要β-klotho蛋白质作为专门的感受器，缺乏β-klotho蛋白质诱导的小鼠，出现过早衰老的表型。FGF21能够刺激细胞外的信号调节蛋白1和2（ERK1/2）随后的信号激活LKB1。然而，β-klotho蛋白主要表达在肝脏、胰脏和脂肪组织中，FGF21调节新陈代谢的功能，主要通过激活AMPK-SIRT1信号。FGF21主要的功能之一是调节热量限制的适应性反应，但AMPK-SIRT1信号通路在通过β-klotho蛋白质缺乏诱导的过早衰老过程中的作用。据报道酵母Sir2与哺乳动物抗衰老酶的直系同源性蛋白质，能够延长酵母菌的寿命。在此之后发现的Sri2基因，也能够在C型线虫和果蝇中起到延长寿命的作用。但最近Burnett等研究表示，无法确认这些基因对寿命有影响，现在看来转基因的遗传背景和诱变插入可能影响早期的研究的结果。然而，不同的方法已经清楚地表明，哺乳动物的SIRT1能够改善健康状况，减轻许多衰老相关的退行性疾病，例如心血管疾病和神经变性疾病。2.3.7AMPK与FOXO轴哺乳动物叉头蛋白转录因子FOXO家族由四个成员组成：FoxO1,FoxO3a,FoxO4和FoxO6，其参与管理调控几个关键的细胞功能，例如细胞凋亡、细胞周期、抵抗应激、葡萄糖和脂质代谢以及炎症反应。在1997年从C型线虫体内发现的DAF-16，与哺乳动物的FOXOS为同源，它在管理寿命延长方面扮演着重要的角色。在哺乳动物和线形虫中，DAF2路径对应哺乳动物胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路，下调19 [70]FOXO/DAF-16转录的活性因子。在哺乳动物中，已有报道指出，AKT激酶磷酸化FOXO因子在14-3-3伴侣蛋白结合的三个启动部位，促进FOXO蛋白质从细胞核和含有FOXOS的细胞质内导出。Lin等发现，功能缺失的DAF-2路径，能够双倍延长C型线虫的寿命。他们还发现，激活和延长寿命相关的核运转DAF-16。C型线虫的14-3-3基因，FTT1和FTT2，可能通过DAF-16-依赖和独立机制参与寿命调控。提出，长寿机制与AMPK-依赖,UNC-51-like激酶1(ULK1)-诱导的自噬相关联。[71]Greer等证明，AMPK在鼠成纤维细胞激活区，直接磷酸化FOXO3蛋白质，在苏氨酸/丝氨酸残基上。这也表明，AMPK诱导激活FOXO3介导的转录，但不影响FOXO3蛋白质的亚细胞位置，AMPK-FOXO/DAF-16轴参与了通过饮食限制实现C型线虫寿命延长的过程。他们还诱导出AMPKγ2不断活跃的基因突变的转基因蠕虫，用以研究AMPK-FOXO/DAF-16轴对延长寿命所起到的作用。有趣的是，研究人员发现，AMPK的持续活跃，能够升高有机体对氧化应激的抵抗能力以延长蠕虫的寿命。这些持续不断激活AMPK效应的实现，需要保证DAF-16蛋白质完整的存在。多个研究验证了，通过FOXO/DAF-16实现基因的激活。AMPK-FOXO3路径的靶基因，与延长寿命相关，其包括多个对抗氧化应激的基因，例如，硫氧环蛋白和解偶联蛋白UCP2以及对抗DNA损伤的如GADD45a。此外，FOXO因子整合进入其他的具有延长寿命功能的其他因子中。比如，已知的FOXO3a抑制NF-Kb信号，通过诱导抑制KB基因，IKBβ和IKBε，从而预防与年龄相关的炎症反应。另一方面，上游NF-B信号激酶，IKKα和IKKβ，能够磷酸化FOXO3蛋白质，触发蛋白质的泛素化和降解。众所周知的P38α激酶，诱导细胞衰老，能够抑制AMPK-FOXO3α信号。他们还观察到，药物阻断P38α触发的细胞核内FOXO3α和磷酸酶及张力蛋白同族蛋白（PTEN）表达增高，强效抑制IIs/DAF-2途径从而诱导FOXO3发生核转位。这种正反馈回路能够激活AMPK-FOXO3α轴。虽然，AMPK能够通过Ulk1/雷帕霉素哺乳动物结合靶位点（mTOR）的调节来激发自噬，FOXO因子也能刺激若干自噬诱导物的表达，例如Bnip3,LC3,ATG12和Gabarabl1。这些研究表明，FOXO1和FOXO3α能够提升促进例如骨骼肌和心肌结构内的自噬。此外，SIRT1能够在热量限制期内增强FOXO3α介导的自噬。最近，Demontis和Perrimon证明了，在果蝇体内，FoxO/4E-BP信号能够激发自噬，以及吸收和维护老化肌肉中的蛋白质沉积。由此看来这种蛋白质能够通过FoxO和ULK1/mTOR路径增强自噬。FOXO因子和P53交织存在于复杂的信号网络结构中。有趣的是，这两种蛋白在细胞应激情况下可以诱导Sestrins的表达，例如氧化应激、缺氧和DNA损伤应激。在哺乳动物三个SESNs应激诱导Sestrins，有抗氧化能力但它们的功能还不得而知。值得注意的是，Lee等证明了，在果蝇体内FOXO具有AMPK激活能力并且在FOXO与AMPK信号之间已经证实存在正反馈回路。P53也能够激活AMPK，随后抑制mTOR诱发自噬。他还证明了缺损的Sestrin终导致与年龄相关的病理变化，如线粒体的功能障碍、肌肉变性以及脂肪堆积。