小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究

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分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究StudyonIntestinalMicroecologicalChangesintheProcessofType2DiabetesMellitusinMice曾通旭指导教师姓名哈小琴教授（兰州总医院兰州730070）学科专业名称预防兽医学研究方向兽医微生物与免疫论文答辩日期2018年5月28日学位授予日期2018年6月答辩委员会主席苏海翔研究员评阅人王胜义研究员评阅人孙晓琳研究员2018年6月 ClassificationNo.：Secrecylevel：UDC：Schoolcode：10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeStudyonIntestinalMicroecologicalChangesintheProcessofType2DiabetesMellitusinMicePostgraduate:Zeng-TongxuAdvisor:Prof.Ha-XiaoqinSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:MicrobiologyandImmunologySubmittedTime:Jun,2018Address:Lanzhou,China,730070 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究摘要【目的】本研究通过构建小鼠2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）发病进程的动物模型。采用16SrRNA高通量测序分析粪便菌群丰度变化，采用ELISA及流式细胞术观察肠道免疫、体液免疫及细胞免疫在糖尿病发病进程中的变化。探讨糖尿病发生过程中菌群丰度的改变与免疫的变化。【方法】（1）小鼠2型糖尿病发病进程模型的制备。根据预实验结果，采用随机数字表法，将SPF级雄性C57BL/6J实验小鼠分为6组：0天组（A组）、20天组（B组）、40天组（C组）、60天组（D组）、80天组（E组）、105天组（F组），每组16只，各组间体重、血糖水平无统计学意义（P>0.05）。A组为正常组，不做任何处理。B-E组为高脂高糖饲喂组，F组是高脂高糖饲喂80天时联合小剂量多次注射STZ制备T2DM模型。模型制备过程中，每2周进行空腹血糖（fastingbloodglucose,FBG）测定，腹腔注射糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetrial，IPGTT）观察空腹血糖水平及糖耐量的变化情况。每次IPGTT实验之后第三天进行胰岛素耐量试验（insulintolerancetest，ITT），共15周。为了观察葡萄糖在体内的利用，选择做曲线下面积（areaundercurve，AUC）参数判断糖耐量与胰岛素抵抗情况。各实验组在对应时间点（A组第0天、B组第20天、C组第40天组、D组第60天、E组第80天、F组第105天），分别处死小鼠进行样本采集。取模型小鼠粪便、血液、肠、胰岛、肝脏组织进行检测。（2）HE染色观察在T2DM发病进程中胰腺、肝脏、回肠等组织病理变化。胰腺用抗胰岛素抗体做免疫组化实验。（3）生化仪检测与糖尿病相关的生化指标变化（CRE、FBG、FFA、CHO、HDL、LDL、TG）。（4）16SrRNA高通量二代测序检测各模型组肠道菌群的丰度变化。（5）酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）水平，回肠组织中分泌型免疫球蛋白A（SecretoryImmunoglobulinA，SIgA）水平。比浊法检测超敏C反应蛋白+（hypersensitiveC-reactiveprotein，hs-CRP）水平。（6）流式细胞仪检测各模型组血液中CD3、++CD4、CD8等T淋巴细胞亚群占比。【结果】（1）T2DM发病进程中，各实验组小鼠腹腔脂肪明显增多。各实验组小鼠的FBG水平:A组5.6mmol/L、B组6.7mmol/L、C组8.1mmol/L、D组9.3mmol/L、E组10.2mmol/L、F组13.6mmol/L,各实验组之间差异有统计学意义（P<0.05）。IPGTT结果显示，在糖尿病的发生过程中，小鼠糖耐量能力逐渐开始下降。ITT结果显示，A组注射胰岛素15～30min之后，空腹血糖浓度下降约50%，且在120min恢复到正常血糖水平，高脂高糖组血糖在注射胰岛素后15～30min下降不足50%且下降缓慢，F组血糖下降不足30%且恢复到原始血糖缓慢，下降过程中A组与各实验组差异有统计学意义（P<0.05）。AUC结果显示，与A相比，C、D、E组对应的AUC增大，差异有统计学意义（P<0.05），F组显著增大且差异有统计学意义（P<0.01）。I 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究（2）组织病理切片结果，胰腺：A组细胞周围腺泡界限清晰。C组时发现胰腺轻度萎缩，轻度纤维化。F组胰岛大面积重度萎缩。胰岛内β细胞肥大，可见大量透明脂肪和空泡化细胞。T2DM的发病过程伴随着肝脏、回肠组织的病理变化。（3）各实验组生化指标结果如下：A、C、D组FBG、FFA、CRE、TG、CHO、HDL、LDL、UA差异具有统计学意义（P<0.05）；A、B、C、D、E、F组的UREA与各实验差异差异无统计学意义（P＞0.05）。F组的TG、CHO、HDL、UA只与A组差异显著（P<0.05）。（4）本实验采用Illumina测序技术对6个实验组小鼠粪便样品16SrRNAV4区的PCR产物测序，进行细菌种群多样性研究。各实验组小鼠粪便菌群中占比前5位的是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）；在糖尿病发病进程中的C组中发现变形菌门（Proteobacteria）水平明显高于其他A、B、D、E、F组；F组中厚壁菌门(Firmicutes)水平明显高于其他A、B、C、D、E组。在T2DM的发病进程中，各实验组小鼠肠道微生物种群都会出现不同程度的失调，提示肠道微生态可能与2型糖尿病的发生具有相关性。（5）血清中Hs-CRP、IL-6、TNF-α的水平及回肠组织中SIgA的结果：实验发现A组与E组、A组与F组的Hs-CRP、IL-6、TNF-α差异均具有统计学意义（P<0.05）；正常组SIgA为22.3pg/mL，D组SIgA为20.1pg/mL，E组SIgA水平为18.3pg/mL，F组SIgA水平为17.6pg/mL。SIgA在F组水平最低，且与A组差异具有统计学意义（P<0.05）。++++（6）流式细胞术结果：A组与C组、A组与E组、A组与F组的CD3CD8、CD3CD4+差异具有统计学意义（P<0.05），A组与F组的CD3细胞差异具有统计学意义（P<0.05），A组与B、C、D等组的差异不具有统计学意义（P＞0.05）。【结论】（1）通过成功制备了T2DM发病进程的动物模型，发现在糖尿病前期已经存在胰岛素抵抗，且伴随着不同程度的肝脏及胰岛、回肠的损伤，发展为T2DM时胰岛素抵抗更为显著。（2）在2型糖尿病的发生过程中伴随着肠道菌群丰度变化，尤其是丰富种群：厚壁菌门、梭菌门、变形菌门、蓝藻菌门等菌群随着血糖的升高出现不同的变化趋势，可能引起慢性炎症最终胰岛素抵抗。（3）在糖尿病的发生过程中肠道菌群丰度失衡引起小鼠肠道免疫、细胞免疫与体液免疫出现紊乱，提示在T2DM的发展进程中相关的免疫指标异常及T淋巴细胞亚群的比例失衡与糖尿病的发生风险有一定的相关性。【关键词】肠道微生态；免疫；糖尿病前期；2型糖尿病；小鼠模型II 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究Abstract【Objective】Ourstudyaimtothechangeofbacterialabundanceandimmunologicalchangesintype2diabetesmellitus.16SrRNAhighthroughputsequencingwasusedtoanalyzethechangesinfecalfloraabundance,ELISAandflowcytometrywereusedtoobservethechangesofintestinalimmunity,humoralimmunityandcellimmunityintheprocessofdiabetes.【Methods】(1)Type2diabetesmousemodel.MaleC57BL/6Jmice(SPFgrade)wererandomlydividedinto6groups:0days(groupA),20days(groupB),40days(groupC),60daysgroup(groupD),80daysgroup(groupE),105daysgroup(groupF),16miceineachgroup.Agroupisanormalgroupwithnotreatment.ThegroupB-Ewasfedwithhigh-fatandhigh-sugardiets,andthegroupFwasfedwithhigh-fatandhigh-sugardietscombiningwithsmalldosesofmultipleinjectionsofSTZfromthe81stday.Fastingbloodglucose(FBG)wasusedtodetectthebloodglucoseevery2weeks.Glucoseintoleranceweremeasuredbyintraperitonealglucosetolerancetrial(IPGTT),insulintolerancetest(ITT)andtheareaundercurve(AUC)for15weeks.Atthecorrespondingtimepoint,miceweresacrificedandvarioustissueswerecollectedasfollow:feces,blood,intestines,islets,andliver.(2)HEstainingwasusedtoobservethepathologicalchangesofpancreas,liver,ileumandotherpathologicalchangesinthepathogenesisofT2DM.Insulincontentinpancreaswastestedwithananti-insulinantibodyforimmunohistochemistry.(3)Diabetesassociatedbiochemicalindicators(CRE,FBG,FFA,CHO,HDL,LDL,TG)weredetectedbybiochemicalanalyzer.(4)16SrRNAhigh-throughputsecond-generationsequencingwasusedtodetecttheabundanceofintestinalflora.(5)Serumlevelsofinterleukin-6(IL-6),tumornecrosisfactor-α(TNF-α)andsecretoryimmunoglobulinA(SIgA)inileumweremeasuredbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Thelevelofhypersensitivec-reactiveprotein(hs-CRP)wasdetectedby+++turbidimetricmethod.(6)ThepercentageofCD3,CD4andCD8cellsinTlymphocytewasmeasuredbyflowcytometry.【Results】(1)InthedevelopmentofT2DM,theabdominalfatofmiceineachexperimentalgroupincreasedsignificantly.FBGlevelsincreasedgraduallyfromgroupAtoFandtherewasastatisticalsignificancebetweentheexperimentalgroups(P<0.05).IPGTTandITTdatashowedthatglucosetolerancegraduallydeclinedwiththeprogressionofdiabetes.ComparedtogroupA,theAUCingroupC-Fincreasedinthedevelopmentofdiabetes.(2)HistopathologicalresultsshowedthattheacinarofpancreaswasclearlyingroupA.IngroupC,pancreaswasmildlyatrophicandfibrotic.ThepancreaticisletwasseverelyatrophiedintheFgroup.Pancreaticβ-cellappearedhypertrophyandrevealedalargeamountoftransparentfatandIII 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究vacuolatedcells.ThepathogenesisofT2DMwasaccompaniedwithpathologicalchangesinliverandileum.(3)Biochemicalindicatorsintheexperimentalgroupswereasfollows:ComparedwithgroupA,FBG、FFA、CRE、TG、CHO、HDL、LDL、UAingroupCandDshowedsignificantdifferences(P<0.05);TherewasnoobviousdifferenceinUREAbetweenthegroupEandF(P>0.05).TG,CHO,HDL,UAingroupFweresignificantlyhigherthanthoseingroupA(P<0.05).(4)Illuminasequencingtechnologywasusedtosequencethe16SrRNAV4regionPCRproductsfromfecessamplestostudybacterialpopulationdiversity.Thetop5ofthefecalfloraineachexperimentalgroupwereFirmicutes,Bacteroidetes,Proteobacteria,Actinobacteria,Spirochaetes.ThelevelofProteobacteriawassignificantlyhigheringroupCthaninothergroupswiththedevelopmentofdiabetes;thelevelofFirmicutesingroupFwassignificantlyhigherthanthatothergroups.IntheprogressionofT2DM,theintestinalmicrobialpopulationsineachexperimentalgroupshoweddysregulationatdifferentdegree,suggestingthattheintestinalmicrobiotamayberelatedtotheoccurrenceoftype2diabetes.