消退素D1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗作用的研究

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授予单位代码10089学号或申请号20152079中国图书分类号R587.1HebeiMedicalUniversity硕士学位论文学术学位消退素D1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗作用的研究研究生：杨婷婷导师：王瑞英教授专业：内科学二级学院：河北医科大学第二医院2018年3月 河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文一，第署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北斗大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：导师签章二级＾胃章＾日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。：研究生签名导师签章：＾年ｔ月日为 目录中文摘要············································································································1英文摘要············································································································4英文缩写············································································································7研究论文消退素D1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗作用的研究前言············································································································8材料与方法································································································9结果··········································································································15附图··········································································································18附表··········································································································25讨论··········································································································29结论··········································································································33参考文献··································································································33综述消退素与肥胖所致的胰岛素抵抗作用关系的研究进展·····················38致谢·········································································································52个人简历··········································································································53 中文摘要消退素D1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗作用的研究摘要目的：通过观察高脂饮食诱导下小鼠体重、血糖、胰岛素及血脂、TNF-α、IL-6的变化，明确2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)胰岛素抵抗模型小鼠是否成功建立，以及给予2型糖尿病小鼠消退素D1（RvD1）干预后，能否改善胰岛素抵抗，并通过观察小鼠脂肪组织中IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、P-IRS-1(Ser307)、GLUT4、NF-κB蛋白表达水平，揭示RvD1具体作用机理，为其临床应用提供理论依据。方法：以35只雄性C57BL/6小鼠为实验对象，适应喂养1周后，随机分为空白对照组（normalcontrolgroup，NC)组和高脂饮食(high-fatdiet，HFD)组，分别予以普通饮食和高脂饮食喂养8周后，给予HFD组小鼠腹腔注射链脲佐菌素（STZ，100mg/kg），3天后测定血糖≥16.7mmol/L为2型糖尿病模型小鼠。去除废鼠后剩余造模成功的小鼠随机分为2型糖尿病组（T2DM组）和2型糖尿病+RvD1干预组（T2DM+RvD1组），两组小鼠分别腹腔注射PBS溶液0.2ml/只/天和RvD1100ng/只/天，连续21天，断头处死动物，定期监测小鼠体重及血糖变化，检测小鼠血脂、血清胰岛素水平及TNF-α、IL-6水平，取小鼠新鲜脂肪组织通过westernblot方法检测IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、P-IRS-1(Ser307)、GLUT4、NF-κB蛋白表达，明确RvD1是否能改善2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗，并了解其可能相关机制。结果：1.小鼠体重变化造模前，NC组小鼠体重增加缓慢，HFD组小鼠体重增加迅速。造模后，与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠体重均明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。与T2DM组相比，给予RvD1干预3周后，T2DM+RvD1组小鼠的体重有所降低，有统计学差异（P<0.05）。2.小鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）水平的变化实验过程中，NC组小鼠血糖波动不明显。造模前，HFD组小鼠血糖1 中文摘要逐渐升高。造模后，与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数水平均有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），RvD1干预3周后，与T2DM组小鼠相比，T2DM+RvD1组小鼠血糖降低，差异有统计学意义（P<0.05），T2DM+RvD1组小鼠胰岛素及胰岛素抵抗指数水平有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。3.小鼠血脂水平的变化与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠血中胆固醇和甘油三酯水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠血中胆固醇和甘油三酯水平有所降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。4.检测小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的变化与NC组相比，T2DM组小鼠血清中TNF-α、IL-6明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），而T2DM+RvD1组小鼠TNF-α、IL-6与NC组无明显差异（P>0.05）。RvD1给予3周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。5.小鼠脂肪组织中NF-κB、IRS-1、P-IRS-1(Ser307)、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白表达水平变化与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中P-IRS-1(Ser307)、NF-κB蛋白表达明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。RvD1干预3周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中上述指标有所降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中水平IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。