这些Sestrin消耗引发的效应很可能归因于mTOR活动20 的增强和自噬相关的吸收减少通过AICAR激活AMPK和通过雷帕霉素抑制mTOR防护这些病理。这意味着，FOXOs以及p53，可以被认为是诱导mTOR负反馈回路的信号，并且通过激活AMPK能够翻译细胞应激信号进入自噬防御，从而能够延长有机体寿命。2.3.8AMPK与p53途径人们已经发现P53蛋白在衰老和细胞凋亡方面发挥重要作用。P53转录因子是一个重要的肿瘤抑制蛋白质，它在调节新陈代谢和自噬方面所起的重要作用也被认可。已知的不同的应激因子能够在p53蛋白质的激活区磷酸化ser-20信号。AMPK是一种适应能量代谢缺乏的靶向定位激酶类。Jones等证明了AMPK提升了p53的活性，通过磷酸化ser-15诱导的细胞周期停滞。Okoshi观察到[60]，AMPKα2强迫表达增加了P53基因的转录和提高了p53蛋白质的磷酸化。在ser-46诱导的细胞凋亡过程中，减量调节AMPKα2能够减低ser-46的磷酸化作用和减少p53的表达。这些研究表明，P53蛋白质是一种受AMPK控制的靶蛋白，控制p53的表达水平和对其具有反式激活能力。有文献表示，p53在细胞老化和有机体衰老过程中所起的作用不相一致。Matheu等证明了在小鼠体内，激活Arf/p53能够明显延缓衰老的过程，并且减少了与年龄相关的损害，这可能是因为增加了抗氧化基因的表达。有研究显示，p53是一种强有力的抗氧化蛋白的诱导物从而能够减少与衰老相伴的氧化应激。最近有研究指明，p53主要影响长寿基因调节，但是这种调节的发生需要依赖多种细胞代谢的相关作用过程。比如，p53是一种有效的自噬调节剂，但它的反应依赖细胞内的定位化，即存在于细胞质内p53抑制自噬，然而如果延伸到细胞核其便能够激发自噬，通过转录DNA损伤调节自噬调节剂1（DRAM1）和sestrin2蛋白质。P53在自噬中所起到的效应是依赖于mTOR的激活水平和活性氧物质（ROS）的产生。这清楚地证明了，p53在通过自噬介导的有机体衰老过程中的效应。增强自噬能够延长有机体的寿命，反之抑制其将会引起废物的积累从而影响健康和寿命延长。线粒体是几个p53功能活动的主要靶位点，例如线粒体的再生和以这种方式p53调节线粒体的能量代谢以及细胞凋亡。最近的研究表明，p53也能够通过Mieap诱导控制线粒体的完整性，Mieap是一种蛋白质能够消除线粒体内部的氧化蛋白。[60]Feng证明，在衰老的小鼠组织中，p53能够有效的使细胞的应激反应下降。他们还注意到转录p53因子以及p53相关因子明显的减少了因衰老引发的细胞凋亡。他们没有研究衰老对AMPK活性的影响，但是这种与年龄相关的AMPK激活缺乏能够引起p53信号抑制。P53功能的下降是同已经报道的衰老过程中诱导的相似现象，例如自噬减退，通过兴奋NF-KB途径和增大氧化应激使炎症反应增多。除此之外，p53和nf-kb之间有拮抗作用，例如在衰老过程中能够增强nf-kb的活动，能下调许多p53的功能。衰老能够使p53的激活能力下降，同时也能够减少sestrin驱动的AMPK激活和增强年龄相关的病理现状的表现。21 2.4总结由此可见，由于细胞自噬功能异常，细胞清除变形、损伤、衰老或非功能性蛋白质及细胞器的能力降低，导致这些废物在细胞内大量聚集，从而诱发AD的产生。通过适宜强度的运动训练上调细胞自噬水平能清除胞质内受损的蛋白质、细胞器及代谢产物，并将其降解为氨基酸、核苷酸、游离脂肪酸等物质参与物质能量循环，从而预防或减轻AD、提前衰老、心血管疾病等自噬相关疾病。但是，运动训练影响AD脑功能确切的细胞分子机制还不明确。AMPK是能量代谢的中心调节器，与AD发病密切有关。AMPK的活化可以改善AD大脑的代谢紊乱，也能通过调节APP加工来减少Aβ蛋白的生成。AMPK还可以磷酸化tau蛋白的多个位点，增强与微管的结合。此外，AMPK的活化会抑制mTOR信号通路，促进自噬和Aβ蛋白溶酶体的退化。越来越多的研究表明，AMPK是防止代谢性应激的神经保护因子，在AD发病机理中起着重要作用，是治疗AD的潜在靶点。AD神经元自噬，尤其是神经元对具体运动方式发生特异性自噬途径的基因表达和信号通路还鲜为人知，与运动敏感性基因表达有关的调控因子还知之甚少。3研究对象与方法3.1研究对象雄性2月龄SD大鼠80只，体重206±12g，购于西安交通大学，医学院，动物实验中心，许可证号：SCXK(陕)2007-003。国标啮齿类动物，饲料喂养，自由饮食。动物饲养环境:室温(24±1)℃,湿度30%~60%，自然光照。