(5)SerumHs-CRP,IL-6,TNF-αandSIgAinileum:OurresultsshowedthatHs-CRP,IL-6,andTNF-αingroupEandFwerehigherthangroupA(P<0.05);SIgAleveldecreasedgradually(groupA:22.3pg/mL,groupD:20.1pg/mL,groupE:18.3pg/mL,andgroupF:17.6pg/mL).SIgAlevelingroupFandhadstatisticallysignificantdifferencefromgroupA(P<0.05).++++(6)FlowcytometrydatashowedthatCD3CD8andCD3CD4ingroupC,E,andFhad+statisticallysignificantcomparedtogroupA(P<0.05).CD3ingroupFhadstatisticallysignificantcomparedtogroupA(P<0.05).TherewasnosignificantdifferencebetweengroupAandB,C,andD(P>0.05).【Conclusion】(1)Inthepresentstudy,weconstructedtheT2DMmodelindifferentstage.Wefoundthatinsulinresistanceexistsinthepre-diabeticstage,andinsulinresistanceaggravatedgraduallyaccompanyingwithvaryingdegreeofinjuryinliver,islet,andileum.(2)Thedevelopmentoftype2diabeteswasaccompaniedwithachangeintheabundanceofintestinalmicroflora,especiallyintheabundanceofpopulations:thebacterialfloraofthephylumStreptomyces,Clostridium,Proteobacteria,andCyanobacteria,etc.Thesechangesmaycausechronicinflammationresultingininsulinresistance.(3)Theimbalanceofintestinalfloraabundanceduringthedevelopmentofdiabetescausedadisturbanceinintestinalimmunity,cellularimmunityandhumoralimmunity,whichsuggestedabnormalofimmuneindicesandTlymphocytesubsetswererelatedtodiabetes.【Keywords】Intestinalmicroecology;Immunity;Pre-diabetes;Type2diabetes;MousemodelIV 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究目录摘要..............................................................................................................................................ⅠAbstract............................................................................................................................................Ⅲ缩略词中英文对照表....................................................................................................................VII一、文献综述....................................................................................................................................11.12型糖尿病发病进程的研究现状..................................................................................11.2肠道微生态与2型糖尿病发病进程的研究现状.........................................................21.3肠道微生态与免疫研究现状.........................................................................................3二、小鼠2型糖尿病发病进程模型的制备....................................................................................41.实验材料...........................................................................................................................41.1实验动物.......................................................................................................................41.2实验材料.......................................................................................................................41.3主要仪器.......................................................................................................................42.实验方法.............................................................................................................................52.1模型制备预实验...........................................................................................................52.2动物分组及模型制备...................................................................................................52.3标本采集.......................................................................................................................62.4病理组织学观察...........................................................................................................72.6生化指标检测...............................................................................................................93.实验结果.............................................................................................................................93.1小鼠2型糖尿病发病进程模型的制备.......................................................................93.2组织病理学结果.........................................................................................................113.3胰腺免疫组化结果.....................................................................................................143.4血液生化指标检测结果.............................................................................................144.讨论.................................................................................................................................155.小结.................................................................................................................................17三、小鼠2型糖尿病发病进程中肠道菌群丰度的变化..............................................................181.实验材料...........................................................................................................................181.1实验动物......................................................................................................................181.2试剂与耗材.................................................................................................................182.实验方法...........................................................................................................................182.1分组及样本采集.........................................................................................................182.2小鼠肠道微生态丰度检测.........................................................................................192.3肠道局部免疫指标检测.............................................................................................232.4体液免疫指标检测.....................................................................................................232.5细胞免疫指标检测.....................................................................................................243.实验结果...........................................................................................................................243.1粪便肠道微生态丰度结果.........................................................................................243.2肠道局部免疫结果...................................................................................................373.3体液免疫结果...........................................................................................................38V 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.4细胞免疫结果.............................................................................................................384.讨论.................................................................................................................................405.