RvD1干预3周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中上述指标有所升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论：1.RvD1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗有一定改善作用。2.RvD1可能通过减少脂肪组织中NF-κB的表达，进一步减少了TNF-α、IL-6等炎症因子的产生，使胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化水平增强，丝氨酸磷酸化水平减弱，最终增加GLUT4的表达，改善胰岛素抵抗。2 中文摘要关键词：2型糖尿病，胰岛素抵抗，消退素D1，IRS-1，P-IRS-1(Tyr896)，P-IRS-1(Ser307)，GLUT4，NF-κB3 英文摘要TheeffectofResolvinD1oninsulinresistanceinAdiposeTissuewithType2DiabetesMiceABSTRACTObjective:Byinvestigatingthechangesinbodyweight,bloodglucose,insulin,lipids,TNF-α,andIL-6byhigh-fatdiet,determinewhether,whethertype2diabetes(T2DM)insulinresistancemodelmiceweresuccessfullyestablishedandwhethertheinterventionofresolvingD1(RvD1)canimproveinsulinresistance(IR)intype2diabetesmellitus(T2DM)mice.ByobservingthelevelsofIRS-1,P-IRS-1(Tyr896),P-IRS-1(Ser307),GLUT4,andNF-κBproteinsinmouseadiposetissue,revealthespecificmechanismofRvD1andprovideatheoreticalbasisforitsclinicalapplication.Methods:Thirty-fivemaleC57BL/6micewereusedasexperimentalsubjects.Afteroneweekoffeeding,theywererandomlydividedintoblankcontrolgroup(NCgroup)andhigh-fatdie（tHFD）group.After8weeksoffeedingonanordinarydietandahigh-fatdiet,Afterinjectionofstreptozotocin(STZ,100mg/kg),after3daysbloodglucose≥16.7mmol/LwasmeasuredinT2DMmodelmice,withabandoningtheunsuccesfulmice,theremainingmicemodelwererandomlydividedintotype2diabetesgroup(T2DMgroup)andtype2diabetes+RvD1interventiongroup(T2DM+RvD1group).TwogroupsofmicewereintraperitoneallyinjectedwithPBSsolution0.2ml/dayandRvD1100ng/dayfor21consecutivedays.Animalswerekilledbydecapitation,andbodyweightandbloodglucoselevelsweremonitoredregularlyanddetectedthemiceofbloodlipidsin,SeruminsulinlevelsandTNF-α,IL-6levels.TodeterminewhetherRvD1canimproveadiposetissueIRinT2DMmiceandtounderstanditspossiblemechanisms,thefreshmouseadiposetissueweredetectedtoanalysisofIRS-1,P-IRS-1(Tyr896),P-IRS-1(Ser307),GLUT4,NF-κBproteinbyWesternblot.Result:4 英文摘要1.ChangesinbodyweightinmiceBeforemodeling,weightofmiceinNCgroupincreasedslowly,andbodyweightinmiceintheHFDgroupincreasedrapidly.Aftermodeling,ComparedwithNCgroup,theweightofmiceinT2DMgroupandT2DM+RvD1groupwassignificantlyincreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ComparedwiththeT2DMgroup,after3weeksofinterventionwithRvD1,thebodyweightofmiceintheT2DM+RvD1groupwassignificantlyreduced(P<0.05).2.Changeofbloodglucose,insulinandinsulinresistanceindex(HOMA-IR)levelsinmiceDuringtheexperimentalperiod,thebloodglucoselevelofmiceinNCgroupwasnotsignificantlychanged.Priortomodelestablishment,bloodglucoselevelsinHFDmicegraduallyincreased.Aftermodeling,ComparedwithNCgroup,thelevelsofbloodglucose,insulinandinsulinresistanceinT2DMgroupandT2DM+RvD1groupweresignificantlyhigher(P<0.05).After3weeksofRvD1intervention,ComparedwiththeT2DMgroup,thebloodglucoselevelsofmiceinT2DM+RvD1groupweredecreased(P<0.05).ThelevelsofinsulinandinsulinresistanceindexinmiceofT2DM+RvD1groupwerereduced,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).3.ChangesinbloodlipidlevelsinmiceComparedwiththeNCgroup,thebloodcholesterol(CHOL)andtriglyceride(TG)levelsintheT2DMgroupandtheT2DM+RvD1groupweresignificantlyhigher,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ComparedwiththeT2DMgroup,thebloodcholesterol(CHOL)andtriglyceride(TG)levelsinthemiceoftheT2DM+RvD1groupwerereduced,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).4.DetectionofserumTNF-α,IL-6levelsinmiceComparedwiththeNCgroup,T2DMgroupandT2DM+RvD1miceserumTNF-α,IL-6wassignificantlyhigher,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).TherewasnosignificantdifferencebetweenTNF-αandIL-6inNCgroupandT2DM+RvD1group(P>0.05).After3weeksof5 英文摘要treatmentwithRvD1,comparedwithT2DMgroup,thelevelsofTNF-αandIL-6inserumofT2DM+RvD1miceweredecreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).5.ChangesinlevelsofNF-κB,IRS-1,P-IRS-1(Ser307),P-IRS-1(Tyr896),andGLUT4proteininadiposetissueofmiceComparedwithNCgroup,P-IRS-1(Ser307)andNF-κBproteininadiposetissueofT2DMgroupandT2DM+RvD1groupweresignificantlyincreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).AftertreatmentwithRvD1for3weeks,comparedwithT2DMgroup,theabove-mentionedindexesinadiposetissueofT2DM+RvD1micewerereduced,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).ComparedwithNCgroup,thelevelsofIRS-1,P-IRS-1(Tyr896)andGLUT4proteininadiposetissueofT2DMgroupandT2DM+RvD1groupweresignificantlydecreased,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).AftertreatmentwithRvD1for3weeks,comparedwithT2DMgroup,theaboveindicatorsinadiposetissueofT2DM+RvD1micewereincreased,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P<0.05).Conclusion:1.RvD1canimprovetheinsulinresistanceofadiposetissueintype2diabeticmice.2.RvD1mayreducetheproductionofTNF-α,IL-6andotherinflammatoryfactorsbyreducingtheexpressionofNF-κBinadiposetissue,andincreasethetyrosinephosphorylationlevelofinsulinreceptorsubstrate1anddecreasethephosphorylationlevelofserine.ThefinalincreaseinGLUT4expressionimprovesinsulinresistance.Keywords:Type2Diabetes,InsulinResistance,ResolvinD1,IRS-1,P-IRS-1(Tyr896),P-IRS-1(Ser307),GLUT4,NF-κB6 