3.2研究材料3.2.1主要试剂试剂名称生产公司D-半乳糖Sigma公司兔多克隆抗大鼠Bcl-2博奥森公司兔多克隆抗大鼠Beclin-1ABCAM公司鼠单克隆抗大鼠MAPLC3-ISanta公司鼠单克隆抗大鼠MAPLC3-IISanta公司兔多克隆抗大鼠P-AktCellSignalingTechnology公司羊抗兔FITC（绿）SAB公司羊抗鼠CY3（红）康为世纪公司SP免疫组化试剂盒博奥森公司DAB显色试剂盒北京中杉公司抗体稀释液北京中杉公司PVDF膜Millbe公司RIPA裂解液陕西先锋科技公司cocktain抑制剂罗氏公司公司22 BCA蛋白定量盒博奥森公司WB制胶试剂盒陕西先锋科技公司鼠单克隆β-actionSanta公司5x蛋白上样缓冲液Santa公司彩色预染蛋白markerSanta公司DAPI染液抗荧光淬灭剂Santa公司兔HRP二抗Santa公司鼠HRP二抗Santa公司电泳缓冲液陕西先锋科技公司转膜缓冲液陕西先锋科技公司TBS陕西先锋科技公司吐温20陕西先锋科技公司BSA陕西先锋科技公司ECL发光液Promega公司X光胶片陕西先锋科技公司定影显影粉陕西先锋科技公司SOD测试盒南京建成生物工程研究所MDA测试盒南京建成生物工程研究所GSH测试盒南京建成生物工程研究所3.2.2主要仪器仪器名称生产公司动物跑台上海欣软信息科技有限公司全功能酶标仪德国johannaotto公司紫外分光光度计日本岛津公司电泳仪北京六一厂转移电泳槽北京六一厂垂直电泳槽北京六一厂台式高速冷冻离心机eppendorf公司羊抗鼠CY3（红）康为世纪公司石蜡切片机德国徕卡公司光学显微镜日本奥林巴斯公司荧光显微镜德国徕卡公司3.3研究方案实验前，随机将大鼠分为4组，即正常对照组(NormalControlGroup,NC组)2023 只、运动对照组（ExerciseControlGroup,EC组）20只、AD模型对照组(AlzheimerControlGroup,AC组)20只、AD模型训练组(AlzheimerExerciseGroup,AE组)，20只。NC组按常规饲养，自由活动，每日上午腹腔注射1次生理盐水(150mg/kg)，共8周；EC组同NC组，并运动；AC组按常规喂养，自由活动，每日上午腹腔注射1次D-半乳糖(150mg/kg)，共8周；AE组除每日腹腔注射D-半乳糖(150mg/kg)外，[61]还进行跑台训练（见图1），共8周。大鼠训练方案见表1：表1大鼠跑台训练方案周数跑速（m/min）每天运动时间（min）每周训练时间（d）第1周10306第2‐4周15456第5‐8周15606图1大鼠跑台训练照片在实验后期，AC组和AE组各有2只大鼠非正常死亡。3.4测试方法3.4.1大鼠行为学测试实验前一天将大鼠放入温水中自由游泳5min，使其熟悉水迷宫环境。在实验第9周采用Morris水迷宫对各组大鼠进行行为学测试，测试分两步，第一步进行定位航行实验，共5天，将受试大鼠面向迷宫池壁的4个标记点依次轻放入水，如大鼠在120s内找到平台，则记录其时间，即逃避潜伏期，如超过120s未找到，则逃避潜伏期为120s。第二步是空间探索实验，实验第6天将平台拿走，放大鼠于水池中，记录大鼠120s内在平台所在象限停留的时间和穿越平台所在象限的次数（见图2）。24 图2大鼠Morris水迷宫3.4.2海马CAI区Nissle染色水迷宫测试结束后24h，各组取4只大鼠，10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经升主动脉灌注肝素化的生理盐水250ml，继4%多聚甲醛500ml灌注。取海马置4%多聚甲醛溶液中后固定24h，水洗；先后移入70%,80%,90%和无水乙醇及二甲苯中脱水透明；浸蜡，包埋，切片；切片裱于经多聚赖氨酸处理过的玻片上，室温干燥，切片入蒸馏水，从70%酒精开始逐级上行至无水酒精脱蜡，每级约2min，再下行返回各级酒精；每级约2min，最后入蒸馏水10min×2；0.5%甲苯胺蓝(60℃)浸染60min；水洗，梯度酒精分化、脱水；二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察。采用Image-proPlus6.0软件计数阳性染色像素总和，采用阳性染色像素计数总和反映脑片内存活的神经细胞。3.4.3大鼠海马区Golgi染色在行为学检测实验结束后24h，每组各取5只大鼠进行Golgi染色。具体方法如下：①取材及固定：大鼠麻醉后经主动脉灌注肝素化的生理盐水，接着用500ml4%多聚甲醛进行灌注固定，取左侧大脑半球置4%多聚甲醛溶液中后固定24h。②流动水冲洗24h，入3.5%重铬酸钾溶液浸泡6天，每天换液1次，蒸馏水冲洗后，取出吸干。③用1.5%硝酸银水溶液室温浸泡2天，经蒸馏水快速冲洗，依次在70%、90%和无水酒精中脱水4小时，放入5%火棉胶中8小时包埋。④行厚40um做连续切片，放切片于80%酒精中洗2次，将切片置于混合液中变成灰黑色，用70%酒精冲洗15分钟，于25%亚硫酸钠水溶液固定10分钟。⑤蒸馏水冲洗、95%酒精脱水，二甲苯透明，每只大鼠随机取5张脑片，中性树脂封片观察。每张脑片选择6个细胞于海马CA1区进行观察，并于油镜下拍照，[62]测量距胞体150-200um扇形范围内的侧树突密度，并计数。3.4.4海马CAI区P-AMPK免疫荧光染色取材同上，石蜡切片，常规脱蜡至水。3%H2O2去离子水孵育30min，PBS清洗，抗原修复后血清封闭室温30nin，倾去，勿洗。滴加一抗(P-AMPK,1:400)，4℃过夜。25 PBS冲洗，3min×5次。滴加荧光二抗（羊抗兔CY3，1:200），室温暗色湿盒孵育1h，PBS洗脱，甘油封片，荧光显微镜下进行观察拍照。