用16S rDNA方法鉴定细菌种属.doc

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1、.......用16SrDNA方法鉴定细菌种属一、实验目的1.掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、实验原理细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23SrRNA。16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等

2、步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。　16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。16SrDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直

3、接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鉴定细菌，其技术路线如下：细菌培养液基因组DNA16SrDNA片段连接克隆载体阳性克隆鉴定测序片段回收DNA提取PCR扩增细菌基因组的提取：得到胞内可溶物质菌体破碎纯化DNA分离出DNAPCR的基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链

4、DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引.s..............物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。二、操作步骤1、细菌基因组DNA提取；2

5、、PCR扩增；3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；4、扩增片段回收；5、DNA片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，，则凝胶为400mg，因此加入的BindingBuffer为1200μl。我们小组选用B116Ssequence，以下为制作进化树过程：1、根据B116S基因序列，到NCBI上比对，确定其种属（1）NCBI主页（.ncbi.nlm.nih.gov/）依次点击进入B

6、LAST（2）选择nucleotideBLAST.s..............（3）将B1序列复制到文本，框里ChooseSearchSet处点复选按钮others，最后点BLAST（4）点击BLAST后，数据进行提交。BLAST结果如下：.s..............图中“Evalue”指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totlescore）都是数值越高相似度越高。我组将数据按照Querycover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。（5）导出数据数据导出格式选择FASTA：（6

7、）选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌.s..............（6）下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG（7）通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中.s..............（6）选择W中AlignDNA，然后点击OK（10）选择Date中的MEGAFormat，生成meg文件.s..............（11）打开.meg文件.s..............（11）生成进化树（12）导出文件，我组导出PDF格式.s..........

8、....2、进化树B1应该属于Proteus（变形杆菌属）电泳图谱：.s..............从右数第四个条带为本组电泳条带，条带清晰且明亮，无明显拖尾以及弥散，表明DNA提取和PCR扩增非常顺利，所得目的片段完整，数量较多。四