英文缩写英文缩写英文缩写英文全称中文全称GLUT4Glucosetransporter4葡萄糖转运蛋白4HOMA-IRHomeostasismodelassessment胰岛素抵抗指数NF-κBNuclearfactor-κB核因子-κBIL-6Interleukin-6白介素-6-6TNF-αTumorNecrosisFactor-α肿瘤坏死因子-α-αIRSInsulinreceptorsubstrate1胰岛素受体底物IRInsulinresistance胰岛素抵抗FBGFastingbloodglucose空腹血糖PBSPhosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液ALXLipoxinA4receptor脂氧素A4受体WBWesternblot免疫蛋白印迹STZStreptozocin链脲佐菌素DHADocosahexaenoic二十二碳六烯酸EPAEicosapentaenoicacid二十碳五烯酸7 研究论文消退素D1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗作用的研究前言胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)是指机体靶组织（骨骼肌、肝脏和脂肪）对胰岛素的反应性低于正常的一种病理生理状态。与此同时，它也是以糖脂代谢紊乱、高血压、肥胖为特征的代谢综合征发生发展的基础，是2型糖尿病发病的重要机制，改善胰岛素抵抗对治疗2型糖尿病及相关代谢性疾病具有重要意义[1]。近年来，国内外对胰岛素抵抗发生机制及其通路的相关研究层出不穷，但多数学者一致认为影响胰岛素信号通路中核心点即是胰岛素受体底物蛋白(insulinreceptorsubstte，IRS)异常磷酸化。而影响IRS异常磷酸化的原因有很多，现阶段研究最为广泛的为炎症机制。目前研究认为炎症的消退由一系列抗炎介质所控制，其中消退素D1(ResolvinD1，RvD1)是体内重要的促炎症消退因子。Krishnamoorth等发现RvD1可作用于两个受体：脂氧素A4受体(lipoxinA4receptor，ALX)和G蛋白偶联受体GPR32[2]。有文献证实RvD1在多种疾病中显示出强效的抗炎效果，如感染、哮喘、肿瘤、过敏反应、急性肺损伤等[3-6]。其具体机制未见明确报道，但相关研究指出RvD1的抗炎作用与NF-κB的活化被抑制有关[7]。此外,RvD1能够显著减少TNF-α和IL-6的水平以及MPO的活化，明显增加IL-10水平的表达[8]。目前尚无RvD1在胰岛素抵抗发生发展过程作用的详细研究，但许多研究表明，大量炎症因子聚集于脂肪组织，从而引起的慢性低度炎症过程被认为是肥胖诱导的胰岛素抵抗发病机制中的主要因素，基于RvD1能够抑制相关炎症因子的表达，设想RvD1能否改善胰岛素信号通路中的某些关键环节而进一步改善胰岛素抵抗。为了验证上述观点，本实验连续给予T2DM小鼠RvD13周后，观察小鼠的体重、血糖及各项生化指标水平，并检测小鼠血清中TNF-α、IL-6水平和脂肪组织中IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、P-IRS-1(Ser307)、GLUT4、NF-κB蛋白表达水平，明确其改善胰岛素抵抗的可能机制。8 研究论文材料与方法1实验材料1.1实验动物C57BL/6小鼠35只，雄性，6周龄，健康，清洁级，体重18-22克，购于北京维通利华实验动物有限公司。实验前普通饮食饲养1周，保持温度：20-25℃，湿度45-55%，小鼠每日饲养于自然光照12h条件下，自由饮水。1.2主要试剂链脲佐菌素（STZ）美国Sigma公司消退素D1美国Cayman公司小鼠胰岛素Elisa试剂盒上海森雄科技实业有限公司小鼠TNF-αElisa试剂盒上海森雄科技实业有限公司小鼠IL-6Elisa试剂盒上海森雄科技实业有限公司IRS-1鼠单克隆抗体美国Affinity公司P-IRS-1(Tyr896)抗体美国Abcam公司P-IRS-1(Ser307)抗体美国Abcam公司GLUT4抗体美国Affinity公司NF-κB抗体美国Abcam公司1.3主要仪器电子天平Sartorius公司，德国雅培越佳血糖测定仪及试纸上海雅培有限公司血脂检测仪及试纸美国Cardiochek公司酶联免疫检测美国Thermo公司5424高速冷冻离心机德国Eppendorf公司冰箱（4℃、-20℃、-80℃）中国青岛海尔公司移液枪法国Eppendorf公司实时荧光定量PCR仪Thermo公司制冰机AF10SCOTSMAN,美国去离子水仪PALL,PurelabPlus，美国PVDF膜Millipore，美国9 研究论文医用X射线胶片柯达公司，美国高速离心机Eppendorf公司，德国转移脱色摇床海门其林贝尔仪器制造公司电泳仪北京六一仪器厂低温离心机Eppendorf，德国凝胶玻璃板、固定夹北京六一仪器厂垂直电泳槽北京六一仪器厂转移槽北京六一仪器厂1.4饲料配方空白对照组饲料：其中蛋白质占20％、碳水化合物68％、脂肪12％，购于河北医科大学实验动物中心。高脂饮食组饲料：碳水化合物20.1%，脂肪59.8%，蛋白质20.1%，购买机构与上相同。2实验步骤2.1实验分组本实验应用6周龄雄性C57BL/6小鼠35只适应性喂养一周后，随机分为2组即空白对照组（NC组，n=9），高脂饮食组(HFD组，n=26)。2.22型糖尿病小鼠模型的建立NC组和HFD组小鼠分别以普通饮食和高脂饮食喂养8周,在第8周末,禁食不禁水12h。给予HFD组每只小鼠100mg/kgSTZ(PH=4.2-4.5)腹腔注射，同时给予NC组小鼠单次腹腔注射等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后继续上述饮食喂养3天后，尾部取血测定血糖，2型糖尿病模型小鼠血糖≥16.7mmol/L。最终判定，HFD组26只小鼠造模成功者为21只，其余5只为废鼠，2组小鼠继续分别普通饮食和高脂饮食喂养4周后，将HFD组造模成功的21只小鼠随机分为2型糖尿病组（T2DM组n=10）和2型糖尿病+消退素D1干预组（T2DM+RvD1组n=11)。三组小鼠分别以相应饮食喂养，T2DM+RvD1组每日腹腔注射消退素D1100ng/只，NC组及T2DM组每天腹腔注射等剂量PBS溶液，持续21天，监测血糖及体重。2.3血糖测定检测前禁食不禁水12h，快速剪断尾巴末端（约2~3mm）,用酒精棉10 研究论文球擦拭尾部，采用葡萄糖氧化酶法，于小鼠尾部最低点取血检测血糖。2.4小鼠取血及处死小鼠麻醉后摘其单侧眼球取血，应用美国Cardiochek血脂检测仪测定小鼠胆固醇（CHOL）、甘油三脂（TG）水平，测定完毕及记录后收集剩余血液标本，全部离心后取血清检测胰岛素及炎症因子TNF-α、IL-6水平。2.5组织标本的留取断头处死小鼠，迅速解剖，取小鼠肠系膜周围及附睾旁脂肪，置于冰块上，经滤纸滤干，称重，液氮速冻并保存于－80℃冰箱中备用，以用于免疫蛋白印迹的检测。2.6各项生化指标的测定2.6.1IL-6Elisa酶联免疫试剂盒步骤：检测步骤1)将标本及试剂复温，使其符合所需的实验条件2)保持37℃，取100ul的待测样本加入每孔中，固定45min持续反应3)洗板，完成后用滤纸拭干。4)除空白孔外，将入工作液及相等的蒸馏水50μl分别加入剩余各个孔中，按照上述温度继续反应20min。5)洗板6)每孔加入酶标记抗体工作液100μl，继续以37℃反应10min。7)再次洗板8)每孔加入底物液100μl，37℃反应15min9)反应后将100ul终止液置于每孔中，合适力度混匀。10)在30分钟之内，测定450nm最大吸收波长下的OD值。2.6.2胰岛素、TNF-α的Elisa试剂盒实验方法同2.6.1。2.6.3胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）的计算：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.52.7脂肪组织中IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、P-IRS-1(Ser307)、GLUT4、NF-κB蛋白表达水平测定Westernblot检测脂肪组织样本：2.7.1蛋白的提取及其含量测定11 研究论文(1)样品蛋白的提取由-80℃冰箱取出提取的总蛋白样品，为避免蛋白降解过快，将其置于冰中待缓慢融化。称取40mg小鼠脂肪组织，冲洗干净，置于匀浆器中（全部过程均在冰上完成），将10ul的PMSF和40u的磷酸酶抑制剂混匀，配比成相应浓度后，将组织置于冰面上，加入配比好的裂解液，使其充分裂解。(2)样品蛋白含量测定用胶头滴管吸取上清液置于洁净离心管中，进行蛋白定量，余下部分分装放-80℃冻存备用。