小结.................................................................................................................................44结论................................................................................................................................................45展望................................................................................................................................................46参考文献..........................................................................................................................................47在学期间科研成果..........................................................................................................................51致谢................................................................................................................................................52导师简介..........................................................................................................................................53原创性声明......................................................................................................................................54VI 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究缩略词中英文对照表英文缩写英文全称中文全称AUCareaundercurve曲线下面积CRPC-reactiveproteinC反应蛋白CREcreatinine肌酐CHOcholesterol总胆固醇FFAfreefattyacid游离脂肪酸FBGfastingbloodglucose空腹血糖丝裂原活化蛋白激glucosetransporter4GLUT4酶metabolicsyndrome葡萄糖转运受体4HDLhighdensitylipoprotein高密度脂蛋白苏木精和伊红（染HEhematoxyclinandeoxsin色）hs-CRPhypersensitiveC-reactiveprotein超敏C反应蛋白IKKinhibitorkappa-Bkinaseβ抑制物K-B激酶βIRS-1insulinreceptorsubstrate-1胰岛素受体底物-1IGTimpairedglucosetolerance糖耐量受损IDFinternationaldiabetesfederation全球糖尿病联盟ITTinsulintolerancetest胰岛素耐量实验impairedfastingglucoseIFG空腹血糖受损IRInsulinresistance胰岛素抵抗IL-6Interleukin-6白细胞介素-6VII 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究intraperitonealglucosetolerance腹腔注射糖耐量实IPGTTtrial验LDLlowdensithlipoprotein低密度脂蛋白NF-κBnuclearfactorκB核因子κBPre-DMPre-diabetesMellitus前期糖尿病PBSPhospahatebalancedsaltsolution磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainreaction多聚酶链式反应STZstreptozotocin链脲佐菌素SDSSoddodecylsulfate十二烷基硫酸钠SFAstaturatedfattyacid饱和脂肪酸分泌型免疫球蛋白SIgASecretoryImmunoglobulinAAT2DMTypeIIDiabetesMellitus2型糖尿病TNF-αtumornecrosisfactor-α肿瘤坏死因子-αTLR4toll-likereceptor4Toll样受体4TGTriglyceride甘油三酯UAUricacid尿酸VIII 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究一、文献综述1.2型糖尿病发病进程的研究现状近年来，随着人们生活水平的提高，2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）的发病率越来越高，对人们的生活影响也随之增大。根据其临床症状可将糖尿病可以分为三个不同的时期，第一个时期被称为高危人群，第二个时期被称为糖尿病前期（Pre-diabetesmellitus，Pre-DM），直到第三个时期才被称为T2DM［1］。据2017年国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederation，IDF)发布的全球大数据如图（图1-1）所示，2017年糖耐量受损人数达到3.521亿，多发人群集中于20-79岁，约占总人数的7.3%的，其中发展中国家占有大部分患者（72.3%）的比例。我国T2DM发病率高达9.4%，T2DM患者达到1.29亿人，这项数据占［2］当今全世界4.22亿T2DM患者近三成比例。2010年美国糖尿病协会（AmericnDiabetosAssociation，ADA）发布空腹血糖受损（impairedfastingglucose，IFG）的诊断标准是：空腹血糖在6.1-6.9mmol/L之间，口服糖耐量实验（oralglucosetolerancetest，OGTT）<7.8mmol/L;或糖耐量异常（impairedglucosetolerance，［3］IGT），患者空腹血糖<7.0mmol/L，OGTT>7.8mmol/L且<11.0Lmmol/L。因此，T2DM给我国人民的生活带来严重的影响，所以对T2DM的发生过程进行研究迫在眉睫。图1-1全球排名前十的糖尿病国家T2DM的主要特征是胰岛β细胞功能障碍而引起的胰岛素抵抗(insulinresistance,IR)，其发病机制主要是由IR引起的。近年来，随着研究的深入，人们对T2DM的进一步认识，肥胖相关免疫炎症与T2DM的发展具有较强的相关[4]性。最早在20世纪初，Williamson通过利用非甾体抗炎药水杨酸钠降低T2DM1 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究[5]患者的糖尿量，首次证明炎症与糖尿病的关系。直到1993年，Hotamisligil首次发现肥胖引起的炎症因子，肿瘤坏死因子-α(TumorNecrosisFactor-α,TNF-α)可以引起使实验动物IR。越来越多的临床研究表明TNF-α、IL-18(Interleukin-18)、IL-1β(Interleukin-1β)、CRP(Creactiveprotein)等炎症因子均与肥胖有密切关系，[6]其直接或间接参与T2DM发病过程并最终引起IR。健康人群的空腹血糖（fastingbloodglucose，FBG）维持在3.9～5.6mmol/L［7］［8］。餐后血糖的变化幅度也在3mmol/L之内。在T2DM发病过程中，研究发现FBG与OGTT在体内失衡。因此，有专家用重复实验的方法研究了葡萄糖水平、胰岛素敏感性及胰岛素分泌，发现在T2DM的发病进程中OGTT处于连续变化的过程。英国专家WhitehallII通过对糖尿病患者13年随访中发现，在前7年，其血糖处于正常状态，但其胰岛素敏感性开始下降，且胰岛素分泌上升。在接下来的2～6年，受试者胰岛素敏感性与胰岛素分泌同时骤然下降，直至发展［9］为T2DM。因此，T2DM的发病进程中，胰岛素抵抗发生在葡萄糖耐量受损的前期，且伴随着胰岛β细胞功能受损。2.肠道微生态与2型糖尿病发病进程的研究现状T2DM的发生已成为全球性的健康问题。与之相关的研究也越来越多，但是[10]其发病机制尚未明确。Dethlefsen等通过16SrRNA测序技术发现人体肠道内定植约数万亿细菌，总重量可达1.5kg。这些细菌群落在免疫、代谢、营养等方面具有重要的作用。有研究发现，肠道菌群菌群的代谢产物具有明显抑制炎症发生的作用，肠道中特殊菌体利用纤维合成多聚糖之后能够促进T淋巴细胞分泌具有强烈的抗炎症作用的白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）和协调性T细胞(Regulatorycells，Treg)，Treg对机体过度的炎症与自身免疫疾病的调解非常重要[11]，从以上研究中可以看出肠道菌群的丰度及其代谢产物与疾病的发展过程密切相关。最新研究表明，肠道菌群被认为与代谢性疾病特别是T2DM的发病机制[12]中发挥作用，T2DM病患者肠道内的细菌环境更加恶劣，最终会产生多重耐药[13]性。LeChatelier等研究发现心血管疾病及T2DM的发生与肠道菌群的相关性较弱，但是又发现肠道菌群丰度较丰富的人对肥胖综合症及慢性炎症的发病率较[14]高。肥胖相关的炎症因子引起胰岛素的信号传导障碍加快了T2DM的发生，是[15]胰岛功能减弱的一个很重要的环节。因此肠道菌群在T2DM的发生过程中有可能起重要作用。在T2DM的动物模型中，由于在模型鼠体内没有定植完整的菌落而使免疫功能发生变化，更严重者有可能会引起结肠炎症。在造模过程发现模型小鼠的状态2 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究一般，体重逐日下降，日常活动指数上升。当模型小鼠用健康小鼠的粪便移植后，与炎症相关的一些指标会明显弱化，此研究表明炎症的发生与某种菌群的定植具[16]有一定的相关性。因此，我们肠道菌群可能通过影响免疫因子的分泌，从而对机体的疾病具有调控作用。也有研究发现，T2DM是处于与代谢性内毒素血症相关的低水平炎症状态。LPS是革兰氏阴性菌细菌壁的主要成分，也是内毒素的主要成分。LPS可以与免疫细胞表面的Toll样受体4(toll-likereceptor4,TLR-4)结合形成相应的复合物，从而激活免疫细胞，引起胰岛素抵抗与肥胖的炎症状态。该[17]研究在敲除TLR-4的基因小鼠中得到了验证。3.肠道微生态与免疫研究现状有不少学者研究发现肠道微生态与免疫系统疾病的发生具有相关性。婴儿的出生方式以及滥用抗生素，会影响婴儿肠道菌群的定植，有可能在童年时期会增[18-19]加哮喘、过敏等与免疫相关的疾病发生风险。如果母亲在怀孕期间服用抗生[20]素也会影响胎儿肠道菌群的丰度，会增加胎儿患麻疹的机率。高纤维饮食会使肠壁的通透性增加，影响肠道免疫指标(SecretoryImmunoglobulinA,SIgA)下降，促进细菌的代谢产物脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）进入血液，其可能产生内毒素血症，引起全身性的炎症，最终可能导致肥胖或T2DM等代谢性疾病的发[21]生。因此，肥胖及其相关代谢性疾病患者慢性炎症的发生与其肠道菌群失衡有密切关系。肠道内的纤维与拟杆菌门的菌体相结合，从而形成多聚糖，进而可以诱导T淋巴细胞生成抗炎因子IL-10。有研究发现，若给无菌小鼠肠道内定植B.[22]fragilis后，会降低炎症性肠病的发病率，这是由于无菌小鼠肠道内没有革兰阴性菌的代谢产物肽聚糖进入到血液循环，会引起机体的第一道免疫屏障有所缺损，导致无法对特定致病菌起到免疫作用，最终使中性粒细胞对肺炎链球菌和[23]Staphylococcusaureus等有害菌群的免疫力降低。以上研究都证明了细菌的代谢产物肽聚糖与外周免疫息息相关。因此，肠道菌群既能通过代谢产物保护肠道的天然免疫系统，又可以通过“肠壁渗漏学说”来调节全身性免疫反应.。基于以上研究现状，本实验采用高脂高糖饮食及高脂高糖饮食联合小剂量多次注射链脲佐菌素（Streptozocin，STZ）制备T2DM发病进程的动物模型。用16SrRNA高通量测序分析粪便菌群丰度的变化，通过分析细胞免疫和体液免疫在糖尿病发病进程中的变化，探讨T2DM发病过程中菌群丰度的改变与免疫变化的关系。3 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究二、小鼠2型糖尿病发病进程模型的制备T2DM是一种非胰岛素依赖型糖尿病。一种由多种病因导致的、以慢性高血糖为特征并伴有胰岛素分泌不足、胰岛素作用缺陷或二者同时存在而导致的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱的代谢性疾病。本研究目的是制备小鼠2型糖尿病发病进程模型，为后期实验做好准备。目前对于糖尿病动物模型制备多采用高剂量STZ注射方法，而大剂量STZ注射会导致胰岛β细胞大面积破坏，引［24-25］起受试动物大量死亡，且往往只能制备成1型糖尿病模型。本实验采用高脂高糖饮食结合小剂量多次注射STZ方法模拟T2DM的发病过程，此过程在高血糖特征、糖耐量受损、胰岛素抵抗、组织病理改变等方面的变化与人类2型糖尿病的发病过程非常相似，是一种较为理想的T2DM动物模型制备方法。1.实验材料1.1实验动物雄性SPF级C57BL/6J小鼠156只，35～40日龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK（京）2016—0011）。1.2实验材料（1）链脲佐菌素（STZ）：美国Sigma公司，批号：S0130（2）高糖高脂饲料：北京博泰宏达生物技术有限公司，批号：HD001（3）烯醇氏葡萄糖：北京索莱宝科技有限公司，批号：R1623（4）组织固定夜：北京索莱宝科技有限公司，批号：R1806（5）门冬胰岛素注射液：诺和诺德制药有限公司，批号：S201530011.3主要仪器（1）日立7600全自动生化分析仪：日立公司（2）电泳仪：eppendorf公司，型号：PowerPacUnivesal（3）电转仪：eppendorf公司，型号：PowerPac（4）微量振荡器：江苏其林贝尔仪器制造公司，型号：MH-I型（5）-80℃超低温冰箱：海尔集团，型号：DW-86l626（6）快速混匀器：医疗仪器公司，型号：SK-1（7）精密电子分析天平：奥豪斯公司，型号：DV314C（8）水处理系统：誉维生物科技公司，型号：R10（9）隔热式恒温水浴箱：誉维生物科技公司，型号：R8064 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究（10）高压蒸汽灭菌器：Zealway公司，型号：GR60DR（11）低温高速离心机：Eppendorf公司，型号：5417R（12）ACCU-CHEK血糖仪：Roche公司（13）血糖试纸：Roche公司（14）一次性真空促凝管：华博医疗器械公司，批号：201612022.实验方法2.1模型制备预实验前期预实验动物模型制备，在兰州总医院动物实验中心清洁级动物房进行，实验条件符合动物生长需求：温度控制在22±2℃、湿度控制在50±10％，每周定时更换2次垫料。