3.4.5氧化应激指标检测实验结束24h后，各组取5只大鼠，10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,迅速开胸下腔静脉穿刺取血约2mL/只，3000r/min离心10min，取上清-80℃备用。在冰板上快速分离出海马称重后在超声均浆机上匀浆。用Bradford的考马斯亮蓝染色法，测定各样品的蛋白含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性,丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH）活性均采用相应的试剂盒测定。3.4.6WesternBlot检测实验结束24h后，各组取5只大鼠，10%水合氯醛(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，迅速断头取脑。切取海马置于预冷的细胞裂解液中充分匀浆后冰上静置30min；加入等量的5×buffer混匀，沸水中煮5min；冰上冷却5min；以12000r/min4℃离心30min；弃沉淀，留上清液。取小部分上清液用BCA法测定蛋白浓度，剩余上清液分装，置-80℃冰箱待用。等量蛋白样品(50μg)经12.5%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜上。经5%脱脂牛奶室温下摇床封闭1h，分别用兔多抗P-AMPK(Thr172)、Beclin-1(1:2000)、鼠单抗LC3I/II(1:2000)、P-Akt(1:2000)、Bcl-2(1:1000)兔单抗β-action(1:1000)，封口薄膜包装，4℃过夜；TBST洗膜10min×3次,分别加入相应的HRP结合的羊抗兔、羊抗鼠IgG(1:2000)室温孵育1h；TBST洗10min×3次，加入ECL发光液1min后于暗室内进行胶片曝光、显影、定影、晾干。实验重复3次,β-action作为内参照。以目的条带与内参的吸光度比值表示蛋白表达。应用Bandscan.5.0进行分析。3.5统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有数据均以xs表示，两组数据比较使用t检验，多组比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。4研究结果4.1大鼠行为学测试结果4.1.1各组大鼠定位航行实验结果表2各组大鼠Morris水迷宫逃避潜伏期(s)组别nD1D2D3D4D5NC2046.24±7.3326.32±5.7817.54±5.549.97±1.873.41±1.25EC2044.42±6.3223.37±4.6816.59±5.378.49±1.392.58±1.22*****AC1859.44±9.3835.38±7.4726.73±7.6720.12±6.5416.36±6.54***##**##AE1852.68±8.2633.56±6.5721.72±5.2710.41±5.175.22±2.26###注：与NC组相比*p<0.05,**p<0.01;与AC组相比p<0.05,p<0.01.26 如表2所示，各组大鼠定位航行实验结果显示：与NC组比较，AC组和AE组大鼠逃避潜伏期在第3天明显增加(p<0.05，p<0.01)，表明这两组大鼠在第3天空间记忆能力出现显著下降。在实验第4，5天，AE组大鼠逃避潜伏期与AC组比较，明显降低(p<0.01)，表明8周跑台训练能有效缩短AD模型大鼠寻找平台的时间，可以改善AD模型大鼠的空间记忆能力。EC组与NC组相比，无显著性变化（p>0.05）。4.1.2各组大鼠空间探索成绩比较表3各组大鼠Morris水迷宫空间探索实验成绩组别n目标象限停留时间（s）穿越原平台位置次数（次）NC2048.46±10.4510.83±2.17EC2046.88±9.369.87±1.99AC1829.58±5.74**3.16±1.21**####AE1039.43±9.476.49±1.32###注：与NC组相比*p<0.05,**p<0.01;与AC组相比p<0.05,p<0.01.在第5天撤除平台后的空间探索实验成绩如表3所示，与NC组相比，AC组在目标象限停留的时间明显降低(p<0.01)，穿越原平台位置次数也显著减少(p<0.01)，表明AC组大鼠的空间探索能力与NC组相比明显减弱。与AC组比较，AE组在目标象限停留的时间明显变长(p<0.05)，穿越原平台位置的次数也显著增加(p<0.01)，表明AE组大鼠的空间探索能力与AC组比较有显著提高。4.2大鼠海马CAI区神经元Nissle染色结果Nissle染色结果如图3所示，NC组与EC组神经元饱满，细胞边界清晰，细胞排列紧密，尼氏小体染色均匀，细胞核无固缩现象；AC组神经元排列稀疏，细胞边界模糊，细胞核出现大量固缩（见白色箭头），尼氏小体着色不匀，部分细胞已解体；AE组神经元部分细胞核也出现固缩，但尼氏小体较AC组着色相对均匀，细胞排列也较清晰、紧密。