应用BCA法测定蛋白浓度，将50ml的A试剂与1ml的B试剂混合（即A:B=50:1）,每95ulBCA工作液加待测蛋白样品5ul，37℃反应30min，上机测490nm的OD值。(3)加入4ul缓冲液，加入根据标准曲线测定好的蛋白量，100℃反应10min，冰上降温备用。2.7.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验流程如下：提取组织总蛋白、测定含量↓制备SDS-PAGE胶↓蛋白样品变性、电泳↓电泳转膜↓封闭↓一抗↓TBST洗涤↓HRP标记的二抗↓TBST洗涤↓12 研究论文TMB试剂作用↓显影↓结果分析制备SDS-PAGE凝胶(1)用洗洁精洗净玻璃板，最后用ddH2O冲洗，用干净的纸巾擦拭晾干，玻璃板对齐卡紧固定，明确分离胶的灌注位置。(2)将10%分离胶5ml按下表条件配比好，先快后慢，使胶沿玻璃壁内侧流入，避免产生气泡。(3)在胶面上缓慢匀速加入去离子水，防止胶体被冲变形，室温下静置约40min，胶与水间出现一条清晰的折线时，即可判断胶体凝固。(4)配制5%浓缩胶2ml（见下表）分离胶浓缩胶10%5%ddH2O2.3ml1.2ml30%Acrylamide(4℃避光)1.5ml0.27ml1.5MTris-HCl(pH8.8)1.25ml------0.5MTris-HCl(pH6.8)------0.5ml10%SDS60μl20μl10%APS(后加)60μl20μlTEMED（后加）4.0μl2μlToTal5ml2ml(5)将去离子水倒掉，并用吸水纸吸掉残留的液体。将凝胶板垂直，将配比好的浓缩胶沿板壁缓慢倒入填满剩余空间，插入样品梳，室温凝胶约40min。(6)40min后拔除梳子，边加水边拔，避免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拔出后用ddH2O冲洗两边胶孔以去除残余胶，用0.1%的SDS封胶，最后将玻璃板对齐牢靠的固定在电泳槽上。样品变性及电泳(1)立即用1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液充满小槽，确保整个电泳过程13 研究论文中，电泳缓冲液需浸没矮玻璃板上缘。(2)根据蛋白定量结果，加入相应体积的总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液,混匀后95℃变性10分钟，置于冰上1~2min冷却,离心。(3)将样品按顺序加至上样孔中，接通电源，电泳仪电压调至80V，电泳使染料至分离胶适当位置时结束电泳。凝胶转膜及其检测凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。用于Western印迹法的固相支持物有多种，本实验采用PVDF膜作为固相支持物，并采用半干转的转膜方式。(1)PVDF膜的预处理：先置于100%甲醇中浸泡2-3min，水、电转液依次漂洗2min×2次，置于电转液中备用。(2)剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。(3)取下电泳板，将其平置（使“凹”面玻璃板在下），小心取出夹板中的垫片及去掉上层玻璃板，切除多余凝胶，将含样品胶用电转液漂洗一次。(4)将样品胶与膜装入标有正、负极的转膜夹板中：由阴极侧开始，依次为3层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸（注意：排除气泡），扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中。(5)正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。（转膜条件：电流130ma，电压60v左右，转膜时间为60分钟）(6)封闭：将膜从电转移槽中取出，经去离子水稍加漂洗后浸没与封闭液中，室温下缓慢摇荡1小时。(7)一抗反应：将一抗用封闭液稀释；将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃静置过夜，反应体系外罩衣湿润平皿以防止液体过多蒸发。一抗浓度P-IRS-1（ser307）1：1000P-IRS-1（tyr896）1:3000IRS-11:500NF-κBP651:1000GLUT41:500Actin1:500014 研究论文(8)洗膜：一抗孵育结束后，用1×TBST漂洗后再浸洗反应膜三次，每次持续10分钟。(9)二抗反应：将洗涤后的一抗反应膜放入二抗工作液（1:10000）中，室温、避光轻摇1小时。二抗（山羊抗兔easybioBE0101山羊抗小鼠BE0102）(10)洗膜：再次应用1×TBST洗膜，与（8）操作一致；(11)曝光及洗片2.8数据统计处理实验结果以均数±标准差表示，实验数据用SPSS21.0软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析方法，并以LSD法进行两两比较，P<0.05表示具有显著性差异。结果1.小鼠体重变化造模前，高脂喂养8周作用下，NC组小鼠体重缓慢增加，T2DM及T2DM+RvD1组小鼠体重迅速增加，与NC组（32.74±0.65g）相比，T2DM组（37.51±0.50g）和T2DM+RvD1组（37.74±0.44g）小鼠体重均明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。造模成功4周后，T2DM组（39.62±0.83g）和T2DM+RvD1组（39.97±0.86g）小鼠体重较前增加缓慢，与NC组（36.71±0.84g）相比，差异仍具有统计学差异（P<0.05）。应用RvD11周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组体重未见明显变化（P>0.05），应用2周后，体重有所下降,差异有统计学意义（P<0.05），干预3周后，T2DM+RvD1组体重明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。如Fig.1、Table1所示。2.小鼠血糖水平的变化实验过程中，NC组小鼠血糖波动不明显，造模成功前，在高脂饮食喂养8周的影响下，与NC组（5.39±0.45mmol/L）相比，T2DM组（7.93±1.03mmol/L）和T2DM+RvD1组（8.14±0.95mmol/L）小鼠血糖水平均有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。造模成功4周后，上述结论仍成立，仍具有统计学意义。RvD1干预2周后，与T2DM组15 研究论文（20.15±1.57mmol/L）相比，T2DM+RvD1组（18.67±1.08mmol/L）小鼠血糖有所降低，RvD1干预3周后，与T2DM(20.47±1.09mmol/L)相比，T2DM+RvD1组（17.98±0.78）血糖下降幅度较前明显，差异均有统计学意义（P<0.05）。如Fig.2、Table2所示。3.小鼠胰岛素及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）水平的变化小鼠NC组胰岛素水平为4.37±1.01uIU/ml，T2DM组小鼠胰岛素水平为20.58±2.64uIU/ml，T2DM+RvD1组小鼠胰岛素水平为11.02±2.48uIU/ml，与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠胰岛素水平均有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。应用RvD13周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠胰岛素水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。如Fig.3、Table3所示。小鼠NC组胰岛素抵抗指数为与1.27±0.51，T2DM组小鼠胰岛素抵抗指数为19.39±1.87，T2DM+RvD1组小鼠胰岛素抵抗指数为10.89±1.57，与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠胰岛素抵抗指数均有明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。RvD13周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠胰岛素抵抗指数明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。如Fig.4、Table3所示。4.小鼠胆固醇（CHOL）和甘油三酯（TG）水平的变化NC组小鼠CHOL为2.49±0.35mmol/L，TG为0.59±0.09mmol/L，T2DM组小鼠CHOL为3.34±0.46mmol/L，TG为0.89±0.14mmol/L,T2DM+RvD1组小鼠CHOL为2.86±0.30mmol/L，TG为0.76±0.10mmol/L。与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠CHOL和TG水平均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠CHOL和TG水平有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。如Fig.5、Table4所示。5.小鼠血清中TNF-α、IL-6水平的变化NC组小鼠TNF-α为16.19±1.85pg/ml，IL-6为14.07±1.35pg/ml，T2DM组小鼠TNF-α为18.52±1.45pg/ml，IL-6为15.61±1.16pg/ml,T2DM+RvD1组小鼠TNF-α为16.54±1.02pg/ml，IL-6为14.32±0.80pg/ml。与NC组相比，T2DM组小鼠血清中TNF-α、IL-6显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05），T2DM+RvD1组小鼠血清中TNF-α、IL-6水平无明显差异16 研究论文（P>0.05）。