60只SPF级雄性C57BL/6J实验小鼠适应性饲喂一周，开始先用高脂高糖饲喂小鼠，后期联合小剂量多次注射STZ进行动物模型制备，造模过程中，实验动物的饮水、高脂高糖进食都较自由，每周进行FBG测定、腹腔注射糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetrial，IPGTT），共观察15周。发现高脂高糖饲喂的第20天、第40天、第60天、第80天FBG水平组间差异较显著，IPGTT水平组间差异较显著，第100天与第80天相比，FBG与IPGTT均无明显差异（图2-1，图2-2）。因此，高脂高糖饲喂选取这4个时间点做为糖尿病发展进程模型制备的观察时间点，并从第80天开始联合小剂量多次注射STZ制备2型糖尿病动物模型。图2-1预实验各实验组FBG实验结果图2-2预实验各实验组IPGTT实验结果2.2动物分组及模型制备2.2.1分组96只C57BL/6J小鼠进行适应性饲养一周，根据预实验结果，采用随机数字表法，将实验小鼠分为6组：0天组（A组）、20天组（B组）、40天组（C组）、5 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究60天组（D组）、80天组（E组）、T2DM组（F组），每组16只，各组间体重、血糖水平无显著差异（P＞0.05）。A组为正常组，不做任何处理。B-E组为高脂高糖饲喂组，F组是高脂高糖饲喂80天时联合小剂量多次注射STZ制备T2DM模型。2.2.2模型制备过程模型制备过程中，各组小鼠开始用高脂高糖饲喂，实验动物的饮水、高脂高糖进食都较自由，每2周进行FBG测定、IPGTT，观察空腹血糖水平及糖耐量的变化情况，共15周。FBG测定方法：禁食12h，尾静脉采血，第一滴用无菌棉擦去，第二滴用血糖试纸测定FBG，血与试纸接触时间不少于5s。IPGTT方法：禁食12h，用20%的葡萄糖（称量20g烯醇氏葡萄糖，先用少量蒸馏水在烧杯中进行溶解，然后用蒸馏水在定容瓶中定容至100ml）腹腔注射，剂量为2g/kg，分别在注射前、注射后15min、30min、60min、90min、120min尾静脉采血测血糖值。每次IPGTT实验之后第三天进行胰岛素耐量实验（insulintolerancetest，ITT）：胰岛素原液300U/3ml，用三蒸水稀释至0.1U/ml，根据0.75U/kg进行腹腔注射胰岛素，分别在注射前、注射后30min、60min、90min尾静脉采血测血糖值。其中F组高脂高糖饲喂80天时联合小剂量多次注射STZ制备T2DM模型。用柠檬酸缓冲溶液配制0.5%STZ溶液。柠檬酸钠缓冲溶液配制方法：A液为柠檬酸2.1g定容至100ml（0.1mol/L），B液为柠檬酸钠2.94g定溶至100ml(0.1mol/L)，A:B=11.4:8.6配制柠檬酸钠缓冲溶液，PH≈4.5。小鼠腹腔注射STZ剂量为40mg/kg，每次注射STZ前禁食12小时，注射结束后2小时再进行高脂高糖饲喂。若空腹血糖值＞12.3mmol/L，则判定T2DM模型制备成功。为了观察葡萄糖在体内的利用情况，选择做曲线下面积（areaundercurve，AUC）参数判断。以时间为横坐标，以体内的葡萄糖浓度为纵坐标，求得药－时曲线图中函数的AUC，用AUC来反映糖耐量与胰岛素抵抗，AUC越大表示摄入的葡萄糖越多，其糖耐量在下降。AUC以注射前、注射后15min、30min、60min、90min、120minFBG值用GraphpadPrism6.0软件计算所得。2.3标本采集各实验组在对应时间点（A组第0天、B组第20天、C组第40天组、D组第60天、E组第80天、F组第105天）分别处死小鼠进行样本采集。采血之前小鼠禁食12h，用摘眼球的方法采血。全血样本采用EDTA采血管，用于检测hs-CRP、T淋巴细胞亚群占比。血清样本采用分离胶采血管，将样本离心3000rap×15min分离血清，用于检测IL-6、TNF-α、胰岛素、生化指标。取胰腺、肝脏、6 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究回肠等组织样本，部分回肠用锡纸包被立刻用液氮浸没，储存至零下80度冰箱，用于检测SIgA水平；肝脏、胰腺、部分回肠用4%多聚甲醛溶液进行固定，用于制备组织切片及苏木素-伊红染色（HE）；胰腺需另外进行免疫组化实验。用Longsee菌群采样器在回肠末端采集小鼠粪便，储存至零下80度冰箱。2.4组织病理学观察固定组织的4%多聚甲醛溶液需5天更换一次，共2次。由兰州总医院病理科做石蜡包埋，行常规病理切片和HE染色。用光学显微镜观察小鼠T2DM模型发病进程中各时间点胰岛、肝脏及回肠组织的组织病理学形态观察。2.4.1主要试剂溶液的配制苏木精染液：苏木精1g，甘油50ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，无水乙醇50ml，硫酸铝钾5g；1%盐酸乙醇液：盐酸1ml，50%酒精100ml；1%伊红酒精溶液：伊红1g，95%酒精100ml。2.4.2标本制作（1）固定、漂洗：小鼠的胰岛、肝脏、回肠组织标本采样完毕使用生理盐水中漂洗3次，迅速放至固定液中进行固定；（2）脱水：70%乙醇浸泡40min→80%乙醇浸泡40min→90%乙醇浸泡40min→95%乙醇浸泡20min→无水乙醇I浸泡20min→无水乙醇II浸泡20min；（3）透蜡：100%乙醇、二甲苯等比混匀之后进行浸泡15min→用二甲苯I完全淹没30min→二甲苯II完全淹没30min→二甲苯与石蜡等比溶液浸泡20min→石蜡I浸泡30min→石蜡II浸泡30min，过夜保存。初步处理过的标本由兰州总医院病理实验科进行包埋、切片。2.4.3HE染色（1）脱蜡止水：石蜡切片需要用二甲苯I、II各脱蜡15min，配制100%乙醇及二甲苯等比液，然后用该液浸泡40min，100%、90%、80%、70%、50%梯度乙醇溶液浸泡各5min，蒸馏水水洗3min；（2）染色：苏木精染色20min→水洗2min→切片颜色变蓝→0.5盐酸乙醇混合液分化1min→切片颜色变红→水洗30min→切片变蓝；（3）脱水透明：切片入50%、70%、80%、100%等不同梯度乙醇脱水各5min→1%伊红乙醇对比染色3min→95%乙醇分色→100%乙醇脱色3min→二甲苯溶液浸泡3min→二甲苯I、II各透明5min；（4）封藏：用中性树胶进行封片，等盖波片固定了，用显微镜观察组织病变程度。7 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究2.5免疫组化观察本实验采用兔链霉卵白素-生物素法检测小鼠胰岛â细胞的分布。一抗配制比例为抗胰岛素抗体原液：PBS缓冲液＝1:180。以细胞核及细胞浆中出现棕淡黄色颗粒状、棕黄色颗粒状、褐黄色颗粒状表达即可认为是阳性表达，无颗粒附着，或只有黄染均视为阴性表达。每张切片随机选取10个高倍视野。具体实验步骤如下：1切片脱蜡止水：二甲苯1：10min→二甲苯2:10min→100%酒精1:10min→100%酒精2：5min→95%酒精1：5min→95%酒精2：5min→80%酒精：5min→70%酒精：5min→蒸馏水：5min→pbs：5min。2．抗原修复：放入已经配置好的柠檬酸盐缓冲液中加热进行抗原修复，在实验用的微波炉中加热，选择高火5min，中火10min，然后自然冷却至室温。3.加过氧化氢：冷却之后pbs洗3次，每次大约3min，洗完之后用一句剪为条状的滤纸将组织周围的水分吸取干净（切记不要触碰样本），然后加入过氧化氢，室温孵育10min4.加a液：过氧化氢孵育完毕之后pbs清洗3次，约3min，加a液，37度恒温温箱孵育10min5.加一抗：a液孵育完之后，甩去a液，不用洗，把组织周围水稍微擦去之后直接加一抗，一抗加完放入4度冰箱过夜（或者37度温箱孵育2-3h）6.加b液：防脱片从4度冰箱取出先放正常室温约30min左右，然后用pbs清洗3次，每次3min，每次洗完之后用吸水纸将组织周围的水分完全拭干，加b液并放入温箱孵育10-15min7.加c液：b液孵育完之后，配制好的pbs洗3次，约3min，洗完之后用吸水纸将组织周围的水分拭干，加c液并放入恒温温箱孵育10-15min8.显色：将DAB显色剂按比例稀释混匀后，借助显微镜进行显色，显色时出现黄褐色颜色时就要立马放入自来水中进行阻断，自来水阻断10min，9.苏木精复染：阻断之后完毕之后用三蒸水浸入5min，然后放入苏木精约1min左右（视具体情况而定），然后用蒸馏水快速洗1-2遍，放入盐酸酒精分化2-3秒立马放入自来水中进行返蓝，返蓝10分钟左右（分化时要快速涮两下就立马放入自来水进行返蓝，注意：如果苏木精染色较蓝就少返蓝几分钟，如果不太蓝可以多返蓝几分钟），10.上行梯度脱水：返蓝结束后用蒸馏水洗一下即可放入酒精中，分别为：95%酒精A：5min→95%酒精B：5min→100%酒精A:10min→100%酒精B：10min→二甲苯A：10min→二甲苯B：10min8 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究用中性树胶进行封片。读片：本实验拍照采用OlympusCCDP73显微成像采集系统拍摄免疫组织化学图片，用普通光学显微镜观察，先采用低倍对表达部位进行定位，然后采用高倍对具体的表达部位确定，观察阳性表达情况。2.6生化指标检测生化指标由兰州总医院医学检验科协助完成。采用的是日立7600全自动生化仪进行指标测定，检测项目包括尿素（Urea）、总胆固醇（totalcholesterol,CHO）、游离脂肪酸（freefattyacid,FFA）、甘油三脂(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白（high-densitylipoprotein,HDL）、肌酐(freefattyacid,CRE)、尿酸(uricacid,UA)、低密度脂蛋白（low-densitylipoprotein,LDL）。3.实验结果3.1小鼠2型糖尿病发病进程模型的建立3.1.1模型小鼠一般情况模型小鼠分组时血糖与体重差异无统计学意义（P＞0.05），如表2-1所示。A组小鼠一般状态均良好，正常进食，毛色有光泽，反应灵敏。B-F组小鼠随着高脂高糖饲喂，毛色蓬乱且逐渐缺少光泽，行动迟缓，动作不协调，精神不振，活跃程度逐渐下降。取材时发现A组小鼠腹腔脂肪较少，B-F组小鼠随着造模过程的发展，体型逐渐增胖，小鼠的腹腔脂肪呈急剧增多趋势，如图2-1所示。左图表示T2DM模型小鼠制备过程中，A组、C组、F组小鼠腹腔脂肪堆积情况。右图是近距离拍照糖尿病时期小鼠腹腔脂肪的堆积情况图2-1造模过程中小鼠腹腔脂肪变化情况9 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究表2-1小鼠分组前血糖及体重水平（均数±标准差）组别A组B组C组D组E组F组血糖6.03±0.316.08±0.296.1±0.216.11±0.296.09±0.376.3±0.21（mmol/L）体重(g)17.63±0.3217.41±0.4817.19±0.6716.98±0.5916.83±0.4317.16±0.93＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05；3.1.2模型小鼠血糖水平变化结果造模过程中FBG变化如图2-2所示：糖尿病的发病进程中，各实验组小鼠的FBG平均水平:A组5.6mmol/L、B组6.7mmol/L、C组8.1mmol/L、D组9.3mmol/L、E组10.2mmol/L、F组13.6mmol/L,各实验组之间差异有统计学意义（P<0.05）。IPGTT结果如图2-3所示：在糖尿病的发生过程中，与A组相比，高脂高糖组B组7.1mmol/L、C组8.3mmol/L、D组9.6mmol/L、E组11.2mmol/L与T2DM组在15min、30min、60min、90min、120min时血糖明显升高，且与T2DM差异有统计学意义（P<0.01），小鼠糖耐量能力逐渐开始下降。ITT的变化如图2-4所示:A组注射胰岛素15～30min之后，空腹血糖浓度下降约50%，且在120min恢复到正常血糖水平，高脂高糖组血糖在注射胰岛素后15～30min下降不足50%且下降缓慢，F组血糖下降不足30%且恢复到原始血糖缓慢，下降过程中A组与各实验组差异有统计学意义（P<0.05）。AUC结果如图2-5所示：与A相比，C、D、E组对应的AUC增大，差异有统计学意义（P<0.05），F组显著增大且差异有统计学意义（P<0.01）。由于人体与小鼠代谢水平的差异性，临床糖尿病病人的诊断标准不适用于小鼠模型制备的诊断标准。文献显示，不同的小鼠品系不同，其糖尿病诊断标准不同。诸多文献认定血糖超过12.3mmol/L,即可认为模型成功。因此，本实验采用的C57模型小鼠以血糖水平达到12.3mmol/L［26］做为T2DM模型成功的判定标准。图2-2造模过程各实验组小鼠空腹血糖的变化趋势图2-3造模过程小鼠IPGTT的实验结果10 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究＊＃注：与A组比较，差异显著（P<0.05），差异极显著（P<0.01）图2-4造模过程各实验组小鼠ITT实验结果图2-5造模过程小鼠AUC实验结果3.2组织病理学结果3.2.1各实验组小鼠胰腺组织病理结果组织病理观察结果表明，糖尿病发生过程中，胰腺逐渐萎缩，β细胞数量减少，胰岛逐渐出现萎缩迹象。A组与周围腺泡清晰，无病理变化。B少量透明脂肪和空泡化细胞。C组分泌部的腺泡细胞之间有少量脂肪细胞沉积。D组：外分泌腺侵入胰岛内。E组：胰腺间质间动脉管壁平滑肌增厚。F组：胰岛重度纤维化，部分区域腺泡萎缩。胰腺病理切片100×、400×的观察结果如图2-6-a、2-6-b所示：图2-6-a各实验组胰腺病理切片观察（HE100×）11 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.2.2各实验组小鼠肝脏组织病理结果从图可以看出，在糖尿病的发生过程中，部分伴有小灶状炎性细胞浸润，肝细胞凋亡，轻度肝纤维化。A组小鼠肝脏组织正常。B组逐渐开始脂变。C组少部分干细胞凋亡。D组肝细胞脂肪变性小炮性脂肪变性（胞核仍位于细胞中央）。E组：肝细胞弥漫型小泡性脂肪变性。F组肝细胞变性坏死，门管区的小叶间胆管增生，伴有少量炎性细胞浸润。肝脏病理切片100×、400×的结果如图2-7-a、2-7-b所示：图2-7-a各实验组肝脏病理切片观察（HE100×）12 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.2.3各实验组小鼠回肠组织病理结果在糖尿病的发生过程中，肠道出现轻微病变。A组小鼠回肠组织正常。B组粘膜下层的小肠腺出现空泡状脂滴。C组部分腺上皮细胞出现轻微脂变。D组腺体的一些细胞出现脂变。E组：小肠粘膜上皮出现空泡样变。F固有层部分细胞出现凋亡。回肠的病理变化在100×、400×的结果如图2-8-a、2-8-b所示：图2-8-a各实验组回肠病理切片观察（HE100×）13 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.3胰腺免疫组化检测结果在糖尿病的发生过程中，正常组颜色较深，胰岛结构整，细胞排列规则。高糖高脂组颜色稍浅，胰岛结构无明显变化。T2DM组胰岛内有一个或多个空泡，有明显萎缩迹象。胰岛β细胞的免疫组化检测结果如图3-9所示：3.5血液生化指标检测结果14 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究血液生化指标检测结果表明，A、C、D组FBG、FFA、CRE、TG、CHO、HDL、LDL、UA差异具有统计学意义（P<0.05）；A、B、C、D、E、F组的UREA与各实验差异差异无统计学意义（P＞0.05）。