通过对神经元尼氏体染色阳性细胞计数结果表明（见表4），AC组CAI区海马神经元数目较NC组显著减少(p<0.01)，AE组神经元数目较NC组也显著减少(p<0.05)，但AE组较AC组神经元数目显著增加(p<0.05)，此结果表明，AE组神经元形态及存活数量较AC组明显改善。图3各组大鼠海马CA1区Nissle染色图（×400）（注：白色箭头示示凋亡神经元，bar=100um）27 表4各组海马CAI区神经元计数（个，n=4）组别神经元计数NC63.45±5.88EC62.94±6.42AC35.36±3.21**#AE48.29±4.31*###注：与NC组相比*p<0.05,**p<0.01;与AC组相比p<0.05,p<0.01.4.3大鼠海马区神经元Golgi染色结果对各组海马神经元经Golgi染色发现（如图4所示），NC、EC、AE三组神经元树突棘排列规则、整齐，较为密集，而AC组神经元树突棘明显稀疏且不规则。对侧树突密度计数发现（见表5），与NC组相比，EC组与AE组神经元树突棘显著增加(p<0.01)，AC组神经元树突棘密度较NC组显著减少(p<0.01)；与AC组比较，AE组神经元树突棘密度显著增加(p<0.01)，此结果表明，AC组大鼠神经元树突受到明显损伤，而8周的跑台运动可以增加AD大鼠海马神经元侧树突的密度。图4各组大鼠海马Golgi染色图（×1000）（注：bar=10um）表5各组大鼠海马CAI区锥体细胞侧树突密度（单位：棘数/10um）组别神经元数量侧树突NC组67.86±0.22EC组68.48±0.23**AC组65.48±0.18**##AE组68.39±0.30**###注：与NC组相比*p<0.05,**p<0.01;与AC组相比p<0.05,p<0.01.28 4.4大鼠海马CA1区P-AMPK免疫荧光染色结果图5各组大鼠海马CAI区P-AMPK免疫荧光染色图（×400）bar=100um我们对海马CAI区神经元P-AMPK进行免疫荧光染色，胞浆红染为P-AMPK阳性细胞，结果显示（见图5），P-AMPK在AE组表达明显增强，且主要在胞浆表达，而在AC组P-AMPK表达很弱，NC组、EC组P-AMPK表达介于二者之间。此结果表明，AE组海马神经元P-AMPK被激活。4.5各组大鼠海马组织氧化应激指标测定结果表6各组大鼠SOD、GSH、MDA测定结果组别nSOD(U/mg.prot)GSH(U/mg.prot)MDA(nmol/ml)NC5964±42.1873.48±5.191.54±0.21EC5893±41.5461.22±5.121.49±0.14AC5423±19.32**30.88±4.65**4.12±1.31**AE5584±19.26*#34.27±2.89*2.62±0.19*#注：与NC组相比*p<0.05,**p<0.01;与AC组相比#p<0.05,##p<0.01.表6结果显示，AC组和AE组海马组织SOD、GSH含量与NC组比较明显降低，MDA含量明显增加，具有显著性差异(P<0.01)；与AC组比较，AE组大鼠海马组织SOD含量显著提高，MDA含量显著降低，具有统计学差异(P<0.05)，但GSH含量在两组之间没有显著性差异(P>0.05)。4.6WesternBlot检测结果WesternBlot检测结果显示（见图6、7、8、9），与NC组比较，AC组P-AMPK蛋白表达明显降低(p<0.01)，AE组P-AMPK表达较NC组和AC组明显增强(p<0.01)，此结果与荧光染色结果相同。AE组LC3II/LC3I比值较NC组和AC组明显增强(p<0.01)，其余29 三组LC3II/LC3I比值无显著性差异。与NC组相比，EC组和AE组Beclin-1蛋白表达明显增强(p<0.01)，AC组Beclin-1蛋白表达明显降低(p<0.01)；与AC组相比，AE组Beclin-1蛋白表达明显增强(p<0.01)。与NC组相比，AC组和AE组P-Akt、Bcl-2蛋白表达明显降低(p<0.01)，与AC组相比，AE组P-Akt、Bcl-2蛋白表达明显增加(p<0.01，p<0.05)，NC组与EC组之间的蛋白表达没有显著性差异。图6大鼠海马P-AMPK蛋白相对表达量图7大鼠海马LC3II/LC3I蛋白相对30 图8大鼠海马Beclin-1蛋白相对表达量图9大鼠海马P-Akt和Bcl-2蛋白相对表达量5讨论与分析5.1AD大鼠模型的建立及运动干预对其学习记忆功能的影响AD作为一种病理机制尚未完全明确的神经退行性疾病目前是神经学科研究的热点之一，建立一种能够反映人类AD发病机制的动物模型对于AD的研究极为重要。目前国内外常用的AD动物模型主要有：大鼠海马区注射凝聚态Aβ；腹腔注射D-半乳糖；灌注含铝化合物；前脑胆碱能系统损害模型；手术切断穹窿-海马伞模型及PS1/APP双转基因小鼠等。除AD转基因小鼠能较好的再现AD的发病进程和病理特征外，其它几种AD模型的建立都是针对AD发病的某些症状来模仿的。由于AD转基因小鼠在配种、繁殖、鉴定技术及经费昂贵等方面的限制，目前国内多采用传统建模模式。