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《16s rdna 经典材料》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、Normally,weusedfollowingprimerstoamplifybacterial16SrRNAgenes(27Fand1492Rpair)andsequencingthem(usingotherprimers).Theprimersequencsarealllistedinthereference:-LaneDJ(1991)16S/23SrRNAsequencing.In:StackebrandtE,GoodfellowM(eds)Nucleicacidtechniquesinbacterials
2、ystematics.Wiley,Chichester,pp115-17527F5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'PCRandsequencing,mosteubacteria357F5'CTCCTACGGGAGGCAGCAG3'Mosteubacteria530F5'GTGCCAGCMGCCGCGG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria926F5'AAACTYAAAKGAATTGACGG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria1114F5'GCA
3、ACGAGCGCAACCC3'Mosteubacteria342R5'CTGCTGCSYCCCGTAG3'Mosteubacteria519R5'GWATTACCGCGGCKGCTG3'Mosteubacteriaandarchaebacteria907R5'CCGTCAATTCMTTTRAGTTT3'Mosteubacteriaandarchaebacteria1100R5'GGGTTGCGCTCGTTG3'Mosteubacteria1492R5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'PCRandse
4、quencing,mosteubacteria1525R5'AAGGAGGTGWTCCARCC3'PCRandsequencing,mosteubacteriaM=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G,S=G:C.W=A:T;all1:1Anyprimer'sreversecomplementsequenceisitsreversprime.Forexample:519R5'GWATTACCGCGGCKGCTG3'then519F3'CWTAATGGCGCCGKCGAC5'Hopethiswouldusefu
5、ltoyouandansweredyourquestion.Andhopethiswouldusefultomanyotherpeople.GoodLUCK,guys!以16SrRNA基因为靶基因设计或比较通用引物，用blast效果不太好。因为该基因含有很多高度保守区（9-10），且在很多细菌中都是多拷贝的，文献或设计的primers往往都能扩增出几乎所有的真细菌，因此，blast时会得到很多同源序列，尽管如此，还是有更多的序列或细菌被省略了。我设计或验证该UP时，是有目的地根据实验需要，从genebank中确定一
6、些常见细菌的属，每个属选几个菌种，每个菌种选2-3个菌株，但一定要包括标准株（可参考文献），然后用MEGLINE进行序列，并与UP进行比较。设计完成后在拿UP与随意查的其他细菌进行比较验证。尽管需要分析的序列可能达近百个，可现在的计算机内存和速度，及宽带都很大，应该是很快的。细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等
7、级水平上的特异性。16SrRNA(16SrDNA)寡核苷酸的序列分析首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物
8、进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,加入100μL无菌重蒸H2O中,旋涡混匀后,沸水浴2min,12000rmin-1离心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。分离菌株16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：16SrRNA基因的PCR引物：5'-AGAG