F组的TG、CHO、HDL、UA只与A组差异显著（P<0.05）。结果如表3-2所示表3-2各实验组生化指标结果（均数±标准差）生化指标A组B组C组D组E组F组FBG＃&＃＊＊&＃＊&＃＊&＃＊6.2±0.327.1±0.298.13±0.169.8±1.99.9±0.1213.6±0.69(mmol/L)FFA＃&＃&＃&＃＊&＃＊＃＊2.3±0.112.7±0.132.7±0.33.3±0.23.6±0.073.9±0.11(mmol/L)UREA13.77±1.1614.1±1.213.5±2.615.1±1.915.6±1.5818.5±0.44(umol/L)CRE＊&＊&＃＊＃＊＃＃＊18.6±1.518.5±1.123.8±2.124±2.325.5±3.430.5±2.35(umol/L)TG&&＃＃＃1.4±0.191.5±0.251.6±0.061.7±0.21.8±0.122.3±0.28(mmol/L)CHO＊&＊&＃&＃＊&＃＊＃＊3.2±0.533.4±0.54.53±0.345.7±0.66.1±0.87.1±0.8(mmol/L)HDL＊&&＃&＃＃＊1.5±0.151.7±0.22.13±0.343.7±1.14.1±0.636.4±0.6(mmol/L)LDL&&&＃＊＃＊＃＊0.4±0.170.5±0.070.51±0.120.6±0.20.7±0.080.9±0.06(mmol/L)UA＊&＊&＃&＃＊＃＊＃135±5.6143±12156±14.5169±4.9174±4196±23(mmol/L)＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05；4.讨论成功制备动物模型是实验进行的保障，首先得明确如何建立一种既符合人类T2DM的发病特点、又易于开展实验的动物模型在研究中至关重要。鼠类因自身的特点且经济、易于基因修饰等优点作为T2DM的首选动物模型，主要分为三大类：自发性T2DM模型、诱导性T2DM模型及转基因/基因敲除T2DM模型。使用高脂高糖饲喂只能制备胰岛素抵抗动物的模型，且制备周期长，血糖升高用时更长且不明显。若只用化学药物来诱导，只能制备出具有胰岛素分泌障碍的模[27]型小鼠，并且其胰岛素抵抗症状达与T2DM症状不符。链脲佐菌素（STZ）为一种特效抗菌药，主要作用靶点是实验小鼠的胰岛β细胞。使用STZ造模方法[28]在诸多文献主要有两种，第一种是通过大剂量腹腔一次性注射STZ，朱向红等15 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究的方法是以新生雄性Wistar大鼠为对象，腹腔注射剂量为90mg/kg，模型制备9周后发现模型鼠的胰岛体积开始逐渐缩小，且β细胞数量较正常组低，但没有被完全破坏，该症状出与T2DM临床症状相符。另外一种采用C57BL/6J小鼠，通过高脂饮食联合小剂量多次注射STZ制备的T2DM模型亦与临床症状较符，可[29]以用来做T2DM或者与其相关的一些研究。第二种是国内目前应用最广的一种造模方法。因此，本实验采用第二种方法，即高脂高糖饮食联合STZ诱导最[30]终造出具有胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足的T2DM动物模型。本实验采用高脂高糖饮食及高脂高糖饮食联合小剂量多次注射STZ制备T2DM发病进程的动物模型。其优点是成本低，方法简单，多次小剂量注射STZ能够破坏部分胰岛β细胞，且代谢特征与临床患者相似。缺点是该造模过程中，模型鼠死亡率较高，且周期较长。本实验模型制备过程中，各实验组小鼠FBG呈依次上升趋势，A组小鼠的状态良好，随着高脂饮食的干预，行动缓慢，其中C组两只小鼠颈部毛发稀疏且无光泽，并伴有缩头、弓背等症状，但是正常饮食。在取材时发现从A组到F组，小鼠的腹腔脂肪厚度会依次增多，活跃度明显下降，尤其是C组与D组差别最为明显。IPGTT是动物葡萄糖负荷实验的一种常用方法，可以检测小鼠对葡萄糖的耐受能力，通过该方法能对胰岛β细胞的功能及机体对血糖的调节能力有一个清晰的认识。本实验研究发现，各实验组在15min时达到血糖峰值，F组最高；120min时F组的血糖最高，提示在F组用STZ干预后，改组模型鼠糖耐量下降显。由此可得出T2DM的发病进程中，模型小鼠对葡萄糖的耐受能力依次下降。ITT显示，在腹腔注射胰岛素之后，15min时，A组血糖水平下降约50%，B、C、D、E组血糖水平下降依次减少，F组血糖水平下降约25%。说明在糖尿病的发生过程中，从第20天开始胰岛素敏感性逐渐下降。本实验结果与Weir制［31］备的T2DM多级发病模型代谢指标相一致。Weir通过研究T2DM的整个发病过程将其主要分为3个阶段。糖尿病发病的第一阶段是长期补偿期，该期间存在胰岛素抵抗并伴随着胰岛素分泌的增加，在此过程中，β细胞的质量出现持续上升的趋势，该阶段文献描述与高脂高糖饲喂40天时模型小鼠代谢情况相一致；第二阶段是稳定期，β细胞不能够完全补偿胰岛素抵抗，因此该期间FBG与IPGTT的值不再处于正常范围之内，且胰岛素分泌也会随之减少，该阶段文献描述与高脂高糖饲喂80天时模型小鼠代谢情况相一致。这2个阶段是很多糖尿病前期发生的重要阶段，属于糖尿病前期阶段（Pre-diabetesMellitus，Pre-DM）。糖尿病发展的第三个阶段是早期的代谢失常，即β细胞不能补偿胰岛素抵抗，因此［32］血糖水平开始快速上升，该阶段文献描述与T2DM组模型小鼠代谢情况相一16 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究致。综上所述，本实验制备的模型小鼠代谢症状与文献报道基本一致，模型具有较高的可靠性。T2DM是一种慢性糖代谢异常疾病，长期处于高血糖状态，会引起终末器官损伤。胖综合症属于T2DM的高发人群，其发病率是普通人的4倍，60%患者伴［33］随着糖耐量降低，若处于极度肥胖状态，其发病率会高达普通人的30倍。文［34］献显示代谢综合征的患者有三分之一会发展为T2DM。因此，在T2DM的发病进程中，从肥胖综合症开始就伴随着糖耐量的下降，且对胰岛素的敏感性依次降低。FFA的浓度与糖代谢功能有关，其可能会因为糖尿病的发病进程而呈逐渐上升的趋势。FFA刺激的后果是高活性反应分子性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮簇(reactivenitrogenspecies,RNS)生成增多,从而启动了氧化应激机制。这些活性分子可直接参与DNA、蛋白质、脂类的氧化与损伤,还可作为功能性分子信号,激活细胞内多种应激敏感信号通路,这些信号通路与胰岛素抵抗和β细胞功能受损密切相关。本实验发现，T2DM的发病进程中，FFA的浓度呈逐渐上升的趋势，且呈正相关。T2DM的发生过程伴随着终末器官的损伤，其中有10%患者发展为糖尿病肝病。肝脏是体内糖代谢的中心器官，是肝糖原的主要合成场所。本实验研究发现，在20天时，伴有少量炎性细胞浸润，肝脏的病理学形态有轻微病变，但对正常的机体代谢并无大碍；在T2DM时期，会出现肝细胞坏死的迹象，且出现弥漫型小泡性脂肪变形。说明持续性的高血糖状态可能会引起肝脏病变，随着T2DM病程的延长，可能会增加糖尿病肝病的发病率。胰岛在高脂高糖饲喂时期已经逐渐萎缩，且伴随着轻度纤维化，腺泡细胞与外泌部的界限也逐渐消，胰岛间质动脉管壁平滑肌增厚；T2DM时期，胰岛已经重度纤维化且腺泡萎缩。影响胰岛β细胞对胰岛素的分泌。因此，若在高糖高脂时期防止T2DM的发病，可能会使胰岛的病变程度降低。T2DM的发生进程中，回肠会出现轻微病变，由于肠道菌群的稳态被打破，肠道菌群丰度失调易诱发机体低度慢性炎症。说明在糖尿病的发病进程中机体炎症水平逐渐升高，可能最终会引起胰岛β细胞的凋亡及胰岛素抵抗。5.小结本实验的动物模型制备过程与糖尿病的发病过程相似度极高，可以发现在糖尿病的发病进程中，血糖上升伴随着终末器官的损伤，且生化指标的上升。这些指标有可能作为临床诊断T2DM的辅助指标。17 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究三、小鼠2型糖尿病模型发病进程中肠道菌群丰度的变化T2DM的发病过程是由遗传、环境和饮食等多种因素引起胰岛β细胞损伤的过程，与之相关的胰岛素受体功能缺陷及受体信号转导障碍方向的研究较多。近年来有研究发现，T2DM与肠道菌群有密切的关系，但研究主要集中于已发T2DM阶段，对于糖尿病发病进程中肠道菌群的变化鲜有报道。本研究在成功制备T2DM发病进程模型的基础上，主要分析肠道菌群变化及免疫指标变化,探讨T2DM的发生过程中与肠道菌群变化的关系。1.实验材料1.1实验动物同上一部分1.2试剂和耗材（1）BD流氏细胞仪：兰州总医院血液科，型号：FACSCntoⅡ（2）SgnergyHT全自动酶标仪：AnthosZolotype，型号：LT550S（3）紫外可见分光光度计：上海美谱达公司，型号：UV-1100（4）生物安全柜：新加坡ESCO公司，型号：Airstream®DUO（5）微量振荡器：江苏其林贝尔仪器制造公司，型号：MH-I型（6）-80℃超低温冰箱：青岛海尔集团，型号：DW-86l626（7）快速混匀器：江苏医疗仪器公司，型号：SK-1（8）烯醇氏葡萄糖：北京索莱宝科技有限公司，批号：R1623（9）小鼠T淋巴细胞亚类分析抗体合剂含同型对照抗体：美国BD公司，批号：7228925（10）流式细胞分析用溶血素：美国BD公司，批号：349202（11）MouseInsulinELISAkit：上海酶联生物，批号：509E025（12）MouseSIgAELISAkit：上海酶联生物，批号：801E253（13）MouseTNF－αELISAkit：上海酶联生物，批号：A001-1（14）MouseIL-6ELISAkit：上海酶联生物，批号：A003-12.实验方法2.1分组及标本采集18 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究同第一部分。2.2小鼠肠道微生物丰度检测粪便样本提取DNA后送上海美吉生物科技有限公司进行测序。获得原始数据后，我们进行以下生物信息分析：数据过滤与原始序列统计、OTU分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、PCA主成分分析、LEfSe多级物种差异判别分析。2.2.1粪便DNA提取（1）将已经取好的粪便样本放入1.5mlEP管，加入500µL消化缓冲液，吹打混匀，放入55°C水浴，过夜；（2）取出EP管，使劲将消化好的粪便摇匀，每管加入500µL酚/氯仿进行抽提；（3）混匀，12000r/min离心10min，转移200µL上清至新标记好的EP管内；（4）沉淀：加入400µL无水乙醇上下颠倒混匀，此时出现白色丝状的DNA，12000r/min离心5min，弃上清。（5）加入400µL70%乙醇，混匀，12000r/min离心5min，弃上清。（6）加入200µLTE缓冲液。保存至零下20度。2.2.2质检方法-DNA浓度检测OD值为一定波长下的紫外吸收值。提取的DNA浓度：OD260/OD280≈2.0且OD260/OD230>2视为样本合格，可进行下一步建立文库。本实验采用NanoDrop2000微量紫外分光光度计检测样品纯，Qubit/BS-380检测DNA样品浓度。质检方法的完整性检测：采用2100芯片检测，用可定量电泳仪的微体技术方法对各个样品进行分离，检测荧光强度。（DNA；35-10380bp；RNA：25bp以上），引物设计为338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳实，反应体系如下：试剂用量5×FastPfuBuffer4µl2.5mMdNTPs2µlForwardPrimer(5µM)0.8µlReversePrimer(5µM)0.8µlFastPfuPolymerase0.4µl19 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究TemplateDNA10µlRNaseFreeddH2OUpto20PCR仪：ABIGeneAmp®9700型PCR反应参数：A：1×(3minutesat95°C)B：循环数×(30secondsat95°C；30secondsat56°C；45secondsat72°C)C：10minutesat72°C，10°Cuntilhaltedbyuser2.2.316SrRNA文库的制备Illumina文库：将DNA样本处理为合适的片段大小，并给DNA片段两端连接特定的Illumina接头。测序区域不同，选择对应的扩增引物也不同。由于本实验DNA长度为468bp，故采用V3+V4区引物为341F-805R，引物设计338F：5，-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，806R：5，-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3，具体流程图2-1如下：图2-1建库流程图2.2.4库检上机测序采用Hiseq3000/4000平台进行测序。具体实验操作流程如下：20 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图2-2测序流程2.2.5生物信息分析流程我们得到公司测序完成后获得有效的目标序列，然后进行数据优化。我们利用软件QIIME1.8.0版本对处理后的序列进行分析，主要步骤如下：OTU提取、OTU交叠分析、聚类分析、Lefse分析、系统发生树的构建、Alpha多样性分析、Beta多样性分析等。信息分析流程图如下2-3所示：注：分析条目可能因具体项目的不同而有所差异。21 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图2-316S检测肠道微生态信息分析流程图2.2.6数据过滤与原始序列统计通过一系列过滤方法，使用软件对原始数据进行过滤，目的是获得高质量有效的序列。Illumina高通量测序是根据index序列区分各个样本的数据，以fastq格式保存于NCBI，最终得到有效序列。根据所得有效序列绘制出各实验组样本的CleanReads统计图，为后续分析奠定基础。2.2.7OTU分析OTU（OperationalTaxonomicUnits）是为了便于分析，通过聚类所得到的一类最小单元。通过聚类操作，可以将许多原始数据按照一定的相似性分为许多小样本，每个小样本命名为有各自的OTU。采用RDPclassifier算法对97%的OTU进行分类学分析，这样有助于统计各样本菌群的丰度。2.2.8Alpha多样性分析:研究肠道菌群中微生物的多样性，目前研究的主流方法是通过各实验组样本的Alpha多样性分析来反映菌群的丰度及多样性，包括统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。本实验的主要结果分析采用两种不同的Alpha多样性指数，分别为：（1）chao指数通过估算每个实验组样本中所获取的OTU数量的总指数，chao1在肠道微生态中主要用来预算物种的总量，本次分析使用计算公式如下：（2）shannon指数：代表估计各实验组样本中所有微生物的多样性的指数。若Shannon的指数值越大，则说明群落多样性越高，计算公式如下：N=所有的序列数。2.2.9Beta多样性分析（1）样本距离Heatmap图：Heatmap图是根据图中颜色的深浅来反应原始数据的信息，进而能够分析各实验组菌群的组成信息。