给予RvD13周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠的TNF-α、IL-6水平有所降低，差异有统计学意义（P<0.05）。如Fig.6、Table5所示。6.小鼠脂肪组织中NF-κB、IRS-1、P-IRS-1(Ser307)、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白表达水平变化NC组小鼠IRS-1为0.57±0.09，T2DM组为0.34±0.08，T2DM+RvD1组为0.46±0.10。NC组小鼠P-IRS-1(Tyr896)为0.50±0.14，T2DM组为0.27±0.07，T2DM+RvD1组为0.39±0.06。NC组小鼠GLUT4为0.60±0.12，T2DM组为0.36±0.08，T2DM+RVD1为0.48±0.10。与NC组相比，T2DM组和T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中水平IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。RvD1干预3周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中上述指标有所升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。如Fig.7、Fig.9、Fig.11、Fig.12、Table6、Table8、Table10所示。NC组小鼠P-IRS-1(Ser307)为0.30±0.08，T2DM组为0.54±0.12，T2DM+RvD1组为0.42±0.10。NC组小鼠NF-κB为0.27±0.09，T2DM组为0.54±0.12，T2DM+RVD1组为0.41±0.09。与NC组相比，T2DM组和T2DM+RVD1组小鼠脂肪组织中P-IRS-1(Ser307)、NF-κB蛋白表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。给予RvD13周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠脂肪组织中上述指标明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。如Fig8、Fig10、Fig12、Table7、Table9所示。17 研究论文附图图1各组小鼠体重水平Fig.1Weightofmiceineachgroup图2各组小鼠血糖水平变化Fig.2Thelevelofbloodglucoseofmiceineachgroup18 研究论文图3各组小鼠胰岛素水平Fig.3Thelevelofinsulinofmiceineachgroup*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroupTOT1WIT2WIT1WI图4各组小鼠胰岛素抵抗指数水平Fig.4TheHOMA-IRofmiceineachgroup*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup19PDWIT2WI 研究论文图5各组小鼠血脂水平变化Fig.5ThelevelofLipidofmiceineachgroup*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup图6各组小鼠血中炎症指标水平变化Fig.6ThelevelsofTNF-αandIL-6inbloodofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup20 研究论文图7各组小鼠脂肪组织中IRS-1水平变化Fig.7ThelevelsofIRS-1inAdiposetissueofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroupPDWIT2WI图8各组小鼠脂肪组织P-IRS-1(Ser307)水平变化Fig.8ThelevelsofP-IRS-1（Ser307）inAdiposetissueofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup21 研究论文图9各组小鼠脂肪组织P-IRS-1(Tyr896)水平变化Fig.9ThelevelsofP-IRS-1（Tyr896）inAdiposetissueofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup图10各组小鼠脂肪组织NF-κB水平变化Fig.10ThelevelsofNF-κBinAdiposetissueofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup22 研究论文图11各组小鼠脂肪组织GLUT4水平变化Fig.11ThelevelsofGLUT4inAdiposetissueofmice*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup;#P<0.05,comparedwithT2DMgroup23 研究论文NCT2DMT2DM+RvD1IRS-1P-IRS-1(Ser307)P-IRS-1(Tyr896)GLUT4NF-κBβ-Actin图12各组小鼠脂肪组织IRS-1、P-IRS-1(Ser307)、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4、NF-κB蛋白表达Fig.12TheExpressionofIRS-1,P-IRS-1(Ser307),P-IRS-1(Tyr896),GLUT4,andNF-κBproteinsinadiposetissueofmiceineachgroup24 研究论文附表表1各组小鼠体重水平Table1changesinweightofmiceineachgroup分组n8周（g）12周（g）13周（g）14周（g）15周（g）NC组932.74±0.6536.71±0.8437.68±0.7438.36±0.7038.95±0.50T2DM1037.51±0.50*39.62±0.83*40.38±0.74*40.61±0.94*40.71±0.组81*T2DM1137.74±0.44*39.97±0.86*40.59±0.81*39.68±0.91*#39.31±0.+RvD176*#组*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表2各组小鼠血糖水平Table1bloodglucoselevelsofmiceineachgroup分组n8周12周13周14周15周(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)NC组95.39±0.455.39±0.575.53±0.515.94±0.646.02±0.58T2DM107.93±1.03*19.17±1.75*19.96±0.89*20.15±1.57*20.47±1.0组9*T2DM118.14±0.95*19.54±1.17*20.09±1.08*18.67±1.08*#17.98±0.7+RvD18*#组*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup25 研究论文表3各组小鼠胰岛素及胰岛素抵抗指数水平变化Table3INSandHOMA-IRlevelsofmiceineachgroup分组n空腹血糖胰岛素胰岛素抵抗指（mmol/L）（uIU/mL）数NC组95.82±0.874.37±1.011.27±0.51T2DM组1020.88±2.43*20.58±2.64*19.39±1.87*T2DM+RvD1组1117.70±2.91*#11.02±2.48*#10.89±1.57*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表4各组小鼠血脂水平变化Table4Lipidlevelsofmiceeachgroup分组n总胆固醇（mmol/L）甘油三酯（mmol/L）NC组92.49±0.350.59±0.09T2DM组103.34±0.46*0.89±0.14*T2DM+RvD1组112.86±0.30*#0.76±0.10*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表5各组小鼠TNF-α和IL-6水平变化Table5TNF-αandIL-6levelsofmiceineachgroup分组nTNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)NC组916.19±1.8514.07±1.35T2DM组1018.52±1.45*15.61±1.16*T2DM+RvD1组1116.54±1.02#14.32±0.80#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup26 研究论文表6各组小鼠IRS-1水平变化Table6IRS-1levelofmiceineachgroupNC组T2DM组T2DM+RVD1组IRS-10.57±0.090.34±0.08*0.46±0.10*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表7各组小鼠IRS-1(Ser307）水平Table7P-IRS-1(Ser307）levelofmiceineachgroupNC组T2DM组T2DM+RVD1组P-IRS-1(Ser307)0.30±0.080.54±0.12*0.42±0.10*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表8各组小鼠P-IRS-1（Tyr896）水平Table8P-IRS-1(Tyr896)levelofmiceineachgroupNC组T2DM组T2DM+RVD1组P-IRS-1(Tyr896)0.50±0.140.27±0.07*0.39±0.06*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup表9各组小鼠NF-κB水平变化Table9NF-κBlevelofmiceineachgroupNC组T2DM组T2DM+RVD1组NF-κB0.27±0.090.54±0.12*0.41±0.09*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup27 研究论文表10各组小鼠GLUT4水平变化Table10GLUT4levelofmiceineachgroupNC组T2DM组T2DM+RVD1组GLUT40.60±0.120.36±0.08*0.48±0.10*#*P<0.05,comparedwithnormalcontrolgroup,#P<0.05,comparedwithT2DMgroup28 研究论文讨论随着糖尿病发病人数的日益攀升，对人类的健康造成了不可估量的危害。