目前AD发病的多种假说中，“淀粉样蛋白级联学说”被广泛认可，Aβ在神经元外的沉积是引起神经元丢失的主要原因，AD的主要临床表现是近期记忆能力下降，海马区被认为31 是与学习记忆关系最为密切的脑功能区，海马神经元丢失引起细胞突触减少是记忆功能下降的病理基础。[63,64]在所有的AD建模中，D-半乳糖注射是最为简便有效的。据文献报道，对青年大鼠超过5周的D-半乳糖注射后，可使大鼠同时出现衰老和智力低下的表现，尤其是可观察到神经细胞凋亡、神经原纤维缠结、神经炎斑等神经退行性疾病的病理学特征。D-半乳糖损害模型是由我国学者首先提出的，动物表现为学习记忆力下降，皮质神经元中细胞器减少，线粒体膨胀呈空泡样变性，粗面内质网脱颗粒，蛋白质合成减少，神经元丢失，这与老年动物的表现一致。长期注射D-半乳糖后所引起的代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内，影响渗透压，引起细胞肿胀、代谢紊乱、体内活性氧水平升高、细胞膜脂质破坏、细胞核萎缩，最终产生体内多器官、多系统功能衰退等均与老龄鼠相似，同时，D-半乳糖会引起脑神经元的一系列退行性变化，包括脑组织氧化还原酶(如SOD)下降，丙二醛(MDA)含量升高，学习记忆能力下降等明显的生化、病理及行为变化与AD较为近似。在本实验中，我们选用的D-半乳糖的浓度是150mg/kg，进行腹腔注射持续8周，在实验过程中，我们发现AC组大鼠体重增加缓慢，皮毛发黄，缺乏光泽，目光呆滞，进食与粪便都较少，整个身体呈现出代谢变缓的现象。对于如何检验AD模型的建立，国内外常用的方法是通过大鼠行为学检测其学习记忆能力及组织学观察其病理特征。Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段，其在AD研究中的应用非常普遍。较为经典的Morris水迷宫测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。这两项实验都是在水中进行，虽然老鼠是天生的游泳健将，但是它们却厌恶处于水中的状态，同时游泳对于老鼠来说是十分消耗体力的活动，他们会本能的寻找水中的休息场所，寻找休息场所的行为涉及到一个复杂的记忆过程，包括收集与空间定位有关的视觉信息，再对这些信息进行处理、整理、记忆、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隐藏在水中的站台，最终从水中逃脱。本实验结果表明，AD大鼠的逃避潜伏期与正常大鼠相比明显变长，目标象限的停留时间和穿越平台次数与正常大鼠比较也明显变短和变少，这些结果都表明AD大鼠的近期记忆能力下降明显。AD的病理改变除经典的老年斑外，还有突触丢失和神经元丢失，其中神经元丢失是脑萎缩的形态学基础，也是引起学习记忆能力下降最主要的因素。尼氏染色是观察神经元形态及数量最好的染色方法，在生理情况下，神经元内的尼氏体大而数量多，尼氏体清晰可辨，在神经元受损时，尼氏体的数量可减少甚至消失，因为尼氏体是含有核糖体的粗面内质网，尼氏体功能的好坏决定了神经元蛋白质合成功能的高低，进而影响神经元的存活。在本实验中，AD大鼠海马CAI区神经元受损严重，表现为尼氏小体着色不均匀，核固缩等凋亡现象，以致神经元丢失。所以本研究所建立的AD大鼠模型无论从行为学上还是病理学特征上都较好的模仿了AD的发病特点，所以本实验的造模是成功的。32 体育运动作为AD的一种有效干预手段目前被广泛认可。流行病学调查显示，对一定人群的AD患者给予不同负荷的运动刺激后发现，经常参与体育运动的老年人患老年性痴呆的危险较低，中等负荷的体育运动可以防止老年人认知功能下降，改善AD患者[65,66][67]的病况。各种AD动物模型也表明，对AD模型动物进行转笼、跑台、游泳等刺激后，其学习记忆能力得到明显提高，所以选择一种合适的运动干预方案是至关重要的。针对AD病人一般年龄偏高，体力较差，只适合参与轻度或中等负荷的体力活动，所以，我们的运动干预方案选择中等负荷的跑台训练，其原因是跑台负荷可以定量。最大摄氧量（VO2max）是反映有氧运动能力的理想指标。人体和动物运动中，VO2max百分率以其客观性和可比性被广泛用于运动强度评定。在本实验中，我们参照Bedford跑台训练方案加以改动，因为60%-70%VO2max可以看作是中等负荷训练，但本实验对象是AD造模大鼠，体力较正常大鼠弱，所以我们在65%VO2max跑速的基础上将跑台速度下调，最终定为15m/min，并在实验中通过观察大鼠的毛色、饮食、粪便、体重及运动能力来确定，确保大鼠不会出现疲劳症状。近年来的研究表明，适宜负荷的运[68]动训练对AD动物模型的学习记忆能力有不同程度的提高。Wang等研究证明，通过脑室内注射Aβ制作的AD大鼠模型给予12天的转笼训练后，Y型迷宫成绩明显提高，神[69]经元丢失和突触数目减少都明显缓解。Dao等也证实，海马区注射Aβ的AD大鼠模型经过跑台训练后，旋臂水迷宫的学习记忆能力明显提高。在本实验中，我们观察到经过8周的跑台运动训练后，AD大鼠行为学指标明显改善，其近期记忆能力得到明显提高，这表明本实验选取的运动强度和负荷可以改善AD大鼠的学习记忆能力。