首先对各个样本间相似的丰度进行聚类，然后将菌群结果以Heatmap图的形式表现出来。根据各样本颜色的深浅来表现出不同菌落在OTU水平上的相似性及差异性。样本距离分析提供多种计算方法，常见距离算法有Bray-Curtis、Jaccard、UniFrac等。Bray-Curtis与Jaccard距离算法主要基于独立的物种分类单元（如OTU、22 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究属等）进行计算，不考虑各物种之间的进化关系或关联信息。Jaccard算法采用非加权的计算方法，主要考虑物种的有无，而Bray-Curtis算法采用加权的计算方法，同时考虑物种有无和物种丰度。算法名称中含有“unifrac”的算法需要各个物种分类单元（如OTU、属等）的系统进化树（程序会自动搜索项目中存在的完整进化树），通过计算进化树各物种的系统发育进化关系，从而计算样本间距离。此外，算法名称前带有“binary_”的算法为先将OTU表中的数值转换为二进制布尔类型，再进行计算。例如“binary_euclidean”算法。（2）PCA主成分分析：PCA主成分分析（PrincipalComponentAnalysis），是主要是把原有的数据进行简化，将原有的复杂数据降维，但是保存了所有的数据集中对方差贡献最明显的特点。其优点是简单且无参数限制，如果样本物种组成越相似，则反映出的PCA图中的距离越近。基于PCA分析结果，将不同分组样本在第一主成分轴上做箱线图，直观呈现不同分组样本在第一主成分轴上的差异离散情况。不同分组样本的中位值较近，表明物种组成较相近。（3）LEfSe多级物种差异判别分析：LEfSe主要功能是通过线性判断（LDA）来预计组内各个菌落的丰度对总体菌群的差异影响程度。2.3肠道局部免疫指标检测本实验采用双抗体夹心ELISA法测定小鼠肠道免疫指标SIgA。实验前96孔板上提前设计样本孔、样本复孔、标准孔及对照孔种板顺序。实验前试剂盒从冰箱取出，在室温放置约30min。小鼠组织标本从零下80度超低温冰箱取出并冰浴，切割称取合适的质量，加入1mlPH＝7.4的PBS，用匀浆器从低档至高档3个循环进行匀浆，以防匀浆器发热使蛋白降解。各孔加入50µl样品，然后加入酶标试剂，摇匀。用37℃隔水式电热恒温箱反应60min，用洗涤液清洗上样板5次，拍干，先后加入显色液试剂A和试剂B，放入37℃培养箱内显色反应10min，各孔加入终止液，尽快用酶标仪检测各孔在波长为450nm处的OD值。抗凝全血用免疫定量分析仪检测Hs-CRP水平。根据标准品的OD值及其相对浓度，在Excel软件中绘制标准曲线，求得线性方程，根据公式求得各回肠样本的SIgA浓度，进行统计分析。2.4体液免疫检测本实验采用双抗体夹心ELISA法检测体液免疫指标IL-6、TNF-α水平。准备实验同上。各孔加入50µl血清样品，然后加入酶标试剂，摇匀。用37℃隔水式电热恒温箱反应60min，用洗涤液清洗上样板5次，拍干，先后加入显色液试剂A和试剂B，放入37℃培养箱内显色反应10min，各孔加入终止液，尽快用23 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究酶标仪检测各孔在波长为450nm处的OD值。根据标准品的OD值及其相对浓度，在Excel软件中绘制标准曲线，求得线性方程，根据公式求得各血清样本IL-6、TNF-α的浓度，进行统计分析。抗凝全血用免疫定量分析仪检测Hs-CRP水平。2.5细胞免疫指标检测采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群占比，实验方法如下：（1）标本预处理：每次眼球采血取材完毕之后，用肝素抗凝，做好编号，12h内用流式细胞术上机检测。各实验组及阴性对照组均使用3支流式管进行检测。+++++（2）采用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群CD3、CD3CD8、CD3CD4等分型。根据白细胞计数公式：N/20×109/L，确定流式管中加入20µl抗体、50µl样本。实验组与阴性对照同时与抗体避光孵育15min，充分混匀，加红细胞溶血素反应10min，使红细胞充分裂解，倒管弃上清。向各实验管加入450µlPBS，离心3000rap×15min，连续2次，不宜过快，以防止细胞破裂。根据说明书，设置＋＋＋流式细胞仪PE-CyTM偶联CD3，PE偶联CD4，FITC偶联CD8，然后采用流式细胞仪对各实验组T淋巴细胞进行FITC、PE和PE-CyTM荧光强度检测。（3）用CellQuest3.2软件获取实验结果并进行分析，每次获取10000个细+++++胞以上并保存实验数据，分析CD3、CD3CD8、CD3CD4等T淋巴细胞在各实验组所占的比例。3.实验结果3.1粪便肠道微生态16SrRNA高通量测序结果3.1.1小鼠粪便样本琼脂糖凝胶电泳用2%琼脂糖凝胶电泳验证从样本中提取DNA的PCR产物是否符合上机要求，每孔加样3µl。电泳图（图3-1）如下所示：24 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图3-1DNA琼脂糖凝胶电泳图PCR结果显示：目的产物条带为468bp，大小正确，浓度适合。因此，可进行后续实验。3.1.2OTU统计结果本实验使用QIME软件对相似程度大于97%的同源序列进行比对并聚类成OUT。统计各样本OTU聚类情况和对应物种分类学谱系，可对样本进行抽平并对OTU表所得数据进行物种和样本的筛选，然后与数据库GreenGenes进行同源比对和种属分类学鉴定，分析各组样本OTU的水平。本实验共获得7560个OTU，平均OTU个数为210个，各实验组的小鼠OTU统计数目差如表3-1所示，结果差异性无统计学意义(P>0.05)。表3-1各实验组OTU水平统计表GroupSample_123456numberA202.14277.25315.51337.87352.45361B230.99298.62331.88351.47363.48372C224.54294.05324.92343.55354.71362D215.8287.75326.94347.79361.86373E216.12285.05316.11333.44344.85352F170.47256.29304.51332.59351.18365.963.1.3OTU统计热图我们通过分析16SrRNA测序所得数据，Heatmap图是根据颜色的变化来反应原始数据的信息，进而能够分析各实验组菌群的组成信息。通首先对各个样本间相似的丰度进行聚类，然后将菌群结果以heatmap图的形式表现出来，根25 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究据各样本颜色的深浅来反映不同菌群在OTU水平上的相似性和差异性。各实验组Heatmap结果如图（图3-2）所示：图3-2各实验组总体OTU统计热图对各实验组属水平不同的OTU序列进行统计，结果用Heatmap图来展示，可以看出各个样本OTU整体的变化情况。由此可以发现，F组在平均OTU水平最低，C组在平均OTU水平最高。3.1.4各实验组Venn图结果Venn图可用于统计各个实验组样本中共有和特有物种的OTU，也可更加直观的表现出菌群样本在OTU水平数目组成相似性。通常情况下，分析时选用相似水平为97%的OUT，在门分类学水平各的样本的Venn图如下（图3-3）所示：26 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图3-3小鼠肠道菌群OTU水平Venn图由得出的Venn图可以看出，共有的OTU是306个，A组特有的3个OTU是：OTU94、OTU44、OTU57；B组特有的8个OTU分别是：OTU148、OTU142、OTU145、OTU139、OTU174、OTU128、OTU121、OTU164。C组特有的6个OTU是OTU334、OTU203、OTU328、OTU313、OTU259、OTU266。D组特有的6个OTU是OTU437、OTU432、OTU403、OTU393、OTU444、OTU365。E组特有的12个OTU是OTU505、OTU486、OTU488、OTU479、OTU535、OTU531、OTU532、OTU528、OTU514、OTU464、OTU549、OTU542。F组无特有OTU。说明在糖尿病时期，OTU的数目及组成的相似性及重叠情况极高。3.1.5群落柱状图基于OTU的统计结果，对6组大鼠肠道微生态进行OTU水平的物种注释后在门（phyla）级别微生物构成比进行分析。由于分析所得微生物门级别的有统计意义的有13类，所以去除构成丰度小于1%的门类，根据分析结果进行简单统计发现，构成比例处于前5位的微生物门类依次为：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）。实验E组的拟杆菌门的丰度最高，在高脂饲喂及注射STZ后，其占有比例逐渐降低。并且厚壁菌门、梭菌门的丰度都降低，但是变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）的丰度增加。此外，在高27 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究脂饲喂的第40天，拟杆菌门呈现出先升高后降低的趋势，在C组时期其比例达到最大，然后逐渐降低。从6组OTU丰度结果看，伴随着高脂高糖联合STZ制备糖尿病模型，发现在糖尿病的发生过程中，菌群的丰度呈现逐渐降低的趋势，且拟杆菌门与厚壁菌门的比值上升，提示该比值可能与糖尿病的血糖浓度成正比。门水平群落柱状图如下（图3-4）所示：图3-4小鼠肠道菌群门水平群落柱状图3.1.6Alpha多样性(样本内多样性)分析眯俥Alpha多样性要展示的是各实验组菌落的多样性，主要反映菌落的丰度和均匀度。Alpha多样性越高则表现出群落越丰富，群落数目越均匀则提示该菌群群落更加稳定。本实验通过Alpha分析对各组大鼠所有样本的复杂度进行分析。通过丰富度曲线来验证测序数据量是否足够反映样品中的物种多样性。图3-5（a）中Shannon值说明样品中物种的多样性指标之一，横坐标代表序列条数,纵坐标代表ShannonIndex值，即检测到的OTU数量。本实验检测到在700条序列数时曲线趋于平坦，表明随着测序的深度的增加，检测到的OTU数不在增长，说明检测已获得各样品的最大OTU值，样品所含物种的种类得到充分检测，可基本覆盖所有的物种；图3-5（b）为Chao1值，主要反映菌群丰度，Chao1值越大代表物种总数越多，图中可见测序所得物种丰度高，满足后续分析所需的数据量。从图3-5可以看出，A的微生态群落多样性整体稍高。28 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图3-5各样本菌群ShannonIndex值与Chao1值检测结果反应群落多样性shannon指数，第一是种数，第二是各种间个体分配的均匀性（equiability或evenness）。物种之间，如果H值越大，则表明该组的个体趋于均匀。均匀性指数如何来测定呢？通过估算理论的群落最大多样性指数，与实际的多样性指数算出比率，最终得到菌群均匀性指数。本实验结果可以看出（图3-6），各实验组之间的shannon差异显著，说明在糖尿病的发生过程中，C组与各实验组之间的肠道微生态均匀性差异性比较大（P<0.05）。F组的种数与均一性最低，且组间比较差异显著（P<0.05）。图3-6各实验组的shannonIndex值在OTU水平的表达差异3.1.7物种多组差异性分析29 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据，运用严格的统计学方法可以检测不同组样本微生物群落中表现出的丰富度差异的物种，进行假设检验，评估所得到的差异显著性。本实验各实验组是基于门水平对各组间差异进行检测，采用的方法是用单因素方差分析，其用于计算各组样本的均值是否相同。通过此分析可以比较物种在3组或3组以上样本组中的分布是否存在显著性差异，然后对有差异的物种进行post-hoc检验，找出多组中存在差异的样本组多重验证采用fdr校正方法。结果如下图3-7所示：图3-7各实验组用单因素方差分析门水平的组间差异显著性比较由图可以看出，各实验组肠道微生态的厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、螺旋体门、蓝细菌门、柔壁菌门的均值差异性具有统计学意义（P<0.05）；疣微菌门、放线菌门虽然在各实验组所占比例较大，但组间无统计学意义(P>0.05)。3.1.8物种两组差异性分析30 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究两组之间的比较是基于门水平采用Wilcoxon秩和检验，是两组独立样本非参数检验的一种方法。该分析可以对两组样本的物种进行显著性差异分析，并对P值进行多种方法的校正。多重验证采用fdr。本实验在门水平各组与F组及各组与D组的组间差异显著性结果如下图3-8所示：A组与F组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较B组与F组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较31 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究C组与F组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较D组与F组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较E组与F组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较A组与C组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较32 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究B组与C组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较D组与C组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较E组与C组用秩和检验在门水平的组间差异显著性比较图3-8各实验组与C、F两组之间差异性比较33 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究通过以上组间差异显著性检验根据得到的群落丰度数据。用秩和检验分析进行总体比较时，A组与F组比较拟杆菌门(Bacteroidete)、变形菌门(Proteobacteria)差异显著；B组与F组比较拟杆菌门(Bacteroidete)差异显著；C组与F组比较蓝细菌（cyanobacteria）差异显著。D组与F组比较杆菌门(Bacteroidete)差异显著；E组与F组比较，厚壁菌门(PhylumFirmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、柔壁菌门(Tenericutes)、蓝细菌门（cyanobacteria）差异显著。A组与C组比较蓝细菌门（cyanobacteria）、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)差异显著。B组与C组比较，放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)差异显著。