相关研究统计，2010年成人糖尿病患者为2.85亿人，预计到2030年，将高达到4.39亿人[9]。防治糖尿病刻不容缓。尽管目前2型糖尿病的机制尚不明确，但其最主要的病理生理基础仍是胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗[10]。大量动物实验数据分析显示，给予小鼠高脂饮食喂养一段时间后，小鼠会出现肥胖，高血糖，高胰岛素血症和葡萄糖耐受减低等现象，导致胰岛素抵抗状态[11]。研究发现，补充ω-3多不饱和脂肪酸（Omega-3polyunsaturatedfattyacids，ω-3PUFA）可改善亚洲人群2型糖尿病患者的胰岛素敏感性[12]。另有报道，在代谢综合征患者中，鱼油的食用与胰岛素抵抗风险较低有关[13,14]。最近的一项研究[15]显示，补充高剂量ω-3PUFA18个月可有效改善空腹血糖受损或糖耐量减低患者的血糖和胰岛素抵抗，并且血糖受损状态与血糖正常状态的回归似乎是有助于延缓2型糖尿病的发展。本实验予以高脂饮食喂养成功诱导小鼠肥胖，联合STZ（100mg/kg）对胰岛β细胞造成轻度破坏，导致血糖升高，最终引发2型糖尿病，小鼠体重、空腹、随机血糖、胰岛素均较NC组明显升高，在此基础上加以计算胰岛素抵抗指数，与NC组相比，T2DM组有明显升高。给予RvD11周后小鼠上述指标未见明显改变，2周后，小鼠体重、血糖及胰岛素有所降低，3周后降低明显，差异有统计学意义，与前述结论保持一致。实验所得数据进一步验证了RvD1作为ω-3PUFA的衍生物能够改善胰岛素抵抗，并可能通过改善胰岛素抵抗的作用一定程度上降低小鼠血糖及体重，但其改善程度并不能到达到正常小鼠一样，猜想可能与应用RvD1的剂量有一定关系，有待于进一步详细研究。很多年前，在胰岛素抵抗的研究进展中，脂肪组织始终是被关注的热点[16]。脂肪组织是胰岛素应答组织之一，胰岛素通过多种机制刺激脂肪组织中甘油三酯的储存，包括促进前脂肪细胞分化为脂肪细胞，增加来自葡萄糖和脂肪酸的摄取，并抑制脂肪分解[17]。目前认为脂肪组织中大量炎症因子聚集而引发的慢性低度炎症反应状态可能是导致胰岛素抵抗的关键因素。而炎症和胰岛素抵抗之间的介质是脂肪酸（freefattyacid,FFA），29 研究论文FFA通过调节炎症相关的几种信号传导途径而与炎症过程有效关联。例如，脂肪酸可直接激活Toll样受体（TLR），G蛋白偶联受体（GPCR）及TNF-α，并调节炎症信号通路分泌TNF-α，IL-1β和IL-6[18-20]，还引起氧化应激，线粒体功能障碍，内质网应激和促炎基因表达增加。许多临床研究阐释，ω-3PUFA的高摄入量与炎症减少相关[21]。从一项囊括了1985年至1992年间公布的9项实验的数据的荟萃分析得出结论：补充3个月的膳食鱼油显著降低了关节软骨疼痛的次数和晨僵的发生[22]。Cleland等人[23]发现将鱼油作为补充剂的类风湿性关节炎患者更可能减少NSAIDs药物的使用，相比不使用鱼油的患者疼痛缓解更加明显。上述结果表明鱼油减少了患者关节疼痛，晨僵的持续时间，疼痛和疼痛关节的数量以及NSAIDs的长期大量应用。因此，海洋ω-3PUFA在类风湿性关节炎中的疗效有充足的证据。另有学者证明海洋ω-3PUFA能够减少结肠损伤和炎症[24]。在对自发性结肠炎的IL-10敲除小鼠的研究中发现，给予鱼油喂养小鼠，结肠炎症显著减轻[25]。一项炎症性肠病患者补充鱼油的随机对照试验报道了其相关临床获益，主要包括炎症性肠病患者临床评分改善，肠道粘膜组织学改善，复发率降低和皮质类固醇药物使用减少[24]。另外，ω-3PUFA及其衍生物二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid,DHA）在哮喘的小鼠模型中有减轻肺部炎症和改善肺功能中的作用[26]。胰岛素抵抗方面，有报道ω-3PUFA可以改善动物模型中的胰岛素敏感性[27]并且调节动物和人中的脂肪因子基因表达[28]。此外，ω-3PUFA可能减缓胰腺β细胞功能障碍的进展[29]。Derosa等人发现在葡萄糖代谢受损的患者中，补充ω-3PUFA18个月后，HDL-胆固醇增加，甘油三酯减少[15]。最新的研究也证实二十碳五烯酸（Eicosapentaenoicacid,EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoicacid,DHA）相应的下游物质resolvinE1和proteinD1[30]的抗炎机制来调控慢性炎症反应。在急性肺损伤的小鼠中，用RvD1治疗后TNF-α和IL-6分泌减少[3]。本实验予以高脂饮食成功诱导小鼠肥胖，2型糖尿病造模成功后，与NC组相比，T2DM组小鼠血中CHOL、TG水平明显升高，血中TNF-α和IL-6升高幅度明显，给予RvD1三周后，与T2DM组相比，T2DM+RvD1组小鼠血中CHOL、TG有所降低，TNF-α和IL-6也表现出降低的趋势，差异有统计学意义。进一步验证了RvD1能够对2型糖尿病小鼠的高血脂状态有一定改善作用，并且可能通过降脂30 研究论文作用使得脂肪组织中的炎症状态得以消退，进一步减缓其发生胰岛素抵抗的进程。综上所述，越来越清楚的是，RvD1可以作为一种新的治疗方法来预防和改善胰岛素抵抗，特别是在肥胖诱导的胰岛素抵抗中。但其详细明确的机制目前鲜有明确报道。TNF-α是第一个与动物胰岛素抵抗有关的细胞因子，它在肥胖时过度表达，并随体重减轻而减少，也被认为是一种重要的胰岛素抵抗调节剂[31]。已经发现它在体内和体外影响胰岛素信号传导，降低脂联素的表达[32]。它刺激脂肪分解，抑制脂蛋白脂肪酶（LPL）和GLUT4的表达，这是脂肪积累的两个关键因素，因此TNF-α也被认为是影响胰岛素抵抗的关键物质。本实验中已经证实了RvD1具有降低TNF-α的作用，结合上述文献报道的TNF-α在胰岛素抵抗中的明确作用，是否可以TNF-α为切入点，进一步探究RvD1在胰岛素通路中时如何发挥作用的。有研究证实TNF-α能激活NF-κB并加速其自噬作用[33,34]，NF-κB是一种普遍存在且众所周知的核转录因子，具有调控炎症途径中如促炎细胞因子，趋化因子和粘附分子表达的作用[35,36]。由于NF-κB在炎症过程中起着举足轻重的作用，NF-κB一直是治疗许多炎症性疾病的重要而有吸引力的治疗靶点。就胰岛素抵抗而言，脂肪组织中的NF-κB激活也被认为是胰岛素抵抗发生的重要机制[37]。与此同时，Tarkowski[38]、Hsieh[39]、Benomar[40]等在对致炎物质抵抗素的研究时发现，在T2DM小鼠动物模型中，抵抗素与细胞表面的TLR4-MD2复合物和CAP-1蛋白结合后分别激活其下游物质，但两条通路均会启动NF-κB，随后进一步引起大量炎症物质释放，抑制IRS在酪氨酸残基上的磷酸化，引发胰岛素抵抗。本实验中，检测了脂肪组织中NF-κB的蛋白表达，与NC组相比，T2DM组小鼠NF-κB蛋白表达水平升高，而RvD1干预3周后，NF-κB水平较前降低，差异有统计学意义，与上述观点保持一致。胰岛素的代谢作用由其复杂的信号传导通路所介导。当胰岛素与其受体结合时，导致IRS磷酸化激活，启动下游两种途径的活化：磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT/蛋白激酶B（PKB）途径和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径。其中，PI3K途径尤为重要，磷酸化的IRS-1通过与其SH2结构域结合而激活PI3K，产生一种脂质第二信使，激活下游的AKT/PKB，最终，这些信号事件使葡萄糖转运蛋白4转运至质膜，增加31 研究论文葡萄糖的摄取。而MAPK通路，目前暂无研究证实其涉及介导胰岛素的代谢作用。胰岛素抵抗发生时，IRS-1丝氨酸磷酸化程度增强，酪氨酸磷酸化程度减弱，并且IRS-1在丝氨酸（Ser）残基上的磷酸化可进一步降低IRS-1的功能。使胰岛素无法有效刺激下游IRS/PI3K/Akt通路激活[41-43]，导致GLUT4发生转位障碍，最终影响生理性降糖效应，引发糖尿病发生。胰岛素受体信号传导途径和炎性细胞因子可能相互交叉。炎症因子可干扰IRS/PI3K/Akt信号通路，这是炎症引发胰岛素抵抗的主要分子机制[44]。有研究发现ω-3PUFA可使胰岛素刺激GLUT4，IRS-1和糖原合酶-1（GYS1）的mRNA表达增加，证实了葡萄糖利用率提高的发现[45]。有报道称，科罗索酸改善了高脂饮食状态下小鼠脂肪组织中的胰岛素信号传导，P-IRS-1（Ser307）降低，P-IRS-1（Tyr）和Akt磷酸化增加，从而改善了高血糖状态[46]。由此推测，RvD1作为ω-3PUFA下游物质，是否也通过改变IRS-1磷酸化程度及GLUT4蛋白表达，达到改善胰岛素抵抗的作用。