对与学习记忆功能密切相关的海马区神经元进行尼氏染色结果也表明，AD训练组大鼠的海马CAI区神经元形态与AD模型组比较明显改善，AD训练组神经元存活数量明显多于AD模型组，这表明适宜负荷的运动刺激可以改善神经元的生存环境，促进神经元的活性。但适宜运动的刺激如何保护AD神经元的丢失是我们比较关心的问题，在本研究中，我们选择对运动刺激敏感的神经元的可塑性和AMPK信号分子及与神经元丢失密切相关的细胞自噬几个点进行研究，看是否有关联。5.2运动对AD大鼠海马神经元突触及氧化应激的影响动物实验证明，对AD模型动物给予游泳、跑台、转笼或丰富环境刺激均可明显[70,71]提高其学习记忆能力。目前研究表明，神经元突触的可塑性在学习记忆的形成中起着主导作用，AD患者海马区神经元突触可塑性的损害会导致认知功能障碍进行性加重。所谓突触可塑性就是由神经活动引起的神经元之间信息传递效能的增强或减弱，它被认为是学习和记忆能力重要的细胞基础。本研究关注了与突触可塑性密切相关的神经元树突密度来探讨运动改善AD大鼠认知功能的机制。神经元突触中较为常见的是胞-树突触和树-树突触，神经元树突的多少决定了形成突触数量的多少。神经元突触可塑性主要表现为突触的活化和再生，这就为中枢神[72]经系统损伤后机能的代偿提供了可能。突触的活化和再生是指在一定条件下，由神33 经元的胞体、树突和轴突之间形成新的突触现象，可表现为树突密度的增加，如学习和记忆的过程就是新的突触形成的过程。在本研究中，我们选择8周的跑台运动作为一种外源性的刺激因素，我们观察到经过8周的跑台训练后，AD大鼠海马神经元的侧树突密度明显增加，这就为形成新的突触提供了可能，这也是本实验中AD大鼠记忆功能改善的生理学基础。我们分析其原因主要是长期的运动刺激对AD大鼠海马区邻近存活神经元树突的代偿性增生。有研究表明，在成年动物，长期的传入冲动、学习行为和环境刺激均可导致神经元树突增长，树突结构发生适应性改变。在我们的实验中，8周的跑台训练刺激可加速AD大鼠海马区存活神经元对邻近死亡神经元的代偿，因而存留细胞通过树突的增生来补偿死亡细胞，进而发生神经元的纤维发芽和突触重建来改善AD神经元。那么运动是如何保护神经元的呢？我们选择了大鼠海马组织的氧化应激指标进行了测试。在体内，氧自由基的产生和抗氧化酶是处于一种动态平衡中，当机体自由基增多，超过了机体的清除能力，就会产生大量的脂质过氧化产物MDA，从而破坏细胞膜的结构引起细胞的凋亡，而体内重要的抗氧化酶如SOD和GSH会清除多余的氧自[73]由基，减轻MDA的产生，从而对细胞起到保护作用。在本实验中给予大鼠注射的D-半乳糖可由醛糖还原酶催化还原成半乳糖醇，而半乳糖醇不能被进一步代谢进而在细胞内堆积，可以影响细胞渗透压、导致细胞肿胀、造成代谢紊乱及功能障碍，最终能使机体出现衰老。半乳糖在体内代谢产生的半乳醛也会在体内诱发大量氧自由基，[74]从而对细胞膜产生攻击，引起细胞衰老甚至死亡。在本实验中，我们看到AC组海马组织的SOD和GSH活性明显下降，而MDA产物明显增加，这是引起海马神经元凋亡以致死亡很重要的因素。经过8周的跑台运动后，AE组大鼠海马组织的SOD活性与AC组比较明显提高，MDA产物明显减少，但GSH活性没有明显改变，说明长期适宜的运动可以提高脑组织中某些抗氧化酶的活性，从而降低脂质过氧化产物对细胞膜的毒性效应，这是适宜运动保护衰老神经元的可能机制之一。5.3运动对AMPK的激活和自噬对AD的影响AMPK是一个丝/苏氨酸激酶，由一个α催化亚基和两个β、γ调节亚基构成，是真核生物能量代谢变化的感受器，许多生理刺激如低氧、营养、热休克、衰老和运动等都能够激活AMPK。当细胞处于葡萄糖饥饿时，ATP/AMP降低，AMPK被激活，[75]通过磷酸化激活结节性脑硬化复合物2（TSC2）从而抑制mTOR，上调细胞自噬。AMPK也可经mTOR的伴侣分子raptor间接作用于mTOR而抑制其活性，上调细胞自[76]噬。另一些研究表明，AMPK也可降低mTOR的下游分子S6K1和4E-BP1的磷酸[77]化水平从而启动自噬。还有研究表明，AMPK能直接结合UNC-51样酶（UNC-51like[78]kinase1,ULK1）复合物，并磷酸化ULK1，从而诱导自噬。所以，AMPK的激活对于自噬水平的调节是非常重要的。自噬即是细胞的一种自杀现象，也是一种蛋白质降解机制，多是细胞处于饥饿、能量匮乏、各种病理状态下细胞的一种崩解，崩解产生34 的各种细胞碎片又能重新被细胞利用，所以自噬会消灭一些对机体造成损伤的细胞，适度的自噬可对机体起到保护作用。但自噬过度又会造成正常细胞的死亡，所以自噬是一把“双刃剑”，如何合理有效的利用细胞的自噬现象是我们寻找治疗疾病的关键。运动对自噬影响的相关研究报道较少，随着人们对自噬认识的不断深入，研究人员逐渐关注运动中自噬的变化及其生理意义。BethLevine等认为运动可以有效的诱发自噬，并且一次急性运动和耐力运动都可以使具有自噬能力（正常）的小鼠糖代谢能力增加，自噬相关蛋白表达亦增加，而这种情况在自噬缺陷的小鼠体内并不会发生。