D组与C组比较，unclassified_k__norank、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门（cyanobacteria）差异显著。E组与C组比较，脱铁杆菌门(Deferribacteres)、蓝细菌门（cyanobacteria）、螺旋体门(Spirochaetes)差异显著。3.1.9LEfSe多级物种差异判别分析LEfSe结果如图所示，主要目的是通过线性判断（LDA）来预计组内各个菌落的丰度对差异效果的影响程度。如图（图3-9）所示，物种的LDA得分用横坐标来表示，LDAscore具有显著差异是以2为基准，分类水平从门开始到种，每个柱子表示一个物种，不同颜色表示不同的分组。结合进化分支图（图3-10）可见，A组中对群落结构影响较大的物种有拟杆菌（Bacteroidetes）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、拟杆菌目（Bacteroidales）、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、厌氧原体属(Anaeroplasma)、厌氧支原体属（Anaeroplasma）、属产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、梭杆菌(Clostridia)。B组中对群落结构影响较大的物种有费克蓝姆菌属(Facklamia)、梭杆菌(Clostridia)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、孪生菌属(Gemella)、芽胞杆菌目(Bacillales)、双叉型比菲德氏菌(BifidobacteriumBifidum)。C组中对群落结构影响较大的物种有Lachnoclostridium、放线菌门（Adlercreutzia）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）、Gastranaerophilales、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)。D组中对群落结构影响较大的物种有毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Ruminococcaceae、厚壁菌门(Firmicutes)、足球菌属种(Pediococcu)。E组中对群落结构影响较大的物种有螺旋体门(CandidatusSpirochaetes)、Stoquefichus、厌氧生塞内加尔马西利亚菌(Senegalimassilia)。F组中对群落结构影响较大的物种有δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、肉杆菌属(Atopostipes)。具体图解如下：34 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究图3-9LDA值分布柱状图示例图3-10Lefse进化分支图示例35 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.1.10样本比较PCA分析PCA主成分分析（PrincipalComponentAnalysis），是一种简化原始数据的的方法，将原有的复杂数据降维，同时保持数据集中对方差贡献的最大特征。其优点是简单且无参数限制。通过各实验组不同的群落组成反映出各样本间的差异性。若某两个样本在PCA图中的距离越近，则表示这两个样本的群落组成较相似。从图可以看出A组离原点最近，C组离散程度最小，表明6个样本的差异程度较小，F组离散程度最大，表明伴随着糖尿病的发生，小鼠的肠道微生态菌群紊乱程度较高，实验组本实验结果（图3-11）及PCA在OTU水平的箱式图（图3-12）如下：PCAonOTUlevelA15,000CBED10,000F5000)%10.571(2C-5000P-10,000-15,000-20,000-15,000-10,000-50000500010,00015,000PC1(44.66%)注：样品距离远近表明样品的相似度，其中PC1、PC2分别表示第一、第二主成分，每个坐标轴括号中的数字表示此主成分的贡献率。图3-11各实验组PCA在OTU水平的表达ABCADEF-20,000-17,500-15,000-12,500-10,000-7500-5000-2500025005000750010,00012,50015,00017,500PC1图3-12各实验组PCA在OTU水平的箱式图36 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.1.11样本比较PCoA分析PCoA主坐标分析，其原理是采用非约束性的数据降维方法，与PCA分析类似，但是PCoA可以利用样本间的生物学距离进行分析。通过PCoA图（图3-13）可观察群体间的差异。若两个样本之间的三维距离越近，则表示这两个群落差异性较小。在PCoA分析图中可以看到，横坐标PC1贡献度为23.98%，纵坐标PC2贡献度为15.4%，PC3贡献度为9.84%，各组样本间显示空间距离比较接近，说明组内差异较小，这对整体组间的比较非常有价值。图3-13Beta多样性PCoA分析图3.2肠道局部免疫结果肠道局部免疫检测结果，正常组SIgA为22.3pg/mL，D组SIgA水平开始下降，为20.1pg/mL，E组SIgA水平为18.3pg/mL，F组SIgA水平为17.6pg/mL。表明随着T2DM的发病进程，肠道免疫能力逐渐下降。＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05；图3-14各实验组SIgA水平37 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究3.3体液免疫结果体液免疫检测结果：A组与E组、A组与F组的TNF-α、hs-CRP、IL-6差异均具有统计学意义（P<0.05）；B组、C组、D组的TNF-α、hs-CRP、IL-6差异均无统计学意义（P>0.05）。表明随着T2DM的发病进程，模型小鼠体内炎症水平逐渐上升能力逐渐下降。：＃＊&＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.053-15各实验组TNF-α水平3-15各实验组hs-CRP水平＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05；图3-17各实验组IL-6水平图3.4细胞免疫结果全血样本在24h内采用流式细胞术对T淋巴细胞亚群进行分型。结果显示++++如表2所示。正常组CD3CD8与高脂组和糖尿病组的CD3CD8差异显著++（P<0.05）；A组CD3CD4与F组差异显著（P<0.05），在糖尿病发生的过程中，A组与B、C两组组间差异不显著（P>0.05），其余各组间差异均显著（P<0.05）。+A组CD3与高脂组B、C、D、E组差异不显著（P>0.05），与F组差异显著（P<0.05），组间差异不显著（P>0.05）。流式细胞图结果如图3-18所示，分型结果如表2所示：A组：38 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究B组：C组：D组：E组：F组：+++++图3-18CD3、CD3CD8、CD3CD4等T淋巴细胞亚群流式细胞图39 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究表2各实验组T淋巴细胞亚群比例（%）T淋巴细A组B组C组D组E组F组P胞亚群++＊&&＃&＃＊&＃＊&＃＊CD3CD817.4±1.414.1±0.313.3±0.69.8±0.67.1±0.94±2.0P<0.05++＊&&＃&＃＃＃＊CD3CD430.9±8.724.9±3.119.4±4.315.7±1.013.4±3.18.3±3.8P<0.05+&＊&&＃＊CD318.1±1.615.5±2.515.5±2.5116.9±0.320.2±2.711.4±4.5P>0.05＃＊&注：与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05＃＊&＃＊&与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05++++图3-19CD3CD8T淋巴细胞亚群各实验组的变化图3-20CD3CD4T淋巴细胞亚群各实验组的变化＃＊&与A组比较，P<0.05；与C组比较，P<0.05；与F组比较，P<0.05+图3-21CD3T淋巴细胞亚群各实验组的变化4.讨论肠道菌群在免疫、代谢、营养等方面具有重要的作用。有研究表明，肠道菌[36]群与代谢性疾病特别是T2DM的发病机制中发挥作用。T2DM病患者肠道内40 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究[37]的细菌环境更加恶劣，最终会产生多重耐药性。Treg对机体过度的炎症与自身免疫疾病的调解非常重要。有不少学者也证实，肥胖相关的炎症因子所引起的胰岛素信号传导障碍加快了T2DM的发生，是胰岛功能减弱的一个重要的环节[38]［39-42］，且有大量文献表明炎症会引起胰岛素抵抗。综上所述，T2DM的发病进程与肠道菌群引起的炎症有相关性。本实验肠道微生态测序结果显示，A组与F组比较拟杆菌门、变形菌门差异显著；B组与F组比较拟杆菌门差异显著；C组与F组比较蓝细菌差异显著。D组与F组比较杆菌门差异显著，由此可以发现在T2DM发病进程的不同时期，其菌群丰度是不同的。联合肠道免疫、体液免疫及细胞免疫指标的检测结果，发生这种情况的原因可能是肠道菌群丰度失衡使小鼠的免疫力下降引起胰岛素抵抗最终导致T2DM的发生。由于Pre-DM患者基数大呈逐年上升趋势，且将T2DM发病进程与免疫联合的相关研究较少。本实验通过采用16SrRNA高通量二代测序技术，对T2DM发病进程中各实验组小鼠粪便测序并进行生物信息学分析。第一，本实验发现C组是糖尿病发病的一个特殊时期，与其他组比较，C组均一性最好且最稳定。A组与C组比较蓝细菌门、放线菌门、变形菌门、疣微菌门差异显著；B组与C组比较，放线菌门、疣微菌门差异显著；D组与C组比较放线菌门、蓝细菌门差异显著；E组与C组比较，脱铁杆菌门、蓝细菌门、螺旋体门差异显著。其中蓝细菌门呈现先降低后升高的趋势，且与各实验组差异均显著。因此，在T2DM的发病进程中，蓝细菌门可能成为调节肠道菌群的新靶点。第二，在整个T2DM的发病进程中，肠道免疫、体液免疫及细胞免疫的水平都呈逐渐下降趋势，表明模型小鼠的免疫能力在下降。因此，本研究的优点是观察肠道微生态在T2DM发病进程的变化，且与各项免疫指标联合，探讨糖尿病发生过程中菌群丰度的改变对免疫的影响。本实验通过分析A组到F组的微生物群落的多样性，发现菌群丰度呈现出不同的变化，C组小鼠菌群的均一性最好且最稳定，生信分析发现对群落结构影响较大的物种有Lachnoclostridium、放线菌门、蓝藻菌门、Gastranaerophilales、消化链球菌科等。F组小鼠的菌群均一性最差，且丰度失衡最为严重，其中对群落结构影响较大的物种有δ-变形菌纲、脱硫弧菌目、肉杆菌科、肉杆菌属。表明在糖尿病的发生过程中，T2DM菌群的紊乱程度最高，这与糖尿病的发生有一定的相关性，F组群落影响较大菌群的代谢产物可能会促进糖尿病的发生。A组与F组比较，拟杆菌门、变形菌门差异显著，且比值降低；两者在体内是属于共生关系，可以同时促进宿主进行能量代谢。因此，这两种菌在体内的糖发酵具有重要的作用。当该菌的比值失衡时，其代谢产物会随之发生变化，引起肠壁的通透41 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究性改变从，而会改变胰岛素的敏感性。此外，本实验发现肠壁SIgA的水平与拟杆菌门/变形菌门有一定的相关性。因此，对肠道菌群进行干预，调节胰岛素的敏感性，可能会成为预防和治疗T2DM的一个新靶点。正常情况下，人体内定植的菌群丰度变化可能会使机体肠道的免疫功能下降，使各类病原体乘虚而入，这些丰度失衡菌群的代谢产物进入血液循环对机体带来潜在的危害，其中某些共生菌能够刺激肠黏膜产生SIgA，从而会构成一道天然屏障来防御抗原进入机体。SIgA可以通过肠道蠕动及黏液纤毛运动将有害物质清除。若SIgA与DC细胞结合并且被摄取，可以使无炎症反应的免疫过程的到加强；若SIgA与T淋巴结合，可能会使肠黏膜产生TGF-13、IL-6等促炎因子。说明SIgA对肠道屏障功能的完整性具有重要的作用，有助于降低系统的炎症反应。因此，SIgA对肠道免疫具有重要的作用。本研究发现，在糖尿病的发病进程中，肠道的局部免疫能力呈逐渐下降趋势。表明随着肠道菌群丰度的失衡，使肠道菌群代谢产物发生变化，可能导致肠道的局部免疫功能下降。体液免疫相关的炎症因子（hs-CRP、TNF-α、IL-6）在糖尿病、冠心病、类风湿疾病、高血压等许多疾病发病进程中有举足轻重的作用。20世纪90年代，就已经发现促炎因子IL-6、TNF-α在多种组织中影响葡萄糖水平的稳定性。近年来，炎症在T2DM发病进程的研究备受关注，炎症标志物，如hs-CRP、TNF-α、［43］IL-6等都与T2DM发病的进程具有相关性。Hs-CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的一种全身性炎症反应急性期的非特异性标志物，其主要与IL-6和TNF-α的相关调节。由脂肪细胞分泌的细胞因子IL-6和TNF-α是刺激肝脏合成Hs-CRP的主要细胞因子。本文研究发现，Hs-CRP与胰岛素抵抗综合征有较强相关性。更有文献显示，随着体内脂肪的增加,Hs-［44］CRP也伴随着一定程度的升高。本文发现，高脂高糖饲喂的小鼠在发展为T2DM之前的4个时间点，Hs-CRP呈上升趋势，且组间差异较显著。这表明在T2DM发病之前已经伴随着慢性炎症的变化，推测慢性炎症有可能是引起引起胰岛素抵抗的因素之一。IL-6是由活化的T细胞与成纤维细胞产生的淋巴因子，其主要作用是调节细胞免疫活性与激活NK等细胞免疫细胞。IL-6是已知的多功能炎性细胞因子。有研究发现，IL-6可诱发胰岛素抵抗，其主要作用是减少葡萄糖转运蛋白-4（Glucosetransportertype4，GLUT-4）的表达，从而降低脂肪细胞对葡萄糖、脂肪的转运，促进糖尿病的发生。IL-6还可降低IRS-1酪氨酸磷酸化及下游PI3K[45]的活性，导致胰岛素抵抗。Devaraj等研究发现，较高浓度的血糖通过上调PKC、42 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究MAPK及NF-κB途径导致IL-6的产生增多，且在T2DM的发病进程中患者单核细胞中内脂素、TNF-α、IL-6mRNA的表达水平显著增高，提示IL-6的升高与[46]T2DM发病进程的IR有关。VanBeek等研究也发现，肥胖T2DM患者较正［47］常糖耐量患者循环血中IL-6水平高。本实验发现，各试验组的IL-6与在T2DM的发病进程中逐渐升高，更证实了IL-6与胰岛素抵抗具有相关性。TNF具有调节人体免疫与代谢的功能，其不仅是一种有效的肿瘤杀伤因子，而且在调节免疫功能时发挥重要作用，包括TNF-α和TNF-β。TNF-α是一种由巨噬细胞及单核细胞产生的促炎性细胞因子，特点是灵敏度较高，是触发炎症反应的核心。主要功能是参与机体的生长调节、炎症、免疫应答等，是多种信号通路的关键环节。最新的研究发现。