基于这样的猜想，本实验中，我们分别检测NC组、T2DM组及T2DM+RvD1组脂肪组织中的IRS-1、P-IRS-1(Ser307)、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白水平，实验结果证实，与NC组相比，T2DM组P-IRS-1(Ser307)蛋白表达活跃，而IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)及GLUT4蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义，证实了胰岛素抵抗发生时，IRS-PI3K/Akt-GLUT4信号通路传导受到抑制，而应用RvD13周后，与T2DM组相比，T2DM+RVD1组P-IRS-1(Ser307)蛋白表达水平明显降低，而IRS-1、P-IRS-1(Tyr896)、GLUT4蛋白表达有所升高，表明RvD1通过改善胰岛素受体底物1磷酸程度这一关键环节而改善胰岛素抵抗。综上所述，RvD1对T2DM小鼠体重、血糖、胰岛素、血脂有保护作用，对胰岛素抵抗有一定改善作用，其可能的机制为胰岛素抵抗发生时，脂肪组织中NF-κB蛋白水平明显增高，引起血中TNF-α、IL-6水平增高，二者又存在相互作用，加剧脂肪组织的慢性炎症状态，从而IRS/PI3K/Akt通路传导发生障碍，GLUT4转位障碍，而RvD1的应用，使炎症因子表达减少，上述通路传导在一定程度上得以恢复，最终改善胰岛素抵抗。32 研究论文结论1.RvD1对2型糖尿病小鼠脂肪组织胰岛素抵抗有一定改善作用。2.RvD1可能通过减少脂肪组织中NF-κB的表达，进一步减少了TNF-α、IL-6等炎症因子的产生，使胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化水平增强，丝氨酸磷酸化水平减弱，最终增加GLUT4的表达，改善胰岛素抵抗。参考文献1.SEMPLEＲobertk.Howdoesinsulinresistancearise，andhowdoesitcausedisease?:Humangeneticlessons[J].EurJEndocrinol，2016,174(5):209-223.2.KrishnamoorthyS,RecchiutiA,ChiangN,etal.ResolvinD1bindshumanphagocyteswithevidenceforproresolvingreceptors.ProcNatlAcadSciUSA,2010,107(4):1660-5.3.WangB,GongX,WanJY,etal.ResolvinD1protectsmicefromLPS-inducedacutelunginjury[J].Pulmonarypharmacology&therapeutics,2011,24(4):434-41.4.RogerioAP,HaworthO,CrozeR,etal.ResolvinD1andaspirin-triggeredresolvinD1promoteresolutionofallergicairwaysresponses[J].Journalofimmunology,2012,189(4):1983-91.5.WeylandtKH,ChiuCY,GomolkaB,etal.Omega-3fattyacidsandtheirlipidmediators:towardsanunderstandingofresolvinandprotectinformation[J].Prostaglandins&otherlipidmediators,2012,97(3-4):73-82.6.WangL,YuanR,YaoC,etal.EffectsofresolvinD1oninflammatoryresponsesandoxidativestressoflipopolysaccharide-inducedacutelunginjuryinmice[J].Chinesemedicaljournal,2014,127(5):803-9.7.LiuY,ZouD,LongFW,etal.ResolvinD1protectagainstinflammationinexperimentalacutepancreatitisandassociatedlunginjury[J].American33 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综述综述消退素与肥胖所致的胰岛素抵抗作用关系的研究进展21世纪以来，随着肥胖人群数量的不断增加，肥胖已成为威胁全球人类健康的重要目标，肥胖引起血中游离脂肪酸的增多，大量脂肪酸储存于脂肪组织，引起脂肪组织中各种免疫细胞群体的细胞性改变，炎性脂肪因子的改变，导致各种慢性炎症状态，最终导致脂肪组织代谢功能失调，引发胰岛素抵抗和2型糖尿病发生。Serhan[1]等通过脂质组学的方法提取出消退素，首次提出了它的概念。大量研究表明，消退素具有明确抗炎作用。现就消退素来源、构成及从分子水平上对胰岛素抵抗的作用机制、抗炎治疗相关研究新进展等加以详细表述。1消退素的分类、合成1.1消退素的分类研究表明：现阶段被广为熟知的消退素有两类：来源于EPA的E类消退素（resolvinE,RvE)和来源于DHA的D类消退素（resolvinD,RvD)。RvE又分为RvE1和RvE2，RvD包括RvD1－RvD4及ATRvD1－ATRvD4，上述为目前已知的十种消退素[2]。1.2消退素的合成消退素是一类具有抗炎作用的PUFA，产生消退素的EPA和DHA，在人体内无法自身合成，只有通过摄入外源性食物直接或间接转换而获得[3]。RvE1和RvE2是在经阿司匹林作用下形成18R-H(P)EPE后进入白细胞，一系列氧化作用后最终形成[4,5]。而D类消退素的合成则分为两种情况，一种为无阿司匹林存在情况下，DHA经酶化后形成17S-过氧羟基-DHA，进一步反应最终合成RvD1－RvD4[6]。另一种为阿司匹林存在情况下，DHA经环氧化、脂氧化和水解过程被阿司匹林乙酰化的COX-2转化为有活性的17R-HpDHA，再由5-COX合成ATRvD1－ATRvD4[7]。相关研究报道，消退素生物合成的多少与其他花生四烯酸衍生出的脂质介质的数量相关,这表明ω-3PUFA摄入（喂养）可以改变底物（酶作用物）的利用率,产生更多的抗炎脂质介质,从而促进消退素的合成[8]。此外,脂肪1转基因超表达作用能够编码脱氢酶，使内源性ω-6PUFA转化成ω-3PUFA,38 综述转换部分不仅可以防止小鼠因肥胖而导致的胰岛素抵抗，并且增加消退素生物合成途径标志物17-羟-DHA[9]，使ω-3PUFA转化为更多的消退素。2ω-3PUFA及其衍生物消退素改善肥胖所致的胰岛素抵抗的机制肥胖所致的来源于脂肪组织的慢性低度炎症对由脂肪驱动的代谢紊乱、恶化是至关重要的，主要包括胰岛素抵抗和2型糖尿病。因此，肥胖也被认为是T2DM发展中的最显著的的危险因素之一，随着肥胖患病率持续增长，也增加了如代谢综合征[10]，心脑血管病，肝脏和胆囊疾病，睡眠呼吸暂停和妇科病症等其他慢性疾病的发生[11,12]。现在被普遍认可的是作用持久而未能有效控制的慢性炎症是联系肥胖和胰岛素抵抗之间的潜在的关键机制[13,14]。1)巨噬细胞表型转变是发生脂肪组织炎症反应的基础在肥胖的发展过程中，过量的甘油三酯在脂肪组织中储存，发生局部和全身炎症反应，从而进一步导致胰岛素信号传导过程中脂肪因子和细胞因子的释放[15]。在细胞水平上，肥胖促进了脂肪组织形态的强烈变化[16]。尤其是脂肪细胞体积增大以及免疫细胞数量和组成的显著改变加剧了的慢性低度炎症的发生，这又与胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生发展密切相关[17]。作为免疫细胞中的一员，巨噬细胞具有独特的能力，可以快速适应不断变化的环境，使其拥有各种表型，从抗炎到促炎转变。在几乎所有的组织中，巨噬细胞都可以通过清除细胞碎片，参与组织免疫监视和消除炎症，积极参与维持组织的稳态[18]。近年来，随着对脂肪组织功能的不断深入研究，巨噬细胞受到广泛关注。研究统计，瘦小鼠和人体中的巨噬细胞约占脂肪组织细胞的5％，肥胖发生时可达50％[19]。随着细胞数量的增加，脂肪组织巨噬细胞（ATM）在肥胖期间逐渐发生其表型和炎症特征的改变。根据表型和所分泌的细胞因子的差异，可大致归类为经典活化的M1和活化的M2。通常，M1表型由Th1介质如LPS和IFNγ引起，其特征在于促炎性细胞因子的不断分泌增加，而M2表型由Th2介质（例如IL4）驱动，Th2介质激活免疫抑制因子的表达，可促进巨噬细胞清除死细胞和组织重塑[20]。在肥胖个体的脂肪组织中已经鉴定出具有重塑能力但仍能够分泌大量促炎性细胞因子的“M2型”巨噬细胞。在ATM膜上存在CD206和CD11c两者，这是通常用于区分两种类型巨噬细胞的关键点[21]，进一步说明ATM在肥胖个体中可能存在混合的炎症表型。尽管它们具有抗炎39 综述特性，但这种CD11c+CD206+巨噬细胞群与胰岛素抵抗有关[22]。有趣的是，M2巨噬细胞标志物CD163甚至被认为与HOMA-IR显著相关[23]。由此可见，由肥胖引发且发生在脂肪组织上的慢性炎症过程,最主要特点是增加巨噬细胞的聚集和其他炎症细胞的产生[24,25],巨噬细胞表型从抗炎M2样(CD206+)转变为炎症M1-like(CD11c+)表达，并导致胰岛素抵抗[26-30]。研究肥胖小鼠的炎性脂肪组织发现：肥胖能够促进经典激活的M1型巨噬细胞的渗透作用，使它们呈冠状结构(cls)环绕在死亡的脂肪组织周围，吞噬脂肪组织[31,32]，并表现出明确的促炎症特征[33]。肥胖脂肪组织中CLSs中巨噬细胞的存在已被证明直接与胰岛素抵抗相关[34,35]。2)消退素前体及其脂质介质对巨噬细胞的改善作用鉴于肥胖在全球范围内的广泛流行，预防和治疗脂肪组织的功能障碍越来越重要[36,37]。膳食ω-3PUFA，特别是DHA的有益特性已经受到持续关注，其抗炎能力的临床获益已经在一系列疾病疾病中广泛体现，包括各种炎性疾病，心血管疾病，癌症和肥胖症有关[38]。许多体外和体内研究表明，尽管DHA不是由免疫细胞产生的，却减弱了单核细胞/巨噬细胞的炎症表达[39-41]，其在许多炎症和代谢疾病的免疫发病机制中的作用不断扩大[42,43]。有研究以缺乏Elovl2的小鼠为模型，Elovl2是参与DHA合成的关键酶，得到了Elovl2-/-小鼠中经典激活的M1和活化的M2型巨噬细胞之间平衡改变的证据。这种改变不仅影响巨噬细胞表型，还影响其产生炎症介质的能力。事实上，尽管Elov12-/-小鼠能够产生有效的M1和M2巨噬细胞，但来自Elov12-/-小鼠的M1显示其几个标记标记物（iNOS，MARCO，CD80和CD86）的总体上调和增加促炎因子IL-6的表达，而M2巨噬细胞的改变更令人惊讶，不仅伴随其抗炎表型的减少，而且还存在大量转变为M1样表型的现象。