[79]目前，关于运动对AMPK与自噬共同调节的文献非常匮乏。钱帅伟等认为，适宜强度的运动训练可通过上调细胞自噬水平，为细胞再生提供一定的能量与合成底物，而自噬的过度激活则会导致细胞损伤或疲劳，甚至可能诱发自噬性细胞死亡，所以运动强度的选择是激发自噬水平的关键。在AD神经元中，适度的自噬现象可减少正常[80]神经元的丢失。已有研究表明，一种药物如白藜芦醇可通过激活AMPK进而提高AD神经元自噬，改善神经元的功能。在本研究中，我们通过免疫荧光染色和蛋白定量实验都表明，与AD模型组大鼠比较，AD训练组大鼠海马神经元中磷酸化的AMPK表达明显增强，甚至AD训练组大鼠的磷酸化AMPK表达都高于对照组和正常训练[81]组大鼠，这表明运动刺激对AD神经元AMPK的激活更为明显。祖靓等发现力竭运动即刻后小鼠骨骼肌AMPK活性明显提高，细胞的自噬水平也显著增加，提出力竭运动可以通过AMPK途径显著提高骨骼肌细胞自噬水平。AMPK的下游信号分子很多，其中AMPK/mTOR信号通路引起的自噬可能对AD[82]神经元的凋亡和存活产生重要影响。已有研究表明，AMPK的激活可以抑制其下游信号mTOR表达，诱导细胞自噬体的形成，从而破坏衰老细胞，起到保护神经元的作用。微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3)是酵母自噬相关基因8的哺乳动物同源体，是哺乳动物细胞的典型的一种自噬体标志物。在自噬状态下，LC3-I会转变为一种膜结合形式即LC3-II，因此，常用LC3-II/LC3-I比值来衡量自噬活性，其比值升高提示自噬活性加强。哺乳动物Beclin-1是酵母自噬相关基因6的同源物，也是第一个被发现的哺乳动物自噬相关基因。在酵母中的研究发现，Atg6可作为III型P13K(Vps34)的变构激活剂，与Vps34、Vpsl5、Vps38共同[83]组成复合物，参与自噬体的形成。因此Beclin-l也是一个参与自噬和调控自噬的关键基因，在很多细胞株发生自噬的模型中都发现Beclin-1被诱导表达，但其诱导表达的机制目前尚未明确。Beclin-1与自噬吞噬小泡的形成初期有关，是自噬的发起者，Beclin-1也常作为自噬体形成的重要的正调节因子。有研究证明，运动可通过抑制PKB/I型P13K通路，上调自噬相关基因Beclin-l的水平，介导自噬发生。此外JNK能够通过磷酸化抑制Bcl-2，破坏Bcl-2与Beclin-l复合体，释放游离的BecIin-l，使其在胞浆中的浓度升高，促进自噬的发生。在本研究中我们发现，AD训练组大鼠神经元LC3-II/LC3-I比值及Beclin-1表达较对照组和AD模型组均升高，表明本研究的运动负荷可诱导AD大鼠海马神经元自噬的产生，而适度的自噬对神经元起到保护作35 用。我们结果还发现，AD模型组大鼠的Beclin-1表达明显低于对照组，可能是本实验模型下AD大鼠海马神经元自噬现象未产生，导致神经元大量死亡，而运动能强烈[84]刺激自噬体的产生，从而保护神经元。姜宁等研究也发现，早期运动训练可初步启动中脑和纹状体自噬，进而改善中脑和纹状体线粒体功能。PI3K/Akt是生物体内一条重要的促细胞存活通路，它可以促神经细胞再生、分化，调节递质释放、刺激树突生长、增强突触的可塑性等作用。PI3K/Akt下游的重要信号分子Bcl-2是Akt发挥效应的重要蛋白，对神经元的可塑性也起着重要的作用。我们的实验结果证明，8周的跑台运动可以激活磷酸化Akt的表达，从而增加Bcl-2的表达，这可能是运动改变神经元可塑性的原因之一。6结论1.8周的跑台运动可明显改善AD模型大鼠的学习和和记忆能力，这与AD大鼠海马CAI区神经元损伤数量减少和海马神经元树突密度增加密切相关。2.8周的跑台运动可激活AD大鼠神经元磷酸化AMPK的表达，进而引起神经元自噬，表现为自噬的标志性蛋白LC3II与Beclin-1在海马神经元表达明显增加。3.8周的跑台运动可以通过提高AD大鼠海马组织SOD的活性，降低MDA的沉积从而保护AD大鼠的神经元。4.8周的跑台运动可提AktBcl-2信号通路的表达，从而促进神经元存活。36 致谢本文是在导师白石教授的悉心指导下，由本人独立完成。从论文的选题、撰写、修改到定稿，无不凝聚着白老师的心血和教导。在此，对白老师表示最诚挚的感谢！在我的研究生学习期间，导师在工作和治学过程中严谨的态度，一丝不苟的求实精神给我留下了深刻的印象；导师的言传身教不仅教会我如何做学问，更让我懂得如何为人处事；导师亲切的关怀和鼓励、健康向上的生活态度也给我极大的启示和信心。我将在今后的道路上，牢牢地铭记导师的教诲，踏踏实实地走好人生的每一步。同时，也感谢师母对我的学习、生活上的关心和照顾。感谢陕西省自然科学基金（2014JM2-3027，2012JM4039）对本实验的支持。最后，我衷心感谢健康科学系刘涛老师、马艳老师、潘为敏老师、孔淑珍老师、潘秀清老师的悉心帮助与支持，感谢西安体育学院对我的培养，感谢在本研究实验过程中，给予了很大帮助的老师和同学。37 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