FBG与TNF-α有密切的关系，选择小鼠脂肪细胞作为实验对象，使其分化为成熟的细胞，然后观察在不同的状态下GLUT与TNF-α的水平，发现GLUT-4影响脂肪细胞与葡萄糖的结合，最终导致胰岛素抵抗。Tanaka等研究发现，TNF-α能降低过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisomeproliferators-activatedreceptor-γ，PPAR-γ）mRNA的表达，减少[48]PPAR-γ产生。PPAR-γ是一类核转录因子，主要表达在脂肪细胞，可控制该细胞内不同的代谢水平，其作用是抗炎与促进凋亡；同时，PPAR-γ对leptin的转录作用抑制，使leptin水平降低，从而增加了体内游离脂肪酸的生成，体内胰岛素水平上升。本实验研究发现F组的TNF-α水平与其它五组差异较显著，并与胰岛素抵抗水平呈正相关。由此可见在T2DM的发病进程中发生的过程中，TNF-α可以起到关键性的作用。++++T淋巴细胞亚群中主要由CD3、CD4、CD8细胞调节细胞免疫。CD3代表++全部T淋巴细胞亚群、若百分比下降，则表明T淋巴细胞水平下降。CD4与CD8分别代表Treg与毒性T细胞，两者之间通过协同与拮抗作用维持免疫平衡，是机++体免疫调节的关键。CD8受到外来抗原刺激后，直接破坏靶细胞，CD4细胞受到外界抗原致敏后，诱导T细胞、B细胞与巨噬细胞的增殖Treg表面标志较多，特＋异性最高的是FOXP3Treg，当其基因突变时会引起严重的免疫疾病。近年来有＋［49］研究发现T2DM患者FOXP3Treg表达较低。本研究发现T2DM发病进程中，T淋巴细胞亚群比例失衡，表明小鼠长期处于高血糖状态使细胞免疫功能降低，其介导的免疫损伤可能在发病进程中起重要作用。通过采用16SrRNA高通量二代测序技术，对T2DM发病过程中各实验组小鼠粪便测序并进行生物信息学分析。构成比例处于前5位的微生物门类依次为：厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、螺旋体门。在高糖高脂饲喂第40天，拟杆菌门呈现出先升高后降低的趋势，在C组时期其比例达到最大，然后逐43 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究渐降低；发现在T2DM发病过程中，拟杆菌门与厚壁菌门的比值上升，这两种菌群对体内的糖发酵具有重要的作用，两者在体内属于共生关系，可以同时促进宿主能量代谢，提示该比值可能与糖尿病的血糖浓度成正比。5.小结通过本实验研究发现，小鼠肠道微生态的失调使免疫紊乱引起胰岛素抵抗最终导致T2DM的发生。虽然肠道菌群对宿主的免疫系统有重要的作用，可以通过乙酸、丁酸、脂蛋白、脂多糖等特定的代谢产物对免疫系统进行调节，但是其调控机制需要更深入的挖掘。少数共生菌会使不同功能的T淋巴细胞在固有层的分布受到影响。免疫性反应的特点是：肠道微生态可以能够使免疫反应向辅助性T1细胞（Thelpercells1,Thl）极化，而没有受到刺激则会使辅助性T2细胞+（Th2）进行免疫反应。有研究表明，双歧杆菌可以激活CD103DC细胞，并且［50］+在短时间内产生IL-10和IL-27，最终使Thl细胞分化。肠道菌群对于CD4T细胞的分化起着至关重要的作用。在健康人的肠道微生态内，肠道内拥有大量的T细胞，其可以产生IL-17、IL-22、IFN-g和IL-10等与免疫相关的因子，当肠道+菌群丰度失调时，与CD4T相关的Th-1与Th-17细胞减少，但是Treg的数量没有受到太大的影响。当无菌小鼠体内植入脆弱拟杆菌时，由于肠道树突状细胞对脆弱拟杆菌多糖A的识别，可以使Thl/Th2处于动态平衡，该类细胞可以使+IL-10产生CD4T来调节肠道菌群处于稳态。因此，具体免疫机制有待深入研究。44 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究结论通过本实验研究，得出以下结论：（1）通过成功制备了Pre-DM及T2DM的动物模型，发现在前期糖尿病已经存在胰岛素抵抗，且伴随着不同程度的肝脏及胰岛、回肠的损伤，发展为T2DM时胰岛素抵抗更为显著。（2）在2型糖尿病的发生过程中伴随着肠道菌群丰度变化，尤其是丰富种群：厚壁菌门、梭菌门、变形菌门、蓝藻菌门等菌群随着血糖的升高出现不同的变化趋势，可能引起慢性炎症最终胰岛素抵抗。（3）在糖尿病的发生过程中肠道菌群丰度失衡引起小鼠肠道免疫、细胞免疫与体液免疫出现紊乱，提示在T2DM的发展进程中相关的免疫指标异常及T淋巴细胞亚群的比例失衡与糖尿病的发生风险有一定的相关性。45 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究展望与肠道微生态相关的研究方兴未艾，探讨T2DM的发病进程中肠道微生态与免疫相关的研究，对于挖掘与T2DM相关的炎症标志物具有重要临床意义。本实验的研究表明，在T2DM发病进程的前期以胰岛素抵抗为发病基础，最终发展为T2DM。肠道菌群丰度的失调引起体液免疫如SIgA、Hs-CRP、IL-6、+++TNF-α的变化、细胞免疫如CD3、CD4、CD8等T淋巴细胞亚群比例的失衡均与胰岛素抵抗有较强相关性，表明T2DM不仅是一种高血糖疾病，还是一种炎症性疾病。因此，慢性炎症也是引起胰岛素抵抗综合征的一个重要因素。在发病过程中，其肠道微菌群丰度的变化，尤其是丰富种群：厚壁菌门、梭菌门、变形菌门、蓝藻菌门等随着血糖的升高出现不同的变化趋势，这些菌的代谢产物水平发生变化，最终引起慢性炎症最终胰岛素抵抗。因此，肠道微生态失调使小鼠免疫紊乱引起胰岛素抵抗最终导致T2DM的发生。虽然本实验证实肠道菌群的丰度失调可能引起炎症参与了胰岛素抵抗。但是由于研究的局限性没有进行菌群功能组学的研究，目前关于菌群代谢产物与T2DM发病进程中的具体免疫调控机制、肠道微生态、糖尿病的因果关系有待深入研究。以期肠道微生态成为预防T2DM发生的新靶点，能够为后续研究提供理论依据，最终为临床提供更有效的诊断、预防和治疗手段。46 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究参考文献[1]Samocha-BonetD,DebsS,GreenfieldJR.PreventionandTreatmentofType2Diabetes:APathophysiological-BasedApproach[J].2018.[2]司一鸣,应令雯,周健.2018年ADA糖尿病医学诊疗标准解读[J].中国医学前沿杂志,2018,10(1):24-31.[3]李红金,赵敏,綦雯雯,等.2010美国糖尿病协会糖尿病治疗指南[D].2011.[4]WilliamsonRT.Onthetreatmentofglycosuriaanddiabetesmellituswithsodiumsalicylate[J].BMJ,1901,1(2100):760-762.[5]HotamisligilGS,ShargillNS,SpiegelmanBM.Adiposeexpressionoftumornecrosisfactor-alpha:directroleinobesity-linkedinsulinresistance[J].Science,1993,259(5091):87-91.[6]DonathMY,ShoelsonSE.Type2diabetesasaninflammatorydisease[J].NatureReviewsImmunology,2011,11(2):98-107.[7]PathophysiologyofPrediabetes[J].MedicalClinicsofNorthAmerica,2011,95:327–339.[8]MasonCC,HansonRL,KnowlerWC.Progressiontotype2diabetescharacterizedbymoderatethenrapidglucoseincreases.[J].Diabetes,2007,56(8):2054-61.[9]DefronzoRA,Abdul-GhaniMA.Preservationofβ-cellfunction:thekeytodiabetesprevention[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2011,96(8):2354.[10]DethlefsenL,HuseS,SoginML,etal.Thepervasiveeffectsofanantibioticonthehumangutmicrobiota,asrevealedbydeep16SrRNAsequencing[J].PLoSbiology,2008,6(11):280[11]RoundJL,MazmanianSK.InducibleFoxp3+regulatoryT-celldevelopmentbyacommensalbacteriumoftheintestinalmicrobiota[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2010,107(27):12204-12209.[12]EndesfelderD,zuCastellW,ArdissoneA,etal.Compromisedgutmicrobiotanetworksinchildrenwithanti-isletcellautoimmunity[J].Diabetes,2014:631-636.[13]QinJ,LiY,CaiZ,etal.Ametagenome-wideassociationstudyofgutmicrobiotaintype2diabetes[J].Nature,2012,490(7418):55.[14]ChatelierEL,NielsenT,QinJ,etal.Richnessofhumangutmicrobiomecorrelateswithmetabolicmarkers[J].Nature,2013,500(7464):541-6.47 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甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究在学期间科研成果一、发表论文1.曾通旭，徐倩，哈小琴等.肠道微生态将有可能成为治疗免疫疾病的新靶点.华南国防医药杂志（已录用）.2.曾通旭，哈小琴.前期糖尿病及其相关并发症的研究进展.国际检验医学杂志（已录用）.3.曾通旭，杨波，徐倩，蔡小玲，哈小琴.糖尿病的发病进程与免疫的相关性.甘肃农业大学学报（已录用）.4.曹荟哲,徐倩,曾通旭等.游离脂肪酸致胰岛素抵抗的相关分子机制研究进展[J]解放军医药杂志,2017(1):114-116.5.高瞻,曾通旭,王娟,等.鞘氨醇激酶1调控沉默信息调节因子1表达的研究[J].解放军医药杂志,2017,29(1):1-5.二、参与申请课题1、国家自然科学基金项目（81700272）PHLPPI的表达及线粒体转位在糖尿病心肌缺血易损伤中的作用研究；2、国家重点基础研究发展计划子课题项目（2015CB755402）太赫兹无标记检测方法鉴定循环内皮祖细胞的临床研究；3、甘肃省重点研发计划课题项目（17YF1FA135）肿瘤靶向治疗生物新药TPIN临床前研究三、参加课题1、国家高技术研究发展计划（863计划，2011AA02A111）心脑血管慢性损伤及急救指标等体外诊断试剂的研制”子课题“游离脂肪酸致胰岛素抵抗的机制研究”51 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究致谢时如白驹过隙，转眼间我的硕士研究生时光即将画上句号。第一次拎起大白鼠，麻醉、测血糖、造模型；第一次参加检验科大家庭的组会……一路走来，品过成功的甜，也尝过失败的苦。离别在即，心中难免思绪万千，有太多太多的人和事值得感激和记忆。衷心感谢导师哈小琴教授三年来对我的悉心指导和亲切关怀。导师开阔的学术视野，严谨勤奋的治学态度，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。科研学习过程中，导师教导我“要站在更高的层面，思考和解决有意义的科学问题”。时刻牢记导师曾对我说的，“做科研学会克服困难，吃苦耐劳是培养科研素质的基础”，导师的谆谆教诲和悉心关怀是我坚定信念，勇往直前的动力。导师儒雅的人格魅力和乐观、豁达的做人风格不仅让我明白了如何看待事物，而且还明白了许多为人处世的道理，使我受益良多。您的言传身教深刻影响和指引着我今后的工作和生活。感谢导师在我生病期间给予我无微不至的关怀和帮助。值此学业完成之际，谨向导师致以学生最诚挚的谢意和衷心的敬意!在前期课题的完善、结果分析，毕业论文的提交整个过程，都倾注了老师大量的心血。感谢老师三年来的悉心指导和点滴教诲，谨向老师致以衷心的谢意！衷心感谢甘肃农业大学给予我这次学习深造的机会。感谢教学实验中心慧玲主任，桑春艳老师对我的指导和帮助。感谢师姐邢媛、曹荟哲、师兄白燕青的鼓励和帮助。您们对科研的执着与热爱，树立了良好的榜样。感谢同门徐倩，师弟杨波、师妹蔡小玲给予我无私的帮助，在这样一个团结奋进的大家庭中学习是我的荣幸。感谢兰州军区兰州总医院检验科、血液科的各位老师，是你们的帮助让我能够顺利的完成本篇论文。衷心感谢我的父母及家人，感谢他们给予我无限的支持、关心、理解和鼓励，并陪伴我走过这段坚信而充实的日子。他们的无私奉献与支持是我完成学业的坚强后盾!他们永远是我求学路上执着前进的动力。本实验得到了国家高技术研究发展计划（863计划）：“心脑血管慢性损伤及急救指标等体外诊断试剂的研制”子课题“游离脂肪酸致胰岛素抵抗的机制研究”（2011AA02A111）、甘肃省科技支撑计划-社会发展计划项目(NO：0708NKCA128)、等基金项目的资助。在此，一并致以最诚挚衷心的感谢!最后，感谢这些年出现在我生命中，曾经支持、关心、爱护、鼓励和帮助过我的亲人、师长、同窗和朋友们，希望美好和快乐永远与你们相伴！曾通旭2018年3月于兰州52 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究导师简介兰州总医院检验科主任，主任医师，硕士研究生导师。甘肃省领军人才，第六届“甘肃省青年科技奖”获得者，第一批甘肃省杰出青年基金获得者。主要从事肿瘤基因药物研发、肿瘤早期诊断标志物研究、创伤修复药物药效及机理研究及干细胞基础与应用研究。中国合格评定国家认可委评审员，国家自然科学基金评议专家，中国免疫学会第七届理事会理事，中国生物技术协会再生医学专业委员会委员，中国研究型医院学会检验医学专业委员会委员，中国老年医学学会检验医学分会委员，中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会常委，全军检验学会青年委员会常务委员，甘肃省医学会检验学会副主委，甘肃省医学会微免学会副主委。承担国家“863”计划项目、国家自然科学基金项目等科研项目20余项，《中国免疫学杂志》等多家杂志编委。申请专利12项，在国内外期刊发表学术论文170余篇，获得军队、省级科技进步二等奖5项。带教研究生近40名。荣获“全军爱军精武标兵”，“兰州军区保障打赢服务部队百名标兵”，“兰州军区优秀大学生干部”，“兰州军区巾帼建功先进个人”、“兰州军区技术专家重点培养对象”、“兰州军区3231科技英才学科带头人培养对象”、“兰州军区高层次人才培养对象”、“甘肃青年五四奖章标兵”、兰州市“十大杰出青年”等荣誉称号，荣立三等功一次。2016年享受国务院政府特殊经贴。中国共产党十九大代表。53 甘肃农业大学2018届硕士学位论文小鼠2型糖尿病发病进程中肠道微生态变化的初步研究54