另一方面，在DHA缺陷型Elovl2-/-小鼠中观察到的M2免疫调节和抗炎表型的丧失可赋予T辅助细胞2和调节性T细胞的能力降低。这些发现证实了我们的观察结果，当用DHA补充Elovl2-/-小鼠的饮食时，M1/M2失衡被恢复，这表明DHA的损伤可通过增强M1巨噬细胞的促炎症状态显著影响巨噬细胞的可塑性和功能，或通过M2巨噬细胞从抗炎剂重新编程为促炎剂[44]。而进一步研究发现二十二碳六烯酸（DHA）并没有改变巨噬细胞的总数，但显著降低了CD11b/F40/80巨噬细胞在脂肪组织中高表达。这种效应与促炎的脂肪因40 综述子的表达下调有关，也与增加IL-10,CD206,精氨酸酶1,抵抗素样分子,和几丁质酶（壳多糖酶）3样蛋白质的表达都密切相关,表明巨噬细胞极化过程为一种类M2样表型开关转换状态。这种转变主要局限于间质血管细胞部分，这部分Th1细胞因子(IL-6、MCP-1TNF-a)的分泌物被DHA所限制，并且伴随着抑制脂肪组织中局限的间质血管部分分泌的促炎脂肪因子[45]。由此可见,M1和M2型巨噬细胞之间的平衡是改善脂肪组织炎症和胰岛素抵抗反应关系的重要途径[46]。事实上，从DHA衍生出的一系列具有有效的抗炎和促分辨性质的生物活性脂质介质，例如，据报道ResolvinD1（由DHA衍生的脂质介质）和保护素[47]，其发挥抗炎和促进分解的生理功能[48,49]，已经显示通过刺激吞噬活性影响巨噬细胞功能和炎性介质产生，减少炎性因子浸润进入CLS，并促进它们向M2表型的极化[50-54]。最终，肥胖AT降低炎性脂肪因子的分泌可以减少巨噬细胞的持续募集，并减轻炎症性脂肪细胞-巨噬细胞的交叉反应[55-61]，此外，我们评估了肥胖对脂肪组织中由ω-3衍生的炎症脂质介质的改变的影响，治疗了带有炎症脂质介质前体细胞的肥胖老鼠，并研究了其炎症和代谢失调的影响。研究发现肥胖明显地减少DHA衍生的17-hydroxydocosa-hexaenoic酸(17-HDHA即resolvinD1的前身)和保护D1(PD1)在小鼠脂肪组织的水平。在肥胖人群中，膳食中的EPA/DHA可以恢复内源性生物合成的由ω-3-衍生的脂质介质，从而衰减脂肪组织炎症、改善胰岛素敏感性。令人惊讶的是，17-HDHA的治疗可以减少脂肪组织的炎性因子的表达,而增加脂联素的产生,并改善肥胖小鼠的胰岛素敏感性。这些研究发现表明,某些SPM和SPM前体细胞的生物合成的受损,包括17-HDHA和PD1,会在肥胖人群中引发脂肪组织炎症[62]。3)消退素D1是改善脂肪组织炎症导致的胰岛素抵抗的重要物质炎症是许多慢性疾病的一个至关重要的潜在的组成成分,某种程度上，主要是通过大部分抗炎介质缺失的持续作用而实现此过程。最新的研究表明,巨噬细胞是类似TNF-a和IL-6等促炎脂肪因子的重要来源，这类巨噬细胞主要通过增加腹部脂肪组织大规模的扩张与促炎介质的产生来发挥炎症作用。事实上,人类和啮齿动物的研究指出随着脂肪组织中巨噬细胞的积累，脂肪细胞体积和数目随之变化，引发其炎症反应，最终导致胰岛素抵抗。同样,减肥会导致减少炎症标记物和脂肪组织巨噬细胞成分41 综述[45]。近年来，对新型抗炎介质研究最为广泛的是一种用生物合成方法合成的抗炎物质－消退素D1，及时有效地解决炎症和减少组织损伤的程度是消退素D1最显著的作用[63-65]。尤其是,我们证实了消退素D1在巨噬细胞表型转换和促进巨噬细胞非炎症吞噬作用中的强大的抗炎作用,这是解决脂肪组织炎症过程的一个至关重要的步骤。在缺少雄性瘦素受体的(db/db)的老鼠（即患有胰岛素抵抗脂肪肝的肥胖老鼠）,给予消退素D1治疗后改善葡萄糖耐量,降低空腹血糖,并胰岛素敏感基因（PPAR）、GLUT4及IRS-1、IRS-2均有不同程度表达上调[66]。使脂肪组织的炎症过程得以不同程度恢复，改善胰岛素抵抗。值得注意的是,在抗炎脂质介质中,消退素D1很大程度上主导肥胖老鼠的脂肪组织，显著减弱由IFN-g/LPS所致的Th1细胞因子而上调精氨酸酶1的活性水平。此外消退素D1(RvD1)能够阻碍过多的白细胞渗透物进入组织,减弱促炎的细胞因子的产生,同时促进非炎性巨噬细胞的吞噬作用。由于消退素D1的作用，具有冠状结构炎症F4/80CD11c巨噬细胞在脂肪组织中被减少了>50%，并且增加了F4/80巨噬细胞半乳糖c型凝集素1(MGL-1)的百分比。事实上,炎症性脂肪组织巨噬细胞与高胰岛素血症和胰岛素抵抗都相关,而消退素会有针对性的调节巨噬细胞渗透到组织,减轻炎症信号(Ikk)，减轻由肥胖而引发胰岛素抵抗作用。然而,消退素D1的单独效应在由肥胖所致的糖尿病还未被证实。但我们已经报道消退素D1能够通过调节炎症巨噬细胞在脂肪组织的积累而在机体内部分程度上减弱肥胖所致的胰岛素抵抗。而这些结果都表明,有效刺激内源性抗炎中介物消退素D1能够提供一种对于肥胖引发糖尿病的新型治疗策略治疗[46]。3ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFA)及消退素在其他疾病中的研究进展ω-3PUFAs、DHA、EPA及其衍生物消退素已经被证实在一些慢性退行性疾病（如心血管疾病，糖尿病，类风湿性关节炎和癌症等）存在临床获益[67]。Leigh等人[68]报道，在小鼠和人唾液腺细胞中存在一种resolvinD1生物合成途径，并且健康受试者和SS患者的人唾液腺细胞中resolvinD1生物合成相关介质的分布是不同的，这可能表明在干燥综合征（SS）的患者，ResolvinD1正在产生，但不能递送到SS患者的唾液腺靶细胞中。此外，ResolvinD1还能阻断TNF-α介导的炎症反应，TNF-α是诱导唾液腺细42 综述胞凋亡的一种炎性细胞因子[69]，增加了唾液腺细胞的屏障功能和细胞极性[70,71]。这些报道暗示补充DHA可能对SS等唾液腺炎性疾病有预防和治疗作用。几项临床研究揭示了放射和化疗下鱼油给药在癌症恶病质中的有益作用。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一种抗代谢物，可用作多种癌症的化疗药物[72,73]。与单独暴露于任一种物质的细胞相比，结肠癌细胞与鱼油和5-FU的联合治疗显着增强了生长抑制[72]。研究认为非酒精性脂肪肝（NAFLD）是代谢综合征在肝脏的一种表现[74,75]。在最近的一项研究中,我们已经证实了3-pufas及其生物衍生的活性脂质介质通过阻止肝脏的非炎性的损伤而发挥保护作用[76]。尽管这些研究结果并未完全阐明3-pufas及其生物学脂质活性物质改善非酒精脂肪肝的具体作用机制[66]，但也为其提供了新的治疗策略。在对COPD研究中发现，RvD1通过抑制NF-κB和促分裂原活化蛋白激酶的激活来减弱人肺上皮细胞产生的IL-8[77]。RvD1也直接抑制嗜中性粒细胞趋化性[78,79]，对COPD的发展起到延缓作用。综上所述，消退素是一种具有强大抗炎作用的脂质介质，通过其对脂肪组织巨噬细胞表型的影响，可有效改善脂肪组织的慢性炎症反应，从而有效改善胰岛素抵抗，目前对于消退对许多其他疾病的作用尚未十分明确，但其具有的良好抗炎和促炎症消退作用定会为未来人类疾病的防治提供新思路。参考文献1.SerhanCN,HongS,GronertK,etal.Resolvins:afamilyofbioactiveproductsofomega-3fattyacidtransformationcircuitsinitiatedbyaspirintreatmentthatcounterproinflammationsignals[J].JExpMed,2002,196(8):1025-1037.2.HaworthO,LevyBD.Endogenouslipidmediatorsintheresolutionofairwayinflammation.EurRespirJ,2007,30(5):980-92.3.KohliP,LevyBD.Resolvinsandprotectins:mediatingsolutionstoinflammation.BrJPharmacol,2009,158(4):960-71.43 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致谢致谢时光荏苒，岁月如梭，转眼间硕士研究生学习阶段快要结束了，这三年的生活、学习使我收获颇丰，不仅提高了我的临床专业知识技能、还升华了思想境界和人生观。如今我的毕业论文终于完稿，回首这段收集、整理、思索、停滞、修改直至论文最终完成的过程，尤其当我想起老师、朋友，同事们对我的关心和帮助，我的内心怀抱感恩，在此我向你们表达我最真挚的感谢。首先，衷心感谢我的导师王瑞英教授。王老师为人谦和，平易近人，是我研究生三年求学生涯中一盏明灯，为我点亮前进的道路。在这三年期间对我悉心培养，耐心指导，其临床上正直诚恳的医德作风、不耐其烦的为患者服务的精神将影响和激励我的一生，这将是我人生中最宝贵的财富。不止于此，从论文的选题，到撰写及修改都给予了我全心的指导，耐心的帮助。其次，我还要感谢河北医科大学第二医院内分泌科全体老师，不仅在医学知识的传授上给予了我极大的帮助，还给了我你们临床上严谨、无私、高水平的教导，使我的专业知识及临床实践能力得到了提高。同时也要感谢关心帮助过我的同学们，能让我的研究生三年学习生涯如此丰富多彩正是因为有了你们，很庆幸和你们共度三年时光。最后我要感谢这么多年来我的父母对我学习和生活上给予的支持和鼓励。谢谢!52 个人简历个人简历一、一般情况姓名杨婷婷性别女民族汉出生日期1990年09月18日籍贯吉林省长春市二、个人经历2006年09月-2009年07月吉林省长春市九台区第一中学高中2009年09月-2014年07月承德医学院学士2015年09月-2018年07月河北医科大学硕士三、获奖情况2009-2010学年担任学校学生会外联部委员班级宣传委员2009年12月承德医学院大学生红丝带协会文艺汇演荣获二等奖2010年6月被评为承德医学院优秀团员，2010年12月寒假社会实践活动二等奖2012年5月大学生红五月社团文艺汇演中荣获优秀表演奖2014年6月获承德医学院优秀毕业生2015年12月荣获河北医科大学研究生学院“艺统天下”二等奖2015-2016学年河北医科大学学业三等奖学金2016-2017学年河北医科大学学业三等奖学金53